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Eduardo L. Ramos, Susana Ravelo, Enrique Muñoz, Carlos Pérez

La trehalosa. Parte I: su presencia en la caña de azúcar

ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. XLIII, núm. 2, mayo-agosto, 2009, pp. 37-41,

Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar

Cuba

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ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de

Azúcar,

ISSN (Versión impresa): 0138-6204

revista@icidca.edu.cu

Instituto Cubano de Investigaciones de los

Derivados de la Caña de Azúcar

Cuba

www.redalyc.orgProyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

ICIDCA No. 2, 2009 37

Eduardo L. Ramos1, Susana Ravelo1, Enrique Muñoz2 y Carlos Pérez3

1. Instituto Cubano de Investigaciones Azucareras (ICINAZ), MINAZ e.mail: ramguira@yahoo.com

2. Instituto FINLAY 3. Facultad de Química, Universidad de La Habana

RESUMEN

Varios de los problemas que se presentan al tratar de elevar la eficiencia industrialdurante la producción de azúcar, están asociados fundamentalmente a la capacidad dela caña para formar en sus jugos la sacarosa y sus monosacáridos constituyentes. Se hadeterminado que luego del corte se acentúa la formación de azúcares, como: la D-Xilosa,la Lactosacarosa, las Kestosas, la Rafinosa y varios polisacáridos, sustancias que impi-den el desarrollo normal del cristal de sacarosa y disminuyen la calidad del azúcarcomercial. Paradójicamente, hoy día se trata de aumentar el arsenal de componentes(trehalosa) en los jugos de caña con el uso de la ingeniería genética, para mejorar laresistencia al estrés de la caña. Los resultados que se recogen en este trabajo demuestranque la trehalosa es otro de los oligosacáridos que se forma, de manera notable, en losjugos de caña después de la cosecha.

Palabras clave: trehalosa, caña de azúcar, oligosacáridos.

ABSTRACT

Some of the problems that have been observed when an increase of industrial efficiencyin cane sugar production, are frequently associated according to current knowledge to theplant capacity of incorporate in it juices other sugars different than sucrose. It has beendetermined that after cutting the synthesis of other sugar as D-xylose, lactosucrose, kes-toses, raffinose and various polysaccharides, all of them substances that prevent the nor-mal development of sucrose crystal and reduce the quality of commercial sugar. Presentday, paradoxically, the increase of the component stock in sugar cane (trehalose) is beingincreased through genetic engineering to improve the stress resistance of sugarcane.Notwithstanding, the results of present paper illustrate that trehalose is among the oligo-saccharides that are noticeably synthetized by the plant after harvesting.

Key words: trehalose, sugar cane, oligosacharides.

INTRODUCCIÓN

La trehalosa, α-D-glucopiranosil α-D-glucopiranósido, es un oligosacárido noreductor constituido por dos unidades deglucosa unidas por un enlace: α (1 1). Esparticularmente estable al calentamiento yal medio ácido. Se ha aislado en más de 80especies, que incluyen plantas, algas, hon-gos, levaduras, bacterias, insectos, y otrosinvertebrados (1). La treahalosa se sintetizaen un proceso de dos etapas por las enzimastrehalosa 6-fosfato sintasa (TPS), y trehalosa6-fosfato fosfatasa (TPP), y es degradada porla trehalasa (2).

En la actualidad, aun no se entiende acabalidad el proceso de regulación de laacumulación de sacarosa en los organismos.No obstante, se ha implicado en el procesode regulación del flujo de carbono en bacte-rias, hongos y recientemente en las plantas,a varios componentes del metabolismo de latrehalosa. En general, se han propuesto dis-tintas funciones de la presencia de trehalo-sa: a) como fuente de carbono, b) comoagente protector del estrés (sequías, salini-dad del suelo y estrés oxidativo), y c) comouna molécula señal o reguladora del meta-bolismo y el crecimiento de la planta. A suderivado fosfatado en posición 6 se le adju-dican propiedades reguladoras de la distri-bución del carbono. Aunque la trehalosa,noparece estar vinculada directamente a laacumulación de sacarosa, pueden estar aso-ciados el 6-fosfato de trehalosa o las enzi-mas del metabolismo de la misma.

Recientemente, se han encontrado nive-les de trehalosa en los entrenudos de cincovariedades de caña de azúcar, que varíanentre 10-4 y 10-3 mg/g de materia fresca, aun-que estos son insuficientes para considerar-la como fuente de carbono o como agenteprotector del estrés (3).

Se ha tratado de incrementar el conteni-do de trehalosa en varias plantas como sonel arroz y la caña de azúcar. Por ejemplo, enel arroz transgénico (logrado expresandogenes de fusión de E. coli TPS y TPP) se acu-mula trehalosa hasta 1 mg/g de su peso fres-co. En la caña se ha logrado recientementeintroducir el gen de la grifola frondosa tre-halosa sintasa, la planta transgénica acumu-la hasta 8,805-12,863 mg/g de peso fresco(7-10% de los sólidos en el jugo), lo cual es

notable si se compara con las cantidadesprácticamente indetectables, en la caña notransgénica (4). La caña transgénica obteni-da, mostró alta resistencia a la sequía, sinalterar sus índices fisiológicos. No obstante,se desconoce la razón del aumento de tole-rancia de estas líneas transgénicas en lasque se logra una mayor presencia del disa-cárido.

Hoy conocemos que la caña, luego delcorte aumenta su capacidad de formaciónde diversos oligosacáridos, esta tendenciase expresa por el nivel de oligosacáridosen sus jugos, Azúcares que Impurifican ala Sacarosa (AISo), en el momento de sumadurez o corte. Normalmente el nivel deAISo en las variedades de caña oscila alre-dedor de 1% p/p de los sólidos en el jugo.Valores mayores, que pueden alcanzar el10% de los sólidos indican una tendenciaespecial de la variedad de caña a "autode-gradarse" o a formar diferentes oligosacá-ridos a partir de la sacarosa (hasta un 20%de los sólidos). Estos azúcares, en general,resultan perjudiciales (5,6) para el proce-so de fabricación de azúcar. No obstante,al estudiarse la influencia de los oligosa-cáridos de la caña sobre el hábito del cris-tal de sacarosa, se observó que el compo-nente aislado (con volumen de elusióncorrespondiente a la trehalosa) no altera-ba prácticamente el hábito del cristal desacarosa (7).

Sin embargo, la posibilidad de que lacaña forme trehalosa luego del corte encantidades apreciables, como un mecanis-mo de respuesta al estrés durante la etapade siembra y retoño, resulta atrayente tantodesde el punto de vista fisiológico comoindustrial, ya que en el segundo casoincorporaría un constituyente interesanteen las mezclas de oligosacáridos produci-dos a partir de la caña, por las propiedadesbeneficiosas que este azúcar agrega a losalimentos (8). La trehalosa al ingerirse sehidroliza a glucosa, adsorbiéndose en elintestino delgado. Este azúcar protege ypreserva las estructuras de las células enlos alimentos y ayuda en el proceso de con-gelación y masticado de muchos productosalimenticios, ya que asiste en el manteni-miento de la textura deseada de los ali-mentos. Es también estable al calor y noparticipa en la reacción Maillard.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Los experimentos se realizaron en gene-ral usando cañas frescas de 11 variedadesque mostraban una alta tendencia a la auto-degradación luego del corte, las que fuerondetectadas entre 76 variedades estudiadas(5), de ellas 9 mostraban la fracción croma-tográfica donde podía aparecer la trehalosa.Véase la tabla 1.

En esta primera parte del trabajo se pre-sentan los estudios exploratorios usando lavariedad Ja 60-5. Las cañas se cortaronmanualmente en los campos aledaños alcentral “Pablo Noriega”, provincia Habana,las que se desfibraron y prensaron inmedia-tamente. Los jugos obtenidos se dejaronreposar durante 48 h en presencia de undesinfectante apropiado y seguidamente seclarificaron por alcalización a pH 8,5, calen-tamiento por 2 minutos a ebullición y sedi-mentación. Los jugos clarificados se con-centraron hasta un sirope de 50 °Bx.

Métodos cromatográficos de separación

Columnas abiertas de hidroxiapatita esféri-ca (HYDROMAG).

Se utilizó la hidroxiapatita esférica conun tamaño de partícula de 50-60 micras. Elmaterial disperso en alcohol al 85% seempleó en la preparación de una columnasemi-preparativa 2,5 x 12 cm (capacidadmáxima de 30 mg de oligosacáridos).

Para determinar la concentración de oli-gosacáridos en las muestras se empleó lacolumna siguiendo la metodología ya repor-tada (9). La separación y cuantificación delos oligosacáridos presentes en los jugos ysiropes se realizó empleando dos gradientesalcohólicos lineales diferentes: (A1) de 90 a40% y (A2) de 90 a 70% en 500 cm3, usan-do una velocidad de flujo de 4 cm3/min. Elsegundo gradiente se empleó cuando lavariedad de caña producía la 6-Kestosa. Lacolumna permitió la separación del oligosa-cárido estudiado en repetidas corridas apli-cando diluciones alcohólicas (alcohol al85%) de los siropes, las que contenían alre-dedor de 20 mg de oligosacáridos. Las frac-ciones que correspondían a la trehalosa seunieron y concentraron hasta un sirope quese disolvió en metanol seco y se dejó crista-lizar en una desecadora sobre cloruro decalcio, obteniéndose un producto cristalino.

En todos los casos se empleó el métodode antrona sulfúrico para la detección yestimación de la concentración de los oligo-sacáridos.

La hidrólisis del oligosacárido aislado serealizó en dos condiciones: 1) parcial: HCl0,4 N, 65 °C, 30 minutos o enzimáticamentecon invertasa a 30 °C y pH 5,2; (2) total: HCl2N, 100 °C, 3 h.

El poder reductor del oligosacárido sedeterminó utilizando soluciones de 1-2 mgen 1 cm3 de agua destilada de los diferentesoligosacáridos. A las soluciones se añadió0,1 cm3 de las soluciones A y B de Felling,preparadas según la metodología para ladeterminación de reductores y el métodoanalítico de Eynon Lane. La mezcla secalentó en un baño hirviente por tres minu-tos. La aparición de un color rojo indica lapresencia de un oligosacárido reductor

Separaciones por HPLC

a) Cromatografía de Interacción Hidrofílica:Se usó una columna de Lichrosorb NH2,10µ, 4*250 mm, empleando como eluyen-te mezclas de Acetonitrilo-agua al 85%para la separación de los monosacáridos yde 80% para la separación de mono, di ytrisacáridos.

b) Fase inversa: Se usó una columnaUltropack TSK ODS 120 T, 10 µ, dedimensiones de 7*300 mm, se utilizó aguacomo eluyente.

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Tabla 1. Variedades de caña que resultaron más autodegradables

Variedad AIS0 (% sólidos) C128-83 8,42 J64-11 8,12

C88-523 7,10 C227-59 6,87 TY-8628 6,20 C636-70 5,62

C1616-75 5,24 C86-12 2,62 J60-5 2,5

C132-81 3,32/ No trehalosa ni 6 -Kestosa

C90-317 5,02/ No trehalosa ni 6 -Kestosa

En las separaciones por ambascolumnas se empleó como detector unRefractómetro Diferencial KNAUER.

Estudio por resonancia magnéticanuclear

El espectro de RMN-13C fue deter-minado en un equipo Brüker ACF-250 auna frecuencia de 62,89 MHz en aguadeuterada a 300 K y con acetona comoreferencia interna (31,55 ppm respectoa TMS)

DISCUSIÓN

Al estudiar la naturaleza de los azú-cares formados por la caña de azúcarluego del corte y la incidencia de losmismos en la producción de azúcar, se pudodeterminar que los más perjudiciales resul-taban ser la Lactosacarosa y un monosacári-do conocido como D-Xilosa. Ambos azúca-res producen grandes deformaciones en elhábito del cristal de sacarosa y un aumentosensible de pérdida de azúcar por escapesde microcristales, alargados por su eje "c", através de las telas de las centrífugas.Adicionalmente, se pudo determinar la pre-sencia de otros dos oligosacáridos menosrelacionados con los problemas industrialesen nuestro país, conocidos como 1-Kestosa

y la Rafinosa. No obstante, según las sepa-raciones cromatográficas realizadas en lacolumna de HYDROMAG, se pudo consta-tar que en los jugos de la caña fresca, losazúcares crudos y las mieles, generalmenteaparecen como mayoritarios 5 azúcares(AIS) de bajo peso molecular (ver figura 1),aunque algunas variedades forman las otrasdos Kestosas, (ver tabla 2).

Este quinto componente más frecuente,que no mostraba ejercer un efecto sensiblesobre la morfología del cristal de sacarosa,cobra interés por: a) su aparición frecuente

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Figura 1. Oligosacáridos presentes en los jugos de caña

Tabla 2. Separación cromatográfica de diferentes oligosacáridos

Tiempos de retención (min.) Oligosacáridos Métodos

A1/A2 Método

B Método

C Sacarosa 10 11 13

Isomaltosa 23 13 11.5

Melibiosa 52 16,5 11

Rafinosa 60 23 16

Trehalosa 21,5/40 14,5 11,5

1 Kestosa 70 19 17,5

Neo-Kestosa 45 - -

6 Kestosa 23/92 - -

Oligosacárido aislado

Oligo 1 22/40 14,5 11,5

luego del corte de la caña y b) su probablevinculación con los mecanismos de respues-ta al estrés de la caña luego del corte, duran-te la siembra y el retoño. El oligosacárido ais-lado a partir de la primera variedad estudia-da, la J60-5, coincide con la trehalosa segúnlos tiempos de elusión obtenidos por los tresmétodos usados. No pudiéndose hidrolizar eloligosacárido en condiciones suaves (no apa-recen monosacáridos), (ver tabla 2), no resul-ta reductor y se obtiene solamente glucosa encondiciones drásticas de hidrólisis. Además,su espectro de RMN 13C coincide con el deeste disacárido, ver tabla 3. En el espectro 1Hse observa la señal característica de la pre-sencia de los protones anoméricos α en 5,182ppm con una J= 3,6 Mz.

CONCLUSIONES

El quinto componente aislado del jugoautodegradado (sin la acción de los microor-ganismos) de la variedad de caña Ja60-5 se haidentificado como el disacárido trehalosa: α-D-glucopiranosil α-D-glucopiranósido.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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6. Ramos, E. L.; Ravelo, S.; Pino, S.Autodegradación de la caña de azúcar.Efecto de los azúacres que impurifican lasacarosa e inhibidores de las enzimas.Revista ATAC, 68 (2): p. 13, 2007.

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Tabla 3. Análisis del espectro de RMN 13C del oligosacárido

ä exp/ppm ä L/ppm Asignación á á -Trehalosa

94,4 94,0 C-1 73,8 73,5 C-3 73,4 73 C-5 72,3 72 C-2 70,9 70,6 C-4 61,8 61,5 C-6