laboratório de virologia clínica e molecular, departamento de...
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Luiz Gustavo Bentim Góes (Pós-Doc) BSc, MSc, PhD
Laboratório de Virologia Clínica e Molecular, Departamento de Microbiologia
Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade de São Paulo
Plataforma Científica Pasteur-USP (SPPU)
Contato: [email protected]
Lab: 11-3091-7293
• O que são virus ?
• Origem da nomeclatura de Coronavírus/Partícula viral
• Genoma viral
• Hospedeiros e doenças relacionadas
• Classificação
• Provável histórico evolutivo de CoV
• Ciclo de Replicação
• Origem e histórico evolutivo de coronaviroses humanas
• Coronavírus emergentes (SARS-CoV, MERS-CoV)
• Coronavírus e morcegos
• Origem do Novo Coronavírus-2019 SARS-CoV-2
• Contém DNA ou RNA como material genético (não apenas DNA como células)
• Material genético é envolto por proteína e envelope em alguns casos
• Vírus se replicam através do arranjo dos componentes produzidos em células
hospederias gerando um grande número de novos vírions
• Parasitas intracelulares obrigatórios infecciosos formados por material genético
(DNA/RNA) envolto por uma capa protéica podendo conter envelope derivado
da membrana celular hospedeiras.
• Sua replicação ocorre apenas em células
• Vírus são dependentes de células hospedeiras
• Blocos moleculares (aminoácidos e nucleosídeos)
• Maquinaria de síntese protéica (ribossomos)
• Energia em forma de adenosina trifosfato (ATP)
• Todos os virus devem, dentro da célula, gerar mRNA para ser traduzido em
proteínas pelo ribossomo da célula hospedeira, ou seja, são parasitas do
maquinário de síntese protéica da célula hospedeira.
Vírus envelopados
Apresentam aspecto de coroa ao microscópio eletrônico
Content Providers(s): CDC/Dr. Fred
Murphy - This media comes from the
Centers for Disease Control and
Prevention's Public Health Image
Library (PHIL)
Holmes KV. N Engl J Med
2003; 348:1948-1951
RNA polaridade positiva (atua como RNAm)
Linear não segmentado
É o maior genoma entre os virus de RNA (~27 a 32 mil bases)
Proteína Não estruturais (ORF1ab) + Proteínas Estruturais + Proteínas acess.
Ex: Proteases, RNA Polimerase, Helicase
Perlman e Netland. Nature Reviews
Microbiology 7, 439-450 (June 2009).Holmes KV. N Engl J Med
2003; 348:1948-1951
Hospedeiros: Grande diversidade de aves e mamíferos
Associados com doenças respiratórias*, entéricas*, hepáticas e neurológicas
Grupo com grande potencial de transmissão entre espécies diferentes e rápida adaptação (spillover)
Alta taxa de mutação
Elevada taxa de recombinação
Tamanho do genoma
Ordem: Nidovirales
Familia: Coronaviridae
Genero: - Alphacoronavirus, Betacoronavirus: predominantemente em mamíferos
- Gammacoronavirus, Deltacoronavirus: predominantemente em aves
AlphaCoV
BetaCoV
GammaCoV
DeltaCoV
HCoV-OC43
CoV-MERS
CoV emergente em humanos
CoV endêmicos em humanos
Estreita relação de CoV
humanos com CoV de
outros mamíferos
nCoV-2019
• SARS-CoV
• SARS-CoV-2
• MERS CoV
• HCoV 229e
• HCoV NL63
• HCoV OC43
• HCoV HKU-1
Fases da replicação viral:
1. Adsorção (Spike/receptor)
2. Liberação genoma viral p/ interior
celular
3. Traducão enzimas do complexo
Replicação/Transcrição (pol1ab)
4. Transcrição RNAm em segmentos
de polaridade neg.
5. Transcrição RNAm em segmentos
de polaridade +
6. Tradução Proteínas estruturais
7. Replicação RNA gênomico
8. Composição do novo vírion
9. Liberação partícula viral
1
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Retículo endoplasmático (ER)
Compartimento intermediário ER-Golgi (ERGIC)
• Spike (Espícula)
- Responsável pelo reconhecimento do receptor celular
- Determina o tropismo tecidual e do hopedeiro
• Cada coronavírus apresenta um receptor celular específico
• Mutações, deleções e recombinações no gene Spike
permitem a adaptação para novos tecidos e Hospedeiros
Domínio de ligação
com receptor
Sítio de
clivagem
Peptídeo
de fusão
Suínos
Felino
Canino
Humano
1936: Vírus da Bronquite Infecciosa (IBV) (Aves)
1946: Vírus da Gastroenterite Transmissível (TGEV) (Porcos)
1949: Vírus da Hepatite de Murinos (MHV)
1966: Coronavírus Humano 229E e OC43
1975: Classificação oficial do novo gênero Coronavírus pelo ICTV
2003: Coronavírus SARS
2004: Coronavírus Humano NL63
2005: Coronavírus Humano HKU1
2012: Coronavírus MERS
2013: Porcine Deltacoronavírus (suínos)
2017: SADS – Coronavírus da Síndrome Aguda da Diarréia Severa (suínos)
2019: New CoV 2019 (nomeclatura temporária)
. HCoV NL63: ancestral comum mais recente com CoV morcego datado de 560-830 anos
. HCoV-229E: 200 anos (Morcegos)
. HCoV-OC43: 120 anos (Bovinos)
. HCoV-HKU-1: 50 anos (Roedores)
. SARS-CoV: 4 -17 anos antes da Epidemia (Morcegos/Civetas)
. MERS-CoV: 2006 (Morcegos africanos/Camelos)
Spillover p hosp. intermediário
Infecções moderadas
Infecções severas
. Coronavírus Humanos endêmicos
. Circulação anual e mundial.
. Responsáveis por episódios de resfriado
comum (0-20% casos de IRA)
. Não emergentes, não zoonóticos
. Origem zoonótica
Coronavírus emergentes e zoonóticos
• Agente etiológico da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS)
• Epidemia iniciada em Nov de 2002 na província de Guangdong, China
• Transmissão por secreções respiratórias (droplets)
• Atingiu 29 diferentes países em 6 meses
• N0 casos: 8096 / N0 de mortes: 774
• Taxa de mortalidade de 9,6 %
• Originado de transmissão viral entre diferentes espécies
• Transmissão por partículas respiratórias (droplets)
• Atuação importante de Super-spreaders (ex: metropolitan hotel)
Caso Index - Hotel Metropolitan, Hong Kong
- Infecção 16 hóspedes:
- Hong Kong
- Canada
- USA
- Singapura
- Vietnam
- Irlanda
• 300 casos
• Amoy Gardens Housing State
• Transmissão provavél pela aerossolização de esgoto contaminado com vírus
Evidências que o SARS-CoV era um agente zoonótico emergente
• Alguns casos humanos ligados aos “Mercados Molhados” (Wet Markets)
• Ausência de Anticorpos anti-SARS em bibliotecas de soros humanos (doença nova)
• Alta soroprevalência de anti-CoV-SARS em comerciantes e manipuladores de animais dos mercados
Evidência sorológica e genética de virus em animais nos mercados
• Detecção de RNA viral e alta soroprevalência em:
Paguma larvata – (Himalayan palm civet)
Nyctereutes procyonoides - Racoon dogs
Obtenção de genomas virais completos de swabs nasais de Civetas (SZ3, SZ16)
Característica genômica diferentes em casos iniciais e tardios de SARS-CoV
ORF8 +29nt: civetas e primeiros casos humanos
ORF8 -29nT: casos humanos do meio ao final da epidemia (possível adaptação a transm entre humanos)
Mas civetas são os reservatórios ? Provavelmente não
Estudos epidemiológicos extensos indicaram ausência de SARS-CoV em civetas de fazendas e livres na natureza
Infecçõe experimentais demonstraram uma alta susceptibilidade a infecção por SARS-CoV
2013: Detecção de SARS-like CoV altamente relacionados a SARS-CoV
95% de similaridade Nt (98% AA)
Capaz de utilizer ACE2
Vírus neutralizado com soro de paciente da SARS
ORf8 com pouca similaridade ao SARS humano
2005: Detecção CoV SARS-like (SL-CoV) em diferentes espécies de morcegos rhinolophus.
Espécies: Rhinolophus sinicus, R. pusillus, R. macrotis, and R. ferrumequinum
87-92% de similaridade Nt
Não utilizam mesmo receptor da SARS (cultivo inviável)
Todas CoVs apresentavam um motif de +29nt na ORF8
2010: Detecção de SL-CoV em morcegos europeus (Bulgaria, Italia, Slovenia) e África
76-86% nt similarity
2005: Primeira detecção de coronavirus (alfaCoV) em morcegos
SARS host
2017: Gde variedade de CoV Sars-like, em morcegos de uma única caverna, altamente
similares ao SARS, com capacidade de utilizar o mesmo receptor celular (ACE2) e relativa
similaridade na ORF8
2015: Detecção de SL-CoV com alta similaridade na ORF8
Alta identidade com SARS-CoV SZ3 de civetas (cepas iniciais)
Agente etiológico da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS)
Primeiro caso ocorreu no Reino da Arábia Saudita
Situação epidemiológica atual: 2494 casos / 858 Mortes (Taxa mortalidade 34%)
Encontrado em 27 paises
• Análise filogenética de seq.s do CoV MERS de casos humanos e de camelos sugerem
multiplos eventos de Spillover
Evidências da origem zoonótica
1. Alta relação filogenética com CoV de morcegos (HKU-4; HKU-5)
2. Detecção de RNA viral e obtenção de virus infectantes de camelos
3. Observação da presença de Anticorpos contra CoV-MERS em amostras de
sangue de camelo obtidas em diferentes paises e datadas de até 20 anos
anterior a descoberta viral
4. Detecção de virus de alta similaridade em morcegos
Taphozous perforates do Reino da Arábia Saudita
Neoromicia capensis da África do Sul (85,6% de identidade nt).
• MERS‐CoVs circulam em camelos por ao menos 2 décadas
• MERS-CoV pode ser transmitido ao homem por contato próximo com
camelos infectados
• A análise do ancestral comum mais recente indica que o ancestral do CoV-
MERS pode ter sofrido spillover de morcegos para camelos a
aproximadamente 20 anos na África
• Camelos infectados foram então importados para a Península Arábica
CoV com alta similaridade genética e capazes de utilizarem o mesmo recetor
de SARS e MERS já foram encontrados em morcegos
Gallagher & Perlman,. 2013
(Modified)
• Até a descoberta do CoV-SARS em 2002 não era conhecido a relação entre
coronavirus e morcegos.
• Após a epidemia de SARS novos coronavirus humanos foram descobertos, sendo dois
endêmicos e não zoonóticos e 2 zoonóticos emergentes (CoV-MERS e New CoV
2019)
• Atualmente 7 CoV são capazes de infectar humanos
• Estudos de vigilância de CoV em morcegos foram realizados em diferentes morcegos
do mundo e atualmente estes são reconhecidos como hospedeiros reservatórios de
CoV e certamente comportaram CoV ancestrais de diferentes mamíferos.
ΒetaCoV_B
ΒetaCoV_C
ΒetaCoV_D
Drexler JF, et l. 2013.
CoV já foram detectados
192 espécies morcegos (13%)
11 famílias de morc.
59 países
Prevalência de 9.6%
Diversidade viral esta
correlacionado à diversidade
de espécies de morcegos
• Alfa e Betacoronavírus são classificados em 15 espécies
• 8 das 15 são espécies de morcegos
V
V
Morcegos apresentam a maior diversidade genética de coronavirus quando
comparado a todos os outros mamíferos e são, provavelemente, os
reservatórios naturais e ancestrais de todos coronavirus de mamíferos.
Alguns coronavírus de morcegos evoluem e infectam novas espécies.
Uma grande diversidade de CoV similares ao SARS-CoV circulam em
morcegos da China e Europa e mutações/recombinações em seu gene Spike
permitem a infecção de novos hospedeiros
Alguns Coronavírus de morcegos são altamente similares a CoV emergentes
da SARS e do MERS e podem utilizar os mesmos receptores, o que evidencia
a possibilidade de uma transmissão direta destes vírus para humanos e
outros animais.
Morcegos são os prováveis reservatórios do CoV-SARS, CoV-MERS e do novo
Coronavírus 2019 SARS-CoV-2.
Uma grande diversidade de CoV com potencial zoonótico desconhecido já
foram detectados em morcegos de diferentes espécies por todo o globo,
incluindo no Brasil e um número maior aguarda ser descoberto.
A transmissão de coronavírus animais para humanos vai continuar
ocorrendo.
Estudos de vigilância e entendimento de eventos de spillover de CoV,
estratégias de diagnóstico rápido e avaliação da ocorrência destes eventos
devem ser estimulados, inclusive em território nacional.
Quais animais podem ser hospedeiros de vírus relacionados ao
SARS-CoV-2 ?
Como e onde ocorreram os eventos de spillover de SARS-CoV-2 ?
Foi um evento único ou múltiplo?
Eventos de Spillover de CoV estão ocorrendo ou ainda podem
ocorrer?
Como surgem doenças emergentes como O SARS-CoV-2 ?
Cobras, Morcegos, Pangolins ? SARS host
SARS-CoV-2
RBD: 75% nt
Células HELA ACE2 Humano
Células HELA ACE2 Morcego
(Rhinolophus sinicus)
Células HELA ACE2 suínos
Células HELA ACE2 civeta
Células HELA ACE2 murino
Células HELA (sem ACE2)
R: Não. Surgimento do CoV-SADS em 2017. Vírus emergente em suínos responsável
pela morte de 25.000 leitões na China (SADS)
A SADS é, muito provavelmente, oriundo de um spillover de CoV de morcegos
relacionados ao Corona de Morcegos HKU2
Nas últimas 2 décadas vírus zoonóticos causadores de alta
mortalidade em humanos e animais foram identificados em
morcegos
• Paramixoírus: Nipah e Hendra
• Coronavírus: SARS, MERS
• Filovírus: Ebola e Marburg
Morcegos:
• Apresentam a maior proporção de vírus zoonóticos e emergentes do
que todas outras ordens de mamíferos
• Apresentam a maior diversidade viral por espécie
• Aparente imunidade a diferentes virus zoonóticos
?
BetaCoV-C
Alfa, BetaCoV B, C, D
Um grupo de cientistas da Universidade de Hong Kong afirmam ter
sequenciado um CoV com 99% de similaridade ao SARS-CoV-2 em
Pangolim da China
Dados de metagenômica indicaram similaridade rm parte do Domínio de ligação do
receptor de CoV de pangolim com SARS-CoV-2
Diferenças ainda estão presents no gene Spike e sequências genômicas completes ainda
não foram liberadas
• O surgimento de virus emergentes é uma consequência da relação entre:
1. Fatores evolutivos virais (ex: taxa mutação ou aspectos da replicação)
2. Aumento do contato direto ou indireto com reservatórios silvestres
• Intensificação da agricultura e pecuária
• Urbanização
• Deflorestamento
• Alterações do habitat
• Invasão de populações humanas em áreas florestais intactas
• Consumo e comercialização de animais silvestres
3. Alta diversidade de mamíferos
4. Perda da biodiversidade
5. Alta densidade pop prox. áreas florestais
1. Presença de uma grande diversidade de CoV em morcegos e
capacidade de alguns utilizarem receptors conservados entre
diferentes espécies (Ex: SARS x ACE2 morcegos, suínos, civetas)
2. Capacidade adaptativa de Coronavírus a novos nichos ou
hospedeiros
3. Aumento do potencial de contato e transmissão de agentes virais
de morcegos reservatórios para hospedeiros intermediários ou
mesmo humanos
1. Transporte de animais infectados para mercados inseridos em áreas
urbanas altamente populosas (ex: comércio illegal)
• Morcegos não são os culpados das pessoas estarem ficando
doentes. Os morcegos coevoluiram com estes vírus, sendo
atualmente inofencíveis para estes organismos. O problema
ocorre quando vírus pulam para novas espécies e atividades
humanas são os causadores destas oportunidades
Perguntas?
• Departamento de Microbiologia, ICB-2 - SP
• Plataforma Científica Pasteur USP
• Full Prof. Dr. Edison Luiz Durigon
• Dra. Angélica Cristine de Almeida Campos
• Universidade Estadual de São Paulo– UNESP
• Prof. Dr. Luzia Queiroz
• Prof. Dr. Ariovaldo Pereira da Cruz Neto
• Dr. Cristiano de Carvalho
• BSc. Guilherme Ambar
• Animal and Plant Health Agency
• Prof. Dr. Anthony Fooks
• Universidade de Medicina CHARITÉ Berlim (Alemanha)
• Prof. Dr. Felix Drexler
• Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo
• Centro Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento