laporan preparasi kromosom

LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014

LEMBAR KERJA MAHASISWA

(LKM)

PRAKTIKUM DASAR-DASAR GENETIKA Laboratorium Genetika dan Pembenihan Ikan

Jurusan Perikanan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada

Tanggal : 20 Mei 2014

Nama : Asterina Wulan Sari

NIM/Prodi : 13030 / THP

Asisten : Bagash Prawira Kurniadi

Aprilia Ratri Kumalasari

A. ACARA

Preparasi Kromosom

B. TUJUAN

1. Untuk mengetahui sedang memasuki fase apa pembelahan sel pada sampel ikan.

2. Untuk mengetahui cara kerja preparasi kromosom

C. TINJAUAN PUSTAKA

Preparasi kromosom adalah metode yang paling tepat untuk menentukan poliploidi

menyediakan untuk menentukan nomor kromosom yang benar-benar dan informasi

kebutuhan penting untuk penelitian sitogenetika (Shao dkk., 2010). Laser capture

microdissection (LCM) adalah proses untuk melindungi mengumpulkan populasi sel

murni untuk DNA berikutnya dan ekstraksi RNA. Meskipun LCM umumnya digunakan

untuk mengisolasi sel-sel tertentu dari bagian jaringan tetap, telah juga efektif untuk

isolasi kromosom individu. Preparation chromosome paint, FISH hibridisasi dan DOP-

PCR dikombinasikan dengan LCM. Salah satu tantangan microdissecting kromosom

adalah sampel diameterof minimal dikumpulkan. Transfer Non kontak LCM pengadaan

cepat spesimen homogen hanya 0,5 mikrometer dengan diameter tanpa gangguan ke

daerah yang berdekatan (CFIM, 2014).

Preparasi kromosom dan banding (pemitaan kromosom) dapat dianggap sebagai

seni serta ilmu. Kromosom yang divisualisasikan secara individual hanya selama mitosis

dan teknik kemudian telah dikembangkan untuk merangsang sejumlah besar sel untuk

memulai divisi melalui penggunaan mitogens seperti phytohaemagglutinin dan pokeweed


dan mengumpulkan sel pada metafase menggunakan spindel inhibitor seperti colcemid.

Banyak metode yang sekarang tersedia untuk mengidentifikasi kromosom dan

mempersiapkan kariotipe untuk tujuan klinis dan penelitian, meskipun kemampuan untuk

menganalisa kromosom dan seberapa baik mereka tetap, menyebar dan bernoda (Moore

dan Best, 2001).

Tanggal 22 Desember 1955, seorang ilmuwan Cina bernama Tjio, mengadakan

pengamatan "kultur fibroblast paru-paru embrio manusia, tumbuh dalam cairan ketuban

sapi" yang menunjukkan tingginya jumlah sel dalam mitosis di lakukan oleh Provesor

Levan di Laboratorium Genetika di University of Lound ( Denmark ) dilakukan oleh

Profesor Levan. Preparasi kromosom dibuat oleh Tjio sesuai dengan Protokol disarankan

oleh Hsu ( seorang ilmuwan Amerika yang bekerja di University of Galveston, Texas

USA), sedikit dimodifikasi, yaitu setelah penggunaan dengan kolkisin (12 - 20 jam)

untuk menghentikan siklus sel, sel yang terkena larutan hipotonik tetapi

mengurangiwaktu total hanya 1-2 menit. Dia kemudian melanjutkan untuk "fiksasi dalam

60 % asam asetat dengan dua kali penggantian dalam rangka untuk membersihkan garam

yang tersisa dari medium kultur dan dari solusi hipotonik". Akhirnya ia diaplikasikan

dengan teknik "squashing", diikuti dengan perwarnaan (Euroclone, 2014).

Preparasi kromosom memiliki hubungan dengan karyotiping. Menurut Chourrout dan

Happe (1986), kurangnya variasi intra individu dalam jumlah kromosom diperoleh dari

penyebaran yang baik disebabkan oleh perlakuan hipotonik yang lebih baik. Variasi

jumlah kromosom dapat disebabkan kesalahan perhitungan sebagai akibat adanya

penyimpangan dari teknik preparasi kromosom, hilangnya kromosom pada proses

pembuatan preparat atau selnya aneuploid. Untuk memperoleh metaphase yang

memuaskan, yaitu dengan menggunakan hewan yang sehat dan usianya mudah. Pada

ikan teleostei jumlah metaphase lebih banyak diperoleh pada ikan muda dan aktif.

Selain beberapa hal diatas masih banyak faktor yang harus diperhatikan untuk

memperoleh hasil preparasi kromosom yang baik. Adapun faktor-faktor tersebut antara

lain medium kultur, ketepatan dalam pemberian dosis kolkhisin, lama perendaman dalam

larutan hipotonik, pemberian fiksatif, pewarnaan dan sterilisasi semua alat yang

digunakan (Pudjirahaju dkk., 2008)


D. ALAT DAN BAHAN

Alat :

1. Section set

2. Piring preparat

3. Pipet tetes

4. Silde (object glass)

5. Centrifuge

6. Mikroskop

Bahan :

1. Sampel ikan

2. Akuades

3. NaCl 0,5%

4. Kolkhisin 0,01%

5. KCl 0,36%

6. Carnoy (3 methanol : 1 asam glasial)

7. Giemsa 3%

8. Label

9. Tissue


E. CARA KERJA

Catat dan gambar fase yang terjadi

Amati dibawah mikroskop

Cuci dengan aquadest dan kering anginkan

Warnai dengan larutan giemsa 20% keringkan 5 menit

Suspensi diambil ,oleskan di atas gelas obyek

Supernatan dibuang diganti dengan larutan Carnoy (2kali)

Sentrifuge dengan kcepatan 800 rpm 5 menit

Rendam dlm larutan KCL 0,36 % & cacah selama 30 menit

Rendam dalam larutan kolkhisin 0,01 % selama 5 menit

Rendam dalam larutan NaCl 0,5% 0,5 ml selama 15 menit

Ambil jaringan insang 2 lembar


F. HASIL DAN PEMBAHASAN

Tabel Hasil Pengamatan

Kelompok Sampel I Sampel II

I Metafase Profase

II Profase, Interfase Profase

III Profase, Metafase Profase, Metafase

IV Metafase Interfase, Anafase, Telofase

V Telofase Interfase, Profase

VI Telofase I Profase

Langkah pertama yang dilakukan dalam preparasi kromosom adalah mengambil

jaringan insang dan direndam dalam larutan NaCl 0,5 % 0,5 ml selama 15 menit.

Perendaman dengan larutan NaCl ini berfungsi sebagai desinfektan agar lamella-lamela

bersih dari kotoran. Kemudian direndam dalam larutan kolkhisin 0,01 % 0,5 ml selama 5

menit. Larutan kolkisin ini berfungsi untuk menghentikan proses mitosis agar didapatkan

kondisi metafase kromosom kemudian direndam dalam KCl 0.036 selama 5 menit.

Perendaman dengan KCl atau larutan hipotonik bertujuan menggelembungkan ukuran sel

sehingga kromosom memiliki ruang yang lebih luas untuk diamati. Setelah itu, dilakukan

pencacahan selama 30 menit agar selnya berpencar dan ukurannya lebih kecil.

Langkah selanjutnya adalah jaringan difiksasi dengan larutan Carnoy selama 5 menit,

setelah itu supernatant dibuang dan diganti dengan larutan Carnoy. Setalah supernatant

diganti, dilakukan sentrifuge pada kecepatan 800 rpm selama 5 menit sebanyak 2 kali.

Larutan Carnoy diganti dengan yang baru setiap 5 menit. Sentrifuge bertujuan untuk

memisahkan molekul berdasarkan berat molekulnya. Fiksasi merupakan perlakuan untuk

mematikan sel tanpa merusak bentuk dan kandungannya. Larutan fiksatif yang paling

sering digunakan adalah campuran methanol dengan asam asetat glacial dengan

perbandingan 3:1. Larutan ini harus dalam keadaan segar jika akan digunakan Fiksasi

dilakukan menggunakan Carnoy sedangkan pewarnaan kromosom dengan Giemsa.

Pewarnaan dilakukan agar kromosom mudah diamati di bawah mikroskop. Giemsa

merupakan pewarna yang paling sering digunakan untuk mewarnai kromosom, setelah

diwarnai kemudian dialiri aquadest sampai bersih dan dikering anginkan kemudian

diamati dengan mikroskop perbesaran 100x.

Pada praktikum preparasi kromosom ini menggunakan sampel insang dari ikan nila.

Insang dipilih karena pada jaringan ini memiliki aktivitas pembelahan sel. Insang sebagai

tempat difusi O2 dan CO2, sehingga aktivitas bekerjanya sangat tinggi dan perlu kondisi


yang optimal. Apabila pada insang ada kerusakan, maka perbaikan akan cepat

berlangsung karena aktivitasnya sangat penting sekali bagi kehidupan ikan dan

perbaikannya itu melalui pembelahan sel.

Hasil pengamatan pada preparasi kromosom kali ini didapat fase interfase, profase,

metaphase, anaphase dan telofase. Berikut ini adalah gambar hasil pengamatan dan

penjelasannya:

1. Interfase

Hasil pengamatan pada interfase dapat

dilihat belum ada kromosom yang terlihat.

Periode interfase ialah periode antara dua

pembelahan disebut juga periode istirahat

karena pada periode ini tidak terjadi

pembelahan kromosom atau sitoplasma. Akan

tetapipada nucleus dan sitoplasma terjadi

peningkatan aktivitas metabolism, akibatnya

volume nucleus dan sitoplasma bertambah

(Winatasasmita, 1986). Selanjutnya interfase dibagi ke dalam fase gap-1 (G1), fase

sintesis (S) dan fase gap-2 (G2). Pada fase G1 sel-sel belum mengaakan replikasi

sehingga DNA masih berjumlah 1 salinan. Pada fase S, DNA dalam inti mengalami

replikasi sehingga pada fase sistesis akhirnya menghasilkan 2 salinan DNA dan

diploid. Pada fase G2 replikasi DNA telah selesai, dan sel bersiap-siap mengadakan

pembelahan (Aryulina dkk.,2007). Menurut Suryo (1998), pada fase Interfase ini

keseluruhan waktu yang dibutuhkan yaitu 18-20 jam.


2. Profase

Gambar disamping menunjukkan

adanya kromosom yang terlihat jelas, karena

pada fase ini kromosom mulai mengalami

penebalan. Pada fase profase kromosom

belum tampak tetapi pada fase profase

kromosom mulai tampak karena terjadi proses

kondensasi. Kromosom membelah

memanjang membentuk dua kromatid.

Kromosom memendek dan bertambah tebal

(Winatasasmita, 1986). Profase ditandai oleh pembentukan spiral benang kromosom menjadi

kumparan untuk membentuk kromosom yang dapat diidentifikasi secara mikroskopik;

membrane inti dan nucleolus menghilang dan benang mitosis berbentuk kumparan (Behrman

dkk.,2010). Tahap profase membutuhkan waktu 60 menit (Yatim, 1996).

3. Metafase

Gambar disamping menunjukkan

adanya kromosom yang bergerak ke bidang

ekuator benang spindel dan kromosom terikat

pada benng spindel melalui sentromer. Pada

fase metaphase, kromosom berkumpul pada

bidang equatorial. Kromosom yang kecil

biasanya terletak pada bagian sebelah dalam.

Nukelolus hilang (Winatasasmita, 1986). Pada

metafase kromosom memudar dan mampak

jelas sebagai struktur tersendiri. Sentromer kromosom menempel pada pipamikro kumparan

mitosis dan kromosom lurus di tengal sel sepanjang kumparan tersebut (Behrman dkk.,2010).

Pada fase ini dibutuhkan waktu sekitar 2-6 menit( Suryo, 1998).


4. Anafase

Fase anaphase pada gambar disamping

ditunjukkan dengan adanya kromosom yang

terbagi menjadi dua dan menuju ke kutub

pembelahan. Menurut Winatasasmita (1986),

sentromer membelah dan kedua kromatid

masing-masing memisahkan diri kemudian

bergerak meuju kutub sel yang berlawanan.

Anafase ditandai oleh pembelahan kromosom

sepanjang sumbe longitudinan membentuk

dua

kromatid anakan dan perpindahan setiap kromatik pasangan menuju ujung sel yang

berlawanan (Behrman dkk.,2010).

5. Telofase

Gambar telofase disamping ditunjukkan

dengan mulai terbentuknya membran inti dan

nucleolus kembali muncul. Dapat dilihat pula

bahwa sel akan akan membelah namun masih

bergandengan. Menurut Winatasasmita (1986),

membran nukleus terbentuk mengelilingi

nukleus, gelendong menghilang dan nucleoli terbentuk kembali. Telofase yang megakhiri

mitosis, ditandai oleh pembentukan kembali membrane inti dan nucleolus, dan duplikasi

sentriolus serta pembelahan sitoplasma dan membentuk 2 sel anakan (Behrman dkk.,2010).

Menurut Suryo(1998), fase ini membutuhkan waktu sekitar 30-60 menit.


G. KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

1. Pada hasil pengamatan preparasi kromosom pada sampel ikan didapatkan fase

profase, metapase, anaphase, telofase dan interfase

2. Jaringan insang direndam dalam larutan NaCl 0,5 selama 15 menit, kemudian

direndam dalam larutan kolkhisin 0,01 % selama 5 menit. Rendam dalam larutan

KCL 0,36 % 0,5 ml sembari dilakukan pencacahan selama 30 menit. Selanjutnya,

jaringan difiksasi dengan larutan Carnoy selama 5 menit dan disentrifuge pada

kecepatan 800 rpm selama 5 menit sebanyak dua kali pencucian. Terakhir,

pewarnaan kromosom dengan Giemsa dan diamati di bawah mikroskop.

Saran

Diharapkan pada praktikum berikutnya, sampel yang digunakan dalam preparasi

kromosom tidak hanya jaringan insang saja, sehingga praktikan dapat mengetahui

jaringan mana yang terbaik untuk preparasi kromosom dalam memudahkan karyotiping

dan mengetahui sedang memasuki fase apa sel tersebut dalam pembelahan.


H. DAFTAR PUSTAKA

Aryulina, D., Choirul M., Syalfinat M. dan Endang W. W. 2007. Biologi. Erlangga.

Jakarta

Behrman, kliegman dan Arvin. 2010. Ilmu Kesehatan Anak. Penerbit Buku Kedokteran

EGC. Jakarta

CFIM. 2013. http://www.cfim.ku.dk/equipment/light_microscopy/palm/1298664_ZEISS

_LabProtocol_Chromosomes.pdf chromosome preparation PALM. diunduh pada hari

Selasa tanggal 27 Mei 2014 pukul 14.36 WIB

Chourrout, D. dan Happe A. 1986. Improved Methode of Direct Chromosome

Preparation in Rainbow trout, Salmo gairdneri. Aquaculture 52:255-261

Euroclone. 2014. http://www.euroclonegroup.it/allegati/prodotti/documenti/Milestones-

Bibliography_3323_.pdf levan methods chromosome preparation. Diunduh pada hari

Selasa tanggal 27 Mei 2014 pukul 15.04 WIB

Moore, C.M. dan Best R.G. 2001. Chromosome Preparation of Banding. Encyclopedia of

Life Sciences. www.els.net. Diunduh pada hari Selasa tanggal 27 Mei 2014 pukul

15.57 WIB

Pudjirahaju, A., Rustidja dan Sutiman B.S. 2008. Penelusuran Genotipe Ikan Mas

(Cyprinus carpio L.) Strain Punten Gynogenetik. Ilmu-ilmu Perairan dan Perikanan

Indonesia XV(1): 13-19

Shao, C.W., Wu, P.F., Wang X.L., Tian, Y.S. dan Chen, S.L. 2010. Compison of

Chromosome Preparation Method for the Different Developmental Stages of the Half-

Smooth Tongue Sole Cynoglossus semilaevis. Micron 41:47-50

Suryo. 1998. Genetika Strata 1.Gadjah Mada University Press.Yogyakarta

Winatasasmita, D. 1986. Biologi Sel. Departemen Pendidikan Dan Kebudayaan

Universitas Terbuka. Jakarta

Yatim, Wildan. 1996. Genetika. Tarsito. Bandung

laporan preparasi kromosom

Documents