PENETAPAN KADAR EUGENOL DALAM BUNGA KERING ATAU DAUN Eugenia caryophyllata L. Merr. & Perry (Myrtaceae) SECARA DISTILASI UAP (STEAM DISTILLATION) Makalah Analisis Farmasi dan Validasi Metode Distilasi Uap(Steam Distillation)

Disusun oleh :Asti Aprilia Putri138114071Edwin Tesalonika 138114072Michael Ryanda E. 138114073Andre Syofian138114081Dendi Putro A.138114082Marcellina D. D.138114084GOLONGAN A1

PJ Laporan: Henry

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA2015PENETAPAN KADAR EUGENOL DALAM BUNGA KERING ATAU DAUN Eugenia caryophyllata L. Merr. & Perry (Myrtaceae) SECARA DISTILASI UAP (STEAM DISTILLATION)A. Tujuan1. Mengetahui cara mendapatkan minyak cengkeh dengan metode distilasi uap.2. Memahami isolasi dan determinasi kadar Eugenol dalam bunga kering atau daun Eugenia caryophyllata L. Merr. & Perry (Myrtaceae) secara ekstraksi dan analisis Gas Chromatography.

B. PrinsipDistilasi uap merupakan salah satu jenis distilasi yang merupakan gabungan antara distilasi kontinu dan distilasi batch. Bahan yang akan dipisahkan dengan distilasi berada dalam kolom distilasi (batch) sedangkan uap air mengalir melalui bahan secara kontinu (Vargasa et al, 2009).Prinsip dari distilasi uap adalah dengan mengalirkan uap air ke dalam campuran bahan dimana terdapat komponen yang ingin dipisahkan. Contohnya pada pemisahan minyak atsiri yang terdapat pada batang, daun dan bunga tumbuhan. Bagian tumbuhan yang akan didistilasi, ditempatkan diatas plat penyangga yang berlubang-lubang tempat aliran uap. Selama proses distilasi berlangsung, uap air akan mengalir melalui sela-sela bahan baku tersebut dan memanaskan minyak yang terkandung di dalamnya, sehingga menguap dan terbawa bersama uap air. Campuran uap air dan uap minyak ini kemudian diembunkan di dalam kondensor sampai seluruhnya mencair. Karena antara minyak dengan air tidak dapat larut maka akan dengan mudah dapat dipisahkan dengan cara didiamkan (dekantasi) (Vargasa et al, 2009).Prinsip ekstraksi yaitu analit dibersihkan dari bahan-bahan dalam matriks formulasi yang akan mengganggu dalam analisis dengan menggunakan pelarut yang sangat mudah melarutkan analit, tetapi tidak melarutkan senyawa pengganggu. Tahap-tahap pemisahan pelarut lebih lanjut mungkin dapat digunakan untuk mengurangi senyawa pengganggu tersebut (Watson, 2007).Prinsip kerja rotary evaporator adalah menggunakan prinsip distilasi (pemisahan). Prinsip utamanya adalah penurunan tekanan sehingga pelarut dapat menguap pada suhu dibawah titik didihnya. Dengan demikian suatu pelarut akan menguap dan senyawa yang larut dalam pelarut tersebut akan mengendap. Pemanasan dibawah titik didih pelarut memungkinkan senyawa yang terkandung dalam pelarut tidak rusak oleh suhu yang tinggi (Sarker,Latif & Gray, 2006).Prinsip kerja kromatografi gas yaitu gas dalam silinder baja bertekanan tinggi dialirkan melalui kolom yang berisis fasa diam. Cuplikan berupa campuran yang akan dipisahkan, biasanya berbentuk larutan, diinjeksikan ke dalam aliran gas tersebut. Cuplikan dibawa oleh gas pembawa ke dalam kolom dan di dalam kolom terjadi proses pemisahan. Komponen-komponen campuran yang telah terpisahkan satu persatu meninggalkan kolom. Detektor diletakkan di ujung kolom untuk mendeteksi jenis maupunjumlah komponen campuran. Hasil pendeteksian direkam dengan recorder dan dinamakan kromatogram yang terdiri dari beberapa peak (puncak). Jumlah peak yang dihasilkan menyatakan jumlah komponen (senyawa) yang terdapat dalam campuran. Sedangkan luaspeak bergantung kepda kuantitas suatukomponen dalam campuran. Karena peak-peak dalam kromatogram berupa senyawa segitiga maka luasnya dapat dihitung berdasarkan tinggi dan lebar peak tersebut (Tim Kimia Analitik Instrumen., 2010).

C. Latar Belakang Teoritik Cengkeh memiliki nama botani Syzygium aromaticum atau Eugenia caryophyllus merupakan tanaman asli Indonesia yang merupakan famili dari Myrtaceae. Dalam bunga cengkeh selain terkandung minyak atsiri,yaitu eugenol, juga mengandung senyawa kimia yang disebut euginin, asam oleanolat, asam galotanat, fanilin, karyofilin, resin dan gom (Thomas, 2005). Eugenol (4-alil-metoksi fenol) merupakan konstituen dari bunga cengkeh dengan wujud cairan tidak berwarna yang memiliki bobot molekul 164.2 g/mol, memiliki titk didih 253,20C dan titik lebur -7,50C. Massa jenisnya 1,055 dengan tekanan uap 0,03 mmHg. Eugenol larut dalam air dingin, dan bersifat bakterisidal dengan rumus molekul C3H5C6H3(OH)OCH3 (Anonim, 2005).Distilasi ialah salah satu pemisahan campuran yang memiliki prinsip sederhana namun tetap memiliki variasi, dimana setiap variasi distilasi tersebut memiliki kelebihan dan kelemahan. Secara umum, bagian bagian dari alat distilasi adalah labu distilasi, pemanas, kolom distilasi dan labu penampung. Langkah awal, labu distilasi yang berisi cairan dipanaskan, lalu uap dari cairan tersebut akan naik ke kolom zat yang memiliki titik didih yang tinggi yang kemudian mencair lagi pada kolom kondensor. Zat yang titik didihnya lebih rendah akan terus terbawa hingga di labu penampung (Sunardi, 2004).Distilasi untuk 2 cairan yang dapat bercampur, hasilnya agak berbeda. Campuran cairan tersebut akan mendidih pada suhu lebih rendah dari titik didih dari salah satu komponen yang terpisah sebagai senyawa murni. Ketika steam digunakan untuk menghsilkan salah satu fase dari campuran cairan tersebut, proses ini disebut distilasi uap. Keuntungan dari teknik ini adalah komponen yang diinginkan, dapat menguap pada suhu di bawah 100 C. Jika komponen yang ingin dipisahkan merupakan zat-zat yang tidak stabil, peristiwa dekomposisi harus dihindari. Distilasi uap digunakan secara luas dalam mengisolasi cairan dari sumber alami, juga digunakan untuk menghilangkan produk reaksi (produk samping) dari reaksi campuran yang berlangsung lama. (Pavia, 2005).Distilasi uap merupakan metode untuk isolasi suatu senyawa atau memurnikan suatu senyawa pada cara ini digunakan suatu cairan yang tidak saling melarutkan akan mengikuti Hukum Dalton, dimana tekanan yang dihasilkan oleh campuran gas yang tidak bereaksi dengan jumlah tekanan masing-masing uap (Sunardi, 2004).Distilasi uap melibatkan kotidilitas campuran air dan senyawa organik volatil yang tidak bercampur dengan air . Distilasi uap sering kali digunakan untuk memisahkan senyawa volatil dari senyawa non volatil . Metode ini juga sering digunakan untuk memisahkan senyawa yang terdekomposisi pada titik didihnya hal ini dapat di sebabkan suhu distilasi uap lebih rendah dari 100oC . Secara umum, tekanan uap senyawa yang lebih besar dari 10 mmHg pada 100oC sangat efektif bila dipisahkan dengan distilasi uap . Senyawa yang dipisahkan dengan distilasi uap harus tidak larut dalam air, dan memiliki bobot molekul antara 2-1000 dalton. Tekanan uap parsial tidak tergantung pada komposisi dalam campuran Pn=Ptotal campuran berair merupakan jumlah tekanan uap komponen yang tidak bercampur (Arsyad , 2001 ).

Instrumentasi kromatografi gas :(McNair dan Miller, 1998).Keuntungan dari kromatografi gas : Analisisnya cepat Efisien, didukung dengan resolusi yang tinggi Sensitive, mudah mendeteksi ppm sampai ppb Akurasi tinggi untuk analisis kuantitatif (RSD 1-5%) Membutuhkan jumlah sampel yang sedikit (L) Kepercayaannya tinggi dan relatif mudah Tidak mahal biaya operasionalnyaKelemahan dari kromatografi gas : Hanya bisa menggunakan sampel yang menguap (Volatil) Tidak cocok untuk sampel yang tidak stabil pada suhu tertentu Susah untuk sampel yang sangat besar Membutuhkan spektroskopi (mass spektroskopi, untuk mengkonfirmasi identitas peak)(McNair dan Miller, 1998).

Isolasi minyak bunga cengkeh umum dilakukan menggunakan metode distilasi uap dan distilasi air. Kedua metode tersebut mudah dan aman bagi lingkungan karena tidak menggunakan pelarut organik berbahaya. Isolasi dengan distilasi uap menghasilkan minyak cengkeh dengan kandungan eugenol lebih tinggi daripada isolasi dengan distilasi air. (Srivastava, 2005).Hukum Raoult, menyatakan campuran paling sederhana dalam dua pelarut yang larut secara sempurna, volatilitas dari keduanya tidak dapat diganggu oleh zat lain. Titik didih campuran akan berada di tengah-tengah dari zat murni (perbandingan titik didih diantara kedua zat tersebu adalah sama besar), dan tingkat pemisahan yang dihasilkan oleh distilasi tunggal akan bergantung pada tekanan uap atau volatibilitas dari komponen yang terpisah pada suhu tersebut. Pertama kali dikemukakan oleh Raoult. Persamaan Raoult:PT = ( P1)o X1+ (P2) ^o X2Distilasi alkohol 99% menghasilkan uap yang konsentrasinya kurang dari 99%. Oleh sebab itu alkohol tidak dapat dikonsentrasikan dengan distilasi hingga 97% (Edgar dan Showick, 2009).Distilasi uap digunakan teutama dalam kasus distilasi bahan yang sensitif terhadap panas. Substansi-substansi tidak than panas tersebut dapat dipisahkan dengan mengurangi tekanan uap pada komponen yang volatil ini menggunakan inert vapour yang dapat menurunkan temperatur dari proses distilasi itu. Inert vapour yang digunakan harus dapat bercampur dengan komponen yang akan didistilasi. Dalam distilasi uap, cairan didistilasi dengan menambahkan uap secara langsung ke dalam cairan di dalam alat distilasi, kemudian uap tersebut terbawa dari cairan-cairan volatil yang kemudian dikondensasikan. Sementara bahan-bahan yang tidak volatil tetap berada di alat distilasi. Ketika dua campuran tidak bercampur ini didistilasi, tekanan total uap Pt di atas cairan sama dengan jumlah tekanan uap dari setiap campurannya, pernyataan tersebut dihubungkan dengan hukum Dalton. Persamaan Dalton:PT = (P1)^o + (P2)^o(P1) ^o+(P2) ^o = 1atm = 760 mmHg (Gavhanne, 2008).Validasi metode menurut USP (United State Pharmacopeia) dilakukan unutk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reproduksi, dan tahan pada kisaran analit yang akan di analisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk verifikasi bahwa parameter parameter kinerjannya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis, oleh karena itu suatu metode analisis harus divalidasi, pada saat : Metode baru dikembangkan untuk analisis mengatasi problem analisis tertentu Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau karena manualnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi. Penjaminan mutu yang mengindikasikanbahwa metode baku telah berubah seiring dengan berjalannya waktu Metode baku yang digunakan di Laboratorium yang berbeda, digunakan oleh analisis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda Untuk mendemontrasikan kesetaraan antar dua metode, sepperti metode yang baru dan metode baku. (Gandjar dan Rohman, 2007).Validasi metode dilakukan untuk mengetahui sejauh mana penyimpangan suatu metode tidak dapat dihindari pada kondisi normal, di mana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar. Teknik yang digunakan hendak dilakukan dalam memvalidasi metode merupakan salah satu atau kombinasi dari hal-hal berikut: kalibrasi dengan menggunakan standar acuan, pembandingan hasil yang diperoleh dengan metode lain, asesmen yang sistematik dari faktor-faktor yang mempengaruhi hasil antara lain penentuan batas deteksi khususnya untuk metode pengujian yang meliputi LDL (Instrument Detection Limit), LOD (Limit of Detection), LOQ (Limit of Quantitation), akurasi metode (Method Accuracy), metode presisi (Method Precision) (Hadi, 2007).Menurut USP, ada sembilan langkah dalam validasi metode analisis, yaitu : Akurasi: merupakan ketelitian metode analisis, atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima, baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai rujukan. Presisi: merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik. Spesifitas: adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen komponen lain dalam matriks sampel sperti ketidakmurnian, produk degrasi dan komponen matriks. Batas deteksi (Limit of Detection, LOD): merupakan konsentrasi analit terkecil atau terendah, yang dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Batas Kuantifikasi (Limit of Quantification, LOQ): merupakan konsentrasi analit terendah dalam suatu sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat yang diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Linearitas: merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil hasil uji secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan Kisaran (range): merupakan konsentrasi terendah dan tertinggi, yang mana suatu metode analisis menunjukkan akurasi, presisi, linearitas yang mencukupi. Kekasaran (Ruggedness): merupakan tingkat reproduktibilitas hasil yang diperoleh dibawah kondisi yang bermacam macam yang diekspresikan sebagai persen standar deviasi relatif (% RSD). Ketahanan (Robutness): merupakan metode untuk tetap tidak berpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil.(Gandjar dan Rohman, 2007).

Sifat fisika kimia analit yang digunakan :1. Minyak Cengkeh

KarakteristikNilai

Bobot jenis 25CKadar Eugenol (%)1,048-1,0561,534-1,538

Minyak cengkeh mengandung dan komponen utama yakni eugenol (80-90 %) dan -karyofilen (10-20%) yang turut berperan dalam menentukan aroma dari minyak cengkeh tersebut. Minyak bunga cengkeh berupa cairan yang berwarna kuning sampai coklat muda bila bertemu besi berubah menjadi warna coklat - ungu tua, mempunyai rasa yang pedas, keras dan berbau aroma cengkeh yang dimanfaatkan dalam industrifragrance (parfum)danflavorkarena memiliki aroma yang khas dan industri farmasi karena bersifat antiseptik (Nurdjannah, N., 2004).Kualitas minyak bunga cengkeh ditentukan dari fenol, terutama eugenol, bau, dan warna minyak, serta hidrokarbon dan senyawa aromatik. Hasil penyulingan dan sifat fisika kimia minyak bunga cengkeh tergantung pada sumber dan kualitas tanaman cengkeh, metode penyulingan serta keadaan bahan yang disuling. Cengkeh yang didistilasi dapat menghasilkan minyak dengan kadar eugenol tinggi dengan bobot jenisnya 1,06, sedangkan cengkeh yang ditumbuk akan menghasilkan minyak dengan kadar eugenol sedikit lebih rendah (Memmou, F., R. Mahboub, 2012).2. EugenolNama IUPAC: 2-methoxy-4-prop-2-enylphenol Bentuk: CairanWarna: Bening atau kuning pucatBau: Bau cengkehRasa: Pedas dan tajam Berat molekul: 164,20108 g/moLTitik lebur: -9.2 sd 9.1C Titik didih: 225C pKa: 10,19 (25C)Berat jenis: 1,0652 g/cm3 (pada suhu 20C)Kelarutan: 2460 mg/L pada suhu 25C dalam air Larut dalam alkohol, kloroform, eter, asam asetat glacial, aquadesStabilitas: Menggelap pada paparan udara Merupakan komponen utama dalam minyak cengkeh (kandungan mencapai 70-96%). Berwujud cairan bening hingga kuning pucat, mudah menguap, dengan aroma menyegarkan, khas dan pedas. Eugenol adalah senyawa alkohol siklis monohidrasi sehingga dapat beraksi dengan basa kuat, seperti NaOH, KOH, atau Ca(OH)2. Mempunyai rumus molekul C10H12O2, mengandung beberapa gugus fungsional yaitu alil (-CH2-CH=CH2), fenol (-OH) dan metoksi (-OCH3), sehingga memungkinkan eugenol sebagai bahan dasar sintesis berbagai senyawa lain yang lebih tinggi. (Bulan, 2004). Untuk mendapatkan eugenol dari minyak cengkeh biasanya dilakukan dengan penambahan basa kuat, 3-5% sehingga membentuk garam eugenolat yang larut dalam air. Dengan penambahan HCl , eugenol akan terbebas lalu di ekstraksi dengan eter (Kardinan, 2005).

Struktur Eugenol3. AquadestBentuk : CairanWarna: BeningBau: Tidak berbauRasa: Tidak berasaBerat molekul : 18.01528 g/mol Titik lebur: 0CTitik didih: 99.974CBerat jenis: 0.9950 g/cm3 (pada suhu 20C)Kelarutan: Mudah larut dalam etanol, methanol, asetonMerupakan pelarut yang baik, bukan oksidator kuat, bahkan cenderung bersifat reduktor.Reaksi oksidasi dari air sendiri dapat terjadi jika direaksikan dengan logam alkali atau alkali tanah.(International CHEMTREC, 2013).4. Na2SO4( Natrium sulfat anhidrat)Bentuk: Padatan kristal, serbuk kering, cairanWarna: PutihBau: Tidak berbauRasa: PahitBerat molekul: 142,042139 g/moLTitik lebur: 884C Titik didih: > 1700C Berat jenis: 2,671 g/cm3Kelarutan: Sangat larut dalam airKegunaan : sebagai bahan pengering, bersifat sebagai pengering(International CHEMTREC, 2013).

5. KOH (Kalium hidroksida)Bentuk: Padatan kristal, serbuk, cairan (kristal/ serpihan)Warna: Putih hingga uningBau: Tidak berbauRasa: Tidak berasaBerat molekul: 56.10564 g/moLTitik lebur: 380C Titik didih: 1384C Berat jenis: 2.044 g/cm3 (pada suhu 20C)pH: 13.5 (dalam larutan 0,1 M)Kelarutan : Larut dalam air, tidak larut dalam dietil eter(International CHEMTREC, 2013).6. DiklorometanaRumus molekul : CH2Cl2Bentuk: CairanWarna: Tidak berwarnaBau: Berbau seperti kloroformRasa: Pedas dan tajam Berat molekul: 84.932588g/moLTitik lebur: -95C Titik didih: 40C (1013hPa).pH: netral (dalam air, 20C)Berat jenis: 1,3255 g/cm3 (pada suhu 20C)Kelarutan:13.00 mg/L pada suhu 25C dalam air Larut dalam alcohol, eter, etanol, etil eter, karbon tetraklorida(International CHEMTREC, 2013).

7. Asam Klorida Asam Klorida mengandung tidak kurang dari 36,5% b/b dan tidak lebih dari 38,0% b/b HClBentuk: Cairan, GasWarna: Tidak berwarnaBau: TajamRasa: Tajam Berat molekul: 36.46094 g/moLTitik lebur: -114.22C Titik didih: -85C pKa: 10,19 (25C)Berat jenis: 1,639 g/cm3 (pada suhu 20C)Kelarutan: 2460 mg/L pada suhu 25C dalam air Larut dalam air, etanolStabilitas: Stabil dalam suhu tinggi, bersifat korosif(International CHEMTREC, 2013).

8. Natrium kloridaNatrium klorida mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 101,0% NaCl dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Tidak mengandung zat tambahan.Bentuk: Padatan kristal, Serbuk kering, CairanWarna: Tidak berwarna, kristal beningBau: Tidak berbauRasa: Rasa garam Berat molekul: 58.442769 g/moLTitik lebur: 800.7C Titik didih: 1465C pH: 6.7-7.3Berat jenis: 2.17 g/cm3 (pada suhu 25C)Kelarutan: 36.0 mg/L pada suhu 25C dalam airLarut dalam air dingin, air panas. Larut dalam gliserol, asam hidroklorat, dan amonia. Sangat mudah larut dalam alkohol. Sedikit larut dalam etanol.Stabilitas: Stabil dalam kondisi penyimpanan yang direkomendasi(International CHEMTREC, 2013).9. Heksana Nama IUPAC: 3,3-Dimetil butanaBentuk: Padatan kristal, Serbuk, CairanWarna: PutihBau: Tidak berbauRasa: Tidak berasaBerat molekul: 56.10564 g/moLTitik lebur: -128.8C Titik didih: 57.9C Berat jenis: 0.65 g/cm3 (pada suhu 20C)Kelarutan: Larut dalam etanol, eter, sangat larut dalam aseton(International CHEMTREC, 2013).

D. Alat dan Bahan Alat :- Labu alas bulat 500ml - Pipa Liebig - Erlenmeyer 250 ,125 ml - Penjepit - Klem cincin - Ball filler pipet - Adapter Claesin - Pipet gondok - Heating mantel - Statif - Gelang karet - Mortir & stamper - Baskom - Gelas ukur - Corong pisah 250 ml - Flakon - Beaker glass 1000 ml, 250 ml- GC - Pipet tetes - Timbangan Analitik

Bahan:- bunga cengkeh- es batu - aquadest- batu didih - eugenol- Diklormetan - NaCl- Natrium sulfat exicc - larutan 5% Kalium hidroksida- asam klorida - natrium sulfat anhidrat p. - larutan 1/2 jenuh natrium klorida - vaselin - indikator pH universal

E. Bagan KerjaDilakukan untuk setiap sampel A, B, C, D, E1. Distilasi Uap2 g Daun Cengkeh DitumbukSerbuk Daun Cengkeh Ditimbang Ditambahkan 100 ml eugenol pada sampel A Distilasi LAB: Serbuk daun cengkeh + 150 ml akuades + 3 batu didih Corong pisah: 200 ml akuades Destilat(diambil 1 ml destilat E, kemudian dimasukkan ke dalam flakon yang bersih untuk dianalisis)Ekstraksi cair-cair Ditambah 5 g NaCl Ditambah 15 ml diklorometan, `bilas dengan 10 ml diklorometan

Lapisan air Lapisan diklorometan I Ekstraksi cair-cair ditambah 10 ml diklorometan Lapisan air Lapisan diklorometan II Ekstraksi cair-cair ditambah 10 ml diklorometan

Lapisan air Lapisan diklorometan III

Lapisan diklorometan (I+II+III)Lapisan diklorometan (I+II+III) Keringkan dengan Natrium Sulfat exicc.Lapisan diklorometan kering2. PartisiLapisan diklorometan Ekstraksi cair-cair Ditambah 100 ml eugenol Ditambah 30 ml larutan 5% KOH Lapisan air I Lapisan diklorometan Ekstraksi cair-cair Ditambah 25 ml larutan 5 % KOH

Lapisan air II Lapisan diklorometanEkstraksi cair-cair Ditambah 25 ml larutan 5% KOH

Lapisan air III Lapisan diklorometanLapisan air (I+II+III) Dimasukkan ke corong pisah Dicuci dengan 15 ml diklorometan

Lapisan air Lapisan diklorometan Didinginkan Diasamkan secara perlahan dengan larutan 5%HCl sampai pH 1 Lapisan air asam Ekstraksi cair-cair Bilas dengan 10 ml diklorometan (dilakukan 2x)

Lapisan air Lapisan diklorometan (I) Ekstraksi cair-cairDitambah 10 ml diklormetan

Lapisan airLapisan diklormetan (II)

Lapisan airEkstraksi cair-cairDitambah 10 ml diklorometan

Lapisan airLapisan diklorometan (III)Lapisan dikorometan (I+II+III) Dimasukkan ke corong pisah yang sama Cuci dengan 15 ml akuades

Larutan Air Larutan diklorometanCuci dengan 15 ml NaCl setengah jenuh (8 ml NaCl jenuh & akuades)

Lapisan Air Lapisan diklorometanDimasukkan ke dalam erlenmeyer/beaker glassDitambah 15 gram Natrium sulfat anhidrat p.aLarutan Eugenol dalam diklorometan3. PemekatanLabu alas bulat ditimbang

Larutan eugenol dalam diklorometan didecanter dalam LAB sesuai label A B C D E

Ditambahkan 100 mg eugenol pada labu C

Diklorometan didistilasi dengan rotary evaporator

Saat pelarut habis akan tersisa minyak kuning pucat yang berbau tajam dan khas dari cengkeh dan mengandung sekitar 98% eugenol

4. DeterminasiDitambahkan 100 mg eugenol pada labu D

Diinjeksikan ekstrak A B C D E dan 1 ml hasil distilasi E yang disisihkan ke GC-FID yang sudah dioptimasikan

5. Pembuatan Larutan Baku EugenolDibuat larutan stok dengan mengambil 0,1 ml baku eugenol

Dilarutkan dalam heksan dan diencerkan dalam labu takar hingga batas tanda

Dari larutan stok tersebut diambil sejumlah 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 ml larutan

Dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml

Diencerkan dengan heksan hingga batas tanda

6. Pengkondisian GCGC dinyalakan sesuai petunjuk pemakaian

Suhu injektor, oven, dan detektor diatur

Pengkondisian dilakukan selama 1 jam

7. Penentuan waktu retensiOven diatur pada suhu 150C

Standar diinjeksikan sebanyak 1-2 l

Ditunggu sampai puncak eugenol keluar

Waktu retensinya dicatat

Ulangi dengan sampelBandingkan puncak kromatogram sampel dengan standard, nilai Rsnya dihitung8. Jika puncak sudah terpisahDisiapkan seri kadar larutan standar eugenol dari larutan stok standar

Masing-masing seri larutan standar diinjeksikan, dibuat hubungan konsentrasi dengan luas puncak (kurva baku), dihitung LOD teoritis

Sampel diinjeksikan, jika puncak terlalu besar, diencerkan dengan metanol sampai luas puncak masuk ke dalam rentang kurva baku

Dihitung kadarnya dan % recovery

F. Data Pengamatan1. Data Penimbangan Sampel CengkehSampelKertas (g)Kertas + isi (g)Isi (g)

A0.26702.27292.2577

B0.25322.26572.2064

C0.24932.26152.2077

D0.25642.57842.5488

E10.24842.28582.2144

E20.25052.27202.2377

2. Data Perhitungan Baku Eugenol0.1 mL x 99% (v/v) = 0.099 mLm = x V = 1.07 g/mL x 0.099 mL = 0.10593 gram dalam 10 mLC = = 0.010593 g/mL = 10.593 /mL

Konsentrasi Larutan SeriSeri 10.5 mL X 10.593 g/mL = C1 X 10 mLC1 = 529.65 g/mlSeri 21.0 mL X 10.593 g/mL = C2 X 10 mLC2 = 1059.3 g/mlSeri 31.5 mL X 10.593 g/mL = C3 X 10 mLC3 = 1589.5 g/mlSeri 42.0 mL X 10.593 g/mL = C4 X 10 mLC4 = 2118.6 g/mlSeri 52.5 mL X 10.593 g/mL = C5 X 10 mLC5 = 2648.25 g/ml

3. Kurva Baku EugenolTabel Seri Larutan BakuSeriKadarIntegral 1Integral 2AUC

1529.652.8372.9080.071

21059.30.2330.3570.124

31588.950.6580.8350.177

42118.62.5462.7670.221

52648.252.0632.3260.263

4. Data Perhitungan Sampel CengkehTabel Kadar Eugenol Sampel SebenarnyaSampelIntegral 1Integral 2AUCKadar (g/mL)Faktor pengenceranKadar Sebenarnya (g/mL)

A20.35820.5160.1581456.6673.3334855.556

B22.72522.9130.1881790.0002035800.000

C23.07823.2440.1661545.5562030911.111

D22.03722.1850.1481345.5562026911.111

E22.36122.5370.1761656.6671016566.667

LOD LOQ y-LOD = YB + 3SBy-LOQ = YB + 10SBKeterangan: YB = a dari persamaan baku y=bx+aSB = Sy/xy-LOD dan y-LOQ dianggap y dalam persamaan baku, sehingga didapatkan x yang merupakan nilai LOD dan LOQ.

EugenolPersamaan kurva baku y = 0.00009x + 0.0269Xi (Kadar)Yi (AUC)Yi-(Yi-)2

529.650.071-0.0040.0000127

1059.30.1240.0020.0000031

1588.950.1770.0070.0000503

2118.60.2210.0030.0000117

2648.250.263-0.0020.0000050

0.0000829

Sy/x= = 0.00526y-LOD = YB + 3SB = 0.0269 + 3(0.00526) = 0.0427 LOD= 0.0427 = 0.00009x + 0.0269X = 175.5 g/ml y-LOQ = YB + 10SB = 0.0269 + 10(0.00526) = 0.080LOQ= 0.080 = 0.00009x + 0.0269X= 590 g/ml5. % Recovery dan % KesalahanSampelAUC (Y)Kadar (ppm)Kadar (mg/ml)Bobot (mg)

A0.1584855.5564.8560.486

B0.18835800.00035.8003.580

C0.16630911.11130.9113.091

D0.14826911.11126.9112.691

E0.17616566.66716.5671.657

Recorvery A = = = - 1.171 % b/b

Recorvery B = = = 1.923 % b/b

Recorvery C = = = 1.434 % b/b

Recorvery D = = = 1.034 % b/b

% kesalahan total = 100 % - % recorvery A100 % - (-1.171%) = 101.171 %% kesalahan distilasi =% kesalahan total (100% - % recorvery B) 101.171 % - (100% - 1.923 %) = 3.094 %% kesalahan partisi= (100 % - % recorvery B) (100 % - % recorvery C)(100 % - 1.923 %) (100 % - 1.434 %) = -0.489 %% kesalahan pemekatan = (100 % - % recorvery C) (100 % - % recorvery D)(100 % - 1.434 %) (100 % - 1.034 %) = -0.400 %% kesalahan determinasi = (100 % - % recorvery D) (100 % - % recorvery E)(100 % - 1.034 %) (100 % - 100 %) = 98.966 %

6. Presisi Intraday Larutan SeriREPLIKASI ISeriKadarIntegral 1Integral 2AUC

1529.650.0740.1480.074

21059.30.260.3720.112

31588.950.560.7480.188

42118.60.951.1520.202

52648.251.491.8280.338

REPLIKASI IISeriKadarIntegral 1Integral 2AUC

1529.652.092.1530.063

21059.31.9282.0270.099

31588.952.3122.4720.16

42118.62.692.9080.218

52648.253.1913.4730.282

REPLIKASI IIISeriKadarIntegral 1Integral 2AUC

1529.653.5423.6110.069

21059.33.7143.8160.102

31588.953.9954.1730.178

42118.64.4194.6640.245

52648.254.9555.2460.291

SD dan %RSDSERI 1X(X-)(X-)2

0.0740.0050.0000284

0.063-0.0060.0000321

0.06900

SD0.0000605

SERI 2X(X-)(X-)2

0.1120.1040.0080.0000588

0.099-0.0050.0000284

0.102-0.0020.0000054

SD0.0000927

SERI 3X(X-)(X-)2

0.1880.1750.0130.0001604

0.16-0.0150.0002351

0.1780.0030.0000071

SD0.0004027

SERI 4X(X-)(X-)2

0.2020.222-0.0200.0003868

0.218-0.0040.0000134

0.2450.0230.0005444

SD0.0009447

SERI 5X(X-)(X-)2

0.3380.3040.0340.0011788

0.282-0.0220.0004694

0.291-0.0130.0001604

SD0.0018087

7. ResolusiSeri 5 = = = 18.891Sampel C = = = 20.544

8. Faktor Asimetri dan Tailing FactorSeri 5FA = = = 1TF = = = 0.97Sampel CFA = = = 0.8TF = = = 0.85

G. PembahasanTujuan praktikum kali ini bertujuan untuk mengenal dan memahami teknik pemisahan dengan teknik distilasi uap, menentukan kadar eugenol yang terkandun g dalam bunga kering secara kromatografi gas, mendapatkan minyak cengkeh dari bunga cengkeh dengan distilasi uap, dan mengisolasi serta mendeterminasi eugenol dari minyak cengkeh secara ekstraksi dan kromatografi gas.Metode distilasi digunakan untuk memisahkan dan memurnikan senyawa-senyawa organik. Prinsip distilasi yaitu pemisahan dua komponen atau lebih berdasarkan titik didih suatu senyawa, prosesnya meliputi penguapan cairan dengan adanya panas yang kemudian uap tersebut dikondensasikan dengan kondensor.Metode distilasi secara sederhana dibagi menjadi tiga, distilasi sederhana, distilasi uap, dan distilasi fraksi. Teknik distilasi uap biasanya digunakan untuk mengisolasi minyak. Prinsip distilasi uap yaitu didasarkan pada volatilitas beberapa senyawa organik terhadap uap pada temperatur kurang dari 100oC.Pemisahan yang terjadi dalam distilasi uap didasarkan pada perbedaan titik didih dari masing-masing zat dalam campuran, sehingga zat dengan titik didih lebih rendah akan menguap paling awal, uap yang didinginkan akan membentuk embun, menetes, dan menghasilkan destilat (zat murni). Keuntungan digunakan distilasi uap dalam mengisolasi minyak atsiri yaitu penetrasi uap ke dalam sel tanaman cukup baik sehingga dapat membawa minyak keluar dari sel tanaman. Uap air menembus dengan cara osmosis yang menyebabkan pembengkakan membran dan membawa minyak sampai ke permukaan.Distilasi uap didasari oleh Hukum Dalton yaitu tekanan campuran dari gas sebanding dengan jumlah tekanan parsial gas masing-masing senyawa dalam campuran, dinyatakan dengan rumus Ptotal = P1 + P2 (Helmenstine, A. M., 2014).Tekanan uap larutan yang mengandung pelarut mudah menguap dan tidak mudah menguap digambarkan dengan Hukum Raoult, dinyatakan oleh rumus : Plarutan = Xsolven x P0solven. Dimana Plarutan adalah tekanan uap larutan, Xsolven adalah fraksi mol dari solven, dan P0 adalah tekanan uap dari pelarut murni pada suhu tertentu (Helmenstine, T., 2014).Distilasi uap digunakan untuk mendistilasi campuran air dengan senyawa yang tidak larut dalam air, dilakukan dengan mengalirkan uap air ke dalam campuran sehingga suatu bagian akan menguap pada suhu lebih rendah. Dengan adanya tekanan uap campuran dari dua senyawa, maka titik didih masing-masing senyawa akan lebih rendah dari titik didih awalnya.Praktikum kali ini meliputi 5 kali ekstraksi untuk sample A,B,C,D, dan E. Pada sample A, sebelum bubuk cengkeh didistilasi, ditambahkan larutan eugenol sebanyak 100 l. Labu alas bulat yang berisi bubuk cengkeh diberi batu didih untuk mempercepat dan menyebarkan panas saat proses distilasi, lalu tambahkan aquadest sebanyak 150 ml. Penting untuk diperhatikan yaitu air harus tetap pada labu alas bulat, sehingga setiap tetes hasil distilasi yang keluar harus digantukan dengan tambahan dari aquadest. Setelah distilasi selesai, pada destilat E diambil 1 ml untuk dianalisis.Proses selanjutnya yaitu ekstraksi dengan tujuan untuk memisahkan suatu senyawa berdasarkan kelarutannya dalam dua cairan yang tidak saling campur, biasanya digunakan air dan pelarut organik. Ekstraksi yang dilakukan yaitu ekstraksi cair-cair dan menggunakan corong pisah. Pelarut yang digunakan dalam praktikum ini yaitu air (aquadest) dan diklorometan, solute akan berpindah ke dalam pelarut diklorometan dari pelarut air sesuai dengan koefisien distribusinya. NaCl ditambahkan pada hasil destilat supaya terjadi peristiwa salting out yaitu proses penambahan larutan elektrolit ke dalam fase air yang mengandung senyawa organik, penambahan ini bertujuan untuk menurunkan kelarutan senyawa organik dalam air, sehingga konsentrasi senyawa organik dalam pelarut organik akan lebih besar daripada dalam fase air, kemudian ditambah diklorometan. Ekstraksi menghasilkan dua lapisan, di mana lapisan yang atas merupakan fase air dan lapisan bawah merupakan fase diklorometan (organik), hal ini dapat terjadi karena BJ diklorometan lebih besar daripada BJ air yaitu 1,33. Penggojokan konstan dilakukan saat proses ekstraksi supaya tidak terjadi emulsi. Emulsi yang terbentuk akan mengganggu dalam pengamatan saat pemisahan dua lapisan tersebut. Penambahan NaCl dapat digunakan untuk mengatasi terbentuknya emulsi.Larutan diklorometan diambil, sedangkan larutan air dilakukan ekstraksi ulang sebanyak dua kali untuk memastikan apakan zat yang diinginkan benar-benar terbawa oleh pelarut diklorometan karena mencapai kesetimbangan lebih dari saru kali. Ketiga hasil ekstraksi digabungkan. Air yang masih terkandung di dalamnya dikeringkan denga penambahan natrium sulfat exicc.PARTISIProses selanjutnya yaitu partisi, partisi dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan senyawa eugenol dari senyawa organik atau pengotor lain. Lapisan diklorometan yang sudah dikeringkan dipindahkan dalam corong pisah, kemudian ditambahkan 100 mg eugenol baku pada larutan B dengan tujuan untuk melihat kesalahan yang terjadi saat proses partisi. Ekstraksi cair-cair dilakukan dengan cara yang sama untuk semua sample yaitu ditambahkan 30 ml larutan KOH 5% dengan tujuan untuk membentuk garam eugenol yang larut dalam air, sehingga senyawa eugenol dapat terpisah dari senyawa organik lainnya yang terkandung dalam minyak cengkeh. Setelah terbentuk dua lapisan kemudian dipisahkan. Lapisan air disimpan, sedangkan lapisan diklorometan diekstraksi kembali sebanyak dua kali dengan KOH 5%, lapisan air yang terbentuk digabungkan dengan lapisan air sebelumnya. Berikut reaksi pembentukan garam eugenol :

Lapisan air gabungan yang diperoleh dicuci kembali dengan diklorometan sebanyak 15 ml dengan tujuan agar pemisahan yang terjadi benar-benar optimal. Lapisan air diambil dan ditampung dalam erlenmeyer sambil didinginkan (agar eugenol tidak terhidrolisis). Kemudian diasamkan dengan menggunakan HCl 5% hingga mencapai pH 1. Tujuan pengasaman adalah untuk mengubah garam eugenol menjadi bentuk eugenol kembali yang larut dalam pelarut organik dan tidak larut air. Pada pH 1 molekul eugenol akan terbentuk lebih banyak dibanding bentuk ion nya. Dibuktikan oleh persamaan Handerson-Hasselbach:1 = 10,19 + log -9,19 = log = Keterangan : A adalah bentuk ion HA adalah bentuk molekulReaksinya sebagai berikut :

Larutan asam dipindahkan ke dalam corong pisah, kemudian erlenmeyer dibilas dengan 10 ml diklorometan sebanyak dua kali. Dua lapisan yang terbentuk dipisahkan, lapisan diklorometan (lapisan bawah) ditampung dalam erlenmeyer dan ditutup aluminium foil karena eugenol mudah menguap. Lapisan air diesktraksi lagi dengan diklorometan 10 ml sebanyak dua kali, lapisan diklorometan yang terbentuk diambil dan digabungkan dengan lapisan diklorometan sebelumnya. Tujuan pengesktraksian dengan diklorometan ini adalah untuk memisahkan senyawa eugenol dari senyawa lain dalam air. Lapisan diklorometan kemudian dicuci kembali dengan air dalam corong pisah yang sama supaya pemisahan optimal, lapisan diklorometan yang terbentuk diambil dan dicuci dengan NaCl setengah jenuh. Tujuan pencucian ini adalah untuk memisahkan senyawa eugenol dari senyawa lain berupa ion. Lapisan diklorometan dipindahkan dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan natrium sulfat anhidrat dengan tujuan untuk menarik air yang tersisa dalam larutan. PEMEKATANProses selanjutnya adalah pemekatan dengan rotary evaporator. Tujuan dari pemekatan ini adalah untuk meningkatkan kadar eugenol tanpa mengubah menjadi bentuk kering, sehingga didapat minyak kental eugenol. Keunggulan dari vacuum rotary evaporator yaitu dapat menguapkan pelarut lebih cepat karena terdapat vakum yang dapat menurunkan tekanan sehingga titik didih pelarut juga akan turun, maka akan lebih mudah menguap. Rotary (perputaran) akan menyebabkan luas permukaan semakin luas sehingga pemekatan dilakukan dengan waktu yang cukup singkat. Sebelumnya, 100 mg standar eugenol ditambahkan pada labu C yang bertujuan untuk mengetahui persen kesalahan pada proses pemekatan.Evaporasi adalah peristiwa menguapnya pelarut dari campuran. Evaporasi didasarkan pada proses pendidihan secara intensif yaitu (1) pemberian panas ke dalam cairan, (2) pembentukan gelembung-gelembung akibat uap, (3) pemisahan uap dari cairan dan (4) mengkondensasikan uapnya. Evaporasi dilaksanakan dengan cara menguapkan sebagian dari pelarut pada titik didihnya, sehingga diperoleh larutan zat cair pekat dengan konsentrasi lebih tinggi. Dalam evaporasi zat cair pekat merupakan produk yang dipentingkan, sedangkan uapnya biasanya dikondensasikan dan dibuang. Disinilah letak perbedaan antara evaporasi dan distilasi (Praptiningsih, 1999).Prinsip utama dari evaporasi adalah pemisahan larutan dari pelarutnya dengan menggunakan uap panas, pemisahan didasarkan pada perbedaan titik didih dari cairan dalam larutan tersebut, biasanya pelarut yang digunakan adalah air. Pada praktikum kali ini alat yang digunakan untuk evaporasi adalah rotary vakum evaporator. Prinsip kerja rotary vakum evaporator adalah mengubah fase cair menjadi fase gas dengan cara memanaskan campuran sehingga tersisa fase dengan titik didih lebih tinggi dan konsentrasi yang lebih tinggi. Hasil yang diperoleh lebi murni dibandingkan hasil dari partisi. Setelah melalui pemekatan, eugenol dimasukkan dalam labu 5 ml, ditambahkan heksan hingga batas tanda dan siap dideterminasi dengan kromatografi gas.Pada praktikum kali ini larutan yang dievaporasi yaitu larutan partisi C dan E1, selanjutnya setiap larutan diberi diklorometan sebagai pelarut. Kemudian masing-masing larutan tersebut di evaporasi dengan pemanasan ?0 C. Hal ini dilakukan untuk menguapkan diklorometan agar terbentuk cairan yang yang mengandung eugenol sekitar 98% dan berbau khas eugenol serta berwarna kuning pucat. Hal tersebut menandakan bahwa pelarut diklorometan sudah diuapkan.DETERMINASITujuan dari determinasi adalah untuk mengetahui keakuratan hasil senyawa yang telah diekstraksi. Pada tahap determinasi, sampel D ditambahkan 100 mg eugenol dan kemudian sampel A, B, C, D, dan E diinjeksikan dalam GC yang telah dioptimasi.Kromatografi gas adalah metode kromatografi yang diguakan untuk memisahkan dan mendeteksi senyawa-senyawa yang mudah menguap dan stabil terhadap suhu panas dalam suatu campuran. Pemisahan kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi anatara solute dengan fase diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solute dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detektor. Penggunaan suhu yang meningkat (pada kisaran 50-3000C) bertujuan untuk menjamin bahwa solute akan menguap dan karenanya akan cepat terelusi.Dalam praktikum ini digunakan kromatografi gas cair dengan fase diam yang digunakan adalah HP-INNOWax dan HP-5% yang bekerja pada rentang suhu 0-300oC. fase diam yang digunakan memiliki sifat polar sehingga apabila analit yang akan di uji memiliki sifat nonpolar maka akan memiliki waktu retensi yang pendek. Selain itu digunakan fase diam yang lain yaitu 5%-fenil metil siloksan yang bersifat nonpolar yang berfungsi untuk mengoptimalkan pemisahan. Kedua fase diam tersebut bekerja pada rentang suhu 0-300oC sehingga dapat dipakai pada pemisahan dan deteksi, karena suhu pada sistem kromatografi gas diatur di dalam rentang suhu tersebut begitu pula dengan titik didih eugenol.Fase gerak yang digunakan biasanya adalah gas helium, argon, nitrogen, dan hydrogen. Pada praktikum kali ini digunakan fase gerak Nitrogen (N2), Hidrogen (H2), dan udara. Fungsi utama dari fase gerak adalah untuk membawa uap analit melalui sistem kromatografi tanpa berinteraksi dengan komponen-komponen sampel. Gas N2 memerlukan kecepatan alir yang lambat (10cm/detik) untuk dapat mencapai kinerja yang optimum pada HETP minimum. Sementara itu gas H2 dan He dapat dialirkan lebih cepat untuk memperoleh kerja yang optimum, 25cm/detik untuk N2 dan 35cm/detik untuk gas He. Adapunn syarat- syaat fase gerak pada kromatografi gas sebagai berikut : Tidak reaktif Murni (agar tidak mempengaruhi deteksi oleh detektor) Dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi (mengandung helium, nitrogen, hydrogen, ataupun campuran argon dan metana. Pemilihan gas pembawa yang digunakan tergantung dari detektor yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2007).Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan, dimana profil kolom yang digunakan pada praktikum adalah kolom kapiler dengan ukuran 30 m x 0.32 mm. Semakin sempit diameter kolom, maka semakin besar efisiensi pemisahan pada kolom yang ditandai dengan puncak kromatogram yang dihasilkan semakin tajam. Kolom kapiler lebih banyak digunakan karena kemampuannya yang memberikan harga jumlah pelat teori (N) yang sangat besar (>300.000 pelat).Detektor yang digunakan adalah FID (Flame Ionized Detector) dengan gas penembaknya adalah gas hydrogen (H2) yang berfungsi untuk memanaskan detector agar dapat membakar uap sampel agar dapat terion dan dapat terdeteksi. Detektor pada kromatografi gas adalah suatu sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen didalamnya menjadi sinyal elektronik. Prinsip dari detector FID adalah pembakaran terhadap senyawa organik yang nantinya akan terurai menjadi pecahan sederhana dan kemudian diukur dan direkam. Pada pemakaian FID, sebaikanya kecepatan alir dari H2 30ml/menit agar hasilnya efisien dan suhu system harus berada diatas 100oC untuk mencegah kondensasi uap air yang mengakibatkan FID berkarat atau menurunkan sensitifitasnya. Kromatogram yang merupakan hasil pemisahan komponen disajikan detector sebagai deretan luas puncak terhadap waktu.Injektor yang digunakan adalah split use sehingga terdapat pembagian aliran fase gerak yang bertujuan untuk mengurangi tekanan dalam kolom. Untuk menembus lubang pada injektor digunakan syringe yang berujung runcing sehingga memudahkan untuk menembus lubang injektor yang berupa septum. Septum tersebut berfungsi untuk mencegah masuknya zat pengotor yang berasal dari udara yang dapat mengganggu pengukuran. Sebelum diinjeksikan ke GC dilakukan terlebih dahulu pengkondisian GC. Tujuan dari kondisioning GC ini adalah untuk mendapatkan kondisi instrumentasi kromatografi yang sesuai supaya dapat menerima analit-analit yang akan dimasukkan.Kondisioning dilakukan dengan mengatur suhu/temperatur oven sebesar 150oC, temperatur injektor sebesar 200 oC menggunakan gas nitrogen, hidrogen dan udara selama 1 jam. Pemisahan dengan kolom disebut pemisahan dengan prinsip isothermal. Pemisahan ini sering dilakukan pada analisis rutin atau ketika mengetahui banyak sifat sampel yang akan dipisahkan. Diperhatikan jika suhu yang terlalu tinggi akan mengelusi komponen tanpa terpisah, jika suhu terlalu rendah maka komponen yang bertitik didih tinggi akan keluar sangat lambat sehingga dapat mengganggu proses kromatografi selanjutnya.Setelah dilakukan kondisioning, maka diinjeksikan pelarut heksan terlebih dahulu. Tujuannya penginjeksian pelarut adalah untuk melihat kromatogram dari pelarut yang digunakan oleh analit, apakah pelarut tersebut terdapat pengtor atau tidak dan melihat waktu retensi dari pelarut itu sendiri.Kelebihan dari metode kromatografi gas adalah : Waktu analisis relatif singkat dan ketajaman pemisahan yang tinggi Dapat digunakan kolom yang lebih panjang untuk hasil pemisahan yang lebih baik Banyak pilihan detektor dan kolom Temperatur dapat diukur Pemakaian fase cair memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang sangat beragam yang memisahkan hampir segala macam campuran.

Kelemahan dari metode kromatografi gas adalah : Terbatas untuk zat yang mudah menguap Tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar Hanya bisa untuk senyawa yang stabil pada suhu tinggi yang dapat diukur dengan kromatografi gas Alat dan penggunaannya mahalDalam praktikum kali ini digunakan standar adisi yaitu standar yang ditambahkan dengan tujuan untuk mengetahui persen recovery dari keseluruhan tahap yang dilakukan. %recovery dari setiap tahap diperoleh dengan rumus :

Perhitungan dilakukan dari tahap determinasi terlebih dahulu. %kesalahan yang terjadi saat determinasi diperoleh dengan cara mengurangkan 100% dengan %recovery yang didapat. Sedangkan untuk %recovery dari setiap tahapnya diperoleh dengan cara mengurangkan 100% dengan %kesalahan dari masing-masing tahap. Persen kesalahan masing-masing tahap didapat dari 100% dikurangkan dengan jumlah % kesalahan dari tahap sebelumnya dengan % recovery dari masing-masing sampel (A, B, C, D, dan E).Heksan diinjek dahulu sebelum dilakukan pengukuran seri baku, hal ini dilakukan karena heksan merupakan pelarut yang digunakan. Heksan dipilih sebagai pelarut karena waktu retensinya yang berbeda cukup jauh dengan eugenol. Heksan akan terbaca lebih dahulu oleh detektor karena titik didihnya hanya 69oC sehingga akan menguap lebih cepat dibanding eugenol yang mempunyai titik didih 254oC, maka peak heksan akan lebih dahulu dibanding peak eugenol.Standar eksternal juga digunakan yaitu baku eugenol. Seri larutan baku eugenol dibuat dengan 5 level konsentrasi. Seri larutan baku tersebut digunakan untuk membuat persamaan linear baku, persamaan kurva baku yang diperoleh yaitu y = 0,9x10-5 + 0,0269 dengan r = 0.998, dapat disimpulkan bahwa kurva yang diperoleh cukup linear karena r mendekati 1. Dari persamaan yang diperoleh dapat dihitung konsentrasi sampel yang diuji berdasarkan AUC sebagai nilai y dan x sebagai konsentrasi sample.Berdasarkan hasil yang diperoleh, nilai AUC pada sampel A, B, C, D, dan E berturut-turut adalah 0.158, 0.188, 0.166, 0.148, 0.176, sehingga kadar yang diperoleh dari sampel A, B, C, D, dan E adalah 4855.556 g/ml, 35800.000 g/ml, 30911.111 g/ml, 26911.111 g/ml, 16566.667 g/ml. Secara teori urutan kadar sampel dari yang terendah sampai tertinggi yaitu sampel E, A, B, C, D. Sampel E secara teori memiliki kadar terendah, hal ini disebabkan karena pada sampel E tidak dilakukan penambahan adisi. Dari data yang praktikan peroleh sampel dengan kadar tertinggi adalah sampel B, sementara sampel dengan kadar terendah adalah sampel A. Hal ini tidak sesuai dengan teori, karena pada tahap partisi sampel A ada kesalahan, dimana fase organik sebagian kecil tumpah sehingga otomatis akan mengurangi jumlah analitnya. Sementara untuk sampel dengan kadar tertinggi seharusnya dimiliki oleh sampel D, karena penambahan baku adisi pada sampel D terjadi sesaat sebelum sampel dideterminasi menggunakan kromatografi gas, hal ini menyebabkan kemungkinan hilangnya eugenol menjadi semakin kecil. Namun, pada data praktikan sampel D memiliki kadar ketiga terendah setelah A dan E. Hal ini tidak sesuai dengan teori, dapat disebabkan karena analit ikut terbawa menguap bersama pelarut (diklorometan) saat sampel disimpan di dalam almari asam selama 1 minggu. Hal lain yang dapat menyebabkan data tidak sesuai dengan teori adalah karena setiap sampel dikerjakan oleh praktikan yang berbeda sehingga data tidak objektif.Dari hasil percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan parameter validasi metode menurut ICH yang sudah terpenuhi, yaitu : Akurasi, merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan dari nilai terukur dengan nilai diterima. Diukur dengan banyaknya analit yang diperoleh kembali pada pengukuran melakukan spiking pada sampel. Data yang dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali (Gandjar dan Rohman, 2007).

Rentang kesalahan yang diijinkan pada setiap konsentrasi analit pada matriks, yaitu : (Harmita, 2004).Hasil yang didapat yaitu % recovery sampel adalah: sampel A -1.71% b/b, sampel B 1.923% b/b, sampel C 1.434% b/b, dan sampel D 1.034% b/b, sehingga dapat disimpulkan %recovery yang didapat tidak sesuai dengan kriteria yaitu 99-101%. Hasil %recovery sampel A didapatkan nilai minus dikarenakan saat setengah sampel terbuang saat dilakukannya proses partisi. Hasil yang didapat yaitu, % kesalahan total sebesar 101.171%, % kesalahan destilasi sebesar 3.094%, % kesalahan partisi sebesar -0.489%, % kesalahan pemekatan sebesar -0.400%, dan % kesalahan determinasi sebesar 98.966%, dari hasil yang didapat tersebut dapat disimpulkan bahwa kesalahan terbesar terjadi pada tahap determinasi. Dari hasil-hasil yang didapatkan dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan kurang akurat dikarenakan hasil yang didapatkan tidak tepat dan masih jauh dari teori yang sebenarnya. Presisi/ Reprodusibel Pada percobaan ini dilakukan perhitungan presisi intra day yang dilakukan dengan menghitung 5 seri larutan baku sebanyak 3 kali replikasi. Parameter presisi dapat dilihat dari %RSD. Dari hasil percobaan yang dilakukan didapatkan nilai %RSD : seri 1 sebesar 0.088%, seri 2 sebesar 0.089%, seri 3 sebesar 0.230%, seri 4 sebesar 0.426%, dan seri 5 sebesar 0.595%. %RSD yang baik yaitu memiliki nilai 8%, sehingga dapat disimpulkan %RSD dari semua seri memiliki presisi yang baik sehingga keterulangan dari metode yang dilakukan baik dan reprodusible. Selektivitas, merupakan suatu ukuran seberapa mampu metode tersebut mengukur analit saja dengan adanya senyawa senyawa lain yang terkandung didalam sampel. Metode analisis yang paling selektif melibatkan pemisahan secara kromatografi (Watson, 2007). Pengukuran selektivitas dapat dilakukan dengan mengukur resolusi dari 2 puncak yang terbentuk pada senyawa, sedangkan resolusi yang baik yaitu 2.0. Resolusi yang didapatkan dari hasil percobaan yaitu sebesar 18.891 untuk seri 5 larutan baku dan 20.544 untuk sampel c cengkeh, sehingga kesimpulannya yaitu seri 5 larutan baku sudah diklasifikasikan telah terpisah namun kurang baik, sedangkan untuk sampel c cengkeh resolusinya sudah terpisah baik antar 2 puncaknya. Batas Deteksi (LOD/Limit Of Detection) Batas deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit diatas atau dibawah nilai tertentu (Gandjar dan Rohman, 2007). Dari hasil yang didapatkan, nilai LOD nya yaitu sebesar 175.5 g/ml. Semakin kecil nilai LOD maka semakin mampu untuk mengidentifikasi sampel yang akan diuji, dan hasil LOD yang didapat kecil. Batas Kuantifikasi (LOQ/Limit Of Quantification) Batas kuantifikasi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2007). Dari hasil yang didapatkan, nilai LOQ nya yaitu sebesar 590 g/ml. Semakin kecil nilai LOQ maka semakin mampu untuk mengidentifikasi sampel yang akan diuji, dan hasil LOQ yang didapat kecil. Linearitas, Pada hasil pengukuran terhadap seri larutan baku, didapatkan konsentrasi sebesar 529.65 g/mL, 1059.3 g/mL, 1588.95 g/mL, 2118.6 g/mL, dan 2648.25 g/mL. Dari hasil pengukuran juga didapatkan waktu retensi eugenol sekitar 255-265 sekon (puncak berada pada 262 sekon), dan didapatkan kurva baku yaitu y = 0.00009x + 0.0269 dengan nilai r = 0.997. Dalam persamaan y = bx + a, b merupakan nilai slope/ kemiringan kurva, dan a merupakan nilai intersep. Dapat dikatakan nilai linearitas baik saat nilai r mendekati 1, dimana korelasi antara kadar analit (x) dengan respon instrument AUC (y) baik. Dari hasil r yang didapatkan dapat disimpulkan bahwa linearitas dari kurva baku sudah baik.Farmakope Amerika (United StatesPharmacopeia, USP) menentukan parameter parameter yang dapat digunakan untuk menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis. Pada umumnya paling tidak ada 2 kriteria yang biasanya dipersyaratkan untuk menunjukkan kesesuaian sistem suatu metode (Gandjar dan Rohman, 2007). Dari hasil percobaan, kriteria menurut USP yaitu : Tailing Factor dan Faktor AsimetrisGuna menentukan tingkat asimetri puncak dilakukan dengan menggukur faktor asimetris dan tailing factor (Tf). Nilai Tf =1 menunjukkan bahwa hasil puncak pada kromatogram sudah simetris. Harga Tf > 1 menunjukkan adanya tailing (Gandjar dan Rohman, 2007). Besarnya Tf dihitung menggunakan persamaan berikut :Tf (tailing factor) = (Ahuja and Dong, 2005). Dari hasil percobaan yang diukur pada 2 peak terbaik, didapatkan nilai Tf dari seri 5 larutan baku sebesar 0.97 dan Fa sebesar 1, dan pada sampel C cengkeh Tf sebesar 0.85 dan Fa sebesar 0.8, dan dapat disimpulkan bahwa puncak seri 5 larutan baku hanya terjadi sedikit tailing karena nilainya tidak jauh dari teori yaitu 1, sedangkan untuk puncak yang dihasilkan sampel C cengkeh cenderung tailing karena nilai Tf nya jauh dari 1.

H. KesimpulanTeknik pemisahan senyawa dapat dilakukan dengan menggunakan metode distilasi uap yaitu berdasarkan pada perbedaan titik didih dan tekanan uap dari campuran. Eugenol didapatkan dengan cara isolasi minyak cengkeh menggunakan metode ekstraksi corong pisah (partisi) kemudian dilanjutkan dengan pemekatan untuk mendapatkan isolat murni, setelah itu eugenol yang didapat dideterminasi dengan Kromatografi Gas. Jumlah eugenol yang didapat tiap sampel yaitu 4855.556 g/ml (sampel A), 35800.000 g/ml (sampel B), 30911.111g/ml (sampel C), 26911.111g/ml (sampel D), dan 16566.667g/ml (sampel E).

I. Jawaban Pertanyaan1. Cek kromatogram 1 mL E yang disisihkan, perlukah dilakukan tahap clean up?Dari hasil kromatogram yang diperoleh untuk sampel E tidak perlu dilakukan tahap clean up, karena kromatogram yang diperoleh cukup bagus (tidak terjadi fronting ataupun tailing) dan terpisah dengan puncak pelarut cukup jauh (tidak terjadi overlapping) hal ini menunjukkan bahwa anait sudah cukup bersih dari zat pengotor.2. Hitung konsentrasi masing-masing ekstrak dengan cara standarisasi eksternal yang sudah valid dan sesuai peruntukannya!Perhitungan Baku Eugenol0.1 mL x 99% (v/v) = 0.099 mLm = x V = 1.07 g/mL x 0.099 mL = 0.10593 gram dalam 10 mLC = = 0.010593 g/mL = 10.593 /mLKonsentrasi Larutan Seri Seri 10.5 mL X 10.593 g/mL = C1 X 10 mLC1 = 529.65 g/ml Seri 21.0 mL X 10.593 g/mL = C2 X 10 mLC2 = 1059.3 g/ml Seri 31.5 mL X 10.593 g/mL = C3 X 10 mLC3 = 1589.5 g/ml Seri 42.0 mL X 10.593 g/mL = C4 X 10 mLC4 = 2118.6 g/ml Seri 52.5 mL X 10.593 g/mL = C5 X 10 mLC5 = 2648.25 g/mlSampelIntegral 1Integral 2AUCKadar (g/mL)Faktor pengenceranKadar Sebenarnya (g/mL)

A20.35820.5160.1581456.6673.3334855.556

B22.72522.9130.1881790.0002035800.000

C23.07823.2440.1661545.5562030911.111

D22.03722.1850.1481345.5562026911.111

E22.36122.5370.1761656.6671016566.667

Persamaan kurva baku y = 0.00009x + 0.0269Konsentrasi Sampel A0,158= 0.00009x + 0.0269x= 1456,667 ppm Konsentrasi Sampel B0,188= 0.00009x + 0.0269x= 1790 ppmKonsentrasi Sampel C0,166= 0.00009x + 0.0269x=1545,556 ppmKonsentrasi Sampel D0,148= 0.00009x + 0.0269x= 1345,556 ppmKonsentrasi Sampel E0,176= 0.00009x + 0.0269x= 1656,667 ppmKonsentrasi samepl tersebut dalam ppm, dikalikan dengan faktor konversi masing-masing sampel hingga didapat kadar dalam g/mL (tabel perhitungan).3. Hitung LOQ metode diatas!Persamaan kurva baku y = 0.00009x + 0.0269Xi (Kadar)Yi (AUC)Yi-(Yi-)2

529.650.071-0.0040.0000127

1059.30.1240.0020.0000031

1588.950.1770.0070.0000503

2118.60.2210.0030.0000117

2648.250.263-0.0020.0000050

0.0000829

Sy/x= = 0.00526y-LOD = YB + 3SB = 0.0269 + 3(0.00526) = 0.0427 LOD= 0.0427 = 0.00009x + 0.0269X = 175.5 g/ml y-LOQ = YB + 10SB = 0.0269 + 10(0.00526) = 0.080LOQ= 0.080 = 0.00009x + 0.0269X= 590 g/ml4. Apakah konsentrasi eugenol pada E diatas/dibawah LOQ? Kesimpulan?Konsentrasi Eugenol E = 16566.667 g/ml16566.667 g/ml > 590 g/ml (LOQ). Kesimpulannya adalah eugenol dapat dikuantifikasi dengan akurasi dan presisi yang baik pada kondisi pengujian diatas.5. Hitung % recovery konsentrasi ekstrak A, B, C dan D SampelAUC (Y)Kadar (ppm)Kadar (mg/ml)Bobot (mg)

A0.1584855.5564.8560.486

B0.18835800.00035.8003.580

C0.16630911.11130.9113.091

D0.14826911.11126.9112.691

E0.17616566.66716.5671.657

Recorvery A = = = - 1.171% b/b

Recorvery B = = = 1.923% b/b

Recorvery C = = = 1.434% b/b

Recorvery D = = = 1.034% b/b6. Hitung % kesalahan konsentrasi ekstrak A, B, C dan D! % kesalahan total = 100 % - % recorvery A100 % - (-1.171%) = 101.171 % % kesalahan distilasi (A)=% kesalahan total (100% - % recorvery B) 101.171 % - (100% - 1.923 %) = 3.094 % % kesalahan partisi (B)= (100 % - % recorvery B) (100 % - % recorvery C)(100 % - 1.923 %) (100 % - 1.434 %) = -0.489 % % kesalahan pemekatan (C)= (100 % - % recorvery C) (100 % - % recorvery D)(100 % - 1.434 %) (100 % - 1.034 %) = -0.400 % % kesalahan determinasi (D)= (100 % - % recorvery D) (100 % - % recorvery E)(100 % - 1.034 %) (100 % - 100 %) = 98.966 %7. Tahapan mana yang perlu dioptimasi lagi? Tahapan yang perlu dioptimasi lagi adalah tahap determinasi karena memiliki %kesalahan yang besar yaitu 98.966%.

J. Daftar PustakaAnonim, 2005, http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9924007 di akses pada 11 Maret 2015 pukul 17.58.Arsyad, M., 2001, Kamus Kimia, PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, hal. 93,94. Bulan, R., 2004, Reaksi Asetilasi Eugenol dan Isolasi Metil Eugenol, Program Studi Teknik Kimia, FMIPA, Universitas Sumatera Utara, diakses pada 11 Maret 2015 pukul 17:17.Edgar and Showick, 2009, General Studies Manual, 6th ed, Dorling Kindersley, India, p. 1147.Gandjar, I.G., Rohman, A.,2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal. 459, 460, 465-470.Gavhanne, 2008, Mass Transfer II,`6th ed, Nirali Prakashan, India, pp. 174-175.Hadyana, P.A., 2004, Kamus Kimia, Balai Pustaka, Jakarta, hal. 236.International CHEMTREC, 2013, Material Safety Data Sheet Aquadest, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal 11 Maret 2015, pukul 17:58.International CHEMTREC, 2013, Material Safety Data Sheet Chloride Acid, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal 11 Maret 2015, pukul 17:58.International CHEMTREC, 2013, Material Safety Data Sheet Dichloride methane, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal 11 Maret 2015, pukul 17 :58.International CHEMTREC, 2013, Material Safety Data Sheet Eugenol, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal 11 Maret 2015, pukul 17:59.International CHEMTREC, 2013, Material Safety Data Sheet Haxane, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal 11 Maret 2015, pukul 17:59.International CHEMTREC, 2013, Material Safety Data Sheet Sodium Chloride, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal 11 Maret 2015, pukul 17:59.International CHEMTREC, 2013, Material Safety Data Sheet Sodium Sulfate Anhydride, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/., diakses tanggal 11 Maret 2015, pukul 17:59.Kardinan, A. 2005. Tanaman Penghasil Minyak Atsiri, Agromedia Pustaka, Jakarta, hal. 74.McNair, H.M., Miller, J.M., 2009, Basic Gas Chromatography, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 1,2.Memmou, F., R. Mahboub, 2012, Composition of Essential Oil from Fresh Flower of Clove, Jour. Of Sci. Res. In Phar, 1(2), pp. 33-35Nurdjannah, N., 2004, Diversifikasi Tanaman Cengkeh, J. Perspektif, 3(2), hal. 6170.Pavia, D. L., 2005, Introductionto Organic Laboratory Techniques: A Small Scale Approach, Thomson Learning, Inc., USA, pp. 786, 797.Srivastava, A.K., SK Srivastava, K.V. Syamsundar, 2005, Bud and Leaf Essential Oil Composition of Syzygium aromaticum from India and Madagascar, Flavour Fragr. J., 20, pp.51-53. Sarker, S.D., Latif, Z., Gray, A.I., 2006, Natural Products Isolation, Humana Press Inc., New Jersey, p. 327.Sunardi, 2004, Diktat Kuliah Cara-cara Pemisahan, Departemen Kimia, FMIPA UII, Depok, hal. 183.Thomas, A.N.S., 2005, Tanaman Obat Tradisional, Kanisius, Yogyakarta, hal. 22,24.Tim Kimia Analitik Instrumen, 2010, Penuntun Praktikum Kimia AnalitikInstrumen (KI-431), Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI, Bandung, hal. 15.Vargasa, R.M.F., N. Martinez, D. Lorenzo, E. Dellacassa, 2009, Steam Distillation Modeling For Essential Oil Extraction Process, Volume 29, Issue Press, pp. 171176.Watson, D.G., 2007, Analisis Farmasi: Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi dan Praktisi Kimia Farmasi, Edisi II, Buku Kedokteran EGC, hal. 413.

Yogyakarta, 17 April 2015Praktikan,

Asti Aprilia PutriEdwin TesalonikaMichael Ryanda138114071138114072138114073

Andre SyofianDendi Putro A.Marcellina D. D.138114081138114082138114084