La Génomique���Biologie, informatique, évolution

Hugues Roest Crollius hrc@ens.fr

Dyogen Group

L3 – Introduction aux sciences du vivant – 03.12.2013

La « génomique fonctionnelle »

La « génomique évolutive » TAATGGTACCAGTTAGCAGAGT…

CCATGGTTCCCGTAGCCAGAGT…

TAATGGTACCGGTTAACAGAGT…

TTATGGTACCTGTTAACAGAGT…

CGATGGTGCCGGTCGACAGAGC… CTATGGTCCCTGTTATCAGAGC… GTATGGTCCCTGTCGTCAGAGC… CCATGGTTCCCGTAGCCAGAGT…

human baboon mouse dog cat cow pig chicken

human

mouse

rat

dog

Applied Biosystems 3730 (ici au Broad Institute (USA))

1 Mb / jour

1990 2008

La production des données de génomique

2013

Illumina MySeq2500 Capable de re-séquencer 1 génome humain / jour

(40X; 135 Gb)

Séquençage manuel par radioactivité

100 b / jour

La production des données de séquençage

326 millions 686 milliards

1990 91 92 93 94 95 96 97 98 99 2000 01 02 03 04 05 06 07 08 09

Cartographie génétique

Cartographie physique

Human Genome Project (HGP)

Projet Celera

Projet HapMap

Séquençage très haut débit

J.C. Venter

Aujourdhui l’information issue du génome humain et du génome d’espèces modèles nous permet de mieux comprendre certains processus biologiques Bientôt, l’information issue de milliers de génomes humains, intégrée à des données épidémiologiques et de structure de la population, seront la base d’une nouvelle médecine « personnalisée ».

Bactérie Levure Nématode Drosophile Humain Souris Poule Chimpanzee

Whole genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenza Rd

Fleischmann et al. (1995) Science 269:496-512!

•  Preuve par l’exemple: assembler un génome à partir d’un séquençage aléatoire est possible (14 pages /17)!

•  1,830,137 bases!•  38% GC!•  6 opérons ARNr!•  Origine de réplication trouvée!•  1743 gènes annotés!•  736 gènes sans rôle assigné!•  ~50% des protéines connues de E. coli n’ont pas de similarité !

•  Quelques conclusions biologiques générales: !

•  voies métaboliques absentes et présentes!•  gènes de pathogénicité!

Life with 6000 genes

•  1er génome eucaryote séquencé!

•  600 chercheurs, 100 laboratoires, le plus grand projet décentralisé de la biologie moléculaire !!!•  Seules 43,3 % des protéines ont une fonction connue ou « suggérée »!

•  Beaucoup de régions du génome sont dupliquées!

•  Tous les gènes d’histones sont présents (dont H1)!

Science (1996) Vol. 274: 546 - 567

(Saccharomyces cerevisae)!

Conséquences politiques!!•  Un génome eucaryote complexe peut-être séquencé. !•  le projet a révélé l’importance de la bioinformatique (AceDB, GeneFinder)!•  Un modèle de projet « ouvert »: accès libre au matériel et aux données!

Résultats scientifiques!!•  19099 gènes, trois fois plus que la levure!•  La densité en gène est plus importante près des centromères (sauf sur le X)!•  Les éléments répétés sont plus nombreux vers les télomères!•  Les extrémités des chromosomes seraient des régions à évolution plus rapide!•  32 % des protéines de C. elegans sont similaires à des protéines humaines, 70% des protéines humaines sont similaires à celles de C. elegans !

Genome Sequence of the Nematode C. elegans: A Platform for Investigating Biology Science (1998) vol. 282: 2012-2018.

Initial sequence of the chimpanzee genome and comparison with the human genome Nature (2005) vol 439:69-87!

•  1,23 % de divergence nucléotidique avec l’espèce humaine sous forme de SNPs, dont 1,06% fixé au cours de l’évolution (ce qui fait ~ 30 millions de bases). !

•  1,5 % de la séquence euchromatique de chaque espèce lui est spécifique (insertions ou délétions; ~45 Mb)!

•  29% des protéines sont identiques entre les 2 espèces, la plupart des autres ne divergent que par 2 acides aminés!

•  Les protéines de la réponse immunitaire, de la reproduction et de l’olfaction divergent plus vite que les autres!

•  De nombreuses «pépites  » sur les gènes spécifiques à l’espèce humaine (éliminé du chimpanzé) ou vice-versa, parfois en liaison avec des maladies humaines. Certaines mutations humaines causant des maladies sont en fait l’allèle sauvage «  ancestral  » (ex: predisposition au diabète de type 2)!

Le génome Humain

~

Tout un symbole

Un symbole de l’opposition « privé - public »!!•  Celera (Craig Venter)!!•  Human Genome Project (F. Collins, R. Waterston, J. Sulston, P. Green!!

!Opposition !! !- sur les finalités!! !- l’accès aux données!! !- la stratégie!

Un symbole de la médiatisation de la science!!•  Course à la (aux) publication(s)!

•  battage médiatique intense!

•  Reconnaissance par le monde politique!

La variabilité génétique

« La » séquence du génome humain disponible dans les bases de données représente en réalité un génome fictif: il s’agit d’un assemblage de l’ADN obtenus de plusieurs individus. Cette séquence ne contient pas de variabilité (polymorphisme allélique). Cette séquence est conventionnellement utilisée comme référence.

Mais la population humaine est composée de > 6 milliards d’individus, chacun avec un génome qui lui est unique. En plus des influences de l’environnement, cette variabilité entre individus est l’un des déterminants majeurs de la morphologie, des propriétés physiologique, du comportement, de la santé des individus. Comment se manifeste cette variabilité génétique?

A haplotype map of the human genome Nature (2005) vol 437:1299-1320!

•  Nous ignorons encore les causes génétiques de la plupart des maladies humaines: troubles maniaco-depressifs, réponses aux anti-hypertensenseurs, etc…!

•  Nous savons que probabement la moitié des facteurs de risques à la racine de ces maux sont d’origine génétique. !

•  1 007 329 SNPs ont été testés dans 269 individus appartenant à 4 groupes:!•  population des Yoruba (Ibadan) au Niger!•  familles du CEPH (Utah, USA)!•  population chinoise (Han) de Beijing!•  population japonaise de Tokyo !

A haplotype map of the human genome Nature (2005) vol 437:1299-1320!

Quelques surprises:!!La plupart des variants dans la population sont rares: !

!- 46 % des SNPs ont une fréquence d’allèle minoritaire (FAM) < 0.05!!- 9% ne sont vus que dans un seul individu. !

!La plupart des variants sont largement partagés!

!- 90% des variants observés dans un individu sont des SNPs ! « communs » !

Des confirmations:!!Les échantillons ne sont pas homogènes!

!- la population du Niger est plus riche en SNPs de faible fréquence!!!

Mais nous sommes bien de la même espèce :-)!!- seulement 16 SNPs sur 1 million sont « fixés » dans une population par !

rapport aux autres!!!

Séquençage par synthèse (SBS)

Le séquençage des génomes

Il  a  fallu  créer  une  nouvelle  division  dans  les  bases  de  données:  Short  Read  Archives  (SRA)  

4,5  trillions   573  trillions  

Le séquençage des génomes

La  séquence  d’un  génome  est  donc  une  succession  de  conDgs  organisés  en  scaffolds.  Selon  le  degré  de  finiDon,  les  scaffolds  peuvent  être  ancrés  sur  une  carte  généDque,  ordonnés  et  orientés,  et  les  trous  de  séquence  entre  les  conDgs  et  scaffolds  peuvent  être  bouchés.    

Les  génomes  eucaryotes  séquencé  à  très  haut  niveau  de  qualité  (<  1.106  erreurs/base)    Saccharomyces  cerevisiae   Levure  de  boulanger  

Caenorhabdi2s  elegans   Ver  nématode  

Drosophila  melanogaster   Mouche  à  vinaigre  

Arabidopsis  thaliana   ArabeTe  

Homo  sapiens   Humain  

Mus  musculus   Souris  

Danio  rerio   Poisson  zèbre  

Le séquençage des génomes

Le  «  N50  »,  une  mesure  devenue  classique  pour  évaluer  la  conDnuité  d’un  assemblage.      Le  N50  est  la  taille  du  scaffold  (ou  conDg)  tel  que  50%  des  bases  de  l’assemblage  sont  comprises  dans  des  scaffolds  de  taille  supérieures  à  ceTe  taille.    

La taille du segment (scaffold) telle que la moitié de la somme des bases de tous les segments (assemblage) soit compris dans des segments de taille supérieure.

N50 Scaffolds  de  l’assemblage  

Trier par taille

50%  des  bases  50%  des  bases  

Le génome humain en 2013

Un génome à l’état de « brouillon »

Le  génome  du  cheval  (Equus  caballus)  L’assemblage  actuel  (2013)  est  la  version  version  EquCab2,  obtenu  par  la  technique  Whole  Genome  Shotgun  (WGS)  avec  une  couverture  de  6.79x  en  lecture  «  Sanger  ».  Une  jument  appelée  "Twilight"  fut  sélecDonnée  pour  obtenir  le  génome  référence  de  l’espèce.  Le  projet  fut  coordonné  et  le  génome  séquencé  par  Le  Broad  InsDtute  (USA).    La  taille  N50  des  conDgs  est  de  112.38  kb,  et  la  somme  totale  des  conDgs  est  de  2.43  Gb.  En  incluant  la  taille  esDmé  des  trou  entre  les  conDgs  dans  les  scaffolds,  l’assemblage  couvre  2.68  Gb.    

Un génome à l’état de « brouillon »

Platyfish  (Xiphophorus  maculatus)  

L’assemblage  (version  XipMac4.4.2)  a  été  produit  par  The  Genome  InsDtute,  Washington  University  School  of  Medicine  (USA).  Cet  assemblage  a  été  réalisé  par  whole  genome  shotgun  à  parDr  de  séquences  produites  par  la  technologie  “454”  et  Illumina,  pour  une  couverture  totale  du  génome  de  ~19.6X.  

Le  séquençage  du  génome  humain  

Après  le  séquençage,  la  première  étape  de  «  valorisaDon  »  de  la  séquence  est  d’y  idenDfier  (annoter)  les  régions  foncDonnelles,  principalement  les  gènes  codant  les  protéines.        Chaque  génome  eucaryote  conDent  des  milliers  de  gènes.  On  ne  peut  pas  envisager  de  faire  une  «  expérience  »  pour  idenDfier  chaque  gène:  il  faut  recourir  à  des  logiciels  pour  réaliser  une  annotaDon  automaDque,  ou  à  des  ressources  génomiques.        Annoter  les  gènes  automaDquement  est  une  tâche  difficile  et  un  champs  encore  très  «  ouvert  »  de  la  bioinformaDque.  Dans  les  génomes  eucaryotes,  les  gènes  ont  des  structures  extrêmement  variables:  il  difficile  d’établir  des  «  règles  ».    

Les  gènes  ….  

25  

Chr. 20 Chr. 21 Chr. 22

Taille chromosome 59,42 Mb 33,54 Mb 33,46 Mb

Gènes connus 335 127 270 Autres 392 98 298

Pseudogènes 168 (18,7%) 59 (20,7%) 134 (19,1%) Densité en gènes 12,2 g./Mb 6,7 g./Mb 17,0 g./Mb

Tailles des gènes

Connus 51,3 kb 57,0 kb 1 ↔ 593 kb Pseudogènes 1,9 kb

Taille des exons

Connus 294 bp 8 ↔ 7600 bp Pseudogènes 499 bp

Nombre d’exons

Connus 10,3 Pseudogènes 1,4

Combien(y(a(t,il(de(gènes(dans(le(génome(humain?(Premières(estimations((année(2000)(((

40000   20000   50000  

EsDmaDons  du  nombre  de  gènes  dans  le  génome  

92   93   94   95   96   97   98   99   00   01   02   03   04   05   06  

20  000  

40  000  

160  000  

140  000  

120  000  

100  000  

80  000  

60  000  

(Antequera  and  Bird)  

(Fields  et  al.)  

(Roest  Crollius  et  al.)  

(Lander  et  al.)  

EsDmaDons  publiées  

(Ewing  and  Green  et  al.)  (Liang  et  al.)  

27  

BLAST

Altschul et al. (1990) Basic Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol. 215:403-410

Nombre total de citations : 36103 (en novembre 2013) L’article le plus cité en sciences du vivant  

28  

Query: SPWTFPS*FLMSSSMKVPSWSRISSPM*GIL*STVSSST SPWTFPS* L+SSS+KV S S SSPM*GIL T SSST Sbjct: SPWTFPS*LLISSSIKVSSSSFTSSPM*GILHKTXSSST

Query: LLFQLFLALSDLKQLRILHTDLKPDNVMLVD--EKELKIKLMDFGLALLTHEAKT--GTI +L Q+ AL LK L ++H DLKP+N+MLVD + ++K++DFG A +H +KT T Sbjct: ILQQVATALKKLKSLGLIHADLKPENIMLVDPVRQPYRVKVIDFGSA--SHVSKTVCSTY

Query: VNALAQYSHNEDEEEEEEHDFKVDKT-DLCDSKKHPE VNAL QY+ ++D+++ ++ + + +K DL D + E Sbjct: VNALGQYNDDDDDDDGDDPEEREEKQKDLEDHRDDKE

Query: RYKELTEQQMPGALPPECTPNMDGPHARSVRREQSLHSFHTLFCRRCFKYDRFLH +YKELTEQQ+PGALPPECTPN+DGP+A+SV+REQSLHSFHTLFCRRCFKYD FLH Sbjct: KYKELTEQQLPGALPPECTPNIDGPNAKSVQREQSLHSFHTLFCRRCFKYDCFLH

29  

BLAST  

A T T G C G T A T G C A G C G T A G C A A T T G C G A T A C!

T T A C G C G A T G T A G A C A G C G T A G C A A T G T T G C A!

Match  exact  

Query  

Subject  

“mot”  de  taille  W  =  11  bases  

30  

A T T G C G T A T G C A G C G T A G C A A T T G C G A T A C!

T T A C G C G A T G T A G A C A G C G T A G C A A T G T T G C A!

Blast:  

Query  

Subject  

T A T G C A G C G T A G C A A T!

Matrice de score NUC.4.4

A T G C N!A 5 -4 -4 -4 -2!T -4 5 -4 -4 -2!G -4 -4 5 -4 -2!C -4 -4 -4 5 -2!N -2 -2 -2 -2 -1!

+5-4-4+5!

- 8 < X!

                 X  =  seuil  maximal  de  mismatch  autorisé            =  21  par  défaut  

W

31  

Mot  “W”  =  3  a.  a.    

(Seuil    “X”)  

(Seuil  “T”)  

L E C N Q L I P I A H K T C P E G K N L

H K T!H L T!H V T!H Y T!Y K T!N K T!

L K C H N T Q L P F I Y K T C P E G K N

Extension  

Automate  

TBLASTX,  BLASTP,  BLASTX  

32  

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X * A 4 -1 -2 -2 0 -1 -1 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 0 -3 -2 0 -2 -1 0 -4 R -1 5 0 -2 -3 1 0 -2 0 -3 -2 2 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 -1 0 -1 -4 N -2 0 6 1 -3 0 0 0 1 -3 -3 0 -2 -3 -2 1 0 -4 -2 -3 3 0 -1 -4 D -2 -2 1 6 -3 0 2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -1 -4 C 0 -3 -3 -3 9 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 -3 -3 -2 -4 Q -1 1 0 0 -3 5 2 -2 0 -3 -2 1 0 -3 -1 0 -1 -2 -1 -2 0 3 -1 -4 E -1 0 0 2 -4 2 5 -2 0 -3 -3 1 -2 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -1 -4 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2 0 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -1 -4 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 -3 -3 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -2 2 -3 0 0 -1 -4 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 2 -3 1 0 -3 -2 -1 -3 -1 3 -3 -3 -1 -4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 -2 2 0 -3 -2 -1 -2 -1 1 -4 -3 -1 -4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 0 1 -1 -4 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 0 -2 -1 -1 -1 -1 1 -3 -1 -1 -4 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 -4 -2 -2 1 3 -1 -3 -3 -1 -4 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 -1 -1 -4 -3 -2 -2 -1 -2 -4 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 1 -3 -2 -2 0 0 0 -4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 -2 -2 0 -1 -1 0 -4 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 2 -3 -4 -3 -2 -4 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 -1 -3 -2 -1 -4 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4 -3 -2 -1 -4 B -2 -1 3 4 -3 0 1 -1 0 -3 -4 0 -3 -3 -2 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -1 -4 Z -1 0 0 1 -3 3 4 -2 0 -3 -3 1 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -1 -4 X 0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -2 0 0 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -4 * -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 1

Matrice de score BLOSUM62

33

Levure 6000 Drosophile 13600 Humain 25000

Nematode 19000

Arabidopsis 25000

Nombre de gènes dans les génomes eucaryotes

34

EVOLUTION  MOLECULAIRE    

Quelques  principes  

MutaDon  

Dérive  généDque  

SélecDon    posiDve  

SélecDon    négaDve  

FixaDon  100%  

Avantageuse  Neutre  Délétère  

DispariDon  0%  

Fréquence  Intermédiaire  

0-­‐100%  

Evolution moléculaire

Les fréquences des variations au sein d’une population fluctuent au cours du temps.

P

0

1

Générations (temps)

Pour estimer les fréquences dans une population, il faut échantillonner de nombreux individus

Les variations AVANTAGEUSES sont sélectionnées et augmentent en fréquence Les variations DELETERES sont éliminées et diminuent en fréquence

Les variations NEUTRES fluctuent de manière aléatoire

La sélection naturelle

Cys Ser Arg Cys Lys Gly His Cys Arg Ala Arg!TGT TCG AGA TGT AAG GGC CAT TGT CGA GCA AGA!!!!Cys Leu Arg Cys Lys Arg His Cys Arg Ala Lys!TGT TTG AGA TGT AAA CGC CAT TGT AGA GCT AAA!!!!

Observé Attendu neutre Substitutions synonymes 3 Substitutions non-synonymes 3 ~3 X 4 = 12 è 75% des

mutations sont délétères

dS: taux de substitution synonyme (Ks) dN: taux de substitution non-synonymes (Ka) ω = dN / dS ω ~ 1 è ω << 1 è evolution sous sélection négative ω >> 1 è evolution sous sélection positive

Fréquence des valeurs de ω pour 835 paires de gènes orthologues rat-souris (les valeurs indiquées en abscisse sont la moyenne de la classe)

Hurst DL (2002) TIGS 18:486-487

Génomique Comparative

L’alignement multiple entre génome est un outil fondamental pour identifier des régions conservées au cours de l’évolution (par sélection négative)

UCSC Genome Browser : http://genome.ucsc.edu/ Une région de 100 pb sur Xq26:

Tous les mammifères possèdent à peu près le même nombre de gènes, et partagent les mêmes grandes fonctions de la vie

- reproduction - développement - système nerveux central - système digestif - système musculaire - ….

On estime que les gènes présents dans le génome de la souris ou du chien peuvent être informatifs pour identifier les gènes humains (ou vice-versa) simplement par alignement de séquence. Généralisation: Toutes les informations importantes contenues dans le génome (codage des protéines et autres…) sont susceptibles d’êtres partagées entre espèces différentes et donc d’être découvertes par alignement de séquences.

Génomique  ComparaDve:  Annoter  les  Gènes  

Génomique Comparative (5)

Les séquences fonctionnelles les mieux connues dans le génome humain sont les exons des gènes codant les protéines. On peut les comparer par paires, mais les comparer toutes ensemble est plus informatif, à l’aide d’un alignement multiple

Les exons codant sont particulièrement ben conservés, à travers l’ensemble des vertébrés (sélection négative). Les régions « UTRs » évoluent plus vite. Les introns ne montrent pas de conservation particulière (évolution neutre) Les espèces trop proches de l’homme sont peu informatives (ex: Macaque)

Migration, adaptation et selection naturelle

Les variations génétiques qui confèrent un avantage pour une meilleure adaptation seront sélectionnés

Mutation avantageuse

Different types de sélection naturelle

Mutation neutre Mutation délétère mutation “balancée”

SELECTION POSITIVE

Ex. G6PD, CD40 protection contre la malaria en Afrique

SELECTION BALANCEE

Ex. MHC worldwide, HbS en Afrique (malaria)

SELECTION PURIFICATRICE

Ex. Beaucoup de gènes humain

La cas de la lactase

La plupart des adultes ne peuvent métaboliser le lactose, sucre principal du lait, car la fonction de l’enzyme lactase-phlorizin hydrolase diminue après le sevrage. Mais certaines population, principalement celles descendantes de population ayant pratiqué la domestication du bétail, maintiennent cette possibilité à l’âge adulte. Fréquences de la « persistance de la lactase »

> 90% chez les suédois et les danois ~ 50% chez les français et les espagnols 5% - 20% chez les africains de l’ouest « non-pastoraux » 1 % chez les chinois

Mais 90% chez les Tutsis, Fulani, … populations africaines « pastorales ». Certains SNPs ont été retrouvés dans les introns d’un gènes voisin de la lactase, et sont associé au phénotype « persistance de la lactase »

Distribution du phénotype « persistance de la lactase » dans le monde

La cas de la lactase

La cas de la lactase

Intron 13

Danois et Suédois

Europe du sud S. A. Tishkoff et al., Convergent adaptation of human lactase persistence in Africa and Europe. Nature genetics 39, 31 (2007).

La cas de la lactase

Danois et Suédois

Europe du sud

Afrique

S. A. Tishkoff et al., Convergent adaptation of human lactase persistence in Africa and Europe. Nature genetics 39, 31 (2007).

La cas de la lactase

Conclusions: Les mutations de la lactase sont un cas classique d’évolution convergente:

le même phénotype est sélectionné de manière indépendante dans des populations différentes, mais pas par le biais du même génotype.

Les mutations favorables sont dans les introns d’un gènes voisin du gène dont la protéine confère l’avantage Les mutations augmentent la production de lactase au cours de la vie adulte (modification de l’expression du gène)