laporan 4 biokim klt

8/18/2019 Laporan 4 Biokim KLT

1/17


2/17

membuktikan adanya asam amino yang telah terpisah itu. +arak yang telah ditempuh

olehsuatu asam amino tertentu (b$, dibandingkan dengan jarak pelarut dari garis a*al

hingga garis akhir diberi lambang f . (nna poedjiadi, !""#$

arga f yaitu ba merupakan ciri khas suatu asam amino pada pelarut tertentu.

Dengan menggunakan standar asam-asam amino yang telah diketahui macamnya pada

kramotografi kertas seperti yang dilakukan diatas, dapat diketahui macam asam amino

yang diperiksa. Penentuan macam asam amino dapat pula dilakukan dengan

menghitung harga f masing-masing asam amino, kemudian dibandingkan dengan

harga f asam amino yang terdapat ditabel yang telah ada. (nna poedjiadi, !""#$

romatografi penukar ion merupakan metoda paling penmting banyak

dipergunakan untuk memisahkan, mengidentifikasikan, dan menghitung jumlah tiap-

tiap asam amino di dalam suatu campuran. 'etoda ini juga memanfaatkan perbedaan

dalam tingkah laku asam-basa dari asam amino, tetapi terdapat faktor tambahan yang

menyebabkan prosedur ini efektif. olom kramotografi terdiri dari tabung panjang yang

diisi oleh granula resin sintetik yang mengandung gugus yang bermuatan tetap. esin

dengan gugus anion tertentu disebut resin penukar kation/ resin dengan gugus kation

tertentu disebut resin penukar anion. (0ehninger, 1#2!$

romatografi lapis tipis. romatografi ini menggunakan aluminium oksida,

serbuk selulosa atau silika gel sebagai absorben yang berupa lapis tipis yang diletakkkan

di atas selembar kaca. &eperti halnya pada kromatografi kertas, larutan yang

mengandung beberapa asam amino diteteskan di atas absorben dan dibiarkan bergerak.

Pemisahan asam amino didasarkan perbedaan bergerak asam-asam amino tersebut pada

p tertentu. (nna poedjiadi, !""#$

Pela!anaan KLT

1. 3ase Diam

3ase diam yang digunakan dalam 04 merupakan penjerap berukuran kecil

dengan diameter partikel antara 1"-5" 6m. &emakin kecil ukuran rata-rata partikel

fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja

04 dalam hal efisiensi dan resolusinya.


3/17

Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa,

sementara mekanisme sorpsi yang utama pada 04 adalah adsorpsi dan partisi

(7andjar 8 ohman, !""9$.

!. 3ase 7erak

3ase gerak pada 04 dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan

mencoba-coba karena *aktu yang diperlukan hanya sebentar. &istem yang paling

sederhana ialah campuran ! pelarut organik karena daya elusi campuran kedua

pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi

secara optimal. :erikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi

fase gerak ;

1$ 3ase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena 04

merupakan teknik yang sensitif.

!$ Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga f

terletak antara ",!-",2 untuk memaksimalkan pemisahan.

5$ Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,

polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti

juga menentukan nilai f. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar

seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan

meningkatkan harga f secara signifikan (7andjar 8 ohman, !""9$.

Penotolan /ampel

Untuk memperoleh roprodusibilitas, %olume sampel yang ditotolkan paling

sedikit ",< 6l. +ika %olume sampel yang ditotolkan lebih besar dari !-1" 6l, maka

penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan

(7andjar 8 ohman, !""9$.

Pengembangan:ila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan

sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase

gerak. 4epi bagian ba*ah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam

fase gerak kurang lebih ",


4/17

bejana dilapisi dengan kertas saring. +ika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas

saring, maka dapat dikatakan bah*a fase gerak telah jenuh (7andjar 8 ohman, !""9$.

-ete! Berca

Deteksi bercak pada 04 dapat dilakukan secara kimia dan fisika. )ara kimia

yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui

cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. )ara fisika yang dapat digunakan

untuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi

sinar ultra%iolet. 3luorosensi sinar ultra%iolet terutama untuk senya*a yang dapat

berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas (7andjar 8 ohman, !""9$.

Deteksi senya*a dilakukan dengan menggunakan detektor U= di ba*ah sinar

U= ! nm, indikator pada plat 04 akan memancarkan *arna hijau dan pada U= 5??nm akan memancarkan *arna ungu. omponen yang menyerap cahaya pada ! atau

5?? nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya (7ibbons, !""?$.

'etode deteksi lain adalah dengan menggunakan pereaksi semprot. Pereaksi semprot

yang umum digunakan dapat dilihat pada tabel !.!.

VI. Alat *an Ba0an

1. lat

&. 7elas kimia


5/17

Plat gelas yang dipakai hars bersih, terutama harus bebas lemak. 4imbang !<

gr silica gel dan kocok dengan


6/17

5. &ebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi f pada kromatografi lapis

tipis B

>. 4erangkan bagaimana orang melakukan analisa kuantitatif sautu zat

tertentu dengan cara kromatografi lapis tipis B,! cm 5," cm 5 cm #"4&

sparagin > cm 5,< cm 5,9 cm ",29<

sam amino C < cm 1"' cm 5,! cm #"32

I


7/17

'assa 7lysin yang dibutuhkan ! gram (dimasukkan kedalam labu ukur 1""

ml F aGuadest$

B. Pembatan Lartan Argnn ' >

=olume larutan yang akan dibuat 1"" ml

! E 7ly x gr

100ml x 100

!1"" (1""$ C (1""1""$

!""1"" C

! gram C

'assa rginin yang dibutuhkan ! gram (dimasukkan kedalam labu ukur 1""

ml F aGuadest$

7. Pembatan Lartan A!paragn ' >


! E 7ly x gr100ml

x 100

!1"" (1""$ C (1""1""$

!""1"" C

! gram C

'assa sparagin yang dibutuhkan ! gram (dimasukkan kedalam labu ukur

1"" ml F aGuadest$

-. Pembatan Lartan < ' >


! E 7ly x gr

100ml x 100

!1"" (1""$ C (1""1""$

!""1"" C

! gram C

'assa C yang dibutuhkan ! gram (dimasukkan kedalam labu ukur 1"" ml F

aGuadest$

E. Pembatan Lartan Pen9emprot pr ntrat

4ambahkan !,< ml larutan jenuh kuprinirat dalam air ke dalam !

=olume larutan yang akan dibuat 1 ml

larutan=V zat terlarut

V larutan x100

1"E x ml

1ml x100


8/17

1"1"" (1$ C (1""1""$

1"1"" C

",1 ml C

=olume C yang dibutuhkan ",1 ml (ditambahkan ",# ml aGuades $

Membat lartan alo0ol (etanol) ?3> !eban9a '$# mL0arutan Hnduk ; etanol 1"" E

larutan=V zat terlarut

V larutan x100

96=V zat terlarut

250ml x 100

V zat terlarut

=24000ml

100

V zat terlarut =240mletanol (ditambahkan 1"ml aGuades$

@. Pembatan lartan pen9emprot nn0*rn

0arutkan ",5 gr ninhidrin ke dalam 1"" ml n-butanol. 4ambah 5 ml asam asetat

glasial.

=. Meng0tng R+ a!am%a!am amno

R+ Jarak yang ditempuh olehkomponen

Jarak yangditempuholeh pelarut

1. rginin 5. sparagin

f 3cm

5cm ",? f 3,5cm

4 cm ",29<

!. 7lisin >. sam amino

f

3cm

4,2cm ",91 f

3,2cm

5cm ",?>


9/17

O

O

OH

OH

H COOH

NH2

F

ninhidrin 7lisin

C

C

C

O

O

OH

OH

ninhidrin

F I-5

C

C

C

O

H

HO

O

hidridantin

F

C

C

C

O

H

HO

O

F H3C CH

O

F I-5 F )J!

hidridantin

C

C

C

O

OH

C

C

O

O

N C F 5-!J

diketodihidrindilendiketodihidrindamin*arna biru ungu


10/17

H3N+

CH

C

O

O

R

+ CH3CH 2OH H3N

+

CH

C

O

OCH 2CH3

R

+

Asam Amino

REAK/I A/AM AMINO -EN=AN ETANOL

C

C

C

O

O

OH

OH

+ R C

H

NH2

COOH

Asam Amino

C

C

C

O

O

H

OH

NH 3 CO 2 + R C

H

O

C

C

C

O

O

OH

OH

+ 3H2OO + H

+

C

C

C

O

O

N C

C

C

O

O

Ninhidrin

Berwarna merah muda

Etanol

Ninhidrin

REAK/I A/AM AMINO -EN=AN NIN:I-RIN

H2O

REAKSI ASAM AMINO DENGAN KUPRINITRIT

H2NCH

C

O

OH

R

+ Cu(NO 3)2

O

C

R

O

Cu++

NH2NH2

O

R

C

O

+ 2NO3-

asam amino

ku!ini"!i"

s#n$a%a komks un'u


11/17

jenis asam amino berbeda yaitu, arginin,

glisin asparagin dan asam amino C pada permukaan lapis tipis. sam amino yang

digunakan memiliki golongan yang berbeda-beda yaitu arginin (bermuatan positif$,

alanin (non polar$, glisin (polar$ dan asam amino C yang belum diketahui dan dan akan

diidentifikasi berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan. Perbedaan jenis asam

amino ini dimaksudkan agar terbentuk *arna yang berbeda dari masing-masing asam

amino sehingga lebih mudah dalam mengamati dan menganalisisnya. :eri jarak setiap

penetesan asam amino. Pemberian jarak dilakukan agar ketika penetesan asam aminotidak saling bercampur dan keringkan. emudian masukan kedalam alat yang berisi

eluen dari etanol. 4etesan asam amino tidak boleh terendam eluen karena akan

menyebabkan asam amino turun bukan naik. 4unggu hingga eluen naik sampai 1" cm.

&etelah sampai 1" cm keringkan lapis tipis dalam suhu kamar.

&etelah kering baru lapis tipis di semprot dengan menggunakan penyemprot

ninhidrin. Penyemprotan ini harus merata tidak boleh ada permukaan lapis tipis yang

tidak terkena semprotan. Penyemprotan dilakukan untuk mengetahui *arna dari asam


12/17

amino yang di uji. &etelah di semprot baru di keringkan dalam o%en dengan suhu 11"

℃ selama 1" menit. &etelah lapis tipis sudah kering baru disemprot lagi dengan

menggunakan penyemprot kupri nitrat. Penyemprotan ini dilakukan untuk lebih

memperjelas *arna dari asam amino yang di identifikasi dan dikeringkan. itung nilai

f setiap asam amino.

Pada percobaan ini fase diam yang digunakan adalah silica gel 7 sedangkan fase

geraknya digunakan eluen dari etanol. Dari hasil percobaan ini didapatkan nilai f dan

*arna yang dihasilkan dari asam amino yang digunakan. Iilai f dari percobaan ini

didapatkan rginin ".?, 7lisin ".91, sparagin ".29< dan asam amino C ".?> dan *arna

yang dihasilkan arginin memiliki *arna biru, glisin ber*arna orange kekuningan,

asparagin ber*arna merah kekuningan, dan asam amino C ber*arna biru keunguan.

Dari hail pengamatan yang didapat asam amino C ialah arginin. hasil dari percobaan

yang didapatkan sangat jauh berbeda dengan teori yang telah diketahui nilai f yaitu

7lisin ",!? , arginin ",!", alanin ",52, dan arginin ",!". 'ungkin kesalahan dilakukan

pada saat pembuatan lapis tipis yang ketebalan, pada saat pengambilan serbuk silica gel

7, pada saat melarutkan silica gel 7, permukaan kaca yang kurang bersih dan kurang

tepatnya perbandingan eluen yang digunakan atau kurang tepatnya posisi lempeng kaca

maupun cara penyemprotan silica gel dengan ninhidrin kan kuprinitrat. &ehingga

komponen akan terdorong yang membuat jarak semakin jauh.

.

. 0empeng kaca yand digunakan harus bebas lemak agar tigak mengganggu

proses elusi dan pemisahan.


13/17

0ehninger, . 1#22. Dasar-dasar :iokimia. 4erjemahan 'aggy 4hena*idjaya.

@rlangga, +akarta

Poedjiadi, nna. !""#. Dasar-dasar :iokimia. +akarta; UH Press.

Kirahadikusumah, 'uhammad. 1##9. Biokimia Protein, Enzim, dan Asam Nukleat.

:andung ; H4:


14/17

5. &ebutkan factor-faktor yang mempengaruhi f pada 04L

+a*ab ;

• &truktur kimia dari senya*a yang sedang dipisahkan.

• &ifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

:iasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam o%en, hal ini akan

mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari

penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap

harga f meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi

hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama, jika menggunakan penyerap

yang sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada$ dicampur hingga

homogen.

• 4ebal dan kerataan dari lapisan penyerap.


15/17

Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi

perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. etidakrataan akan menyebabkan

aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.

• Pelarut (dan derajat kemurniannya$ fase bergerak.

emurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam

kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut

digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.

• Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.

• 4eknik percobaan.

rah pelarut bergerak di atas plat. ('etoda aliran penaikan yang hanya

diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran

penurunan dan mendatar juga digunakan$.

• +umlah cuplikan yang digunakan.

Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil

penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak

kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada

harga-harga f .

• &uhu.

Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini

terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang

disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.

• esetimbangan.

4ernyata bah*a kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam

kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh

dengan uap pelarut. &uatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan

uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan

dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat

pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.

>. :agaimana orang dapat melakukan 04 dalam analisa kuantitatif suatu zatL


16/17

+a*ab ;

• Dengan menyemprotkan lempeng dnegan asam sulfat


17/17

Lampran '

romatografi lapis tipis di tambah etanol

romatografi lapis tipis di semprot romatografi lapis tipis Fninhidrin

dengan hinhidrin di keringkan

laporan 4 biokim klt

Documents