laporan rabbit pyrogen test
TRANSCRIPT
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
1/23
TEKNOLOGI SEDIAAN STERIL
Uji Pirogenitas Rabbit Test
Disusun oleh:
Siti Nurlaela Kurnia
NIM: P17335112207
POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES BANDUNG
JURUSAN D3 FARMASI
2013
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
2/23
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 LATAR BELAKANG
Studi mengenai efek panas setelah pemberian larutan tertentu secara
intravena dimulai sebelum abad ke-19. Pada 1894, Sanarelli menunjukkan
kultur larutan Ebert bacillus, yang bebas dari mikroorganisme, tapi dapat
menyebabkan intoksikasi yang diikuti dengan demam ketika diinjeksi pada
hewan, bahkan beberapa terjadi kematian. Pada abad ke-19, istilah
injection fevertelah digunakan untuk menunjukkan reaksi demam yang
terdapat setelah administrasi beberapa larutan. Pemberian produk secara
intravena pada abad ke-20, meningkatkan jumlah kecelakaan yang terjadi
akibat pirogen, menyebabkan para peneliti membuat serangkaian evaluasi
mengenai hal ini.
Pada 1912, Hort dan Penfold membuat nama pyrogenicuntuk air
yang ketika diinjekkan menyebabkan hipertermia. Istilah ini juga
digunakan Florance Seibert pada tahun 1923 yang menyebutkan senyawapirogenik sebagai hyperthermising atau zat yang menyebabkan
hipertermi, yang mengandung bakteri mati-intak maupun disintegrasi,
patogenik maupun tidak, atau lebih pada produk metabolik bakteri, seperti
protein denaturasi, endotoksin, atau eksotoksin. Jadi, pirogen eksogen
merupakan senyawa yang bila diadministrasikan pada manusia dan hewan
akan menyebabkan peningkatan suhu tubuh.
Semua produk farmasi dengan berbagai macam rute harus memenuhi
kriteria safetydan efficacy. Produk parenteral merupakan sediaan dengan
pemberian injeksi dengan melalui kulit atau membran mukosa langsung
menuju sistem biologis, melewati mekanisme pertahanan tubuh. Dengan
demikian sediaan parenteral memiliki kriteria yang lebih ketat jika
dibandingkan dengan rute pemberian lain. Hal ini disebabkan karena
resiko pemberian secara parenteral yang lebih besar dibandingkan dengan
pemberian dengan tipe lain.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
3/23
Produk parenteral memiliki standar purity (kemurnian) dan safety
(keamanan) yang berbeda dari produk lain. Selain harus memenuhi standar
potensi dan stabilitas, sediaan parenteral harus memenuhi standar terkait
mikroba (sterilitas dan pirogen), parameter fisik (bebas dari kontaminasi
partikel), dan parameter kimia (isotonisitas, kapasitas dapar). Untuk
mencapai standar tersebut dibutuhkan usaha pada formulasi maupun level
manufaktur.
Untuk mengetahui apakah produk parenteral memenuhi syarat bebas
pirogen, maka dilakukan pengujian. Salah satu metode pengujiannya
adalah Rabbit Test. Pada praktikum kali ini, dilakukan pengujian pirogen
terhadap sediaan parenteral dengan metode Rabbit test. Tujuan dari
praktikum ini agar praktikan dapat mengetahui dan memahami uji
pirogenitas dengan metode Rabbit Test. Pengujian dilakukan dengan
mengukur peningkatan suhu badan kelinci yang disebabkan penyuntikan
intravena sediaan uji steril.
I.2 TUJUAN PRAKTIKUM
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah:
1. Praktikan dapat mengetahui dan memahami uji pirogenitas denganmetodeRabbit Test.
2. Praktikan mampu melaksanakan uji pirogenitas dengan metodeRabbitTest.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
4/23
BAB II
LANDASAN TEORI
II.1 PROGEN
Pirogen adalah racun (toksin) yang menimbulkan demam bila
diberikan secara intravena dalam jumlah tertentu (Goeswin Agus, 2009).
Ada dua kelas utama pirogen, yaitu endogenus dan eksogenus. Pirogen
endogen merupakan senyawa yang diproduksi oleh tubuh setelah
seseorang mengkonsumsi pirogen eksogen. Respon ini merupakan
mediator utama dari proses demam. Senyawa pirogenik yang paling poten
adalah yang diproduksi oleh bakteri gram negatif (endotoksin), akan tetapi
gram positip dan fungi juga menghasilkan pirogen dengan potensi yang
lebih rendah. Selain pirogen beberapa senyawa lain juga diketahui
menyebabkan reaksi piretik ini, yaitu steroid, virus, bahan kimia dan obat
tertentu. Akan tetapi, yang paling menjadi perhatian industri farmasi
adalah, eksogenus pirogen yang paling penting, yaitu endotoksin.
Endotoksin, disebut juga LPS, merupakan komponen utama dari
membran terluar bakteri gram negatif. Endotoksin tersusun dari
polisakarida hidrofilik, yang terikat secara kovalen dengan kandungan
lipid yang hidrofobik (Lipid A). LPS dari sebagian besar spesies bakteri
tersusun dari tiga bagian yang berbeda, yaitu: bagian antigen-O,
oligosakarida inti (core oligosacharida) dan Lipid A.
Lipid A merupakan bagian yang paling konservatif, dan merupakan
bagian yang menjadi penyebab aktifitas biologi endotoksin, misalnya
toksisitas endotoksin. Bagian hidrofobik dari endotoksin tersebut tersusun
secara heksagonal, sehingga secara struktur lebih rigid (kuat)
dibandingkan dari molekul lain. Bagian oligosakarida inti memiliki
struktur konservatif dengan bagian dalam berupa 3-deoxy-D-manno-2-
octulosonic acid (KDO)-heptose region, terdapat lima tipe inti yang
berbeda, sedangkan spesies salmonella memiliki hanya satu tipe. Antigen-
O secara umum tersusun dari sekuens oligosakarida yang identik (masing-
masing terdiri dari 3-8 monosakarida), yang spesifik sesuai jenisnya.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
5/23
Molar mass dari monomer endotoksin bervariasi dari 10-20 KD,
bervariasi tergantung pada ikatan oligosakaridanya, akan tetapi ada juga
yang mencapai 70 KD. Telah diketahui bahwa endotoksin membentuk
berbagai agregat supra-molekular di larutan yang mengandung air, yang
disebabkan oleh interaksi non-polar antara ikatan lemak dan juga jembatan
yang dihasilkan antara gugus fosfat oleh kation divalen. Berbagai studi
telah dilakukan yang menghasilkan bahwa pada larutan aquous,
endotoksin dapat self assemble menjadi berbagai bentuk, seperti lamela,
kubik dan heksagonal, dengan diameter hingga 0,1 mikrometer, dan
memiliki stabilitas yang tinggi tergantung pada sifat larutan (pH, ion,
surfaktan).
Endotoksin dihasilkan pada jumlah besar pada saat sel mati dan selama
pertumbuhan dan pembelahan. Endotksin memiliki sifat haet-stable dan
tidak dapat dihancurkan dengan kondisi sterilisasi biasa, karena banyak
pirogen tahan terhadap proses autoklaf, dan dapat lolos filtrasi dengan
ukuran pori-pori 0,2 mikrometer yang biasa digunakan untuk sterilisasi
akhir.
Endotoksin baru bisa diinaktivasi ketika diekspos pada suhu 2500C
selama lebih dari 30 menit, atau 1800C selama lebih dari 3 jam. Asam dan
alkali dengan kekuatan minimal 0,1 M dapat juga digunakan untuk
menghancurkan endotoksin pada skala laboratorium.
Level endotoksin maksimum untuk aplikasi intravena pada produk
farmasi dan biologi adalah 5 endotoksin unit (EU) per kg berat badan per
jam yang dicantumkan pada farmakope. Istilah EU menunjukan aktivitas
biologis endotoksin. Sebagai contoh, 100 pg standar endotoksin EC-5 dan
120 pg endotoksin dari Eschercia coli O111:B4 memiliki aktivitas 1 EU.
Untuk memenuhi persyaratan ini, merupakan tantangan bagi industri
farmasi.
II.2 DEPIROGENASI
Depirogenasi bahan, alat dan wadah pada produksi sediaan farmasi
dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu inaktivasi (destruksi) atau removal.
A.InaktivasiInaktivasi biasanya melibatkan beberapa reaksi kimia
(contohnya oksidasi, alkilasi, atau hidrolisis endotoksin). Metode
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
6/23
tersebut tidak banyak digunakan untuk depirogenasi bahan awal
dan air. Bila menggunakan metode ini maka harus memperhatikan
bahan kimia yang digunakan untuk memastikan tidak adanya efek
samping.
Inaktivasi dengan panas kering merupakan metode yang efektif
untuk inaktivasi pirogen pada alat-alat gelas dan minyak yang
tahan panas, juga bubuk tahan panas. Temperatur yang disarankan
untuk insinerasi adalah 170-350 deg C. Suhu yang paling umum
digunakan adalah 2500C selama 30 menit (Remington: 45 menit).
Suhu lain bisa digunakan 6500C selama 1 menit atau 1800C selama
4 jam. Dengan suhu yang lebih rendah membutuhkan waktu
insinerasi selama 1 hingga 12 jam.
B.RemovalRemoval pirogen secara fisik lebih menguntungkan dari pada
penambahan bahan kimia karena tidak ada bahan kimia yang
ditambahkan pada bahan yang akan di sterilisasi.
1. RinsingAtau dilusi bahan/ alat dengan air bebas pirogen
merupakan cara yang efektif untuk menghilangkan pirogen.
2. DestilasiMetode ini merupakan metode yang cukup umum
digunakan untuk raw water dimana pirogen merupakan
bahan yang tidak menguap dan dengan demikian tidak akan
ada pada destilat.
3. UltrafiltrasiMerupakan teknik separasi berdasarkan pada ukuran
partikel molekul endotoksin. Endotoksin aktif merupakan
suatu agregat dengan berat lebih dari 10.000 D. Kombinasi
ultrafiltrasi dengan ukuran pori 0,1 mikrometer dengan
filter sterilisasi (0,2 mikrometer) digunakan untuk sediaan
larutan LVP. Penggunaan depth filter dilakukan dengan
cara melewatkan larutan pada katridge atau pad yang
tersusun dari kaolin, alumunium oksida atau keiselguhr.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
7/23
Endotoksin dihilangkan dengan cara absorpsi
elektrostatik atau obstruksi mekanis. Selain itu,
dikembangkan juga suhu filter bermuatan, dimana media
filter diberi muatan positif yang dapat meningkatkan
afinitas terhadap endotoksin yang bermuatan negatif.
4. AdsorpsiAdsorpsi menggunakan charcoal biasa juga digunakan.
Akan tetapi bahan ini merupakan adsorben kuat untuk
banyak obat, terutama dalam bentuk larutan, dan biasanya
sulit dihilangkan dari larutan akhir. Adsorbsi yang lain yang
bisa digunakan adalah adsorpsi pada suspensi barium sulfat.
5. Reverse OsmosisReverse osmosis diikuti dengan deionisasi merupakan
metode yang diketahui berhasil digunakan untuk
menghilangkan berbagai kontaminan pada air, termasuk
endotoksin.
6. Resin ion-exchange dan gamma irradiasiMerupakan metode yang digunakan juga untuk
menghilangkan endotoksin dari sediaan parenteral.
III.3 TEKNIK DETERMINASI ENDOTOKSIN
Prosedur detail mengenai uji pirogen dan uji bakteri endotoksin telah
dijelaskan dengan lengkap pada farmakope.
Untuk pengujian pirogen, digunakan kelinci, dimana hewan coba
diukur peningkatan suhu tubuhnya setelah diinjeksi IV larutan steril yang
diuji. Digunakan kelinci oleh karena respon fibrilnya mirip dengan
manusia. Farmakope telah mensyaratkan, apabila tidak dipersyaratkan
untuk melakukan uji bakteri endotoksin, maka uji ini harus dilakukan pada
semua larutan parenteral dimana volume konsumsinya untuk dosis tunggal
adalah 15 ml atau lebih.
Kerugian dari rabbit testini adalah biaya yang mahal dan waktu yang
panjang untuk pengujian; tidak dapat dikuantifikasi dan larutan parenteral
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
8/23
tertentu (misalnya yang mengan dung fosfat kalium disis tinggi) akan
memberikan respon pirogen.
Uji untuk bakteri endotoksin, diketahui sebagai Limulus Amoebocyte
Lysate (LAL) test. Uji ini merupakan uji yang telah umum dilakukan di
industri farmasi dimana diperlukan hasil yang terkuantifikasi. Basis dari
uji ini adalah lysate dari amoebocyte yang berasal dari darah Horseshoe
Crab (Limulus polyphemus), dengan penambahan endotoksin, akan terjadi
clotting atau gelasi, sehingga menimbulkan turbiditas atau presipitasi.
Saat ini telah dikembangkan kit untuk uji LAL ini yang banyak
digunakan di industri. Uji ini telah banyak digunakan untuk uji air dan
end-process-testing untuk sediaan parenteral, radiofarmasi dan alat-alat
kesehatan.
Rhodes dan Hoft mengemukakan alasan mengapa pengujian LAL lebih
disukai dibandingkan dengan pengujian pirogen pada kelinci untuk
radiofarmasetikal:
1. Pengujian lebih sensitif2. Pengujian lebih cepat3. Memerlukan material uji dalam jumlah kecil4. Keduanya, baik kontrol positif maupun kontrol negatif, dapat
dilakukan untuk setiap pengujian
5. Tidak menyebabkan kelinci mengandung bahan radio aktifsehingga lebih disukai dari segi keamanan radiologi.
6. Lebih murah dan lebih mudah disimpan.Akan tetapi terdapat beberapa kerugian dari metode LAL ini.
Beberapa faktor sangat mempengaruhi hasil uji, yaitu pH larutan uji,
sumber reagen yang digunakan, konsentrasi kation (kalsium atau
magnesium) pada larutan uji, dan level agregasi dari bakteri juga
mempengaruhi hasil uji. Sedangkan keuntungan dari metode LAL adalah
waktu singkat untuk uji, relatif murah, mudah dilakukan, dan
terkuantifikasi.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
9/23
BAB III
PERCOBAAN
III.1 PERALATAN
1. Alat suntik bebas pirogen2. Alat kaca bebas pirogen3. Jarum bebas pirogen4. Termometer5. Kandang kelinci6. Timbangan
III.2 BAHAN
1. Kelinci dewasa yang sehat2. NaCl 0,9% bebas pirogen3. Larutan Uji
III.3 PROSEDUR KERJA
Uji pirogenitas menurut FI edisi III adalah sebagai berikut:
A. Kondisi hewan uji:Hewan percobaan digunakan kelinci yang selama seminggu
sebelum pengujian tidak menunjukkan penurunan bobot badan. Kelinci
tidak dapat digunakan uji pirogenitas jika:
1. 3 hari sebelumnya telah digunakan untuk pengujianpirogenitas dan memberikan hasil negatif.
2. 3 minggu sebelumnya telah digunakan untuk pengujianpirogenitas, sediaan uji tidak memenuhi syarat.
3. Telah digunakan kapan saja untuk pengujian pirogenitasdan respon rata-rata kelompok kelinci melebihi 1,20.
B. AlatDigunakan termometer atau termometer listrik dengan
ketelitian skala 0,10
dan dapat dimasukkan ke dalam rektum kelinci
sedalam lebih kurang 5 cm.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
10/23
Alat suntik dibuat dari kaca atau bahan lain yang cocok, tahan
pemanasan pada suhu 2500.
C. Sediaan ujiDibuat dari zat uji dengan melarutkan atau mengencerkan
dengan larutan natrium klorida P steril bebas pirogen atau jika zat uji
berupa larutan yang sesuai dapat langsung digunakan.
D. Prosedur KerjaTerdiri dari uji pendahuluan dan pengujian pendahuluan.
D.1 Uji pendahuluan
1. 1 jam sebelum pengujian masukkan kelinci ke dalam kotakkelinci sedemikian rupa sehingga kelinci tertahan dengan letak
leher yang longgar, badannya bebas hingga kelinci dapat duduk
dengan bebas.
2. 1 sampai 3 hari sebelum pengujian, suntikkan intravena 10 mlper kg bobot badan dengan larutan NaCl P 0,9% steril bebas
pirogen dalam ruangan yang tenang.
3. Perbedaan suhu ruangan terhadap suhu pemeliharaan tidakboleh lebih dari 30.
4. Selama 1 malam hingga pengujian selesai kelinci tidak di berimakan dan selama waktu pengujian tidak diberi minum.
5. Catat suhu badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30menit dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga 3 jam
sesudah penyuntikan dengan larutan NaCl P 0,9% steril bebas
pirogen.
6. Kelinci yang menunjukkan beda suhu lebih besar dari 0,60tidakdapat digunakan untuk pengujian utama.
D.2 Pengujian utama
1. Lakukan pengujian menggunakan sekelompok hewanpercobaan terdiri dari 3 ekor kelinci.
2. Hangatkan sediaan uji hingga suhu lebih kurang 38,50,suntikkan perlahan-lahan ke dalam vena auricularis tiapkelinci.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
11/23
3. Kecuali dinyatakan lain, waktu penyuntikkan tidakmelebihi 4 menit dan volume sediaan uji tidak kurang dari
0,5 ml dan tidak lebih dari 10 ml per kg berat badan.
4. Jika pengujian gagal, ulangi pengujian hingga 4 kali, tiapkali menggunakan 1 kelompok yang terdiri dari 3 ekor
kelinci.
D.3 Penafsiran hasil
Suhu awal tiap kelinci adalah suhu rata-rata pembacaan suhu
dengan interval 30 menit dan dilakukan 40 menit sebelum penyuntikan
sediaan uji.
Suhu maksimum adalah suhu tertinggi yang dicatat selama 3 jam
setelah penyuntikan sediaan uji.
Catat suhu badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit
dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga 3 jam setelah
penyuntikan sediaan uji.
Selisih antara suhu inisial dan suhu maksimum tiap kelincidinyatakan sebagai suhu respon. Jika suhu respon negatif, dianggap
nol.
Kelinci dinyatakan memenuhi syarat jika perbedaan suhu awal
antara kelinci yang satu dengan yang lain tidak lebih dari 10.
Kelinci dinyatakan tidak memenuhi syarat jika perbedaan suhu
awalnya lebih besar dari 0,20, suhu awal lebih kecil dari 38,00 dan
tidak lebih besar dari 39,80.
Sediaan uji dinyatakan memenuhi syarat jika jumlah respon tidak
melebihi kolom 2 dan dinyatakan tidak memenuhi syarat jika jumlah
respon melebihi kolom 3 untuk tiap kelompok.
Jika jumlah respon terletak antara kolom 2 dan kolom 3, pengujian
diulangi. Jika pengujian ke- 4 jumlah respon melebihi 6,600sediaan uji
dinyatakan tidak memenuhi syarat.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
12/23
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
13/23
3. Masukkan kelinci dalam kotak penyekap sehingga kelincitertahan dan letak leher longgar (jika menggunakan
transmisator).
4. Tentukan suhu awal kelinci, 30 menit sebelum disuntikanlarutan uji.
5. Atur suhu awal kelinci, tidak boleh lebih dari 39,80C danbeda suhu tiap kelinci dalam 1 kelompok tidak boleh lebih
dari 10C.
6. Suntikan 10 ml/ KgBB, melalui vena tepi telinga 3 ekorkelinci dan penyuntikan dilakukan dalam waktu 10 menit.
7. Larutan uji berupa sediaan yang bila perlu di konstitusiseperti yang tertera pada masing-masing monografi dan
disuntikan dengan dosis seperti yang tertera pada etiket.
8. Jika uji pirogen pada alat kesehatan, maka cuci permukaanalat yang berhubungan langsung dengan tubuh atau jaringan
tubuh pasien dan air bilasan pencucian alat kesehatan yang
di ujinya.
9. Hangatkan larutan pada suhu 370C 20C sebelumpenyuntikan.
10.Rekam suhu berturut-turut setelah 1 jam pertamapenyuntikan sampai jam ke-3, suhu di ukur setiap 30 menit.
III. Penafsiran hasil1. Setiap penurunan suhu di anggap nol.2. Sediaan memenuhi syarat apabila tak seekor kelinci pun
menunjukkan kenaikan suhu 0,50C atau lebih, lanjutkan
pengujian dengan 5 ekor kelinci.
3. Jika tidak lebih dari 3 ekor, dari total 8 ekor kelinci masing-masing mengalami kenaikan suhu 0,50C atau lebih, tetapi
suhu total dari 8 ekor kelinci maksimum 3,30C, maka
sediaan dianggap bebas pirogen.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
14/23
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 HASIL
A. Pengamatan bobot kelinci selama 1 mingguTabel 4.1 Bobot kelinci
Identitas
Kelinci
Hari-Jam pengamatan Bobot (Kg) Keterangan
Kelinci 1
Selasa, 17 09 2013; 12.30
WIB
1,55 kg Citra
Rabu, 18 09 2013; 12.30
WIB
1,55 kg Citra
Kamis, 19 09 2013; 12.30
WIB
1,56 kg Citra
Jumat, 20 09 2013; 12.30
WIB
1,58 kg Citra
Sabtu, 21 09 2013; 12.30
WIB
1,58 kg Citra
Minggu, 22 09 2013; 12.30
WIB
1,59 kg Ghina
Senin, 23 09 2013; 12.30
WIB
1,60 kg Ghina
Kelinci 2
Selasa, 17 09 2013; 12.30
WIB
1,64 kg Ghina
Rabu, 18 09 2013; 12.30
WIB
1,64 kg Ghina
Kamis, 19 09 2013; 12.30
WIB
1,64 kg Ghina
Jumat, 20 09 2013; 12.30
WIB
1,65 kg Novia
Sabtu, 21 09 2013; 12.30 1,70 kg Novia
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
15/23
WIB
Minggu, 22 09 2013; 12.30
WIB
1,72 kg Novia
Senin, 23 09 2013; 12.30WIB
1,72 kg Novia
Kelinci 3
Selasa, 17 09 2013; 12.30
WIB
1,80 kg Novia
Rabu, 18 09 2013; 12.30
WIB
1,83 kg Bu Ela
Kamis, 19 09 2013; 12.30
WIB
1,83 kg Bu Ela
Jumat, 20 09 2013; 12.30
WIB
1,83 kg Bu Ela
Sabtu, 21 09 2013; 12.30
WIB
1,84 kg Bu Ela
Minggu, 22 09 2013; 12.30
WIB
1,86 kg Bu Ela
Senin, 23 09 2013; 12.30
WIB
1,86 kg Bu Ela
Kesimpulan:
Dari ketiga kelinci yang diamati, tidak ada satupun kelinci yang mengalami
penurunan berat badan selama satu minggu. Jadi ketiga kelinci tersebut memenuhi
persyaratan sebagai hewan percobaan pada uji pendahuluan.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
16/23
B.Uji pendahuluan
Waktu pelaksanaan: 24 september 2013
Larutan uji: Larutan NaCl 0,9% steril bebas pirogen
Keterangan mengenai penyuntikan: Volume penyuntikkan masing-masing kelinci adalah
sebesar 10 ml/kg BB. Penyuntikan dilakukan secara intravena.
Penyuntikan :
Kelinci 1 : 1,60 kg x 10 ml = 16 ml
Kelinci 2 : 1,72 kg x 10 ml = 17,2 ml
Kelinci 3 : 1,86 kg x 10 ml = 18,6 ml
Pencatatan suhu tubuh kelinci adalah sebagai berikut:
Tabel 4.2 Uji pendahuluan
Identitas Kelinci Jam pengamatan Suhu (oC) Keterangan (nama
pelaksana
Kelinci 1
07.00 WIB 36,0 Citra
07.30 WIB 36,1 Citra
08.00 WIB 36,1 Citra
08.05 WIB (Penyuntikan) Citra
08.35 WIB 36,1 Citra
09.05 WIB 36,1 Citra
09.35 WIB 36,2 Citra
10.05 WIB 36,2 Ghina
10.35 WIB 36,2 Ghina
11.05 WIB 36,2 Ghina
Kelinci 2
07.05 WIB 36,2 Ghina
07.35 WIB 36,2 Ghina
08.05 WIB 36,3 Ghina
08.10 WIB (penyuntikan) Ghina
08.40 WIB 36,5 Bu Ela
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
17/23
09.10 WIB 36,5 Bu Ela
09.40 WIB 36,5 Bu Ela
10.10 WIB 36,5 Bu Ela
10.40 WIB 36,5 Bu Ela11.10 WIB 36,5 Bu Ela
Kelinci 3
07.10 WIB 35,5 Bu Ela
07.40 WIB 35,5 Novia
08.10 WIB 35,6 Novia
08.15 WIB (Penyuntikan) Novia
08.45 WIB 35,6 Novia
09.15 WIB 35,7 Novia09.45 WIB 35,8 Novia
10.15 WIB 35,8 Novia
10.45 WIB 35,8 Novia
11.15 WIB 35,8 Novia
Kesimpulan:
Dari ketiga kelinci yang telah diuji pendahuluan, tidak satupun kelinci menunjukkan
perbedaan suhu atau kenaikan suhu lebih dari 0,6oC sehingga dapat disimpulkan bahwa
ketiga kelinci tersebut dapat digunakan untuk pengujian utama.
B. Uji Utama (menurut FI edisi IV)Waktu Pelaksana: Kamis, 26 September 2013
Larutan Uji: Calcii Glukonas injeksi 10%
Keterangan mengenai penyuntikkan:
Dosis untuk manusia adalah sebesar 10% = 10 gram/100ml = 0.1 gram/ml
Konversi dari manusia (70 kg) ke kelinci adalah 0,07
Dosis untuk kelinci = 0,1 gram/ml x 0,07 = 0.007 gram/ml = 7 mg/ml
Penyuntikan :
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
18/23
Kelinci 1 : 1,60 kg/1,50 kg x 7 mg/ml = 7,5 mg + WFI ad 16 ml
Kelinci 2 : 1,72 kg/1,50 kg x 7 mg/ml = 8,0 mg + WFI ad 17,2 ml
Kelinci 3 : 1,86 kg/1,50 kg x 7 mg/ml = 8,7 mg + WFI ad 18,6 ml
Tabel 4.3 Uji utama
Identitas
Kelinci
Jam
pengamatan
Suhu (oC) Keterangan
(nama
pelaksana)
Keterangan
(suhu
respon)
Kelinci 1
07.00 WIB 36,2 Citra
0,5
07.30 WIB (Penyuntikan) Citra
08.30 WIB 36,6 Citra
09.00 WIB 36,7 Citra
09.30 WIB 36,7 Citra
10.00 WIB 36,7 Ghina
10.30 WIB 36,7 Ghina
Kelinci 2
07.00 WIB 36,5 Ghina
0,5
07.30 WIB (Penyuntikan) Ghina
08.30 WIB 36,8 Ghina
09.00 WIB 36,9 Ghina
09.30 WIB 37,9 Bu Ela
10.00 WIB 37,0 Bu Ela
10.30 WIB 37,0 Bu Ela
Kelinci 3
07.00 WIB 35,8 Bu Ela
0,3
07.30 WIB (Penyuntikan) Novia
08.30 WIB 36,0 Novia
09.00 WIB 36,0 Novia
09.30 WIB 36,1 Novia
10.00 WIB 36,1 Novia
10.30 WIB 36,1 Novia
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
19/23
Kesimpulan:
Dari ketiga kelinci diatas ada dua kelinci yang mengalami kenaikan suhu lebih atau
sama dengan 0,5oC sehingga pengujian dilanjutkan dengan lima ekor kelinci. (FI IV, 1995)
Tabel 4.4 Uji tambahan
Identitas
Kelinci
Jam
pengamatan
Suhu (oC) Keterangan
(nama
pelaksana
Keterangan
(suhu
respons)
Kelinci 4
12.00 WIB 36,6 Citra
0,2
12.30 WIB (Penyuntikan) Citra
13.30 WIB 36,7 Citra
14.00 WIB 36,8 Citra
14.30 WIB 36,8 Citra
15.00 WIB 36,8 Citra
15.30 WIB 36,8 Citra
Kelinci 5
12.00 WIB 37,0 Ghina
0,4
12.30 WIB (Penyuntikan) Ghina
13.30 WIB 37,2 Ghina
14.00 WIB 37,4 Ghina
14.30 WIB 37,4 Ghina
15.00 WIB 37,4 Ghina
15.30 WIB 37,4 Ghina
Kelinci 6
12.00 WIB 37,3 Novia
0,4
12.30 WIB (Penyuntikan) Novia
13.30 WIB 37,5 Novia
14.00 WIB 37,5 Novia
14.30 WIB 37,5 Novia
15.00 WIB 37,7 Novia
15.30 WIB 37,7 Novia
Kelinci 7
12.00 WIB 36,8 Bu Ela
0,312.30 WIB (Penyuntikan) Bu Ela
13.30 WIB 37,0 Bu Ela
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
20/23
14.00 WIB 37,0 Bu Ela
14.30 WIB 37,1 Bu Ela
15.00 WIB 37,1 Bu Ela
15.30 WIB 37,1 Bu Ela
Kelinci 8
12.00 WIB 36,5 Ghina
0
12.30 WIB (Penyuntikan) Ghina
13.30 WIB 36,4 Citra
14.00 WIB 36,3 Citra
14.30 WIB 36,3 Bu Ela
15.00 WIB 36,3 Bu Ela
15.30 WIB 36,3 Bu Ela
Kesimpulan:
Setelah dilakukan pengujian kembali pada 5 ekor kelinci, tidak ada satupun dari 5
ekor kelinci tersebut mengalami kenaikan suhu lebih dari atau sama dengan 0,5 oC, serta
jumlah kenaikan suhu maksimum dari 8 ekor kelinci tidak lebih dari 3,3oC yakni hanya 2,6oC
(0,5 + 0,5 + 0,3 + 0,2 + 0,4 + 0,4 + 0,3 + 0), maka dinyatakan sediaan memenuhi syarat bebaspirogen.
IV.2 PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan uji pirogen terhadap sediaan uji yaitu injeksi calcii
glukonas 10%. Uji pirogen ini menggunakan metode Rabbit Test. Pengujian dilakukan pada
kelinci yang sehat dan memenuhi syarat sebagai hewan percobaan uji pirogen sebagaimana
tercantum dalam Farmakope Indonesia.
Adapun alat-alat yang digunakan dalam uji pirogen ini adalah alat suntik bebas
pirogen, alat kaca bebas pirogen, jarum bebas pirogen, kandang kelinci, dan termometer
dengan tingkat ketelitian skala 0,10C. Sedangkan bahan yang digunakan adalah larutan NaCl
0,9% steril bebas pirogen, dan larutan sediaan yang akan di uji.
Uji pirogen dilakukan menurut FI edisi III, yang terdiri dari beberapa tahap yaitu:
pengamatan bobot kelinci selama 1 minggu, uji pendahuluan dan uji utama. Pada praktikum
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
21/23
kali ini dilakukan pengamatan bobot kelinci selama 1 minggu, dan uji pendahuluan (menurut
FI edisi III) dan uji utama (menurut FI edisi IV).
Pengamatan bobot kelinci dilakukan selama 1 minggu dari tanggal 17 - 23 september
2013. Pengamatan dilakukan terhadap 3 ekor kelinci, dan dari ke-3 ekor kelinci tersebut,
tidak satupun kelinci yang mengalami penurunan berat badan (lihat tabel 4.1). Jadi ke-3 ekor
kelinci tersebut dapat digunakan atau memenuhi syarat sebagai hewan percobaan pada uji
pendahuluan.
Uji pendahuluan dilaksanakan pada tanggal 24 september 2013. Larutan uji yang
digunakan adalah larutan NaCl 0,9% steril bebas pirogen. Volume penyuntikan 10 ml/
KgBB, secara intravena ke dalam vena auricularis dari masing-masing kelinci. Perbedaan
suhu ruangan terhadap suhu pemeliharaan tidak boleh lebih dari 30. Selama 1 malam hingga
pengujian selesai kelinci tidak di beri makan dan selama waktu pengujian tidak diberi minum.
Catat suhu badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit dimulai 90 menit sebelum
penyuntikan hingga 3 jam sesudah penyuntikan dengan larutan NaCl 0,9% steril bebas
pirogen. Kelinci yang menunjukkan beda suhu lebih besar dari 0,60C tidak dapat digunakan
untuk pengujian utama. Dari hasil pengamatan, dari ke-3 kelinci tersebut tidak satupun
kelinci yang menunjukkan beda suhu lebih dari 0,60C (lihat tabel 4.2). Sehingga ke-3 kelinci
tersebut dapat digunakan pada pengujian utama.
Pengujian utama dilaksanakan pada tanggal 26 september 2013. Pengujian dilakukan
menurut FI edisi IV. Sediaan yang di uji adalah injeksi calcii glukonas 10%. Volume
penyuntikan 10 ml/ KgBB, secara intravena ke dalam vena auricularis dari masing-masing
kelinci. Penyuntikan dilakukan dalam waktu 10 menit. Untuk perhitungan dosis, dilakukan
konversi dari dosis manusia (70 kg) ke kelinci (1,5 kg) yaitu 0,007. Tentukan suhu awal
kelinci, 30 menit sebelum disuntikan larutan uji. Suhu awal kelinci tidak boleh lebih dari
39,80C dan beda suhu tiap kelinci dalam satu kelompok tidak boleh lebih dari 10C. Catat suhu
berturut-turut setelah 1 jam pertama penyuntikan sampai jam ke-3, suhu di ukur setiap 30
menit. Setiap penurunan suhu di anggap nol. Sediaan memenuhi syarat apabila tak seekor
kelinci pun menunjukkan kenaikan suhu 0,50C atau lebih, lanjutkan pengujian dengan 5 ekor
kelinci. Dari hasil pengamatan, ada 2 kelinci yang mengalami kenaikan suhu lebih dari atau
sama dengan 0,50C yaitu kelinci 1 dan 2 (lihat tabel 4.3). Sehingga pengujian dilanjutkan
dengan 5 ekor kelinci.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
22/23
Pengujian tambahan dilakukan pada 5 ekor mencit. Perlakuan sama dengan halnya
pada uji utama. Jika tidak lebih dari 3 ekor, dari total 8 ekor kelinci masing-masing
mengalami kenaikan suhu 0,50C atau lebih, tetapi suhu total dari 8 ekor kelinci maksimum
3,30C, maka sediaan dianggap bebas pirogen. Setelah dilakukan pengamatan dan pencatatan
kenaikan suhu dari ke-5 ekor kelinci tersebut, ternyata tidak ada satupun dari 5 ekor kelinci
tersebut mengalami kenaikan suhu lebih dari atau sama dengan 0,5oC, serta jumlah kenaikan
suhu maksimum dari 8 ekor kelinci tidak lebih dari 3,3oC yakni hanya 2,6oC (0,5 + 0,5 + 0,3
+ 0,2 + 0,4 + 0,4 + 0,3 + 0), maka dinyatakan sediaan memenuhi syarat bebas pirogen.
Dari percobaan uji pirogen terhadap sediaan uji injeksi calcii glukonas 10%, dapat
disimpulkan bahwa injeksi calcii glukonas tersebut memenuhi syarat bebas pirogen, karena
hanya 2 ekor kelinci dari 8 ekor kelinci yang diuji, yang mengalami kenaikan suhu lebih dari
atau sama dengan 0,50C, dan jumlah kenaikan suhu maksimum dari 8 ekor kelinci tidak lebih
dari 3,3oC yakni hanya 2,6oC.
IV.3 PENDALAMAN MATERI
Uji pirogen dilakukan untuk mengetahui apakah sediaan uji (sediaan parenteral) bebas
dari pirogen. Uji pirogen ini sangat penting, karena pirogen yang ada dalam sediaan, jika
disuntikan ke tubuh manusia dapat menimbulkan peningkatan suhu tubuh atau demam. Selain
itu pirogen memberikan efek vasokontriksi, dilatasi pupil, depresi nafas, dan peningkatan
tekanan darah. Mungkin reaksi yang muncul juga adalah nyeri pada persendian dan
punggung, sakit kepala, mual dan malaise, shok endotoksin, kerusakan jaringan tubuh dan
kematian. Akan sangat berbahaya untuk pasien dengan kondisi sakit yang menerima LVP
(Large Volume Parenteral) yang mengandung endotoksin.
Salah satu metode uji pirogen adalah Rabbit Test. Digunakan kelinci sebagai hewan
coba. Hal ini dikarenakan kelinci memiliki respon fibriel yang mirip dengan manusia.
Pada uji pirogenitas, penyuntikan dilakukan pada pembuluh vena. Hal ini bertujuan
agar obat atau sediaan uji yang disuntikan, langsung terdistribusi ke dalam aliran darah.
Sehingga efek panas dari pirogen dapat langsung diamati.
Penyuntikan dilakukan pada vena auricularis, karena vena auricularis adalah vena
terbesar yang ada pada tubuh kelinci. Sehingga vena dapat dengan mudah dicari dan dilihat.
-
8/13/2019 Laporan Rabbit Pyrogen Test
23/23
Sebelum dilakukan uji pirogen terhadap kelinci, perlu dilakukan pengadaptasian
terhadap kelinci, dengan tujuan untuk menghindari hasil yang positif palsu, kelinci
mengalami kenaikan suhu tubuh bukan disebabkan oleh sediaan uji, melainkan kelinci stress
dengan lingkungan yang baru karena sebelumnya tidak diadaptasikan terlebih dahulu.