la degradación de tolueno por las enzimas de escisión en orto
DESCRIPTION
Articulo impotante acerca de la utilizacion de bacterias Burkholdeiras ppara la dregradacion del tolueno mediante enzima de ortoTRANSCRIPT
La degradación de tolueno por las enzimas de escisión en orto
Burkholderia fungorum FLU100
Daniel Dobslaw y Karl-Heinrich Engesser *
Departamento de Residuos Biológico de purificación de aire, Instituto
de Ingeniería Sanitaria y Calidad del Agua Residuos Sólidos
Gestión de la Universidad de Stuttgart, Bandtäle 2,
Stuttgart, D-70569, Alemania.
Sumario
Burkholderia fungorum FLU100 oxida simultáneamente
cualquier mezcla de tolueno, benceno y monohalogen
bencenos a (3-sustituido) con catecoles
una selectividad de casi el 100%. Metabolismo más
producido a través de las enzimas de las vías de escisión orto
con la mineralización completa. Durante la transformación
de 3-metilcatecol, 4-carboximetil-2-
metilbut-2-en-4-olida (2-metil-2-enelactone, 2-ML)
acumulada transitoriamente, siendo aún más mineralizada
sólo después de una fase de retardo de 2 h en el caso de las células pre-adultos
el benceno o mono-halógenas bencenos. No lag
fase, sin embargo, se produjo después de un crecimiento en tolueno.
Los cultivos inhibidos por cloranfenicol después del crecimiento
en benceno o mono-halógeno bencenos fueron incapaces
para metabolizar 2-ML suministra externamente, incluso después de
incubación prolongada. Una cultura de control cultiva con
tolueno no mostró ninguna fase de latencia y se usa 2-ML como
un sustrato. Esto significa que 2-ML es un intermediario
de la degradación de tolueno y convertida por específica
enzimas. La conversión de 4-metilcatecol como una
muy menor subproducto de la degradación del tolueno en
cepa FLU100 resultó en la acumulación de
4-carboximetil-4-metilbut-2-en-4-olida (4-metil-
2-enelactone, 4-ML) como un producto sin salida, excluyendo
su naturaleza como un posible intermedia. Por lo tanto, 3-
metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, 3-metilcatecol,
Muconate 2-metilo y 2-ML fueron identificados como
intermedios centrales de escisión orto productiva
vías para el metabolismo de tolueno en B. fungorum
FLU100.
Introducción
Debido al uso generalizado de alquilo, así como halógeno
bencenos como reactivos y disolventes en la industria química,
pertenecen al top ten de las más frecuentes que aparecen
contaminantes en el agua y el suelo (UBA, 2013). Biológica
descontaminación de estos sitios es altamente interesante
debido a sus bajos costos y carácter "baja tecnología"
(Christodoulatos et al., 1996; Johnson y Odencrantz,
1,999; Kao y Borden, 1999; Smul Sachsen, 2000; Kao
y Prosser, 2001; Kao et al., 2006; Farhadian et al.,
2008). En contraste, la degradación de cócteles de contaminantes
todavía es problemática (Corseuil et al., 1998; Lovanh
et al., 2002), particularmente con respecto a las mezclas de chloroand
compuestos aromáticos sustituidos con metilo.
El clorobenceno es el mono-halógeno más ampliamente utilizado
benceno. Se convierte en primer lugar (cloro-) catecoles
como intermediarios centrales vía dioxigenación del
anillo aromático que forma chlorocyclohexa-3,5-dieno-1,2-dioles
(Reineke y Knackmuß, 1984;. Beil et al, 1997), a través de dos
sucesivas monooxygenations producen clorofenoles
como productos intermedios, o por medio inicial (Yen et al., 1991)
formando fenol deshalogenación (Zhang et al., 2011).
Chlorocatechols generalmente se transforman adicionalmente por
intradiol (orto) la escisión del anillo formando cloro-cis / cismuconates
(Dorn y Knackmuß, 1978; Schlömann,
1994; Reineke, 1998; Zerlin, 2.004; Gröning et al.,
2012). La posterior conversión se lleva a cabo por una
chloromuconate cycloisomerase formando directamente dienelactone
Con intermediario (-en-4-olides 4-carboxymethylenebut-2)
deshalogenación (Schmidt et al, 1980;. Kuhm
et al., 1990; Vollmer et al., 1994; Vollmer y Schlömann,
1995; Reineke, 1998), o indirectamente a través de chloromuconolactones
y la subsiguiente deshalogenación (Vollmer et al.,
1994; Moiseeva et al., 2002; Skiba et al., 2002; Nikodem
et al., 2003; Gröning et al., 2012). Los dienelactones son
más escindido hidrolíticamente a maleílo ser acetato
reducida en el siguiente paso para 3-oxoadipate, un centro de
metabolito de la vía 3-oxoadipate (Reineke, 1998).
La degradación de fluorobenceno, bromobenceno y
yodobenceno procede de una manera similar a la degradación
de clorobenceno (Strunk, 2000; 2007;. Carvalho et al,
2006; 2007; 2009; Strunk et al., 2006; Moreira et al.,
2013; Strunk y Engesser, 2013).
Tolueno como ampliamente utilizado aromático sustituido con alquilo
ya sea compuesto se convierte en methylcatechols, catecol o 3,4-dihidroxibenzoato como productos intermedios centrales.
Formación de methylcatechols - similar a
chlorocatechols - se lleva a cabo ya sea a través de dioxigenación
el anillo aromático formando metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-
diolefina (Gibson et al, 1974;. Zylstra et al., 1988; Warhurst
et al., 1994; Cho et al., 2000; Kim et al., 2002; Cafaro
et al., 2005; Chaikovskaya et al., 2008) oa través de dos sucesivos
monooxygenations con cresoles como intermedios.
En segundo lugar, el tolueno puede ser transformada a través de la cadena lateral catecol
oxidación formando alcohol bencílico, benzaldehído y
benzoato como productos intermedios (Worsey y Williams, 1975;
Harayama, 1994). Por último, la transformación de tolueno para 3,4-
dihidroxibenzoato a través de p-cresol y 4-hidroxibenzoato
También se ha descrito (Richardson y Gibson, 1984;
Escudos et al., 1989; Kaphammer et al., 1990; Yen et al.,
1.991). Posteriormente, methylcatechols suelen ser mineralizada
por extradiol (meta) la escisión del anillo (Hou et al., 1977;
Taeger et al., 1988; Reineke, 1998).
Mientras que la mineralización de alquilarse o halogenado
aromáticos como sustratos únicos es no crítica con la mayoría
bacterias, mezclas de esos compuestos son difícilmente biodegradable,
basado preferentemente en la incompatibilidad de
itinerarios individuales con potencial de formación de reactivo
intermedios en caso de la vía de escisión meta
(Klecka y Gibson, 1981; Knackmuß, 1981; Bartels
et al., 1984; Rojo et al., 1987; Pettigrew et al., 1991). Sólo
unas pocas cepas son capaces de hacer frente a sustituido cloro-
catecoles través de la vía de escisión de meta. No obstante, en
la mayoría de estas cepas, la inactivación de la meta
pyrocatechase solamente se compensa parcialmente por la reactivación
o caro continuar la síntesis de novo (Oldenhuis
et al., 1989; Haigler et al., 1992; Arensdorf y Focht,
1994; 1995; Hollender et al., 1994; 1997; Wieser et al.,
1994; Heiss et al., 1997; Marte et al., 1997; 1,999;
Franck-Mokross y Schmidt, 1998; Kaschabek
et al., 1998; Riegert et al., 1998; 1,999; Göbel et al.,
2004).
La segunda alternativa para mineralizar mezclas de alkyland
compuestos aromáticos sustituidos con halógeno es degradar no sólo
los catecoles halogenados, sino también-alquilo sustituido
compuestos aromáticos como el tolueno a través de vías orto. El orto
la escisión de methylcatechols como una reacción individual
fue descrito colector en la literatura. Por ejemplo,
4-metilcatecol se convirtió en 4-carboximetil-4-
metilbut-2-en-4-olida (4-metil-2-enelactone, 4-methylmuconolactone,
4-ML) es un metabolito sin salida en
la mayoría de las cepas que poseen vías de escisión orto
(Catelani et al, 1971;. Rojo et al, 1987;. Sovorova
et al., 2006; Marín et al., 2010). Sin embargo, Cupriavidus
necator JMP134 (Pieper et al., 1985; 1,988; 1,990;
Bruce et al., 1989), Rhodococcus opacus 1CP
(Sovorova et al., 2006) y Pseudomonas knackmussii
B13 FR1 (pFRC20p), una cepa genéticamente modificada
(Rojo et al., 1987), fueron capaces de eludir esta botella
cuello por una enzima isomerasa, cambiando el metilo
grupo de 4-posición a la posición 3 con el fin de conseguir
3-methylmuconolacton (4-carboximetil-3-metilbut-2-
en-4-olida), que era un sustrato de crecimiento para cada
cepa.
Sin embargo, el principal obstáculo para la degradación de
tolueno a través de reacción de escisión orto es el hecho de que
principalmente 3-metilcatecol se forma como un intermedio de
la oxidación del anillo. Este intermedio es mayor
transformado a 2-metil-cis, ácido cis-mucónico seguido de
formación de 4-carboximetil-2-metilbut-2-en-4-olida
(2-metil-2-enelactone, 2-methylmuconolactone, 2-ML),
que con frecuencia se ha descrito a ser un callejón sin salida
metabolito.
Hasta ahora, sólo unos pocos autores describieron una productiva
mineralización de 2-ML. Taeger et al. 2-ML utilizado como sustrato
para enriquecimientos obtención de cepas bacterianas totalmente
mineralización 2-ML. Sin embargo, la exposición de estas cepas
a 3-metilcatecol, enzimas de escisión de la meta
vía fueron inducidos (Taeger et al., 1988). Pettigrew
et al. encontrado un mutante de Pseudomonas sp. JS150, llamado
JS6, que tenía un defecto en la catecol-2,3-dioxigenasa
y por lo tanto era incapaz de escindir 3-metilcatecol por
vía meta (Pettigrew et al., 1991). Además,
3-metilcatecol era mineralizada por un orto modificado
Camino con 2-ML como intermedio. Sin embargo, tolueno
hubo inductor de esta vía orto y la cepa nativa
mineralización preferido de tolueno por escisión meta
vía. Resultados similares fueron encontrados con Ralstonia sp.
PS12 (Lehning, 1998). Franck-Mokross y Schmidt
informó acerca de la cepa de Pseudomonas sp. D7-4
siendo capaces de degradar m-toluato productivamente a través
3-metilcatecol y 2-ML mediante el uso modificado orto
enzimáticos (Franck-Mokross y Schmidt, 1998).
Sin embargo, 2-ML acumula temporalmente y era aún más
mineralizado después de una fase de latencia que dura unos pocos horas.
Consistentemente, esta cepa no fue capaz de mineralizar
tolueno.
Hemos descrito previamente la cepa Burkholderia
fungorum FLU100 poder mineralizar todas monohalogenado
bencenos, benceno y tolueno como pura
sustancias por una vía de escisión orto (Strunk, 2000;
2007; Dobslaw, 2003; Strunk et al., 2006; Strunk y
Engesser, 2013). Hemos postulado 2-ML como intermedio de
la vía de degradación tolueno.
En el presente artículo, mostramos los datos claramente demostrando
2-ML como el principal producto intermedio en la producción
degradación de tolueno por escisión orto modificado
enzimas así como la capacidad de la cepa para FLU100
degradar mezclas de benceno, tolueno y monohalogen
bencenos simultáneamente. Para nuestro conocimiento,
esta es la primera descripción de una funcional, no ingenieril
orto vía para la degradación total de
tolueno.
Resultados y discusión
La degradación simultánea de mezclas de
compuestos aromáticos
Fungorum Burkholderia FLU100 fue capaz de degradar cualquier
mezcla de los compuestos aromáticos benceno, tolueno,
fluorobenceno, clorobenceno, bromobenceno, así como
yodobenceno simultáneamente presentado como suela de carbono
fuente sin observar una fase de latencia. El aumento de la
número de compuestos, la transformación-sustrato específico
tasas disminuyeron. Sin embargo, la suma de la específica
tasas de transformación se quedaron casi constante durante cada
serie de pruebas. Por lo tanto, la transformación de cada sustrato parece
para ser llevada a cabo por el mismo dioxigenasa inicial previamente
descrito (Strunk y Engesser, 2013).
Los extractos de medios de cultivo con 0,25% FLU100
dimetilformamida (DMFA) y 2 a 3 mmol l-1 aromático
compuestos como concentraciones de inicio mostraron transformación
tasas de entre 90 y 120 mg l-1 C-1 h-1 OD
Y
180 mg l-1 C-1 h-1 OD al máximo en caso de óptima
condiciones de inducción (Apoyo a la Información Tabla S1).
Muestras acuosas sin DMFA, analizados por un alto
cromatografía líquida - sistema con
UV / detector de luz visible (HPLC-UV / VIS), reveló tasas de hasta
a 280 mg l-1 C-1 h-1 OD en el caso de tolueno como suela de carbono
fuente que muestra el efecto tóxico de DMFA. Sin embargo, el
tasas de transformación-sustrato específico reflejan diferencias
en la afinidad de la enzima por diferentes sustratos
(en mg l-1 C-1 h-1 OD
: Tolueno, 280; benceno, 178;
fluorobenceno, 127; clorobenceno, 159).
Como se muestra, la máxima velocidad de transformación específico para
tolueno con FLU100 en caso de concentraciones variables de
tolueno fue 280 mg l-1 C-1 h-1 OD y se mantuvo estable
con la disminución de las concentraciones de tolueno a 60 mg
tolueno · l-1
. De esta manera, un valor de Ks de 30 mg tolueno · l-1 podía
ser calculado.
Influencia del valor del pH en el comportamiento de la mineralización
de tolueno
La transformación de altas cantidades de tolueno, benceno o monohalogen
bencenos como sustratos únicos, así como en cualquier
mezcla, los sobrenadantes de cultivo y las células se tiñeron de FLU100
negro. Esto es debido a una polimerización dependiente del pH bien conocida
de (sustituido) catecoles tan pronto como que están siendo
acumulada. Por lo tanto, la tasa de escisión de catecoles es una
cuello de botella en la vía de degradación de estos compuestos aromáticos
impidiendo arriba-escala para aplicaciones a gran escala. La cantidad
de productos polimerizados fotométricamente fue analizado
reducida mediante la reducción del valor del pH del medio de cultivo
a partir de 7.15 a 5.0. En consecuencia, HPLC correspondiente
análisis mostraron un incremento en la concentración de
2-methylmuconate (Apoyo a la Información Fig. S1) como
así como un metabolito siendo desconocido con mayor lipofilia
de 3-metilcatecol. Obviamente, bajo este régimen,
mayores cantidades de metilcatecol podrían ser enzimáticamente
metabolizado sin sufrir autooxidación química.
Relaciones de captación de oxígeno-sustrato específico
Strain FLU100 degrada un amplio espectro de compuestos aromáticos,
favoreciendo una amplia aplicación en la biorremediación posible.
El potencial de oxidación de las enzimas iniciales se caracterizó
mediante la medición de las tasas específicas para la absorción de oxígeno
diferentes fuentes de carbono en dependencia de fluorobenceno,
tolueno y benceno como sustratos pre-cultivo, permitiendo
para juzgar el número de enzimas iniciales mediante el análisis de
las tasas de transformación máximas relativas. El correspondiente
Los resultados se muestran en la información de apoyo
Tablas S2 y S3. Todos los resultados están estandarizados para el tolueno
o catecol como 100%, respectivamente. Estos datos están dando
el resultado promedio de varios experimentos independientes
cada uno realizado por doble.
Con la excepción del valor de fluorobenceno en
fluorobenceno células cultivadas, las actividades específicas relativas
para cada sustrato fueron casi independiente de la precultivo
condiciones. Por lo tanto, la misma inicial oxigenasa
parece estar inducida independientemente de la naturaleza de
diferentes derivados de benceno. Como únicas actividades bajo posible
medirse con los derivados de fenol probados, así como
con alcohol bencílico y benzoato, la enzima inicial más
probablemente es una dioxigenasa oxidante directamente con el aromático
anillo. No hay actividad para la oxidación de la cadena lateral, que es una posible
, no se observó reacción en el caso de tolueno. Actualmente,
no tienen ninguna prueba para explicar la mayor actividad de fluorobenceno
después del crecimiento en fluorobenceno. La existencia de una especial
sistema de transporte para fluorobenceno en las células inducidas
por fluorobenceno es la explicación más probable.
En contraste con la dioxigenasa inicial, la absorción de oxígeno
los valores de las enzimas de escisión dependen fuertemente de catecol
el tipo de sustrato de crecimiento. La captación absoluta de oxígeno
de casi 2.100 U en el caso de las células pre-cultivan en
fluorobenceno era 10 veces mayor que el medido para
células tolueno y 20 veces mayor que la de las células crecidas con anterioridad
en benceno (ver información de apoyo Tabla S3).
Esto intensifica la expresión de la escisión catecol
enzimas en caso de fluorobenceno pueden reflejar y compensar
las actividades relativas más bajas para la escisión del anillo de
3-fluorocatechol con el fin de evitar su acumulación y
autooxidación.
En general, muconates se describen como inductores de
catecol vías de escisión orto (Feist y Hegeman,
1969). De acuerdo a la literatura, a 2 halomuconates son
inductores fuertes de la vía chlorocatechol modificado
de 2-methylmuconate o no sustituido muconate
(Reineke, 1998). Sin embargo, la comparación de la relación
actividades para muconates en células pre-cultivan en fluorobenceno
o tolueno, respectivamente, mostraron una alta similitud. En Por el contrario, se encontraron las células cultivadas en benceno a fuertemente
desviarse de este patrón, lo que indica la presencia de una
vía orto adicional, ser demasiado específico para tolerar
sustituyentes voluminosos en los sustratos. Por lo tanto, es tolueno
transformado principalmente por la vía orto modificado con
chlorocatechol-1,2-dioxigenasa como la enzima inicial, seguido
por una enzima de amplio especificidad como chloromuconate
cycloisomerase.
La prueba de la naturaleza de la enzima dioxigenasa inicial
acumulación de sus productos
La existencia de una enzima dioxigenasa inicial fue también
a prueba por un transposón mutante de la cepa FLU100, llamado
FLU100 P2R5 (Strunk, 2007), donde el transposón
se insertó dentro del elemento de benceno dihydrodioldehydrogenase
que codifica la secuencia del gen. Durante el volumen de negocios
de tolueno, la 3-metilciclohexa-3,5- correspondientes
dieno-1,2-diol acumulada en el sobrenadante. Esta
diendiol se puede volver a aromatizado también químicamente por el calor
tratamiento para 5 min en condiciones ácidas produciendo el
o-cresol correspondiente cuantitativamente. Para todos monohalogen
bencenos, tolueno y benceno, el correspondiente
diendiols se transformaron en compuestos fenólicos,
que fueron identificados y verificado por comercial
normas.
En segundo lugar, se produjeron las mismas estructuras diendiol
por Escherichia coli pST04, un análogo de la cepa
pSTE44, que contenía regulado operón lac un
dioxigenasa tetraclorobenceno. Esta cepa, así como
los productos de la transformación fue anteriormente descritos en
literatura con más detalle (Pollmann et al., 2003). Esta
establece claramente la naturaleza de 3-metilciclohexa-3,5-
dieno-1,2-diol para ser el director intermedia del
oxidación de tolueno en FLU100 después del crecimiento con
tolueno.
Por otra parte, el uso de FLU100 P2R5, hemos sido capaces de
producir y aislar estas estructuras diendiol para los seis
sustratos aromáticos (para estructuras diendiol de benceno,
tolueno y fluorobenceno, ver información de apoyo
Fig. S2) y, además, los utilizaron como sustratos en la conversión
experimentos. Se siguió el proceso de conversión
por análisis de HPLC. Durante la conversión de la
3-metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, por ejemplo, un temporal
acumulación de otros intermedios de tolueno
la degradación, a saber, 3-metilcatecol, 2-metil-cis, cismuconic
ácido, así como 2-ML se observó, de nuevo proponer
el camino del metabolismo de tolueno para seguir la ruta
para-halo benceno degradación hasta el nivel de metilo
lactona.
La tasa de conversión del compuesto en comparación diendiol
con tasas de conversión de 3-metilcatecol,
Ácido 2-methylmuconic y 2-ML era extremadamente alta. En
caso de 3-metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, casi
0,6 mmol l-1 del sustrato, equivalentes al 50% de la
concentración suministrado, se convirtió biológicamente a la
catecol correspondiente dentro de 5 min (Fig. 1). Porque
retrasos de HPLC análisis, la tasa de conversión de
diendiol entre la segunda y tercera mediciones
fue trasladado a la Tabla 1, que muestra la conversión absoluta
tarifas de todos los sustratos y productos intermedios relevantes para las células
pre-crecido en tolueno.
GRAFICAIdentificación de 3-metilcatecol y 2-metil-cis /
ácido como otros intermedios cis-mucónico del tolueno
vía de degradación
Catecoles correspondientes se formaron fuera de la
intermedios diendiol por deshidrogenación utilizando viable
las células (Fig. 1). La identificación se realizó utilizando una
cromatógrafo de gases con un espectrómetro de masas como detector
(GC-MS) y el análisis del concentrado orgánico
fase después de una extracción con acetato de etilo tres veces
así como la metilación de la fase orgánica con
diazometano. Para tolueno, 3-metilcatecol (antes
metilación) y 2-metoxi-3-metilfenol (después de
metilación) se identificaron mediante el uso disponible comercialmente
compuestos estándar (información de apoyo
Tabla S4).
Los catecoles de los seis sustratos se escindieron por una
orto vía escote y sin actividad de escisión meta
fue observado. Medición de la absoluta y relativa
actividades de conversión de células enteras, así como el crudo
extractos de FLU100 cepa mostraron un patrón de actividad
con una baja similitud con el patrón en la conversión
P. knackmussii B13 (Dorn y Knackmuß, 1978). En
Por el contrario, el patrón de actividad de FLU100 reveló alta
similitud con el patrón de actividad típico para chlorocatechol-
1,2-dioxigenasa de B13 readoptado por los autores
(Dobslaw, 2003).
A pesar de que la cepa FLU100 es capaz de metabolizar
4-sustituidos catecoles, el principal, casi exclusivamente
productos de transformación formados de los derivados del benceno
examinados en este estudio son los correspondientes
Catecoles 3-sustituido. Estos catecoles son más
escindido a los correspondientes (2-sustituido) cis-cismuconic
ácidos. Estos ácidos mucónico fueron identificados por
comparación de tiempos de retención y espectros de longitud de onda
con sustancias de referencia producidas por E. coli Klon 4,
llevar plásmido pBBRCI, a partir del correspondiente
catecoles. Este mutante expresó chlorocatechol-1,2-
dioxigenasa regulado por un operón lac y anteriormente fue
descrito (Pérez-Pantoja et. al, 2003).
La naturaleza intermedio de 2-en methylmuconolactone
la vía de degradación de tolueno de FLU100
Mientras 2-halogenados mucónico ácidos se pueden transformar
de trans-dienlactone durante la formación del anillo de lactona /
eliminación de haluro por muconate-cycloisomerases (ver
por ejemplo Vollmer et al., 1994; Vollmer y Schlömann,
1995; Reineke, 1998; Moiseeva et al., 2.002), 2-
ácido methylmuconic como intermedio de tolueno no puede ser
transformado de esta manera, debido a que el grupo metilo no es
grupo saliente en absoluto. Se observó que la cycloisomerase
transformado ácido 2-methylmuconic a
2-methylmuconolactone (2-ML), que era más mineralizado.
No había indicios de la existencia de un
exocíclico 5-methylmuconolactone, un posible producto de
cicloisomerización alternativa de ácido 2-methylmuconic.
En contraste con la cepa Pseudomonas sp. D7-4 (FranckMokross
y Schmidt, 1998; Taeger et al., 1988;) y
otras cepas obtenidas por el enriquecimiento, el 2-ML y
3-metilbenzoato de metilo (Taeger et al., 1988), que también eran
capaces de mineralizar 2-ML, cepa FLU100 fue capaz de crecer
en tolueno como única fuente de carbono y energía.
Sin embargo, la transformación de 3-metilcatecol por las células de
FLU100 tensión pre-cultiva en benceno o monohalogen
bencenos, casi el 55-65% de la prevista
3-metilcatecol acumula temporalmente como 2-ML.
Además transformación se observó después de una fase de latencia de
2-3 horas (Fig. 2). Por el contrario, no hay o sólo pequeñas concentraciones
de 2-ML acumulado en caso de tolueno-inducida /
células en crecimiento (Fig. 3). Esto significa que las enzimas clave para
degradación de 2-ML solamente fueron inducidos después de la adaptación
en tolueno, pero no en benceno o mono-halógeno
bencenos.
Para probar esta interpretación y para evitar la inducción de
nuevas enzimas, los mismos experimentos se realizaron después
adición de cloranfenicol (CAP) como un inhibidor de
síntesis de proteínas. Las células inducidas con benceno o monohalogen
bencenos mostraron concentraciones similares de
2-ML acumular en el sobrenadante en comparación con
células no inhibido. Sin embargo, ninguna otra transformación
GRAFICAaparecido, incluso después de una incubación prolongada (Fig. 2). En
Por el contrario, no se detectó acumulación de 2-ML cuando
células utilizadas fueron inducidos previamente con tolueno (Fig. 3).
En un segundo experimento, una solución acuosa de
2-ML fue producido por la transformación completa de
3-methycatechol por las células de FLU100 crecido en benceno,
seguido de la posterior separación de las células. El final
concentración de 2-ML se ajustó a aproximadamente 1,7 mmol l-1
.
Esta solución se dividió y se añade a dos cultivos líquidos de
FLU100 tensión pre-cultiva en tolueno. Una de estas culturas
se ha complementado con la PAC. Ambos cultivos
transformado 2-ML sin mostrar fase de latencia en la transformación
tasas de 0,35 mmol l-1 h-1 OD-1 (cultivo sin PAC) y
0,17 mmol l-1 h-1 OD-1 (con CAP), respectivamente. La transformación
tarifa sin CAP fue dos veces mayor, porque
la formación de nuevas enzimas era posible (Fig. 3). Los
resultados de ambos conceptos experimentales confirmaron la
inducción de enzimas que transforman 2-ML-específicas en caso
de las células de FLU100 tolueno-metabolizar.
2-ML como metabolito se identificó por HPLC-MS y
GC-MS análisis e identidad estaba a prueba por comparación
con los datos de Knackmuß y colegas (1976) y
Pieper y sus colegas (1985), dan en la Tabla 2.
Una ruta alternativa teórica para dioxigenación tolueno
en posición 3,4, es decir, en meta y posición para la formación
4-metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, 4-metilcatecol,
3-metil-cis, ácido cis-4-mucónico y ML como productos intermedios,
se encontró que era no productiva. Metabolismo de ácido 4-
metilcatecol, añadido a las células enteras de FLU100, conducir a
acumulación estequiométrica de 4-ML como un callejón sin salida
metabolito (datos no mostrados). 4-ML en sí, así como
Metil éster de 4-methylmuconolactone como producto de reacción
después de metilación fueron identificados por GC-MS análisis (ver
Tabla 2).
GRAFICAPara identificar otros intermedios de 2-ML degradación
vía, los análisis se realizaron mediante el uso de HPLCs con
un detector de dispersión de luz por evaporación (HPLC-ELSD) o
un espectrómetro de masas (HPLC-MS). Sin embargo, ni
metabolitos de degradación de 2-ML eran reproducible
identificación detectable ni de compuestos detectados era
posible. Succinato de 2-metilo como hipotética intermedia
de la vía de degradación 2-ML, sin embargo, se utilizó como
un sustrato en experimentos de conversión. Considerando que la referencia
succinato de sustrato se transformó sin
mostrar ninguna fase de latencia, metilo sustituido succinato era
no se convierte en absoluto por las células enteras de FLU100 (ver Apoyo
Tabla de Información S5). Por lo tanto, la revelación de la
completa vía de degradación aguas abajo del intermedio
2-ML no tuvo éxito. Conversión máxima
las tasas de los intermedios identificados de la degradación de tolueno
por FLU100 pre-crecido en tolueno se dan en la Tabla 1.
La vía de degradación de la correlación se muestra en la Fig. 4.
Observaciones finales
Cepa fungorum Burkholderia FLU100 demostró mineralizar
tolueno sola y simultáneamente en cualquier mezcla
con benceno y bencenos mono-halógeno, incluso incluyendo
fluorobenceno. El ataque inicial en todos estos sustratos
por una dioxigenasa atacar el anillo aromático
producido en el correspondiente 3-sustituido cyclohexa-
3,5-dien-1,2-dioles, que se metabolizan a través de una deshidrogenasa
a las correspondientes 3- (sustituidos) catecoles.
Estos catecoles se escindieron casi exclusivamente por un
chlorocatechol-1,2-dioxigenasa al ácido mucónico
derivados. Sobre la base de la falta de actividad de escisión meta,
tolueno se atípicamente escindido por esta enzima orto resultante
en la formación de ácido 2-methylmuconic, seguido de
2-metil-2-eno-lactona (2-ML) como los siguientes pasos. En contraste
a la literatura, este último intermedio no es un callejón sin salida
metabolito. La mayor degradación de 2-ML by hasta ahora
enzimas desconocidas, inducidas por el crecimiento con tolueno,
queda aún por esclarecer.
Procedimientos experimentales
Las condiciones de cultivo de FLU100 (tipo salvaje
y mutantes)
Wild tipo de FLU100 cepa se cultivó a 30 ° C en 500 ml
frascos de vidrio que contienen 200 ml de un medio de sal mineral previamente
descrito (Dobslaw, 2003). Cerca de 20 l de tolueno,
benceno o mono-halógenas bencenos se añadió directamente a
este medio y los matraces se incubaron durante 48-72 h. Después
añadiendo 10-15 l de sustrato, los cultivos se incubaron adicionalmente
durante la noche y se recogieron por centrifugación. El sedimento se
se resuspendieron en medio fresco.
El P2R5 mutante de FLU100 cepa se obtuvo a través de
transposón mutagénesis por apareamiento con el destinatario FLU100
la cepa donante de E. coli pCro2a (ONACA et al., 2007) y
proyección de casi 16 800 mutantes. El plásmido lleva una
gen de resistencia a ampicilina para la detección de falsos positivos,
mientras que la pieza de inserción Tn5 lleva un gen de resistencia a kanamicina
y una secuencia ori. Los mutantes se seleccionaron por difusión
las células en placas de medio minerales que contienen 10 mmol l-1
glucosa y 100 mg l-1 de kanamicina. Colonias crecido eran
transferido a cultivos líquidos (20 ml de volumen) con el mismo
medio. La acumulación de los productos intermedios de la degradación aromático
se comprobó mediante la adición de 10 l de tolueno u otro
compuesto aromático y 200 l de una solución de glucosa 1 M
después de 48 h. Formación de intermedios se verificó la siguiente
día a través de análisis por HPLC.
Para la cuantificación de las concentraciones de compuestos aromáticos restantes
en el medio líquido a través de la extracción y el análisis de CG posteriores,
mezclas de compuestos aromáticos se suministran en DMFA
con concentraciones finales de 2 a 3 mmol l-1 y compuestos aromáticos
0,25% DMFA en el medio de cultivo. Se realizó extracción
usando diclorometano.
En el caso de experimentos de absorción de oxígeno, el sedimento se
resuspendieron en medio mineral fresca y de cultivo se
se agita a 30 ° C durante la noche sin suministro de sustratos. Como
preparación, el cultivo se airea, muestras de 3 ml de
la suspensión se introdujeron en un agitador templado 30 ° C y
la captación de oxígeno se registró. Para la medición de la
la absorción de oxígeno-sustrato específico, 30 l de una solución de sustrato
(c = 0,1 mol L-1
) fue añadido.
En el caso de experimentos extracto crudo, el centrifugado
pellets de FLU100 cepa, P. knackmussii B13 o E. coli
Klon 4, se lavaron dos veces con solución salina y
re-suspendido en 15 ml de una solución tampón Tris (8 gl-1
Tris, pH 8,0). Las células fueron rotas por la liberación de presión en
dos o tres carreras en una celda de presión francesa con 10 000 psi.
El extracto se centrifugó durante 10 min a 14 000 rpm a 4 ° C
y el sobrenadante libre de células se almacenó en hielo. En la conversión
pruebas de catecoles, 100 l de extracto crudo se
añadió a 1 ml de tampón Tris pH 8,0, y 900 l de desionizada
de agua y 26 l de ácido etilendiaminotetraacético
(c = 0,1 mol L-1
) En unos 4 ml fusionados cubeta de sílice. Después de la aireación
durante 1 min, 20 l de la catecol probado (c = 0,1 mol L-1
)
se añadió y el cambio en la extinción a 260 nm era
determinar. En caso de alta rotación, las muestras fueron
medido por análisis de HPLC a 210 nm y 260 nm
longitudes de onda. La cuantificación de las tasas de conversión (mol
l
-1 Min-1 mg proteína-1
) Se realizó a través de la medición fotométrica
en ola de extinción máximo longitudes usando extinción
coeficientes dados por (Dorn y Knackmuß 1978). Los
concentración de proteínas se midió por el método de
Bradford.
Pruebas de conversión de catecoles en células enteras de la cepa
FLU100 se realizaron utilizando cultivos con densidades ópticas
de OD546nm = 1,5-2,5. Los cultivos se cultivan en primer lugar pre-en una
sustrato aromático, se centrifugó y resuspendió en nueva
medio mineral. Catecoles relevantes se añadieron en concentraciones finales
de 3 mmol l-1
. Las concentraciones de catecoles
y los intermedios correspondientes con el tiempo fueron observados por
HPLC análisis.
2-ML como se obtuvo sustrato para las pruebas de transformación a través de
conversión de 3-metilcatecol por células enteras de la cepa
FLU100 pre-crecido en benceno. Directamente después de transformación total
de 3-metilcatecol a 2-ML, mezclas de reacción se
centrifugó y el sobrenadante se utilizó directamente en la posterior
experimentos de conversión como solución de sustrato acuoso.
La solución puede ser almacenada a 4 ° C aproximadamente 1 semana. Evitar
la inducción de nuevas enzimas durante la transformación de 2-ML,
Se añadió la PAC como fármaco citostático (10 mg por 50 ml de reacción
volumen). Concentraciones reales de 2-ML en los matraces de reacción
se midieron por análisis de HPLC.
Las condiciones de cultivo de las cepas de E. coli
Todas las cepas de E. coli fueron pre-cultivan en medios de caldo lysogeny
que contiene 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de
cloruro de sodio por litro de agua desionizada. El medio se
en autoclave a 121 ° C durante 30 min. Con la excepción de la cepa
pCro2a, se añadieron 2,5 mmol l-1 de la lactosa. Para el cultivo de
pCro2a, 100 mg l-1 de ampicilina y 50 mg l-1 de kanamicina
fueron agregados. En el caso de E. coli Klon 4, 100 mg l-1 de kanamicina
y en caso de E. coli pST04, 100 mg l-1 de ampicilina y
Se añadieron 10 mmol l-1 de glucosa. Los cultivos se cultivaron
a 37 ° C durante la noche. Después, los gránulos de pST04 y
Klon 4 se recogieron y se resuspendieron en nuevas LB-media
con los aditivos correspondientes y adicional 0.25-
0,4 mmol l-1 IPTG y 5-10 mmol l-1 de sustrato aromático
(pST04) o 1 mmol l-1 de catecol (Klon 4). Después de 4 h, una significativa
de color azul apareció muestra la expresión del lacregulated
secuencias de genes. La producción de sustituido
ciclohexa-3,5-dieno-1,2-dioles se midió directamente por
HPLC analiza a 260 nm. Para la producción de ácidos mucónico,
Klon 4 se preparó análogamente como FLU100 para el crudo
mediciones de extracto.
Las condiciones de cultivo de las cepas de P. knackmussii B13
B13 cepa se cultivó a 30 ° C en un medio mineral
que contiene benzoato o 3-clorobenzoato como sustrato. Mientras
un catecol-1,2-dioxigenasa se indujo en caso de la
ex sustrato, un chlorocatechol-1,2-dioxigenasa era
inducida en el caso de este último sustrato. La preparación
fue similar a la de las mediciones de extracto crudo de
FLU100.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer con gratitud la
extremadamente valiosa contribución de DH Pieper, Helmholtz
Centro de Investigación de Infecciones en Braunschweig, para
Agradecimientos
Los autores desean reconocer con gratitud la
extremadamente valiosa contribución de DH Pieper, Helmholtz
Centro de Investigación de Infecciones en Braunschweig, para útiles
150 D. Dobslaw y K.-H. Engesser
© 2014 The Authors. Biotecnología Microbiana publicado por John Wiley & Sons Ltd y Sociedad para Microbiología Aplicada, Microbiana
Biotechnology, 8, 143-154
comentarios, así como el suministro de Escherichia coli pST04
y E. coli Klon 4. Un agradecimiento especial a J. Altenbuchner,
Instituto de Genética Industrial, Universidad de Stuttgart
la oferta de E. coli pCro2a. Finalmente agradecemos a P. Fischer,
Instituto de Química Orgánica de la Universidad de Stuttgart, por
GC-MS y HPLC-MS análisis.