Objetivos

1. Definir: hormonas, clula diana, retroaccin negativa, metabolismo, tiroxina, hormona estimulante de la tiroides (TSH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), hipotlamo, sistema porta hipotlamo-hipofisario, vena porta,.

2. Dar ejemplos de cmo los bucles de retroaccin negativa regulan la liberacin hormonal.

3. Explicar el papel de la tiroxina en el mantenimiento del metabolismo basal de un animal.

4. Explicar los efectos de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) sobre el metabolismo basal de un animal.

5. Comprender el papel del hipotlamo en la regulacin de la produccin de tiroxina y de TSH.

6. Explicar por qu es importante la insulina y cmo puede utilizarse para tratar la diabetes.

7. Entender como los alteraciones en los niveles de cortisol y ACTH estn asociados a patologas del sistema endocrino

El sistema endocrino regula el funcionamiento de cada clula, tejido y rgano del cuerpo. Acta para mantener un ambiente corporal interno estable, a pesar de los cambios que se producen en el interior o en el exterior del organismo. Las clulas endocrinas tienen la capacidad de percibir y responder a esos cambios a travs de la secrecin de compuestos qumicos especficos denominados hormonas. Las hormonas son transportadas por la sangre, generalmente unidas a protenas plasmticas especficas, y circulan por todo el organismo. Cuando el complejo hormona-protena alcanza una clula diana (la clula a la cual se dirige un mensaje qumico), la hormona se separa de la protena y penetra en la clula para inducir una reaccin especfica.

Las hormonas actan de diferentes maneras, dependiendo de su estructura qumica. Por ejemplo, las hormonas polipeptdicas, compuestas por cadenas de aminocidos, primero se acoplan a una protena receptora de la membrana celular, iniciando una serie de reacciones en la membrana con el resultado de la penetracin en la clula del monofosfato cclico de adenosina (AMPc). La entrada de este producto qumico induce que la clula trabaje ms y ms rpidamente. Las hormonas esteroides y la tiroxina (una hormona secretada por la tiroides y que examinaremos con detalle ms adelante) entran en la clula para unirse a un receptor citoplasmtico. El complejo hormona-receptor penetra entonces en el ncleo celular para unirse a puntos especficos sobre el ADN. Cada unin produce un ARNm especfico que se traslada entonces al citoplasma para ser traducido en una protena especfica.

La mayor parte de la regulacin de los niveles hormonales en el organismo se lleva a cabo mediante un mecanismo de retroalimentacin negativa: si se necesita una hormona particular, se estimular su produccin; si hay suficiente cantidad de hormona, se inhibir su produccin. En muy pocos casos la produccin hormonal est controlada por mecanismos de retroalimentacin positiva. Uno de tales ejemplos es la produccin de la hormona de la hipfisis posterior oxitocina. Esta hormona produce la contraccin de la capa muscular del tero, el miometrio, durante el parto. La contraccin del miometrio causa una liberacin adicional de oxitocina para ayudar a la contraccin, independientemente de la cantidad de hormonas ya presente.

El estudio de los efectos de las hormonas sobre el organismo es difcil realizarlo en el laboratorio, ya que, a menudo, los experimentos pueden durar das, semanas o incluso meses, y son bastante caros. Adems, puede ser necesario el sacrificio de animales, y algunas veces se precisan tcnicas quirrgicas complejas. Las simulaciones de PhysioEx que se utilizarn en este ejercicio permiten estudiar los efectos de determinadas hormonas sobre el organismo, usando animales virtuales en lugar de animales vivos. Sers capaz de llevar a cabo delicadas tcnicas quirrgicas pulsando un botn. Tambin sers capaz de completar experimentos en una fraccin del tiempo que utilizaras en un laboratorio real.

Hormonas y metabolismo

Metabolismo es un trmino amplio utilizado para designar todas las reacciones bioqumicas que tienen lugar en el organismo. Incluye el catabolismo, un proceso por el cual los materiales complejos se descomponen en sustancias ms simples, generalmente con la ayuda de enzimas presentes en las clulas. El metabolismo tambin incluye el anabolismo, en el cual los materiales ms pequeos, por la accin de enzimas, crean molculas ms grandes y complejas. Cuando se rompen los enlaces durante el catabolismo, la energa que estaba almacenada en ellos se libera para ser utilizada por las clulas. Cuando se forman molculas ms grandes, la energa es almacenada en los diferentes enlaces que se forman. Una parte de la energa liberada puede dirigirse hacia la formacin de ATP, el material rico en energa utilizado por el organismo para su funcionamiento. Sin embargo, no toda la energa liberada sigue este camino. Una parte de ella se emite en forma de calor corporal. Los humanos somos animales homeotermos, lo que significa que tenemos una temperatura corporal fija. El mantenimiento de esta temperatura es muy importante para sostener las vas metablicas que existen en el organismo.

La hormona ms importante en el mantenimiento del metabolismo y la temperatura corporal es la tiroxina. Tambin conocida como tetrayodotironina, o T4, la tiroxina es secretada por la glndula tiroides, localizada en el cuello. Sin embargo, la produccin de tiroxina realmente est controlada por la hipfisis, que segrega la hormona estimulante de la tiroides (TSH). TSH es transportada hasta la glndula tiroides (su tejido diana) por la sangre, ocasionando una mayor produccin de tiroxina.

Tambin es importante comprender el papel del hipotlamo en la produccin de tiroxina y de TSH. El hipotlamo, localizado en el cerebro, es una glndula endocrina primaria que segrega varias hormonas que afectan a la hipfisis (tambin localizada en el cerebro). Entre stas se encuentra la hormona liberadora de tirotropina (TRH), que estimula la produccin de TSH en la hipfisis. Si el hipotlamo determina que no hay suficiente tiroxina circulando para mantener el metabolismo corporal, secretar TRH para estimular la produccin de TSH por la hipfisis, la cual, a su vez, estimular la produccin de tiroxina por la glndula tiroidea (un ejemplo clsico de un bucle de retroalimentacin negativa). La TRH es transportada desde el hipotlamo hasta la hipfisis va el sistema porta hipotlamo-hipofisario, una organizacin de vasos sanguneos especializados que consiste en una simple vena porta que conecta dos lechos capilares. El sistema porta hipotlamo-hipofisario transporta otras muchas hormonas desde el hipotlamo hasta la hipfisis. Ante todo, las hormonas secretadas por el hipotlamo son trpicas (o trficas), es decir, hormonas que estimulan o inhiben la secrecin de otras hormonas. La TRH es un ejemplo de una hormona trpica, ya que estimula la liberacin de TSH (que, a su vez, es una hormona trpica, pues estimula la liberacin de tiroxina).

En los siguientes experimentos investigars los efectos de la tiroxina y de la TSH sobre el metabolismo de un animal. Del men principal selecciona Fisiologa del Sistema Endocrino (Endocrine System Physiology). La pantalla de inicio aparecer en pocos segundos (Figura 1).

A la izquierda vers una cmara en forma de bote conectada a un manmetro-respirmetro (consiste de un tubo en forma de U, una jeringuilla y unos tubos asociados). Colocars los animales en este caso ratas en la cmara, con el fin de recopilar informacin sobre el efecto de la tiroxina y de la TSH sobre sus metabolismos basales. Observa que la cmara tambin incluye una balanza y que, junto a ella, hay un temporizador (min) (Timer) para fijar y calcular la duracin de un determinado experimento. Bajo el temporizador hay un indicador de peso (Weight).

En la parte superior de la cmara hay conectados dos tubos. El de la izquierda tiene una abrazadera que puede abrirse o cerrarse. Mantenindola abierta (Clamp open) permitirs que el aire exterior entre en la cmara; cerrando la abrazadera (Clamp closed) se crear un sistema cerrado, hermtico. El otro tubo conduce a un conector en forma de T. Uno de sus brazos est conectado a un tubo en forma de U, denominado manmetro, que contiene un lquido. A medida que un animal consume el aire del sistema cerrado, este fluido ascender en la parte izquierda del tubo en forma de U y descender en la derecha.

El otro brazo del conector en forma de T conduce a una jeringuilla llena de aire. Al utilizar la jeringuilla para inyectar aire en el tubo, medirs la cantidad de aire necesario para que la columna de fluido vuelva a su nivel original. Esta medida ser igual a la cantidad de oxgeno utilizada por el animal durante el transcurso del experimento. La sosa, situada en la parte inferior de la cmara, absorbe el dixido de carbono producido por el animal, de forma que se puede medir fcilmente la cantidad de oxgeno consumido. Este dato, junto con el peso del animal, se utilizar para calcular su metabolismo basal.

Tambin aparecen en la pantalla tres ratas blancas en sus jaulas individuales. Son los ejemplares que utilizars en los siguientes experimentos. Una rata es normal; la segunda est tiroidectomizada (abreviado en la pantalla como Tx) - lo que significa que se le ha eliminado la tiroides-, y la tercera est hipofisectomizada (abreviado en la pantalla como Hypox) es decir, se le ha extrado la hipfisis.

En la parte superior izquierda de la pantalla hay tres jeringas que contienen varias sustancias qumicas: propiltiouracilo (Propylthiouracil), hormona estimulante de la tiroides (TSH) y tiroxina (Thyroxine). La TSH y la tiroxina se han mencionado anteriormente; el propiltiouracilo es un frmaco que inhibe la produccin de tiroxina al bloquear la incorporacin del yodo a la hormona. Sobre cada animal llevars a cabo cuatro experimentos: 1) determinars su metabolismo basal, 2) determinars su tasa metablica tras haberle inyectado tiroxina, 3) determinars su metabolismo basal tras haber sido inyectada con TSH, y 4) determinars su tasa metablica basal tras haberle inyectado propiltiouracilo.

Todos los datos los anotars en el cuadro de resultados. Tambin puedes guardarlos sobre la pantalla, utilizando el equipo que est en su parte inferior. Este equipo registra y muestra los datos que has acumulado durante los experimentos. El conjunto de datos para Normal debe estar resaltado en la ventana de Conjunto de Datos (Data Sets), ya que iniciars la experimentacin con la rata normal. El botn de Guardar Datos (Record Data) te permite guardar tus datos tras una prueba experimental. Pulsando sobre los botones de Borrar Lnea (Delete Line) o Borrar Conjunto de Datos (Clear Data Set), eliminars cualquier dato que desees.

Actividad 1: Determinando el metabolismo basal

En primer lugar, determinars el metabolismo basal para cada rata.

1. Con la ayuda del ratn, pulsa y arrastra la rata Normal (Normal) hasta la cmara, colocndola sobre la balanza. Cuando el animal est en la cmara, suelta el botn del ratn.

2. Asegrate de que la llave del tubo de la izquierda (en la parte superior de la cmara) est abierta, permitiendo la entrada de aire a la cmara. Si est cerrada, pulsa sobre ella para abrirla.

3. Asegrate que en el indicador que est junto al conector en forma de T se lee Cmara y manmetro conectados (Chamber & manometer connected). Si no es as, pulsa sobre el tirador del conector en forma de T.

4. Pulsa sobre el botn Pesar (Weight) del mdulo de la derecha de la cmara para pesar la rata. Anota este valor en el cuadro de resultados5. Pulsa sobre el botn (+) del temporizador (Timer), hasta que se lea 1.00 en el indicador.

6. Pulsa sobre la llave para cerrarla. Esto evitar que entre aire del exterior y asegurar que el nico oxgeno que est respirando la rata es el contenido dentro del sistema.

7. Pulsa Iniciar (Start) del mdulo del temporizador. Vers que el Tiempo Transcurrido (Elapsed Time) aparece en el indicador. Observa qu ocurre con el nivel del agua del tubo en forma de U.

8. Al finalizar el periodo de 1 minuto el temporizador se detendr automticamente. Pulsa entonces sobre el tirador del conector en forma de T hasta que indique Manmetro y jeringuilla conectados (Manometer and syringe connected)

9. Pulsa sobre la llave para abrirla, de forma que la rata pueda respirar de nuevo el aire exterior.

10. Pulsa sobre el botn (+) bajo ml O2 , debajo de la jeringuilla, hasta que se lea 1.0 ml. Pulsa entonces Inyectar (Inject) y observa qu ocurre con el nivel del fluido. Contina pulsando sobre el botn (+) e inyectando aire hasta que el nivel del fluido se iguale en los dos brazos del tubo en U. Cuntos ml de aire has necesitado aadir para equilibrar el fluido en ambos brazos? _______________________ mlEste volumen es equivalente a la cantidad de oxgeno que ha utilizado la rata durante el minuto que ha permanecido en la cmara cerrada. 11. Anota esta medida en el cuadro de resultados.

12. Determina el consumo de oxgeno por hora para la rata. Utiliza la siguiente frmula:

mL O2 consumido X 60 min = ________________ ml O2 /hr

1 minuto

hr 13. Anota este dato en el epgrafe ml O2 utilizados por hora en la seccin Metabolismo Basal de la cuadro 1.

14. Ahora que ya tienes la cantidad de oxgeno utilizado por hora, determina el metabolismo basal por kilo de peso corporal, utilizando la siguiente frmula (observa que necesitars convertir el dato del peso, de gramos a kg, antes de utilizar la frmula):

Metabolismo basal = mL O2 /hr = mL O2 /Kg/hr Peso (kg)15. Guarda este dato en el cuadro de resultados.

16. Pulsa sobre Guardar Datos (Record Data).

17. Pulsa y arrastra a la rata hasta su jaula.

18. Pulsa sobre el botn Reiniciar (Reset) del mdulo denominado Aparato (Apparatus).19. Ahora repite los pasos 1 a 18 para las ratas tiroidectomizada (Tx) e hipofisectomizada (Hypox). Anota los resultados en el cuadro de resultados en las columnas correspondientes a cada rata. Asegrate de resaltar Tx en Conjunto de Datos (Data Sets) (en el mdulo de recogida de datos) antes de iniciar el experimento sobre la rata tiroidectomizada; del mismo modo, resalta Hypox en Conjunto de Datos antes de comenzar el experimento con la rata hipofisectomizada.

Qu diferencias existieron en los valores de metabolismo basal entre las tres ratas?

Si un animal ha sido tiroidectomizado, qu hormona(s) desaparecera(n) de su sangre? cul sera el efecto global sobre el organismo?

Qu efectos esperaras observar en los niveles hormonales de un animal que ha sido hipofisectomizado? Cul sera el efecto sobre el metabolismo de un animal?

Actividad 2: Determinando el efecto de la tiroxina sobre el metabolism basalA continuacin investigars los efectos de las inyecciones de tiroxina sobre el metabolismo basal de las tres ratas.

Observa que en un laboratorio real normalmente necesitaras inyectar tiroxina (o cualquier otra hormona) a una rata diariamente durante al menos 1 o 2 semanas para poder observar alguna respuesta. Sin embargo, en las siguientes simulaciones solo inyectars una vez a la rata y sers capaz de presenciar los mismos resultados que si hubieras administrado mltiples inyecciones durante varias semanas. Adems, al pulsar sobre el botn Limpiar (Clean) mientras una rata est en su jaula, puedes eliminar inmediatamente toda la hormona residual previamente inyectada y llevar a cabo un nuevo experimento sobre la misma rata. En un laboratorio real necesitaras esperar semanas para que los residuos hormonales abandonaran el organismo de la rata, o bien utilizar una rata diferente.

1. Selecciona una rata para el ensayo. El experimento lo vas a realizar con las tres ratas, y no importa el orden en que las utilices. En Conjunto de Datos (Data Sets) resalta Normal, Tx o Hypox dependiendo de la rata que escojas.

2. Pulsa el botn Reiniciar (Reset) en el mdulo denominado Aparato (Apparatus).

3. Pulsa sobre la jeringuilla marcada con tiroxina (Thyroxine) y arrstrala hasta encima de la rata. Suelta el botn del ratn. Esto inyectar la tiroxina en la rata.

4. Pulsa y arrastra la rata hasta la cmara. Sigue de nuevo los pasos 1 a 12 de la Actividad 1, excepto que esta vez debes anotar los datos en la seccin Con Tiroxina en el cuadro de Resultados.

5. Pulsa sobre Guardar Datos (Record Data).

6. Pulsa y arrastra a la rata desde la cmara devolvindola a su jaula, y pulsa Limpiar (Clean) para eliminar cualquier resto de tiroxina del animal.

7. Ahora repite los pasos 1 a 6 con las ratas restantes. Anota tus datos en la seccin Con Tiroxina en el cuadro de resultados, en la columna correspondiente a cada rata.

Cul fue el efecto de la tiroxina sobre el metabolismo basal de una rata normal? Cmo es este metabolismo basal en comparacin con el de una rata normal (sin tiroxina)?

Por qu se observ este efecto?

Cul fue el efecto de la tiroxina sobre el metabolismo basal de una rata tiroidectomizada? Cmo es este metabolismo basal en comparacin con el de una rata tiroidectomizada?

Por qu se observ este efecto?

Cul fue el efecto de la tiroxina sobre el metabolismo basal de una rata hipofisectomizada? Cmo es este metabolismo basal en comparacin con el de una rata hipofisectomizada?

Por qu se observ este efecto?

Actividad 3: Determinando el efecto de la TSH sobre el metabolismo basal

A continuacin investigars los efectos de las inyecciones de TSH sobre el metabolismo basal de las tres ratas. Selecciona primero una rata para experimentar y despus comienza.

1. En Conjunto de Datos (Data Sets) resalta Normal, Tx o Hypox dependiendo de la rata que ests utilizando.

2. Pulsa el botn Reiniciar (Reset) en el mdulo denominado Aparato (Apparatus).

3. Pulsa y arrastra sobre la rata la jeringuilla marcada con TSH y suelta el botn del ratn, inyectando a la rata.

4. Pulsa y arrastra la rata hasta la cmara. Sigue de nuevo los pasos 1 a 12 de la Actividad 1. Anota los datos en la seccin Con TSH del cuadro 1.

5. Pulsa Guardar Datos (Record Data).

6. Pulsa y arrastra a la rata desde la cmara devolvindola a su jaula, y pulsa Limpiar (Clean) para eliminar cualquier resto de TSH.

7. Ahora repite esta actividad con las ratas restantes. Guarda tus datos en la seccin Con TSH del cuadro 1, en la columna correspondiente a cada rata.Para cada rata experimental, explique cules son las diferencias, en su efecto y modo de accin, de la TSH en relacin con la tiroxina? Compare estos resultados con los de las ratas a las que se les inyect tiroxina:

RATA NORMAL

RATA TIROIDECTOMIZADA

RATA HIPOFISECTOMIZADA

Actividad4: Determinando el efecto del propiltiouracilo sobre el metabolismo basal

A continuacin investigars los efectos de las inyecciones de propiltiouracilo (un inhibidor de la tiroxina) sobre el metabolismo basal de las tres ratas.

Selecciona primero una rata para experimentar1. En Conjunto de Datos (Data Sets) resalta Normal, Tx o Hypox dependiendo de la rata que ests utilizando.2. Pulsa el botn Reiniciar (Reset) en el mdulo denominado Aparato (Apparatus).

3. Pulsa y arrastra sobre la rata la jeringuilla marcada con Propiltiouracilo (Propylthiouracil) y suelta el botn ratn, inyectando a la rata.

4. Pulsa y arrastra la rata hasta la cmara. Ejecuta de nuevo los pasos 1 a 12 de la Actividad 1, excepto que esta vez guarda tus datos en la seccin Con Propiltiouracilo del cuadro de resultados5. Pulsa Guardar Datos (Record Data).

6. Pulsa y arrastra a la rata desde la cmara devolvindola a su jaula, y pulsa Limpiar (Clean) para eliminar cualquier resto de propiltiouracilo.

7. Ahora repite esta actividad con las ratas restantes. Guarda tus datos en la seccin Con Propiltiouracilo del cuadro de resultados, en la columna correspondiente a cada rata.

Por qu no se observan efectos en todas las ratas?

Tomando en cuenta el bucle de retroalimentacin negativa, prediga los cambios en las concentraciones de las hormonas participantes RATA NORMAL

RATA TIROIDECTOMIZADA

RATA HIPOFISECTOMIZADA

Insulina y Diabetes

La insulina es producida por las clulas de la porcin endocrina del pncreas. Es vital para la regulacin de los niveles sanguneos de glucosa porque capacita a las clulas corporales para absorber glucosa desde el torrente circulatorio. La glucosa absorbida puede entrar en las clulas (generalmente en las hepticas o musculares) donde se utiliza su exceso para formar glucgeno (almidn animal). Se estima que el 75% de la glucosa que se ingiere en una comida es almacenada de esta forma. Como se considera a los humanos comedores discontinuos, esta produccin de almidn animal tras una comida asegura que existir glucosa disponible varias horas despus de la ingesta. El organismo tiene que mantener un cierto nivel de glucosa en sangre para ser til a las clulas del sistema nervioso, las cuales solo pueden absorber glucosa. Cuando los niveles de glucosa en sangre disminuyen por debajo de un cierto valor, las clulas a del pncreas producen entonces glucagn. La funcin de esta hormona es escindir el glucgeno almacenado en glucosa, para ser liberada a la sangre.

Cuando el pncreas no produce insulina conduce a la diabetes mellitus Tipo I. Cuando el pncreas s produce insulina, pero el organismo no responde a ella, el resultado es la diabetes mellitus Tipo II. En ambos casos, la glucosa permanece en la sangre, incapaz de ser incorporada por las clulas del organismo para ser utilizada como principal combustible para el metabolismo. El exceso de glucosa sangunea es entonces filtrado por el rin. Como la recaptacin de la glucosa filtrada implica un nmero finito de receptores en las clulas renales, parte del exceso de glucosa no ser reabsorbido hacia el organismo y, en su lugar, se perder con la orina. La ausencia de insulina para el transporte de glucosa tambin afecta al msculo y tiene como resultado el catabolismo proteico de las clulas musculares, de forma que los aminocidos liberados pueden formar glucosa en el hgado. Esta accin expone al organismo a un equilibrio negativo respecto del nitrgeno, debido al agotamiento proteico y al consumo tisular resultante. Este trastorno tambin est asociado a una deficiente resistencia a las infecciones.

En el siguiente experimento estudiars los efectos del tratamiento con insulina sobre la diabetes Tipo I. El experimento est dividido en dos partes. En la Parte 1 obtendrs una curva estndar de glucosa, que se explicar brevemente. En la Parte II comparars los niveles de glucosa de una rata normal con los de una rata diabtica, y los comparars, de nuevo, tras haber inyectado insulina a cada rata.

Parte 1

Actividad 5: Obteniendo una curva estndar de glucosa

Para comenzar, selecciona Insulina y Diabetes-Parte 1 (Insulin and Diabetes-Part 1) del men Experimento (Experiment) (Figura 3). En el lado derecho de la pantalla que aparece hay un espectrofotmetro (Spectrophotometer). El espectrofotmetro es uno de los instrumentos de investigacin ms ampliamente utilizado en biologa. Se usa para medir las cantidades de luz de diferentes longitudes de onda absorbidas y transmitidas por una solucin coloreada. En el interior del espectrofotmetro hay una fuente de luz blanca, que es escindida en varias longitudes de onda (o colores) por un prisma. El usuario selecciona una longitud de onda (color) y la luz de este color se hace pasar a travs de un tubo, o cubeta, que contiene la muestra a ensayar. (Para este experimento, la fuente de luz del espectrofotmetro se preseleccionar a una longitud de onda de 450 nm). La luz transmitida por la muestra pasa entonces a un tubo fotoelctrico, que convierte la energa luminosa en una corriente elctrica. La corriente es entonces medida por un medidor. Alternativamente, la luz puede ser medida antes de que la muestra se coloque en su trayectoria, y despus puede medirse la cantidad de luz absorbida denominada (densidad ptica). Utilizando cualquiera de los mtodos, el cambio en la transmitancia luminosa o la luz absorbida, se puede medir la cantidad de una determinada sustancia en la muestra a ensayar. En la Parte II usars el espectrofotmetro para determinar cunta glucosa hay en muestras de sangre que habrs tomado de dos ratas. Pero antes de que puedas realizar esto debes obtener una curva estndar de glucosa, de forma que tengas un punto de referencia para convertir las lecturas de densidad ptica en lecturas de [glucosa] (que se medir en mg/decilitro). Para hacer esto, preparars cinco tubos de ensayo que contengan cantidades conocidas de glucosa: 30, 60, 90, 120 y 150 mg/dl, respectivamente. Determinars entonces, en el espectrofotmetro, las lecturas de densidad ptica correspondientes a cada una de estas cantidades conocidas de glucosa. Usars esta informacin para realizar la Parte II.

En la pantalla tambin hay tres botellas cuentagotas, un lavador de tubos de ensayo (Test Tube Washer), un aparato distribuidor de tubos de ensayo (sobre el lavador) y una unidad incubadora de tubos de ensayo, que necesitars para preparar las muestras para el anlisis.

1. Pulsa y arrastra el tubo de ensayo (de encima del lavador de tubos de ensayo) (Test Tube Washer) a la ranura 1 de la unidad de incubacin. Vers ascender otro tubo de ensayo del aparato distribuidor. Pulsa y arrastra este segundo tubo de ensayo hasta la ranura 2 de la unidad de incubacin. Repite esta operacin hasta que hayas arrastrado un total de cinco tubos de ensayo a las 5 ranuras de la unidad de incubacin.

2. Pulsa y mantn el botn del ratn sobre el tapn cuentagotas de la botella de Glucosa Estndar (Glucosa Standard). Arrastra el tapn sobre el tubo no 1. Suelta el botn del ratn para verter la glucosa. Vers que cae una gota de la solucin de glucosa en el tubo. El gotero automticamente se mover hacia los siguientes tubos. Observa que cada tubo recibir automticamente una gota adicional de glucosa estndar (es decir, el tubo no 2 recibir dos gotas, el tubo no 3 recibir tres gotas, el tubo no 4 recibir cuatro gotas y el tubo no 5 recibir cinco gotas).

3. Pulsa y mantn el botn del ratn sobre el tapn cuentagotas de la botella de Agua Desionizada (Deionized Water). Arrastra el tapn sobre el tubo no 1. Suelta el botn del ratn para verter el agua. Observa que se aaden automticamente cuatro gotas de agua al primer tubo. Nota que cada tubo subsiguiente recibir una gota menos de agua que el anterior (esto es, el tubo no 2 recibir tres gotas, el tubo no 3 recibir dos gotas y el tubo no 4 recibir una gota). El tubo no 5 no recibir ninguna gota de agua.

4. Pulsa sobre el botn Mezclar (Mix) de la unidad de incubacin para agitar el contenido de los tubos.

5. Pulsa sobre el botn Centrifugar (Centrifuga). Los tubos descendern a la unidad de incubacin y sern centrifugados. Cuando los tubos son centrifugados, giran alrededor de un punto central a una velocidad elevada, de forma que cualquier partcula de materia del tubo se posar en su parte inferior, formando lo que se denomina un sedimento.

6. Cuando los tubos vuelvan a la superficie, pulsa sobre el botn Eliminar Sedimento (Remove Pellet). Cualquier sedimento del proceso de centrifugacin ser eliminado de los tubos de ensayo.

7. Pulsa y mantn el botn del ratn sobre el tapn cuentagotas de la botella de Reactivo Enzimtico para Colorear (Enzyme Color Reagent). Manteniendo todava apretado el botn del ratn, arrstralo sobre el tubo no 1. Cuando sueltes el ratn, observars que se aaden cinco gotas del reactivo y que el tapn es devuelto a su botella. Automticamente el gotero se deslizara hacia los subsiguientes tubos.8. Pulsa ahora Incubar (Incubate). Los tubos descendern a la unidad de incubacin donde sern agitados para mezclar completamente el reactivo de color en el tubo, se incubarn y entonces volvern a la superficie.

9. Utilizando el ratn, pulsa sobre Ajustar (Set Up) del espectrofotmetro (Spectrophotometer). Esto calentar el instrumento y lo dejar listo para tus lecturas. En este caso, ajustar tambin incluye fijar el punto cero, de forma que el espectrofotmetro leer exactamente la cantidad de material contenido en cada tubo.

10. Pulsa y arrastra el tubo no 1 al espectrofotmetro (Spectrophotometer) (justo encima del botn de Ajustar (Set Up)) y suelta el botn del ratn. El tubo se colocar en su lugar.

11. Pulsa Analizar (Analyze). En la pantalla aparecer un punto, y los valores aparecern en los indicadores de Densidad Optica (Optical Density) y Glucosa (Glucosa).

12. Pulsa Guardar Datos (Record Data) en la unidad de recogida de datos.

13. Pulsa y arrastra el tubo al interior del lavador de tubos de ensayo (Test Tube Washer).

14. Repite los pasos 13 a 16 con los restantes tubos de ensayo.

15. Cuando todos los tubos hayan sido analizados, pulsa sobre el botn Grfica (Graph). Esta es la grfica estndar de glucosa que utilizars en la Parte II del experimento. Parte II

Actividad 6: Comparando los niveles de glucosa antes y despus de la inyeccin de insulina

Selecciona Insulina y Diabetes Parte 2 (Insulin and Diabetes Part 2) del men Experimento (Experiment).

La pantalla de inicio ser similar a la de la Parte I (Figura 4). Observa las dos ratas en sus jaulas. Una ser el animal Control y la otra el animal Experimental. Observa tambin las tres jeringuillas, que contienen insulina, solucin salina y aloxana, respectivamente. La aloxana es un frmaco que, cuando se administra a un animal, destruye selectivamente todas las clulas B pancreticas que producen insulina y vuelve al animal diabtico al instante.

En este experimento inyectars solucin salina a la rata Control y aloxana a la Experimental. (Normalmente las inyecciones se aplican diariamente durante una semana. En esta simulacin administraremos las inyecciones una sola vez, pero podremos ver los resultados como si se hubiesen administrado durante un periodo ms largo de tiempo).

Tras administrar las inyecciones de solucin salina y de aloxana, obtendrs muestras de sangre de las dos ratas. Inyectars, entonces, a ambas con insulina y obtendrs de nuevo muestras de sangre. Finalmente, analizars todas las muestras en el espectrofotmetro (descrito en la Parte 1) para comparar las cantidades de glucosa presente en ellas.

1. Pulsa y arrastra la jeringuilla de Solucin Salina (Salive) hasta la rata Control (Control) y suelta el botn del ratn para inyectar al animal.

2. Pulsa y arrastra la jeringuilla de Aloxana (Alloxan) hasta la rata Experimental (Experimental) y suelta el botn del ratn para inyectar al animal.

3. Pulsa y arrastra un tubo de ensayo nuevo (del aparato distribuidor de tubos de ensayo) sobre el rabo de la rata Control (Control) y suelta el botn del ratn. Observars que caen tres gotas de sangre desde el rabo al tubo. A continuacin, pulsa y arrastra el tubo hasta el soporte n. 1 de la unidad de incubacin de tubos de ensayo. (Nota: la cola es un lugar comn para obtener sangre de una rata. Su extremo puede cortarse fcilmente y recoger la sangre sin perturbar realmente a la rata. La cola se cura rpidamente, sin dao para el animal.)

4. Pulsa y arrastra otro tubo de ensayo nuevo (del aparato distribuidor de tubos de ensayo) sobre el rabo de la rata Experimental (Experimental) y suelta el botn del ratn. De nuevo observars que caen tres gotas de sangre desde la cola al tubo. Pulsa y arrastra el tubo hasta el soporte n. 2 de la unidad de incubacin de tubos de ensayo.

5. Pulsa y arrastra la jeringuilla de Insulina (Insulin) hasta la rata Control (Control) y suelta el botn del ratn para inyectar al animal.

6. Repite el paso 5 con la rata Experimental (Experimental).

7. Repite de nuevo los pasos 3 y 4, obteniendo muestras de sangre de cada rata y colocndolas sobre los soportes n. 3 y n. 4 de la unidad de incubacin.

8. Pulsa el botn Obtener Reactives (Obtain reagents) de encima del estante que actualmente muestra las jeringuillas. Las jeringuillas y las ratas desaparecern y, en su lugar, vers cuatro botellas cuentagotas.

9. Pulsa el botn del ratn y mantenlo sobre la botella de Agua Desionizada (Deionized Water). Arrastra el tapn sobre el tubo n. 1. Suelta el botn del ratn para verter el agua. Vers que se aaden al tubo cinco gotas de agua. El agua se aade para que todos los tubos contengan el mismo volumen.

10. Repite el paso 9 con los restantes tubos de ensayo.

11. Pulsa y mantn el botn del ratn sobre el cuentagotas de Hidrxido de Bario (Barium Hydroxide). Arrastra el tapn hasta el tubo n 1. Suelta el botn del ratn para verter su contenido. Observars que se aaden al tubo cinco gotas de la solucin. (El hidrxido de bario se utiliza para aclarar protenas y clulas de forma que se puedan obtener lecturas limpias de glucosa.)

12. Repite el paso 11 con los restantes tubos de ensayo.

13. Pulsa y mantn el botn del ratn sobre el cuentagotas de la botella de Heparina (Heparin). Todava con el botn del ratn pulsado, arrastra el tapn hasta el tubo n 1. Suelta el botn del ratn para verter la heparina. La heparina es un anticoagulante que evita que se coagule la sangre mientras se trabaja con ella.

14. Repite el paso 13 con los restantes tubos de ensayo.

15. Pulsa sobre el botn Mezclar (Mix) de la unidad de incubacin para mezclar el contenido de los tubos.

16. Pulsa sobre el botn Centrifugar (Centrifuga). Los tubos descendern al interior de la unidad de incubacin para ser centrifugados y luego volvern a la superficie.

17. Pulsa sobre el botn Eliminar Sedimento (Remove Pellet) para quitar cualquier sedimento del proceso de centrifugacin.

18. Pulsa y mantn el botn del ratn sobre la botella de Reactivo Enzimtico para Colorear (Enzyme Color Reagent). Arrastra el tapn hasta el tubo n 1. Suelta el ratn para verter la enzima.

19. Repite el paso 18 con los restantes tubos de ensayo. En un laboratorio real adems deberas agitar los tubos de ensayo tras aadir el reactivo enzimtico para colorear.

20. Pulsa Incubar (Incubate) una vez ms. Los tubos descendern a la unidad de incubacin, se incubarn y volvern a la superficie.

21. Pulsa sobre Ajustar (Set Up) del espectrofotmetro (Spectrophotometer). Esto calentar el instrumento y lo dejar listo para que realices tus lecturas.

22. Pulsa sobre Grfica Estndar de Glucosa (Graph Glucose Standard). Aparecer en el monitor la grfica de la Parte 1 del experimento.

23. Pulsa y arrastra el tubo n.' 1 al espectrofotmetro (Spectrophotometer) y suelta el botn del ratn. El tubo se colocar en su lugar.

24. Pulsa Analizar (Analyze). Vers que aparece una lnea horizontal en la pantalla, y un valor en el indicador de Densidad ptica (Optical Density).

25. Arrastra la regla mvil (la lnea roja vertical en el extremo derecho del monitor del espectrofotmetro) hasta el lugar donde se cruza la lnea horizontal (del paso 24) con la lnea estndar de glucosa. Observa lo que ocurre en el indicador de Glucosa (Glucose) a medida que mueves la regla mvil hacia la izquierda.

Cul es la lectura de glucosa en el lugar en donde la lnea horizontal cruza a la lnea de glucosa estndar?

Tubo de ensayo n 1: ______________ mg/dL de glucosa.

Este es el valor de glucosa de la muestra que ests ensayando.

26. Pulsa Guardar Datos (Record Data) de la unidad de recogida de datos.

27. Pulsa y arrastra el tubo de ensayo desde el espectrofotmetro (Spectrophotometer) hasta el lavador de tubos (Test Tube Washer), pulsa entonces Limpiar (Clear) debajo de la pantalla del osciloscopio.

28. Repite los pasos 22 a 27 para los restantes tubos de ensayo. Anota aqu las lecturas de glucosa de cada uno de ellos:

Tubo de ensayo n 2: ______________ mg/dL de glucosa.

Tubo de ensayo n 3: ______________ mg/dL de glucosa.

Tubo de ensayo n 4: ______________ mg/dL de glucosa.

Cul es el nivel de glucosa en el tubo de ensayo n 1 comparado con el del tubo de ensayo n 2. Da una explicacin a este resultado.

Cul es el nivel de glucosa en el tubo de ensayo n 3 comparado con el del tubo de ensayo n 1? Da una explicacin a este resultado.

Cul es el nivel de glucosa en el tubo de ensayo n 4 comparado con el del tubo de ensayo n 2? . Da una explicacin a este resultado.

Cul fue el efecto de la administracin de insulina sobre el animal Control y sobre el animal Experimental?

Actividad 7: Anlisis de los niveles de Cortisol y AdrenocorticotrpicaCortisol es una hormona secretada por la corteza adrenal y participa en los mecanismos de regulacin del estrs a largo plazo. La libracin de cortisol es estimulada por la hormona adrenocorticotrpica (ACTH) cuya liberacin, desde la hipfisis anterior, es estimulada por la hormona hipotalmica liberadora de corticotropina (CRH). Aumentos en los niveles de cortisol, bien por desrdenes hormonales o inducida (iatrognica) inhibe la liberacin tanto de ACTH como de CRH. Existen numerosos desrdenes hormonales descritos y asociados a alteraciones en los niveles plasmticos de cortisol y ACTH. Debido a su importancia, analizaremos un mtodo para cuantificar los niveles de cortisol y la hormona adrenocorticotrpica. Primero, selecciona Midiendo las Hormonas Cortisol y Adrenocorticotropica (Measuring Cortisol and Adrenocorticotropic Hormone) del men de Experimentos (Experiments). En la nueva pantalla aparecern 5 muestras de sangre tomadas a pacientes y una columna de cromatografa de alta resolucin o HPLC (High- performance liquid chromatography) que ser utilizada para simular un mtodo para la cuantificacin de los niveles de hormonas en sangre.

Explique brevemente en que consiste la tcnica de cromatografa de alta resolucin o HPLC

Tambin se observa en la pantalla una jeringa que ser utilizada para inyectar las muestras en el inyector del HPLC (HPLC injector) para anlisis. Los botones de Cortisol y ACTH son usados para preparar la columna con los solventes necesarios para separar las dos hormonas. El detector medir la cantidad de hormona presente y la convierte en valores de concentracin1. Inicie el experimento pulsando el botn de Cortisol. Con esto, se preparar la columna para la separacin y cuantificacin de cortisol

2. Pulse sobre la jeringa y arrstrela hasta la primera muestra de paciente. Libere el mouse para instantneamente llenar la jeringa con la muestra.3. Pulse nuevamente sobre la jeringa y arrstrela sobre el inyector de HPLC (HPLC inyector). Libere el mouse para que la muestra entre al tubo y fluya hacia la columna. El detector mostrar la concentracin de cortisol de la primera muestra.

4. Registre sus datos (Record data)

5. Pulse el botn para Limpiar (Clean) cerca de la jeringa para tomar la prxima muestra y Limpiar la columna (Clean Column) cerca del margen superior de la pantalla para remover residuos de cortisol en la columna.

6. Repita los pasos 2-6 utilizando las otras muestras

7. Prepare la columna para la separacin y cuantificacin de ACTH

8. Pulse y arrastre la jeringa sobre la primera muestra. Libere el Mouse para llenar la jeringa con la muestra

9. Pulse nuevamente sobre la jeringa y arrstrela sobre el inyector de HPLC. Libere el mouse. El detector mostrar los niveles de ACTH en la primera muestra10. Registre sus datos (Record data)

11. Pulse el botn para Limpiar (Clean) cerca de la jeringa para tomar la prxima muestra y Limpiar la columna (Clean Column) cerca del margen superior de la pantalla para remover residuos de ACTH en la columna.

12. Repita los pasos 8-12 utilizando las siguientes muestras de sangre13. Seleccione una fila de l conjunto de datos (Data Set) y escoja Alto o Bajo (High o Low) basado en los valores que se muestran en el cuadro adjunto.14. Registre sus valores en el cuadro de resultados Explique brevemente las diferencias en los niveles de cortisol y ACTH en cada una de las muestras

Que paciente podra ser diagnosticado con la enfermedad de Cushing? Por qu?

Cul(es) paciente(s) tienen los niveles hormonales caractersticos del sndrome de Cushing?

Cul(es) paciente(s) es probable que se diagnosticado con la enfermedad de Addison? Por qu?

PRACTICA 3

Fisiologa del sistema endocrino

Figura 1. Arreglo experimental para el estudio de metabolismo basal

Figura 3. Arreglo experimental para el estudio de Insulina y diabetes (Parte 1)

Figura 4. Arreglo experimental para el estudio de Insulina y diabetes (Parte 2)