LA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE LA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI DA HCV: STATO DELL’ARTEINFEZIONI DA HCV: STATO DELL’ARTE

M. M. CrovattoCrovatto

Prevalenza dell’infezione: 2% = 123 milioni di personeShepard C W, Finelli L, Alter M Global epidemiology of hepatitis C virus infection September. Lancet Infect. Dis. 2005; 5:558-67

Presented at CSF

• Test di screeningTest di screening

•• Test supplementare Test supplementare ImmunoblotImmunoblot

•• HCV RNA qualitativoHCV RNA qualitativo

•• HCV RNA quantitativoHCV RNA quantitativo

•• GenotipizzazioneGenotipizzazione

Presented at CSF

TEST QUANTITATIVI PER HCV RNATEST QUANTITATIVI PER HCV RNA

10 102 103 104 105 106 107 108 109 1010 UI/ml

Cobas Amplicor HCV Monitor

LCx HCV Assay

ABI 7000

Versant HCV RNA 3.0 Assay

Cobas TaqMan HCV

UI/ml

UI/ml

UI/ml

UI/ml

UI/ml

Presented at CSF

EVOLUZIONE TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE

PCRPCR

RealReal TimeTime

Presented at CSF

TestTest RangeRange dinamicodinamico SensibilitàSensibilità

HCVHCV 4343--69.000.000 69.000.000 UI/MLUI/ML 15 UI/ML15 UI/ML

Range dinamico e sensibilità tests eseguibili con Cobas TaqMan 48 e ABI 7000 (Real Time)

TestTest RangeRange dinamicodinamico

HCVHCV 1010--10.000.000 10.000.000 UI/MLUI/ML

ABI 7000

Ampliprep + CobasTaqMan 48

CobasTaqMan 48

Presented at CSF

AzioneAmpErase

™

Trascrizioneinversa

Analisi deidati & Calcoli

Estratto

Risultato

Denaturazione

Annealing

Estensione

PCR

Cicli PCR

Sequenza operativa

HCV

Preparazione automatizzata del campione (e QS) su COBAS Ampliprep (lisi, cattura del DNAconparticelle di vetro magnetizzate, eluizione)

Retrotrascrizione, Amplificazione e contemporanea rilevazione su Cobas Taqman 48, mediante segmentazione di una sonda oligonucleotidica specifica a doppia etichetta per il bersaglio ed una specifica per il QS (coloranti fluorescenti del reporter diversi)

Presented at CSF

Presented at CSF

AmpliLink 3.0.1 -Suggerimenti

Presented at CSF

COBAS COBAS AmpliprepAmpliprep (CAP)(CAP)

COBAS COBAS TaqManTaqMan 4848

STRUMENTAZIONISTRUMENTAZIONIPresented at CSF

Presented at CSF

y = 0,9556x + 0,11r = 0.92

p = 0,001

3,50

4,50

5,50

6,50

7,50

3,50 4,50 5,50 6,50 7,50

AMPLICOR HCV MONITOR LOG IU/ml

TaqM

an H

CV

LOG

IU/m

l

Presented at CSF

Genotipo HCV-Q Monitor

HCV-Q TaqMan

Differenza Log

2a/2c 4.4 x 105 4.37 x 104 12a/2c 4.1 x 103 1.20 x 104 0,5NT 7.7 x 105 2.04 x 105 0,63a 2.8 x 105 4.6 x 104 0,83a 4.9 x 106 2.6 x 106 0,3

2a/2c 1.2 x 105 9.2 x 104 0,53a 1.8 x 105 7.8 x 104 0,42 3 x 106 1.2 x 106 0,4

4c/4d 4.5 x 105 3.6 x 105 0,12a/2c 1.6 x 105 1.3 x 104 1,13a 4.4 x 105 4.9 x 104 1

4c/4d 5.1 x 104 2.4 x 104 0,32a/2c 2.24 x 104 3.36 x 104 0,2

2 1.86 x 103 4.23 x 103 0,4

Presented at CSF

Genotipo Amplicor TaqMan Diff. Log

2a 5.15 x 106 2.01 x 106 5150000 2010000 0,408611172

gen 4 3.86 x 106 1.09 x 106 3860000 1090000 0,549160807

2a 8.88 x 105 2.47 x 105 888000 247000 0,555716013

2a 8.74 x 104 8.6 x 104 87400 86000 0,007012981

4c 8.75 x 106 2.78 x 106 8750000 2780000 0,497963257

3a 2.02 x 107 2.28 x 107 20200000 22800000 -0,05258348

4c 8.84 x 105 4.14 x 105 884000 414000 0,329451924

2b + 3a 2.1 x 105 9.41 x 104 210000 94100 0,348629671

gen 4 2.08 x 106 9.73 x 105 2080000 973000 0,329950495

2b 4.32 x 106 1.52 x 106 4320000 1520000 0,453640159

3a 3.1 x 104 2.02 x 104 31600 20200 0,194335713

gen 2 1.2 x 106 7.88 x 105 1200000 788000 0,182655029

4a 2.36 x 104 1.11 x 104 23600 11100 0,327589024

gen 4 + gen1 4.8 x 104 3.55 x 104 48000 35500 0,131012884

3a 3.24 x 107 6.44 x 106 11000000 6440000 0,232506818

gen 4 3.9 x 105 2.31 x 105 390000 231000 0,227452627

1a 2.62 x 106 1.09x106 2620000 1090000 0,380874793

2a 4.05 x 106 9.84 x 105 4050000 984000 0,614459925

2c 3.1 x 104 2.66 x 104 31700 26600 0,076177626

Presented at CSF

Amplicor TaqMan Diff. Log

2.15 x 103 2.27 x 103 2150 2270 -0,0235874

4.49 x 103 2.91 x 103 4490 2910 0,188353352

4.92 x 106 2.04 x 106 4920000 2040000 0,382334935

8.78 x 104 1.61 x 105 87800 161000 -0,26333136

1.99 x 107 6.18 x 106 19900000 6180000 0,507864601

5.14 x 106 2.11 x 106 5140000 2110000 0,386680664

7.20 x 106 2.18 x 106 7200000 2180000 0,518876003

2.12 x 105 1.11 x 105 212000 111000 0,281012882

TL <15

TL TND

TL TND

TL <15

TL TND

TL TND

TL <15Presented at CSF

Simmonds P et al. Consensus Proposals for Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes.HEPATOLOGY2005; 42(4) : 962-973

Presented at CSF

Presented at CSF

Simmonds P et al. Consensus Proposals for Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes.HEPATOLOGY2005; 42(4) : 962-973

Differenza tra genotipi: 31-33%

Differenza tra sottotipi: 20-25%

Ricombinazione

In Russia è stata evidenziato un ricombinante contenente geni strutturali del genotipo 2k e geni non strutturali del genotipo 1b che si sta diffondendo rapidamente tra i tossicodipendenti

Ricombinanti 1a/1b descritti anche in Peru’

• Rilevamento della sequenza genomica completa del ricombinante da 3 o piu’ soggetti

• Ogni nuovo ricombinante deve avere i “breakpoints” nella stessa posizione in ciascuna sequenza

• Deve essere numerato sequenzialmente in ordine di scoperta con le lettere identificanti i sottotipi in ordine alfabetico: RF 01_1b2k

Presented at CSF

Definizione di un nuovo genotipo:

• Definizione provvisoria : richiede la sequenza della regione codificante completa, la dimostrazione della diversità rispetto agli altri genotipi mediante analisi filogenetica e l’assenza di ricombinazione

• Conferma definizione: richiede la sequenza della regione codificante di 2 o piu’ varianti da infezioni che non sono direttamente correlate epidemiologicamente

Presented at CSF

Definizione di un nuovo sottotipo:

• Definizione provvisoria : sequenza delle regioni core/E1 ed NS5B da 3 o piu ceppi provenienti da soggetti diversi

•Conferma definizione: sequenza completa di uno o più genomi

Presented at CSF

Nomenclatura genotipi di HCV: proposta modificaNomenclatura genotipi di HCV: proposta modificaNom. Attuale Nom. Proposta Ceppo Regione sequenziata

Genotipo 2

2j 2k RU169 NS5B,3’UTR

2l 2j BA047 NS5B,3’UTR

2e 2n NL50 C/E1,NS5B

4f/2f 2o FR4 C/E1,NS5B

f 2p NL33 C/E1,NS5B

2k 2q BA045 NS5b,3’UTR

Genotipo 3

10a 3k HPCJK049E1 Genoma completo

Genotipo 4

4a 4r Z4 C/E1

4 alfa 4n 1359 C/E1

4 beta 4o 2153 C/E1,NS5B

Genotipo 6

7d 6c Th846 C/E1,NS5B

7b 6d VN235 Genoma completo

7a 6e VN540 C/E1,NS5B

7e 6f BB7 NS5B

7c 6f Th271 C/E1,NS5B

11a 6g HPCJK046E Genoma completo

9a 6h VN004 Genoma completo

9b 6i Th555 C/E1,NS5B

9c 6j Th553 C/E1,NS5B

8b 6k VN405 Genoma completo

8a 6l VN507 C/E1

Simmonds P. et al. Hepatology, October 2005:962-973

Differenza tra i genotipi a Differenza tra i genotipi a livello livello nucleotidiconucleotidico: :

31% 31% -- 33%33%Differenza tra i sottotipi:Differenza tra i sottotipi:

20% 20% -- 25%25%

Presented at CSF

Nuova classificazione propostaNuova classificazione propostaGenotipo 1Sottotipi:

1a,1b,1c,1d,1e,1f,1g,1h,1i,1j,1k,1l

Genotipo 2Sottotipi:

2a,2b,2c,2d,2e,2f,2g,2h,2i,2j,2k,2l,2m,2n,2o,2p,2q

Genotipo 3Sottotipi:

3a,3b,3c,3d,3e,3f,3g,3h,3i,3k

Genotipo 4Sottotipi:

4a,4b,4c,4d,4e,4f,4g,4h,4i,4j,4k,4l,4m,4n,4o,4p,4q,4r,4t

Genotipo 6Sottotipi:

6a,6b,6c,6d,6e,6f,6g,6h,6i,6j,6k,6l,6m,6n,6o,6p,6q

Genotipo 5Sottotipi:

5a

Simmonds P. et al. Hepatology, October 2005:962-973

Presented at CSF

Regione strutturale Regione non strutturale

ORF (9379-9431 nt)

Precursore della poliproteina

traduzione

Modificazioni co- e post-traduzionali

Signalasi cellulari dell’ospite

Proteinasi NS2-NS3 Zn-dipendentedell’HCV Proteinasi serinica dell’HCV NS3

C

Core

E1

Glicoproteinedell’envelope

E2 p7

Viroporina

NS2

Proteinasi

Zn-dipendente

Proteinasiserina-dipendenteElicasiNTPasi

NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B

3’NC

Ancoraggio alla membrana

Proteina regolatrice dell’RNA polimerasi

RNA polimerasi RNA-dipendente

Cofattore di NS3

5’NC (IRES)

Presented at CSF

Genotipizzazione mediante Ibridizzazione Inversa

Presented at CSF

INNOLIPA HCVPresented at CSF

0

100

200

300

400

500

600

NUM

ERO

GEN

1

GEN

2

GEN

4

1a 1b 2a/2c

2b 3a 4c/4d

5a CO

INF

NO

N TIP

GENOTIPI

FREQUENZA GENOTIPI 2000-2004

GEN 1GEN 1 2222

GEN 2GEN 2 1616

GEN 4GEN 4 1919

1a1a 5757

1b1b 522522

2a/2c2a/2c 332332

2b2b 44

3a3a 176176

4c/4d4c/4d 2121

5a5a 22

COINFCOINF 1313

NON TIPNON TIP 66

Presented at CSF

Richieste ripetute di genotipizzazione (2000-2004):

2x 131

3x 19

4x 7 Media: 17 mesi Range 1-59

5x 1

6x 7

8x 1

Tot. 166=236 test

Il genotipo è risultato sempre lo stessoIl genotipo è risultato sempre lo stesso

Presented at CSF

Genotipizzazione mediante sequenziamento

Presented at CSF

Cy5.5

Cy5

Core

5’NC5’NC

EnvelopeGlicoproteine

RNAPolimerasi

3’NC

La regione sequenziata dell’HCV-RNA è la 5’ NC ( 186 basi )

TRUGENETM HCV 5’NC KIT

C NS2E2 NS3E1 NS4 NS5A NS5B

ProteasiElicasi

Metalloproteasi

Viral RNA (9400 nucleotides)Viral RNA (9400 nucleotides)

HCV-RNA Virale (9400 nucleotidi)

Presented at CSF

Presented at CSF

GT

CA

Micro

Cel™

Cas

sett

e

G

T

Laser

Filters

Excitation

of Cyanine DyesPhotomultiplier

Tubes

B. C

hanz

y, C

H A

nnec

y, 2

000

Presented at CSF

ImageLenses

ObjectLenses

Filters

Laser

Gel

PhotodetectorCy5.5Photo

detectorCy5

ImageLenses

OpenGeneOpenGene™ ™ SystemSystem OpticalOptical ArrayArray

Cy5.5

Presented at CSF

ImageLenses

ObjectLenses

Filters

Laser

Gel

PhotodetectorCy5.5Photo

detectorCy5

ImageLenses

OpenGeneOpenGene™ ™ SystemSystem OpticalOptical ArrayArray

Cy5

Presented at CSF

Correlazione con un cromatogramma

N

N

Presented at CSF

Allineamento e Chiamata delle BasiA C G T

Presented at CSF

Presented at CSF

Presented at CSF

Presented at CSF

Campioni Reattività InnoLipa

Genotipo Sequenziamento

CQ NeQas7531 3,4,6 1b 1b

HCV 05-01 NeQas 3,4,6,13,14,15 1b + 3a 1b

HCV 05-02 NeQas 13,14,15 3a 3a

HCV 05-03 NeQas 13,14,15 3a 3a

HCV 05-04 NeQas 3,4,6 1b 1b

HCV 05-05 NeQas 6,19,20 5a 5a

HCV 05-07 NeQas 6,13,14,15 3a+5a 3a+5a

HCV 05-08 NeQas 3,4,5 1a 1a

Presented at CSF

CONFRONTO InnoLipa-Sequenziamento su 90 90 campioni

Per 82 (91,1%)82 (91,1%) i genotipi sono risultati concordanti

5 (5,6%)5 (5,6%) campioni non tipizzabili con il test InnoLipasono stati tipizzati mediante sequenziamento

In 3 (3,3%)3 (3,3%) casi il test InnoLipa ha evidenziato la presenza di coinfezione mentre il sequenziamento ha rilevato un genotipo unico

Presented at CSF

1 1a 1b 2 2a 2b 2c 3a 4 4a 4c

1 1 3 3

1a 4

1b 4 19

2 4 1

2a/2c 1 16 1

2b 1

3a 15

4 3 1 1

4c/4d 1 3

SEQUENZIAMENTOSEQUENZIAMENTOIn

noLipa

Presented at CSF

Risultati ottenuti mediante sequenziamento di una porzione della regione 5’UTR di ceppi provenienti

da soggetti con doppia infezione con il test InnoLipa

2b + 3a 3a

1b + gen 4 gen 1

2a/2c + 4c 2a

SequenziamentoIn

noLipa

Presented at CSF

Pattern di reattività con il test di ibridizzazione inversa

Sequenziamento

6 6 1b1b

3,6,93,6,9 1b1b

6,9,10,116,9,10,11 2a2a

6,9,10,116,9,10,11 2a2a

5,6,16,17,185,6,16,17,18 GenGen 44

Risultati ottenuti mediante sequenziamento di una porzione della regione 5’UTR di ceppi con

reattività non interpretabili secondo il test InnoLipa

Presented at CSF

Zhang W. et al Mol. Diagn. 2005;9(2):81-7

Test di screening e conferma : Preparazione e valutazione di un chip per rilevare simultaneamente anticorpi anti-HCV diversi (anti-core, NS3,NS4 ed NS5): evidenziate sensibilità e specificità elevate maggiori del test ELISA ed elevata concordanza con il RIBA

Evoluzione………..Evoluzione………..

Presented at CSF

Genotipizzazione:• Sequenziamento contemporaneo di altre regioni

Laperche S. et al J Clin Microbiol 2005;43(2): 733-739

• TaqMan Real-TimeRolfe K.J. et al J Clin Virol 2005;34:115-121

Evoluzione………..Evoluzione………..

• Pyrosequencing

Elahi E. et al J Virol Meth 2003;109: 171-176

• Spettrometria di massaKim YJ et al Clin Chem 2005;51:1123-1131Cook L. et al Clin Chem 2005;51.1091-1092

Presented at CSF