Tujuan PercobaaanTujuan dari percobaan ini yaitu dapat memahami metode identifikasi protein.Teori Dasar1. ProteinProtein merupakan sumber asam amino yang terdiri dari unsur C, H, O, dan N. Protein berfungsi sebagai zat pembangun jaringan-jaringan baru, pengatur proses metabolisme tubuh dan sebagai bahan bakar apabila keperluan energi tubuh tidak terpenuhi oleh lemak dan karbohidrat (Winarno, 2004).Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor . Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus. Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton (Kusnawidjaya, 1989).Protein tersusun dari berbagai asam amino yang masing-masing dihubungkan dengan ikatan peptida. Peptida adalah jenis ikatan kovalen yang menghubungkan suatu gugus karboksil satu asam amino dengan gugus amino asam amino lainnya sehingga terbentuk suatu polimer asam amino (Toha, 2001). 2. Klasifikasi2.1 Berdasarkan Fungsi Biologisnyaa) Protein EnzimGolongan protein ini berperan pada biokatalisator dan pada umumnya mempunyai bentuk globular. Protein enzim ini mempunyai sifat yang khas, karena hanya bekerja pada substrat tertentu.Yang termasuk golongan ini antara lain:(1) Peroksidase yang mengkatalase peruraian hydrogen peroksida.(2) Pepsin yang mengkatalisa pemutusan ikatan peptida.(3) Polinukleotidase yang mengkatalisa hidrolisa polinukleotida.

b) Protein PengangkutProtein pengangkut mempunyai kemampuan membawa ion atau molekul tertentu dari satu organ ke organ lain melalui aliran darah.Yang termasuk golongan ini antara lain:(1) Hemoglobin pengangkut oksigen.(2) Lipoprotein pengangkut lipid.

c) Protein StrukturalPeranan protein struktural adalah sebagai pembentuk structural sel jaringan dan memberi kekuatan pada jaringan.Yang termasuk golongan ini adalah elastin, fibrin, dan keratin.

d) Protein HormonAdalah hormon yang dihasilkan oleh kelenjar endokrin membantu mengatur aktifitas metabolisme didalam tubuh.

e) Protein PelindungProtein pada umumnya terdapat pada darah, melindungi organisme dengan cara melawan serangan zat asing yang masuk dalam tubuh.

f) Protein KontraktilGolongan ini berperan dalam proses gerak, memberi kemampuan pada sel untuk berkontraksi atau mengubah bentuk.Yang termasuk golongan ini adalah miosin dan aktin.

g) Protein CadanganProtein cadangan atau protein simpanan adalah protein yang disimpan dan dicadangan untuk beberapa proses metabolisme.

2.2 Berdasarkan Struktur Susunan Molekula) Protein Fibriler/SkleroproteinProtein ini berbentuk serabut, tidak larut dalam pelarut-pelarut encer, baik larutan garam, asam, basa, ataupun alkohol. Berat molekulnya yang besar belum dapat ditentukan dengan pasti dan sukar dimurnikan. Susunan molekulnya terdiri dari rantai molekul yang panjang sejajar dengan rantai utama, tidak membentuk kristal dan bila rantai ditarik memanjang, dapat kembali pada keadaan semula. Kegunaan protein ini terutama hanya untuk membentuk struktur bahan dan jaringan. Contoh protein fibriler adalah kolagen yang terdapat pada tulang rawan, miosin pada otot, keratin pada rambut, dan fibrin pada gumpalan darah (Winarno, 2004).

b) Protein Globuler/SferoproteinProtein ini berbentuk bola, banyak terdapat pada bahan pangan seperti susu, telur, dan daging. Protein ini larut dalam larutan garam dan asam encer, juga lebih mudah berubah dibawah pengaruh suhu, konsentrasi garam, pelarut asam, dan basa jika dibandingkan dengan protein fibriler. Protein ini mudah terdenaurasi, yaitu susunan molekulnya berubah yang diikuti dengan perubahan sifat fisik dan fisiologiknya seperti yang dialami oleh enzim dan hormon (Winarno, 2004).

2.3 Berdasarkan Komponen Penyusunana) Protein SederhanaProtein sederhana tersusun oleh asam amino saja, oleh karena itu pada hidrolisisnya hanya diperoleh asam-asam amino penyusunnya saja. Contoh protein ini antara lain, albumin, globulin, histon, dan prolamin.

b) Protein MajemukProtein ini tersusun oleh protein sederhana dan zat lain yang bukan protein. Zat lain yang bukan protein disebut radikal protestik. Yang termasuk dalam protein ini adalah:(1) Phosprotein dengan radikal prostetik asam phostat.(2) Nukleoprotein dengan radikal prostetik asam nukleat.(3) Mukoprotein dengan radikal prostetik karbohidrat.

2.4 Berdasarkan Asam Amino Penyusunnyaa) Protein yang tersusun oleh asam amino esensialAsam amino esensial adalah asam amino yang dibutuhkan oleh tubuh, tetapi tubuh tidak dapat mensintesanya sendiri sehingga harus didapat atau diperoleh dari protein makanan. Ada 10 jenis asam esensial yaitu isoleusin (ile), leusin (leu), lisin (lys), metionin (met), sistein (cys), valin (val), triptifan (tryp), tirosina (tyr), fenilalanina (phe), dan treonina (tre) (Tejasari, 2005).

b) Protein yang tersusun oleh asam amino non esensialAsam amino non esensial adalah asam amino yang bibutuhkan oleh tubuh dan tubuh dapat mensintesa sendiri melalui reaksi aminasi reduktif asam keton atau melaui transaminasi. Yang termasuk dalam protein ini adalah alanin, aspartat, glutamat, glutamine (Tejasari, 2005).

2.5 Berdasarkan Sumbernyaa) Protein HewaniYaitu protein dalam bahan makanan yang berasal dari hewan, seperti protein daging, ikan, ayam, telur, dan susu (Safro, 1990).

b) Protein NabatiYaitu protein yang berasal dari bahan makanan tumbuhan, seperti protein jagung, kacang panjang, gandum, kedelai, dan sayuran (Safro, 1990).

2.6 Berdasarkan Tingkat Degradasia) Protein alami adalah protein dalam keadaan seperti protein dalam sel.b) Turunan protein yang merupakan hasil degradasi protein pada tingkat permulaan denaturasi. Dapat dibedakan sebagai protein turunan primer (protean, metaprotein) dan protein turunan sekunder (proteosa, pepton, dan peptida) (Winarno, 2004).

3. Analisis ProteinAnalisis protein dapat dilakukan dengan dua cara:3.1 Analisis Protein Kualitatif

a) Reaksi BiuretReaksi ini merupakan tes umum yang baik terhadap protein, dilakukan dengan cara menambahkan larutan protein dengan beberapa tetes CuSO4 encer dan beberapa ml NaOH. Reaksi positif dengan warna ungu, terjadi karena adanya kompleks senyawa yang terjadi antara Cu dengan N dari molekul ikatan peptida.

b) Reaksi NinhidrinLarutan protein ditambah dengan beberapa tetes larutan ninhidrin kemudian dipanaskan beberapa saat dan didiamkan hingga dingin, hasil positif apabila terbentuk warna biru (Kusnawidjaya, 1989).

c) Reaksi MolishReaksi positif menunjukkan adanya gugus karbohidrat pada protein. Tes ini dilakukan dengan cara, larutan protein ditambah dengan beberapa tetes alpha naftol, dikocok perlahan selama 5 detik, miringkan tabung dan ditambahkan H2SO4melalui dinding tabung, kemudian tegakkan kembali tabung. Hasil positif bila terlihat adanya cincin diperbatasan kedua cairan.

d) Reaksi MillonDilakukan dengan cara menambahkan larutan protein dengan beberapa tetes reagen millon diaduk sampai adanya endapan putih kemudian dipanaskan hati-hati dan ditambahkan NaNO3 setelah dingin. Hasil positif ditandai dengan terjadinya warna merah pada larutan tersebut.

3.2 Analisis Protein Kuantitatif

3.2.1 Cara KjeldahlCara kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,5, diperoleh nilai protein dalam bahan makanan itu. Angka 6,5 berasal dari angkakonversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen. Prinsip cara analisis Kjeldahl adalah, mula-mula bahan didekstruksi dengan asam sulfat pekat menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn. Amonia yang terjadididestilasi dengan zat pengikat, kemudian jumlah nitrogennya ditentukan dengan menitrasi destilat. Cara Kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas tiga cara, yaitu cara makro, semimakro, dan mikro. Cara makro Kjeldahl digunakan untuk contoh yang sukar dihomogenisasi dan besar contoh 1-3 gram, semimakro Kjeldahldirancang untuk contoh ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogen, dan cara mikro digunakan untuk contoh yang lebih kecil lagi yaitu 10-30 mg. Cara Kjeldahl ini terdiri dari beberapa tahap sebagai berikut:

a) Tahap DestruksiDalam tahap ini, sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terurai menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogennya teroksidasi menjadi CO, CO2, H2O, sedangkan nitrogennya berubah menjadi NH4HSO4. Untuk mempercepat proses destruksi, ditambah selenium sebagai katalisator.

b) Tahap DestilasiPada tahap ini amonium hidrogen sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar tidak menghasilkan gelembung gas yang besar maka dapat ditambah dengan logam seng. Ammonia yang dibebaskan selanjutnya ditangkap oeh larutan asam, asam yang dapat dipakai adalah asam borat 2%. Agar kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam larutan asam. Destilasi diakhiri apabila semua ammonia terdestilasi sempurna yaitu destilasi tidak basa lagi.

c) Tahap TitrasiPada tahap ini destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N dengan menggunakan indikator methyl orange (MO) sampai terjadi perubahan warna dari kuning menjadi orange.

(Sudarmaji, dkk, 1989).3.2.2 Cara DumasPrinsip cara ini adalah bahan makanan contoh dibakar dalam atmosfer CO2 dan dalam lingkungan yang mengandung kupri oksida. Semua atom karbon dan hidrogen akan diubah menjadi CO2 dan uap air. Semua gas dialirkan kedalam larutan NaOH dan dilakukan pengeringan gas. Semua gas terabsorpsi kecuali gas nitrogen, dan gas ini kemudian dianalisis dan diukur (Winarno, 2004).

Alat dan bahana. Uji BiuretAlat : tabung reaksi, pipet tetes, gelas ukur.Bahan : natrium hidroksida 2,5 N, larutan protein, larutan (CuSO4) 0,01 M.

b. Pengendapan dengan LogamAlat : tabung reaksi, pipet tetes, gelas ukur.Bahan : larutan protein, merkuri (II) klorida, HgCl2 0,2 M

c. Pengendapan dengan GaramAlat : tabung reaksi, pipet tetes, batang pengaduk, kertas saring, gelas ukur.Bahan : larutan protein, larutan (NH4)2SO4, reagen Millon, reagen uji biuret.

d. Pengendapan dengan AlkoholAlat : tabung reaksi, pipet tetes, gelas ukur.Bahan : larutan protein, buffer asetat 1 M, asam klorida 0,1 M, natrium hidroksida 0,1 M, etil alcohol 95%

e. Uji koagulasiAlat : tabung reaksi, pipet tetes, gelas ukur, stopwatch, spatulaBahan : asam asetat 1 M, larutan protein, reagen Millon, air.

f. Denaturasi ProteinAlat : tabung reaksi, pipet tetes, gelas ukur, stopwatch, thermometer, pH meterBahan : larutan albumin, buffer asetat pH 4,7 (1M), HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M.

Prosedur Percobaana. Uji BiuretDitempatkan 1,5 ml larutan protein pada tabung reaksi. Ditambahkan 0,5 ml Natrium hidroksida 2,5 N, diaduk. Lalu ditambahkan pula 1 tetes larutan tembaha sulfat 0,01 M, diaduk. Jika tidak timbul warna, maka ditambahkan lagi 1 atau 2 tetes larutan tembaga sulfat.

b. Pengendapan dengan LogamSebanyak 1,5 ml larutan protein ditempatkan di tabung reaksi. Kemudian, ditambahkan 5 tetes HgCl2 0,2 M. Diulangi percobaan tersebut dengan memakai Pb asetat 0,2 M.

c. Pengendapan dengan GaramLarutan protein sebanyak 5 ml dijenuhkan dengan ammonium sulfat. Pertama, ditambahkan sedikit garam tersebut ke dalam larutan protein, diaduk hingga melarut. Ditambahkan lagi sedikit ammonium sulfat dan diaduk lagi. Dilakukan sehingga sedikit garam tertinggal tidak terlarut. Setelah larutan tersebut jenuh, lalu disaring. Uji kelarutan endapan di dalam air. Diuji pula endapan reagen Millon dan filtrate dengan uji biuret.

d. Pengendapan dengan AlkoholDisiapkan 3 tabung reaksi. pada masing-masing tabung dimasukkan larutan albumin sebanyak 2,5 ml. Lalu pada tabung pertama, ditambahkan 0,5 ml buffer asetat pH 4,7 (1 M), amati perubahan yang terjadi. Pada tabung kedua, ditambahkan 0,5 ml HCl 0,1 M, amati perubahan yang terjadi. Pada tabung ketiga, ditambahkan 0,5 ml NaOH 0,1 M, amati perubahan yang terjadi. Lalu pada setiap tabung seluruhnya ditambahkan etil alcohol 95% sebanyak 3 ml. Amati perubahan pada masing-masing tabung.

e. Uji KoagulasiSebanyak 2,5 ml larutan protein ditempatkan ke dalam tabung reaksi. ditambahkan 2 tetes asam 1 M. diletakkan tabung tersebut dalam air mendidih selama 5 menit. Endapan diambil dengan spatula. Uji kelarutan endapan dalam air, dan uji pula endapan dengan reagen Millon.

f. Denaturasi ProteinDisiapkan 3 tabung reaksi. PAda setiap tabung dimasukkan larutan albumin 4,5 ml. Pada tabung pertama, ditambahkan 0,5 ml HCl 0,1 M. Pada tabung kedua, ditambahkan 0,5 ml NaOH 0,1 M. Pada tabung ketiga, ditambahkan 0,5 ml buffer asetat pH 4,7 (1 M). Kemudian, ketiga tabung tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 15 menit dan dinginkan pada suhu kamar. Dicatatlah pada tabung mana yang menunjukkan adanya endapan. Lalu pada tabung 1 dan 2 ditambahkan 5 ml buffer asetat pH 4,7. Dituliskan hasilnya.

Data Pengamatana. Uji Biuret Larutan protein + NaOH 2,5 N = larutan memadat seperti agar Larutan protein + NaOH 2,5 N + 1-2 tetes CuSO4 0,01 M = terjadi perubahan warna menjadi warna ungu dan larutan masih tetap memadat.

b. Pengendapan dengan Logam Larutan protein + 5 teted HgCl2 0,2 M = adanya endapan berupa gumpalan putih. Larutan protein + 5 tetes Pb asetat 0,2 M = larutan putih, ada endapan putih.

c. Pengendapan dengan Garam 5 ml larutan protein dijenuhkan + ammonium sulfat = diambil endapannya. Dituangkan pada plat tetes. Endapan + air = tidak terjadi perubahan Endapan + reagen Millon = terjadi perubahan menjadi warna kuning, menandakan adanya protein. Endapan + biuret = terjadi perubahan menjadi warna ungu, menandakan adanya protein.

d. Pengendapan dengan Alkohol Tabung 1: larutan albumin + buffer asetat + etanol 95% = protein tidak larut, mengendap diatas permukaan. Tabung 2: larutan albumin + HCl + etanol 95% = protein tidak larut, mengendap ditengah/ Tabung 3: larutan albumin + NaOH + etanol 95% = tidak terjadi pengendapan, protein larut didalamnya.

e. Uji Koagulasi Larutan albumin (warna kuning) + asam asetat = menjadi terdapat endapan putih di permukaan. Dipanaskan selama 5 menit, terdapat endapan putih. Endapan + air = albumin tak larut. Endapan + reagen Millon = terjadi perubahan warna menjadi warna kuning pekat.

f. Denaturasi Protein Setelah pemanasan selama 15 menit, terdapat endapan putih pada tabung 1-3. Tabung 1: larutan albumin + HCl + pemanasan 15 menit = terdapat endapan seperti puding (memadat). Ditambahkan buffer asetat menjadi tetap padat tapi buffer asetat dibagian atas agak rapuh. Tabung 2: larutan albumin + NaOH + pemanasan 15 menit = terdapat endapan putih bagian atas, warna bening, buffer asetat diatas (cair) tetap padat. Ditambahkan buffer asetat menjdai ada endapan putih di tengah, padat bening. Larutan albumin + buffer asetat + pemanasan 15 menit = terdapat endapan dan pada permukaan terdapat sedikit air/ agak encer.

Pembahasan

Kesimpulan

Daftar PustakaKusnawidjaya, K. 1989. Petunjuk Praktikum Biokimia. Bandung: Alumni.Safro, A.S.M., W. Lestariana dan Haryadi. 1990. Protein, Vitamin dan BahanIkutan Pangan. Yogyakarta: UGM.Sastrohamidjojo. H., 2005. Kimia Organik, Stereokimia, Karbohidrat, Lemak, dan Protein. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.Sudarmadji, S., B. Haryono dan Suhardi. 1989. Analisa Bahan Makanan danPertanian. Yogyakarta: Liberty.Tejasari. 2005. Nilai-nilai Gizi Pangan. Yogyakarta: Graha Ilmu.Toha, A. H. 2001. Biokimia: Metabolisme Biomolekul. Bandung: Alfabeta.Winarno, F.G. 2004. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama