labo reumato

Anticuerpos antifosfolípidos

Anticuerpos dirigidos contra epitopos que contienen fosfolípidos

Surgen de las técnicas para el diagnóstico de la sífilis, muy antiguas (de las primeros inmunoensayos)

VDRL y RPR técnicas para el diagnóstico serológico de la sífilis (1906).

El antígeno de estas técnicas lo constituye una mezcla de:

• cardiolipina (DIFOSFATIDIL GLICEROL)

• lecitina (FOSFATIDIL COLINA)

• colesterol.

En estas técnicas se observó un 8% de falsos positivos (para sífilis), denominados falsos positivos biológicos.

Dentro de estos falsos positivos se distinguen 2 grupos:

• Reacción aguda: los Ac son transitorios y está asociada con infecciones virales, varicela y escarlatina.

• Reacción crónica: (persiste + de 6 meses) asociada a desórdenes autoimmunes (LES, Sjogren, anemia hemolítica, Tiroiditis de Hashimoto y AR.

Los individuos con niveles significativos de anticuerpos anti fosfolípidos

presentan frecuentemente alteraciones de la coagulación

Síndrome anti fosfolípido

Criterios de laboratorio• Anticuerpos anticardiolipina presentes en títulos medios o elevados. De isotipo IgM ó IgG presentes en más de dos ocasiones separadas seis semanas, determinados por ELISA para cardiolipina dependiente del cofactor 2 glicoproteína I.

• Anticoagulante lúpico presente. En más de dos ocasiones separadas al menos seis semanas.

Síndrome anti fosfolípido

• Primario

• Asociado a otra enfermedad

especialmente lupus

infecciones (sífilis)

Los anticuerpos anti fosfolípidos modifican las pruebas para la determinación de la funcionalidad de la cascada de la coagulación, aumentan los tiempos de coagulación

Anticoagulante lúpico

In vitro tiene una actividad anticoagulante contradictoria con lo que sucede in vivo que es pro coagulante

Los anticuerpos antifosfolípidos no sólo involucran al fosfolípido sino también a otra proteína, de la cascada de la coagulación, a la que se le denomina cofactor.

cofactorfosfolípido

Anticuerpos dirigidos sólo al cofactor

Anticuerpos dirigidos al fosfolípido + cofactor

Anticuerpos dirigidos sólo al fosfolípido

• cardiolipina (difosfatidil glicerol)

• fosfatidilserina

• fosfatidilcolina

• fosfatidil inositol

• fosfatidil etanolamina.

Los antígenos fosfolípidicos más comunes

• 2 glicoproteína I (apolipoproteína H). El más estudiado, tiene actividad anticoagulante natural in vitro.

• protrombina

• anexina V

• proteína C

• proteína S

Cofactores

Técnicas empleadas para detectar anticuerpos antifosofolípidos

VDRL y RPR

Técnica de aglutinación en que el fosfolípido (mezcla de lecitina y cardiolipina) se encuentra sobre cristales de colesterol, el anticuerpo aglutina las partículas

SIFILIS

Anticoagulante lúpico(se asoció rápidamente al lupus)

Complejo protrombinasa (factor Xa + factor Va + membranas de plaquetas activadas + Ca ++)


In vivo:

En la prueba in vitro se sustituyen las plaquetas por fosfolípidos, losAc. anti pL inhiben la reacción

protrombina trombina

Anticoagulante lúpico

• prueba de detección (tiempo de tromboplastina parcial activado, tiempo de tromboolastina tisular diluida o prueba del veneno de víbora de Russell).

El diagnóstico se efectúa en tres pasos consecutivos:


• identificación del inhibidor (se repite la prueba que da mal mezclando el plasma del paciente con plasma normal 1:1)

• prueba confirmatoria. Se repite la prueba coagulométrica agregando un exceso de fosfolípidos. Esto debe anular el efecto del inhibidor

Si alguna de estás pruebas está alargada

Si no se corrige existe inhibidor plasmático

La técnica que das más información es el ELISA, puede diferenciar contra qué fosfolípido y contra cuál cofactor están dirigidos. Es la técnica actual de referencia para anticuerpos antifosfolípdos

También da información del isotipo involucrado y título de los mismos.


YY

YYYY

Conjugado anti isotipo inmunoglobulina

Complejo

fosfolípido / cofactor


Tipo de anticuerpo antifosfolípido antígeno Falso positivo biólogico (serología luética +) Cardiolipina

Anticuerpos anticardiolipina

Tipo A con actividad anticoagulante

Tipo B sin actividad anticoagulante

Cardiolipina / 2 glicoproteína I

Anticoagulante lúpico Fosfolípido / protrombina

Anti fosfolípidos verdaderos Fosfolípido sin cofactor

Anticuerpos anti cofactor: Anti 2 – glicoproteína I

Anti protrombina Anti proteína C Anti proteína S Anti anexina V Anti trombomodiluna

2 glicoproteína I

Protrombina

Proteína CProteína SAnexina VTrombomodulina

Anticuerpos anticardiolipina (AAC).

Se detectan por ELISA.

• Los que sólo son contra el fosfolípido sólo aparecen en ciertas infecciones (sífilis). No están vinculados al síndrome

• Los dirigidos al neo epítopo con el cofactor se asocian a manifestaciones clínicas del síndrome.

Valor diagnóstico de los anticuerpos antifosfolípidos y cofactores

Los anticuerpos dirigidos contra otros fosfolípidos, pueden detectarse por ELISA, pero no aportan más información que los AAC.

Anticuerpos contra 2 glicoproteína

Se detectan por ELISA, al inmovilizar la proteína aparece el neoepitopo como si estuviera unido al fosfolípido.

• Tienen gran valor para identificar un grupo de pacientes con el síndrome que tiene riesgo aumentado de trombosis.

• Existen pacientes con las manifestaciones clínicas del síndrome, con anticoagulante lúpico y anticuerpos AAC negativo, que son positivos para esta proteína.

•En conclusión: son de gran valor para la toma de decisiones terapéuticas

La prevalencia en pacientes con lupus oscila entre el 31 al 27 %


Anticuerpos antiprotrombina

Se determinan por técnica de ELISA

Prevalencia global en paciente positivos al anticoagulante lúpico: 55%Prevalencia en pacientes con síndrome primario antifosfolípidos o lupus, positivos al anticoagulante lúpico: 70%

Aunque estos anticuerpos se han asociado a manifestaciones trombóticas, los resultados son contradictorios. Su utilidad clínica está aún por definirse


Anticuerpos anti anexina V

Esta molécula (proteína anticoagulante placentaria) es una anticoagulante natural por desplazamiento de los factores de coagulación de las superficies de fosfolípidos. Se encuentra en placenta y endotelios.

• Crea un estado de hiper coagulabilidad en la placenta.

• se detectan en el 19% de los paciente con lupus


Anticuerpos anticitoplasma del neutrófilo

ANCA

VASCULITISGrupo heterogéneo de enfermedades por lesión inflamatoria de vasos sanguíneos.

Isquemia y/o hemorragia de órganos. La severidad de la enfermedad depende de cuáles vasos están afectados y órganos que irrigan.

Anticuerpos anticitoplasma del neutrófilo anticuerpos anti células endoteliales

VASCULITIS• granulomatosis de Wegener

• síndrome de Churg-Strauss

• poliarteritis nodosa

• poliangitis microscópica

• enfermedad de Kawasaki

DE VASOS PEQUEÑOS

VASCULITIS• arteritis de la temporal

• enfermedad e Takayasu

DE GRANDES VASOS

Las vasculitis pueden ser primarias, no asociadas o consecuencia de otra patología y secundarias, con asociación a otras entidades como infecciones o enfermedades autoinmunes (ARTRITIS REUMATOIDEA Y LUPUS ERITEMATOSO SISTEMCO).

Los anticuerpos anti citoplasma de neutrófilo (ANCA), están dirigidos contra enzimas presentes en los gránulos azurófilos de los neutrófilos

Están asociados a la granulomatosis de Wegener, la poliangitis microscópica y glomerulonefritis idioptática

Vasculitis de pequeños vasos asociadas a ANCAVasculitis de pequeños vasos asociadas a ANCA

VASCULITIS DEFINICIÓN (Conf de Chapel Hill)

Granulomatosis de Wegener

Inflamación granulomatosa del tracto respiratorio y vasculitis necrotizante afectando a vasos de pequeño a mediano calibre (capilares, vénulas, arteriolas y arterias). La glomerulonefritis necrotizante es común

Sindrome deChurg-Strauss

Inflamación granulomatosa rica en eosinófilos afectando al tracto respiratorio, y vasculitis necrotizante de vasos de pequeño a mediano tamaño, y asociada con asma y eosinofilia.

Poliangeítis microscópica (PANm)

Vasculitis necrotizante con escasos o ausentes depósitos inmunes, afectando a los pequeños vasos (capilares, vénulas o arteriolas. Puede haber arteritis necrotizante de arterias de tamaño pequeño y mediano. La glomerulonefritis necrotizante es muy común. A menudo hay capilaritis pulmonar.

GN extracapilar paucinmune

No definida en Consenso de Chappel Hill. Glomerulonefritis necrotizante y con formación de semi lunas, sin evidencias clínicas ni histológicas de vasculitis sistémicas.

ANCA

Inmunoflurescencia indirecta (IFI)

c-ANCA p-ANCA atípicoTinción granular del

citoplasmaTinción del núcleo Tinción diferente

a las anteriores.

Patrones

Patrón cANCA.Patrón cANCA.

• Patrón granular fino con acentuación central en el citoplasma del neutrófilo.

• La especificidad antigénica de c ANCA se identificó como Proteinasa 3 (PR3)

• La PR3 es una enzima localizada en los lisosomas (gránulos azurófilos) de los neutrófilos.

• PR3 degrada elastina, proteína presente en la pared de los vasos sanguíneos.

• PR3 también se denomina antígeno de Wegener.

cANCA 10

Patrón pANCA.Patrón pANCA.

• Fluorescencia perinuclear del citoplasma de los neutrófilos.

• Uno de los Ag responsable del patrón (el más importante) es la mieloperoxidasa, una enzima presente en los lisosomas del neutrófilo.

Fijación con alcohol Fijación con formol

Atención:Atención:

• Otras proteínas lisosomales pueden producir un patrón de fluorescencia pANCA:– Elastasa– Lactoferrina – Catepsina G – Lisozima

c ANCA Patrón citoplasmático IFI

p ANCA Patrón perinuclear IFI

PR3 ANCA ELISA con especificidad por proteinasa 3.

MPO ANCA ELISA con especificidad por mieloperoxidasa

Terminología aceptada

c ANCA+/ PR3 ANCA+ Patrón citoplasmático por IFI, confirmado antígeno por ELISA

pANCA+/MPO ANCA+ Patrón perinuclear por IFI, confirmado antígeno por ELISA

ANCA por ELISAANCA por ELISA

Técnica desarrollada con los objetivos de:

– Conocer la especificidad de los anticuerpos.

– Soslayar problemas de interpretación del patrón de IFI.

ALGORITMO de la paraclínica en las VASCULITIS

1

ANCA +

(60%)

Ac anti MBG +

(10%)

ICC +

(30%)

VASCULITIS CON TOQUE RENALGlomérulonefritis rápidamente progresiva

• ANCA – anticuerpos contra citoplasma del neutrófilo

• MBG - membrna basal

• ICC - inmunocomplejos circulantes

2

Sin manifestaciones

extrarrenales

ANCA +

Con granuloma pulmonar

necrotizante

Arteritis necrotizante

sistémica

Granulomatosis de Wegener

Poliarteritis microscópica

(poliarteririts nodosa)

Glomérulonefritis idiópatica en

semilunas

Ac anti MBG +

3

Con hemorragia pulmonar

Sin hemorragia pulmonar

Nefritis anti membrana basal

glomerular

Síndrome de Goodpasture

Glomérulonefritis lúpica

Ac. Anti DNA + AELO +

Anticuerpos anti estreptolisina

OTROS

ICC +4

Glomérulonefritis post infección por

estreptococos

Crioglobulinas

Glomérulonefritis crioglobulinémica

Glomerulonefritis por inunocomplejos

(otros)

El laboratorio en

Lupus eritematoso sistémico

AUTOANTICUERPOS EN LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO

ANTICUERPOS anti -

Prevalencia en lupus, asociación con otras enfermedades

ADN nativo 40 – 70 %, nefropatía. Anticuerpo marcador

ADN desnaturalizado

70% en enfermedad activa, artritis reumatoidea, lupus inducido por fármacos, hepatitis crónica, infecciones.

Histonas Lupus inducido por drogas (>95%); 50 – 70% en lupus, artritis reumatoidea

Sm 30% criterio diagnóstico (ARA, 1982)

U1-RNP 30 – 40%; fenómeno de Reynaud, enfermedad mixta del tejido conectivo

Ro/SS-A 25-60%; lupus cutáneo (70-90%), lupus neonatal (>90%)

La/SS-B 10-35%;lupus neonatal (75%)

Ribosoma (anti P) 10-20%; sicosis lúpica (56-90%)

Ku 15-40%; síndrome de solapamiento en población oriental

PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular)

3%

lupus

La mayor cohorte estudiada confirma que la mayoría de los casos presentan anti ADN de doble cadena, está ligado estrechamente a la frecuencia y severidad de enfermedad renal.

La presencia de ac. anti cadena única de ADN se describe como más frecuente, pero de menor jerarquia diagnóstica.

Anticuerpos anti ADN

Su presencia es virtualmente diagnóstica por su gran especificidad, pero su frecuencia en los pacientes es baja y no se asocia con características particulares de la enfermedad

Anticuerpos anti Sm

Anticuerpos anti proteína ribosomal P

Asociación con la forma neuropsiquiátrica de la enfermedad.

• Los anticuerpos anti Ro / SSA se asocian con patología renal (especialmente si se encuentra ausente La) y sarpullidos con fotosensibilidad.

• Los anticuerpos anti LA / SSB están particularmente asociados con lupus que presenta además síndrome de Sjögren.

Ambos están presentes en el llamado LUPUS NEONATAL (sarpullido y bloqueo cardiaco)

Anticuerpos anti Ro y La

Presente en el 25% de los pacientes, generalmente a título bajo. No tiene un rol patogénico conocido ni relevancia en el pronóstico

Factor reumatoideo

Prueba% de los casos de lupus

positivos

Anticuerpos anti plaquetas 65

Anticuerpos antifosfolípidos 30 - 40

Factor reumatoideo (bajo título) 30

Depósitos de IgG, C3 y C4 en biopsia de piel 75

Niveles bajos de C3 / C4 60

Velocidad de eritrosedimentación elevada 60

Proteína C reactiva Normal, a menos que haya infección

Crioglobulinemia 60

Nivel de IgG sérica elevada 65

Proteinuria 30

Otras pruebas en lupus eritematoso sistémico

Resultado

Anticuerpos anti ADN doble cadena

C3 C4 Interpretación

Aumento de la actividad. Prestar atención a cambios en el estado clínico

Sospechar toque renal

/ Sospechar una infección. Realizar determinación de proteína C reactiva.

Interpretación de cambios serológicos en muestras seriadas de lupus eritematoso sistémico

El laboratorio en

Artritis reumatoidea

EXÁMENES PARA EL DIAGNOSTICO

• Factor reumatoideo

• Anticuerpos anti péptidos citrulinados cíclicos

Diagnóstico serológico

FACTOR REUMATOIDEO Análisis de su utilidad clínica

Posee significativas limitaciones de sensibilidad,especificidad y valor predictivo. Reconocerlas mejora la utilidad del test alentando a ser mas

selectivos en su solicitud y mas cuidadosos en su interpretación.

A primera vista parece ser particularmente útil

· Esta presente en un 70-90% de los pacientes con AR

· Es el único criterio de laboratorio incluido por la ACR para el diagnostico

de AR.

Sin embargo, las características de los test utilizados y las circunstancias en las cuales son pedidos afectan su utilidad.

La probabilidad de poseer la enfermedad que el clínico estima respecto a ese paciente (PROBABILIDAD PRE-TEST) determina en gran parte la capacidad del FR de ayudar en el diagnostico como vemos en la siguiente tabla:

TABLA 1

Probabilidad de tener AR basada en la ‘probabilidad pre test’ y el resultado del FR, asumiendo una sensibilidad de 80% y especificidad de 95%

Probabilidad RF positivo RF negativo

Pre test

1% 16% 0,2%

15 74 4

75 98 39

90 99 65

De ‘Clinical utility of RF’ Shmerling and Delbanco The American Journal of Medicine, vol91,nov 1991

ENFERMEDADES REUMÁTICAS ASOCIADAS A FR +

AR...........................................................75-90%

SLE.........................................................15-35%

S DE SJOGREN....................................75-95%

ESCLEROSIS SIST..............................20-30%

PM/DM..................................................5-10%

CRIOGLOBULINEMIA..........................40-100%

MCTD....................................................50-60%

VALOR PRONÓSTICO DEL FACTOR REUMATOIDEO

Se ha comprobado estadísticamente que los pacientes con título elevado tienen enfermedad más severa y los pacientes seropositivos para el FR a cualquier titulo se verán mas afectados que los seronegativos.

AR Lupus

FR Positivo en un 70% positivo en un 30% . Título alto bajoANA . Isotipo IgM IgG . Título Bajo Alto . porcentaje de pacientes + 40 % 95 %Unión a ADN <10 % 70 – 85 %Niveles de (C3 + C4) Normal o o normalProteína C reactiva usualmente normalBiopsia de piel - +Nivels séricos de IgG normal a menudo

Serología comparativa de lupus y artritis reumatoidea

En la actualidad se han descrito auto anticuerpos de valor diagnóstico en artritis reumatoidea (2000).

Anti péptidos citrulinados cíclicos (CCP)

Es una modificación post traducción en que se trasforma el entorno arginina de las proteína en citrulina por deiminación

N

H

NH

O

H2N+ NH2

Ca2+

NH2

O

NH

H

N

O

peptidilarginina deiminasa (PAD)

Modificación enzimática de la arginina a citrulina.

Los anticuerpos generados contra proteínas modificadas son generalmente promiscuos en cuanto a su reconocimiento.

• Reconocen tanto a la proteína modificada como la no modificada.

• Por contraste las células T sólo reconocen la proteína modificada.

Una de las proteínas modificas por citrulinización en la artritis reumatoidea es la fibrina.

Los anticuerpos anti filagrina

Pro filagrina filagrina

Deiminación de argininas

Las regiones de la filagrina citrulinadas son los epitopos de los autoanticuerpos.

Péptidos cíclicos citrulinados

Diferenciación celular

Filagrina: es producida durante los últimos estadios de la diferenciación terminal de las células epiteliales en los mamíferos y es sintetizada como una proteína precursora fosforilada (profilagrina)

Grupo AR

positividad

Anti - CCP FR (EIA)

AR temprana (< 3 meses) 385 / 455 344 / 455

Artritis reumatoidea confirmada 189 / 227 72 / 80

Total para el grupo AR% de sensibilidad clínica

547 / 662

80416 / 535

78Grupo control / enfermedad

Donantes sanos 0/323 37/240

Lupus 22/199 69/147

Síndrome de Sjögren 1/86 39/53

Polimiositis y dermatomiositis 0/55 418

osteoartritis 7/66 11/39

Síndrome antifosfolípido 0/10 neg

Esclerodemia 6/96 40/59

Total para el grupo control% especificidad clínica

41/1189

97263/695

62

Ensayo multicétrico de anticuerpos anti CCP

El laboratorio enSíndrome de Sjögren

Anticuerpos en el síndrome de Sjögren

Recordar que puede ser primario o secundario. En este caso aparece asociado a artritis reumatoidea, lupus eritematoso o esclerodermia.

Aparecen anticuerpos anti Ro y anti La.

Anticuerpos específicos de órgano contra

• conductos salivares

• anti-células parietales gástricas

• anti-tiroideos.

Sjögren

Anticuerpos de enfermedades no específicas de órgano

• Factor reumatoideo

• Anticuerpos antinucleares. Se observa en general un patrón moteado como resultado de la presencia de anti SSA-Ro,anti SSB-La o ambos.

No son específicos de la enfermedad, pero son mas frecuentes en estos pacientes.

El ensayo diagnóstico más simple es el test de Shirmer: se coloca una tira de papel de filtro debajo del párpado. La imposibilidad de producir en 5 minutos suficiente cantidad de lágrimas para mojar un área de 10 mm demuestra defectos en al producción de la lágrimas .

En el contexto de otros hallazgos clínicos de enfermedades sistémicas sugiere fuertemente el síndrome de Sjögren.

Sjögren

El laboratorio en

Esclerodermia

AUTOANTICUERPOS EN ESCLERODERMIA

Anticuerpo Antígeno Patrón en la IFI Asociación clínica

Anti SCL70 Topoisomerasa I Nuclear moteado 30% de Difusa

Enz. del nucleolo fino cutánea

Anti-Centrómero Proteínas del ki- Centrómero (en 80% de limita-

netocore metafase) da cutánea

Antinucleolar RNA polimerasa I Nucleolar 25% de difusa

II y III.Fibrilarina cutánea

Anti-PM SCL Complejo de 11 prot. Nucleolar Superposición esclerodermia/miositis

AD

N + ADN sc

ADN dc

AN

A +

La

Sm

RNP

Jo - 1

Perf

il EN

AArtritis reumatoidea

Lupus inducido por drogas

Lupus eritematoso sistémico

Síndrome de Sjögren

Enfermedad mixta del tejido conectivo

Polimiositis / dermatomiositis

Esclerodermia

Ro

Resumen

Scl-70

labo reumato

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