A. PendahuluanGenetically Modified Organism (GMO) adalah organisme yang materi genetiknya telah diubah dengan teknik rekayasa genetika. Teknik ini dapat diterapkan untuk mikroorganisme, hewan, dan tumbuhan. Tumbuhan yang telah mengalami rekayasa genetika disebut juga sebagai tanaman transgenik (Fitzgerald-Hayes, 2010).Salah satu tanaman yang paling luas persebaran hasil rekayasa genetikanya adalah kacang kedelai (Glycine max). Modifikasi genetik yang dilakukan pada kacang kedelai bertujuan untuk membuat tanaman ini menjadi resisten terhadap herbisida glifosat salah satu herbisida berspektrum luas yang dapat membunuh banyak jenis tanaman. Selain itu kedelai juga direkayasa genetika agar memiliki kandungan asam oleat yang tinggi (Gupta, 2004). Sejak pertama kali direkayasa pada tahun 1995, kacang kedelai transgenik telah menyebar luas. Tercatat pada tahun 2010, lebih dari 90% kacang kedelai yang dijual di Amerika adalah kacang kedelai transgenik (Marwoto, 2005).Untuk mendeteksi dan membedakan kedelai transgenik dari kedelai non transgenik dapat digunakan beberapa metode, salah satunya adalah dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR adalah suatu metode amplifikasi DNA secara cepat tanpa memerlukan vektor maupun sel host. Metode PCR mampu menyalin suatu molekul DNA secara identik berulang kali sebanyak yang diperlukan. PCR terdiri atas tiga tahap yang diulang secara terus-menerus sehingga membentuk siklus, dengan hasil yang bertambah secara eksponensial (Fitzgerald-Hayes, 2010).Metode deteksi GMO dengan menggunakan reaksi PCR didasarkan pada ada tidaknya amplikon dari sekuen target dalam sampel. Dalam percobaan ini, sekuen target adalah promoter 35S RNA. Promoter 35S adalah promoter yang berasal dari Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) dan merupakan promoter yang sangat kuat. Sekuen promoter ini banyak sekali digunakan untuk membuat tanaman transgenik. Oleh karena itu, keberadaan sekuen promoter ini dapat menjadi sinyal awal bahwa tanaman tersebut adalah tanaman transgenik. Meski demikian, untuk mendapatkan hasil yang pasti, perlu dilakukan tahap penegasan yaitu southern blot (Zale, 2008).

B. Hasil Percobaan

MW 1 kbG1G2G3G4G6G7G8G9G10G5MW 1 kb

bp

6000

700500

250

Gambar 1. Genom kedelai hasil isolasi menggunakan kit ZR Plant/Seed DNA it dari Zymo Research. Genom sampel kedelai kelompok 1 (G1), 2 (G2), 3 (G3), 4 (G4), 6 (G6), 7 (G7), 8 (G8), 9 (G9), 10 (G10), dan 5 (G5). Sampel kedelai praktikan yang akan dibahas adalah G5.

MW100 bpK 18SK+18SK- 18S klp VMW100 bpS 18S klp V

bp

2531

Amplikon 18S500600

100

Gambar 2. Visualisasi hasil PCR DNA genom kedelai kelompok 5 dengan primer 18S pada gel elektroforesis. Kontrol PCR dari asisten: kontrol negatif 18S (K- 18S) dan kontrol positif (K+18S). Sampel kelompok 5 (S 18S klp V) dan kontrol negatif buatan praktikan (K- 18S klp V). Amplikon 18S pada kontrol positif berukuran antara 500-600 bp.

MW100 bpK 35SK-35S klp VMW100 bpS 35S klp VK+35S 1K+35S 21002002531Amplikon 35Sbp

Gambar 3. Visualisasi hasil PCR DNA genom kedelai kelompok 5 dengan primer 35S pada gel elektroforesis. Kontrol PCR dari asisten: kontrol negatif 35S (K- 35S), kontrol positif dari kedelai positif GMO (K+35S 1), dan kontrol positif dari DNA pEGAD. Sampel kelompok 5 (S 35S klp V) dan kontrol negatif buatan praktikan (K- 35S klp V). Amplikon 35S pada kontrol positif berukuran antara 100-200 bp.

C. PembahasanSebelum masuk proses PCR, DNA Genom kedelai hasil isolasi menggunakan kit ZR Plant/Seed DNA it dari Zymo Research perlu divisualisasi pada gel elektroforesis untuk memastikan keberhasilan isolasi dan kualitas DNA genom yang diperoleh. DNA genom kelompok lima tervisualisasi sebagai pita tebal dengan smear panjang yang bermigrasi sama cepatnya dengan marker berukuran paling besar, yaitu 12.000bp (lihat gambar 1), padahal DNA genom kedelai yang diestimasi sebesar 1.115Mbp (Schmutz et al., 2010) akan berada di atas marker paling besar tersebut. Hal tersebut diakibatkan separasi di gel elektroforesis tidak terjadi dengan sempurna. Pita marker berukuran 8.000, 10.000, dan 12.000bp terlihat belum terseparasi dengan baik sehingga elektroforesis memerlukan waktu lebih lama dan ukuran gel yang lebih besar agar semua pita marker terseparasi sempurna dan estimasi ukuran band dapat dilakukan.Amplifikasi dengan primer 18S bertujuan memastikan DNA sampel berasal dari organisme eukariotik, yang secara normal tidak memiliki promotor 35S. Reaksi PCR DNA sampel dengan primer 18S (lihat gambar 2) menghasilkan pita tebal berukuran antara 500 dan 600bp yang sama dengan kontrol positif dari asisten. Kontrol negatif praktikan dan kontrol negatif asisten menghasilkan pita tipis dengan ukuran yang sama dengan pita di kontrol positif. Kesimpulan bahwa DNA sampel yang diperoleh berasal dari organisme eukariotik tidak dapat ditarik karena diduga bahwa salah satu reagen telah terkontaminasi DNA eukariotik yang dapat menjadi template saat PCR. PCR harus diulang dengan mengganti reagen lama dengan reagen baru. Amplifikasi dengan primer 35S berfungsi untuk mendeteksi apakah DNA sampel merupakan organisme transgenik atau tidak. Hasil reaksi PCR dari DNA sampel praktikan dengan primer 35S (lihat gambar 3) menghasilkan pita tebal pada ukuran antara 100 sampai 200bp. Akan tetapi, kontrol negatif praktikan juga menghasilkan pita tipis pada ukuran 100 sampai 200bp, sementara pada kontrol negatif milik asisten tidak terdapat pita pada ukuran tersebut. Hasil terebut menunjukkan bahwa terdapat kontaminan dalam reagen praktikan sehingga tidak dapat disimpulkan apapun dari reaksi PCR ini dan reaksi harus diulang dengan reagen yang baru.

D. KesimpulanGenom berhasil diisolasi, tetapi tidak dapat disimpulkan bahwa DNA yang diisolasi berasal dari organisme eukariotik ataupun organisme transgenik karena terdapat kontaminan dalam reagen praktikan. Reaksi PCR perlu diulang.

E. Daftar PustakaFitzgerald-Hayes, Molly dan Frieda Reichsman. 2010. DNA and Biotechnology. New York: Elsevier Inc.Gupta, P. K. 2004. Biotechnology and Genomics. Bangkok: Rastogi Publications.Karp, Gerald. 2010. Cell And Molecular Biology: Concepts and Experiments Sixth Edition. RR Donnelley.Karcher, Susan J. (1995). Molecular Biology: A Project Approach. Academic Press: English.Schmutz J, Cannon SB, Schlueter J, Ma J, Mitros T, Nelson W, Hyten DL, Song Q, Thelen JJ, Cheng J, Xu D, Hellsten U, May GD, Yu Y, Sakurai T, Umezawa T,Bhattacharyya MK, Sandhu D, Valliyodan B, Lindquist E, Peto M, Grant D, Shu S, Goodstein D, Barry K, Futrell-Griggs M, Abernathy B, Du J, Tian Z, Zhu L, Gill N,Joshi T, Libault M, Sethuraman A, Zhang XC, Shinozaki K, Nguyen HT, Wing RA, Cregan P, Specht J, Grimwood J, Rokhsar D, Stacey G, Shoemaker RC,Jackson SA. (2010). Genome Sequence Of The Palaeopolyploid Soybean. Nature 463, 178-183.Zale, Janice dan C. Neal Stewart Jr. 2008. Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and Applications. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.