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Labortechniken (2)
Realtime PCR – Quantitative PCR
Prinzip:Nachweis der PCR-Produktein Echtzeit und Quantifizierunganhand eines fluoreszentenReporters
Material:wie bei der konventionellen PCRaber zusätzlich eine Sonde(Taqman probe)
R Q
R=Reporter, Q=Quencher
Taq-PolymeraseSynthese- und Nuklease-Einheit
Labortechniken (2)
Funktionsweise der Hydrolyse-Sonden
1. die synthetische Einheit der Taq-Polymerasesynthetisiert den Gegenstrang
2. die Taq-Polymerase stößt auf die Sonde, dieanschließend durch die Nuklease-Einheit derTaq-Polymerase hydrolysiert wird
3. durch die räumliche Trennung von Reporterund Quencher entsteht ein Fluoreszenzsignal,das proportional zu der Menge an PCR-Produktzunimmt
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Labortechniken (2)
exponientiell
linear
Plateau
konv
enti
onel
le P
CR
Rea
ltim
e-P
CR
Amplifikationskurve (linear – linear)
Labortechniken (2)
Amplifikationskurve (linear – log)
threshold (Schwellenwert)
threshold cycle Ct (Zyklus, beidem die Amplifikationskurveden Schwellenwert kreuzt)
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Labortechniken (2)
106 105 104 103 102Anzahl Moleküle
Amplifikationskurve (linear – log)Standards
Labortechniken (2)
Standardgerade (Ct vs. log c0)
Effektivität = 10(-1/slope)-1(100% Eff. bei einer Steigung von -3,34)
Ct = m log(c) + b
c = 10(Ct-b)/m
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Labortechniken (2)
Bericht (Report)
Labortechniken (2)
7300 Realtime PCR System
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Labortechniken (2)
7300 Realtime PCR System - Schublade
Labortechniken (2)
Pyrosequencing-Reaktion (1)
1. PCR mit einem biotinyliertem Primer
2. Denaturierung des PCR-Amplifikates
3. Binden des biotinylierten DNA-Stranges an Streptavidin-Kügelchen
Kügelchen
Biotin
Biotin
Biotin
StreptavidinSequenzierungsprimer
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Labortechniken (2)
Pyrosequencing-Reaktion (2)
Labortechniken (2)
Film ab!
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Labortechniken (2)
PyroMark ID
Labortechniken (2)
PyroMark ID - Cartridgehalterung
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Labortechniken (2)
PyroMark ID – Einheit für Mikrotiterplatte
Mikrosatellitenanalyse
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Genom
„Viele höhere Organismen besitzen während der Hauptphase ihrer Entwicklung einen diploiden Chromosomensatz, d.h. die Zellen enthalten jedes Chromosom in zweifacher Ausfertigung (eines von jedem Elternteil). Dabei handelt es sich in der Regel nicht um identische Kopien: Zwar passen beide hinsichtlich Form, Struktur und der Abfolge der Genorte genau zueinander - darum spricht man von homologen (gleichartigen) Chromosomen – die Gene selbst jedoch können in verschiedenen Ausführungen (Allelen) vorliegen.“
Kodierende/ nicht kodierende Bereiche
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Mikrosatelliten• nicht kodierende, repetitive DNA-Sequenzen
(Bsp.: CACACACACA)
• wiederholter Abschnitt: 2-6 Basenpaare
• Anzahl der Wiederholungen= stark variabel (hohe Mutationsrate):
- Beeinflussung der Gesamtlänge des MS- geeignet als Genmarker
Anwendung
• Vaterschaftsnachweis, Bestimmungdes Verwandtschaftsgrades
• Kopplungsanalyse
• Genomkartierung, u.a.
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Beispiel: Vaterschaftsnachweis
Primer• Suche nach einem MS im Genom• flankierende Sequenzen beidseits des MS= Primer• einmalig an diesem einen Locus=> funktionieren für jedes Individuum
einer Spezies
forward- Primer
GATCTCTCTCTGTCTTATCTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGCTTTGGCCCTCCGAAGAGTTCTCTCAGGGCTAAGAAAGGACGAGGTTGATGTCTGAACACCTAACAAAGCGTAACCTCGTCCTTTCTTAGCC
reverse-Primer
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Verfahren
1. Der DNA- Abschnitt, der den MS enthält, wird mittels PCR amplifiziert (Primer)
2. Die Größe des Amplifikats hängt ab von der Anzahl der Wdh. innerhalb des MS
3. Das Amplifikat wird auf ein Gel aufgetragen und eine Gelelektrophorese durchgeführt (Auftrennung der DNA-Fragmente nach Größe)
4. Normalerweise: 2 Allele für alle MS gibt es einen Unterschied i.d. Anzahl der Wiederholungen zwischen diesen beiden Allelen, erscheinen 2 separate Banden auf dem Gel
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In vitro- Ergebnisse
Multiplex- PCR Längenstandard
Null- Allel
heterozygot
homozygot
QTL- Analyse
• Phänotyp: Zusammenspiel verschiedener Gene
• unterschiedlich starker Einfluß der jeweiligen Gene
• Ziel: Identifikation der Gene mit möglichst großem Einfluß
• Beispiel Krankheitsresistenz: Phänotyp= resistente/ empfindliche Tiere
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Rolle der Mikrosatelliten bei der QTL-Analyse
Klärung des Erbganges:
Taucht ein Mikrosatellit stets bei Tieren mit einem bestimmten Phänotyp auf, ist davon auszugehen, daß ein für diesen Phänotyp verantwortliches Gen gemeinsam mit dem Mikrosatellit vererbt wird (Kopplung)
Da Lokalisation der Mikrosatelliten bekannt =>
ungefähre Lokalisation des relevanten Gens auf dem Chromosom
Prüfung:
Welche Gene liegen in diesem Bereich des Chromosoms?
Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!