las cÉlulas stem: sueÑo y realidad orlando chaparro

REVISTA LATINOAMERICANA DE BIOÈTICA

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LAS CÉLULAS STEM: SUEÑO Y REALIDAD

Orlando Chaparro, PhD Centro de Investigaciones. Facultad de Medicina

Universidad Militar Nueva Granada e-mail: [email protected]

El tema de las células stemNB ha ocupado recientemente importantes titulares en los medios de comunicación, y el público en general tiene en este momento en su mente un mundo de eterna juventud, y órganos para reemplazar aquellos que han dejado de funcionar adecuadamente, que podrán adquirirse casi tan fácilmente como en un supermercado. Bioeticistas, políticos y ciudadanos del común debaten la conveniencia de investigar y utilizar estas células como una nueva estrategia terapéutica. Desde el punto de vista científico, sin embargo, la investigación en células stem tiene implicaciones mucho más profundas. El cuerpo humano contiene varios billones de células de cerca de 225 diferentes tipos celulares que componen los tejidos de los diferentes órganos. Estos diferentes tipos celulares se originan a partir de una única célula (el cigoto), a través de un complejo proceso de diferenciación, durante el cual grupos de genes particulares se activan o desactivan, dando a cada tipo celular, sus características de individualidad. La mayoría de las células diferenciadas no pueden replicarse y su reemplazo, cuando así se requiere, debe hacerse a partir de un grupo de células indiferenciadas que mantienen su capacidad de autorreplicarse: las células stem. Es necesario, en primer lugar, definir a qué nos referimos con el término “célula stem”. El concepto como tal no es nuevo y se encuentra ya presente en la literatura científica y médica del siglo XIX (Véase una interesante revisión de Pamela Gehron Robey, 2000) (1). Dos características definen a la célula stem: En primer lugar su capacidad de autorreplicación, y en segundo lugar su capacidad de diferenciación, dando origen a uno o más tipos o linajes celulares. Por lo tanto, el concepto de célula stem incluye un amplio rango de células con diferentes capacidades de proliferación y

NB Se ha elegido el término “Célula Stem”, de acuerdo con la nomenclatura internacional, para evitar las imprecisiones conceptuales y confusiones generadas por el uso de otras denominaciones como “células madre, células troncales, células tronco, células estaminales”, que son frecuentes en la literatura en español.


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diferenciación (2, 3, 4). Frecuentemente se incluye dentro de los criterios operacionales que definen a una célula stem la clonogenicidad definida como la capacidad indefinida de dividirse simétricamente, es decir de originar células idénticas a ella misma (5, 6). Las células stem se han clasificado de acuerdo con diferentes criterios: En primer lugar, de acuerdo con su capacidad de diferenciación, se clasifican como Totipotentes, aquellas con capacidad para dar origen a un organismo completo incluyendo el tejido germinal; pluripotentes, las células que son capaces de dar origen a células de las tres capas germinales; y multipotentes, u órgano específico, las que dan origen a células de un tejido u órgano particular (2). Las células stem pueden también clasificarse de acuerdo con su origen en células stem embrionarias (ES), que se obtienen de la masa celular interna del embrión, células stem germinales embrionarias, que se obtienen de la cresta gonadal del feto, y células stem adultas, que se originan de tejidos adultos maduros. Cada uno de estos tipos celulares tiene características diferentes y por lo tanto, dependiendo de las circunstancias, ventajas o desventajas, frente a las demás. Un cambio de paradigma La Dra. Nadia Rosenthal, en una publicación sobre “La promesa de las células stem”, hace una bella referencia al mito de Prometeo. El Titán griego que se atrevió a transgredir las leyes de los dioses, y robó el fuego para donárselo al hombre y enseñarle la civilización y las artes, fue brutalmente castigado por Zeus. Júpiter lo encadenó al Monte Cáucaso donde por más de 30.000 años un buitre devoraba cada día su hígado, el cual se regeneraba para ser devorado nuevamente al día siguiente. Nosotros, simples mortales, no poseemos un hígado con ese potencial de regeneración, pero la leyenda nos hace pensar sobre la extraordinaria capacidad del cuerpo para reconstruirse (4). ¿Qué determina la capacidad de un tejido lesionado para repararse? Hasta hace poco tiempo se presumía que poblaciones celulares indiferenciadas contribuían de manera exclusiva, a la capacidad regeneradora del tejido en el cual ellas residían. Los resultados de experimentos reportados en los últimos años han llevado a replantear esa visión. Los cambios de paradigmas ocurren a medida que las excepciones van acumulándose, de tal manera que se hace necesario reevaluar las teorías prevalecientes. A este respecto Tomas Kuhn escribía en 1962: “Tales cambios, junto con las controversias que casi siempre los


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acompañan, son las características que definen las revoluciones científicas” (7). Los resultados de la investigación con las células stem están cuestionando la visión de la embriogénesis animal mantenida durante largo tiempo, según la cual la posición es todo. La idea de que el destino de una célula quedaba sellado cuando ésta se convertía en parte del endodermo, el mesodermo o el ectodermo, tenía una connotación casi evangélica (8). La especificación de linaje de las células había sido considerada como lineal e irreversible. A nivel molecular esta irreversibilidad había sido atribuida a cambios en la conformación y eventos de metilación de la cromatina, ocurridos durante la diferenciación, de tal manera que la capacidad regeneradora de todas las células stem, con excepción de las de origen embrionario, era considerada restringida a un solo tipo de tejido (2). En la última década, tres logros importantes han hecho tambalear los cimientos tradicionales de la biología del desarrollo dando origen a lo que ha sido denominado como “un nuevo paradigma”: una célula stem puede “transdiferenciarse”, es decir dar origen a células de una capa germinal diferente de aquella de donde ella proviene. Este cambio de paradigma tiene más que una importancia meramente teórica, ya que amplía el horizonte de las posibilidades de una terapia basada en la utilización de las células stem (2). El primer logro fue el uso de la tecnología de la transferencia nuclear, en la clonación reproductiva (9). Más allá de las implicaciones éticas, sociales y legales de las posibilidades de clonar un individuo, la capacidad de producir un organismo completo bajo el control de un núcleo derivado de una célula adulta, fue una demostración trascendental de la plasticidad del proceso de desarrollo. Este hecho abrió las puertas no solo a la clonación reproductiva sino a lo que se ha denominado la “clonación terapéutica”, es decir, a la posibilidad de clonar un individuo para producir células o tejidos con potencial terapéutico. El segundo logro fue el cultivo de células stem embrionarias (ESCs) humanas (10, 11). La posibilidad de cultivar y expandir ESCs humanas abre nuevas posibilidades y permite plantear nuevas estrategias terapéuticas. El tercer logro fue el aislamiento de células pluripotentes de adulto (12). Este logro cuestionó los principios convencionales de la biología del desarrollo y sugirió que los tejidos del adulto podrían ser una fuente alternativa de células stem con un rango de aplicaciones terapéuticas igual o similar al de las ESCs (2).


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En apoyo de este nuevo paradigma existe una gran cantidad de datos experimentales, tanto in vivo como in vitro, documentando la “plasticidad” de las células stem. A este respecto, el Dr. John Gearhart, profesor de Ginecología y Obstetricia de la Facultad de Medicina de la Universidad de Johns Hopkins, en Baltimore, comenta: “Somos nosotros quienes imponemos las restricciones creyendo siempre que los linajes de las células stem están restringidos. Pero lo que claramente puede sobrepasar un programa genético es el ambiente en el cual coloquemos una célula” (8). Las células stem de adulto La sorprendente capacidad de las ESCs de dar origen a prácticamente cualquier tipo de tejido, ha estimulado la investigación en busca de linajes celulares semejantes que puedan contribuir a la autorrenovación y reparación de tejidos lesionados. ¿Es posible que las células stem de adultos (ASCs) posean el mismo potencial clínico que las células stem embrionarias (ESCs) permitiendo a los investigadores eludir los cuestionamientos éticos y los problemas técnicos de la utilización de las ESCs? ¿Cuales son las similitudes y las diferencias entre estos dos tipos de células? Durante mucho tiempo se consideró que las ASCs tenían una capacidad más restringida de autorrenovación y diferenciación que las ESCs. Las células stem hematopoyéticas (HSCs) por ejemplo, envejecen y sufren el consiguiente acortamiento de los telómeros. Eran consideradas multipotentes, ya que pueden originar todas las células del linaje hematopoyético, pero no pluripotentes, ya que se pensaba que no podían dar origen a células no sanguíneas. Este concepto predominó, por lo menos hasta finales de la década del 90. En años recientes, sin embargo, resultados de experimentos in vitro e in vivo, han enfocado el problema de la verdadera plasticidad de las ASCs (13, 14). Se ha reportado, por ejemplo. la diferenciación de HSCs a células musculares, reconstituyendo la expresión de distrofina, en un modelo animal de la enfermedad conocida como distrofia muscular. Más inesperados aún, han sido los resultados mostrando la diferenciación de HSCs de transplantes de médula ósea en neuronas y astrocitos (15). La principal fuente de ASCs es la médula ósea. La médula ósea contiene tres sistemas celulares principales: El hematopoyético, el endotelial y el estromal, que contiene a su vez una subpoblación, las células mesenquimales, que pueden diferenciarse a células óseas, cartílago, adipocitos y músculo esquelético, entre otras (16). En


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1999, investigadores de Osiris Therapautics en Baltimore, dieron un paso muy importante en el campo de la investigación de las células stem: Usando las condiciones experimentales apropiadas, lograron la diferenciación de células mesenquimales de la médula ósea humana, en 3 diferentes linajes (17). “Oh, esto ya se había hecho antes, dijeron muchos investigadores”, comenta el líder del grupo, el Dr. Mark F. Pittinger. “Previamente se habían cultivado células a partir de la médula ósea con diferentes propósitos, pero no se había demostrado que los diferentes linajes se originaban a partir de una única célula y no a partir de múltiples tipos celulares” (18). Fue una cuidadosa caracterización, ensayos in vitro y análisis de clones individuales lo que contribuyó al impacto de sus resultados, sugiere el Dr. Pittinger. Esta población celular se conoce en la literatura científica como Células Stem Mesenquimales (MSCs). En el año 2002, el grupo liderado por la Dra. Cathrine Verfaille de la Universidad de Minesota, identifica en ratas y ratones como modelo animal, una subpoblación de células mesenquimales de la médula ósea, denominada Células Progenitoras Multipotentes Adultas (MAPCs), capaces al nivel de una única célula, de diferenciarse no solamente, en células mesenquimales, sino también en células con características del mesodermo, ectodermo y endodermo. Inyectada en un blastocito temprano, una MAPC contribuyó a la mayoría de los tejidos somáticos (19). Posteriormente su grupo de investigación extiende estas observaciones a MAPCs de humanos, y demuestra su capacidad para diferenciarse a células con características de células hepáticas (20). Las MSCs han sido aisladas no solamente de la médula ósea. Otras fuentes de MSCs la constituyen la sangre de cordón umbilical (21, 22), la placenta (23), el líquido amniótico (24) y la sangre periférica (25), entre otras. La importancia de poder aislar las MSCs a partir de la médula ósea y la sangre periférica, radica en la posibilidad de realizar transplantes autólogos (es decir, utilizando células del mismo paciente), evitando así los problemas relacionados con el rechazo inmunológico. Cientos de trabajos publicados en la literatura científica, han puesto de manifiesto el gran potencial de estas células como una fuente ideal de ASCs para la terapia celular (Véanse por ejemplo, revisiones 26-29). Una de las áreas de aplicación que más expectativas ha generado, ha sido la del transplante de MSCs para tratar pacientes con infarto del miocardio. Son varios los ensayos clínicos que se encuentran en pleno desarrollo y en ellos se están probando diferentes poblaciones celulares y varias rutas de administración de las MSCs (Véase la revisión 30, y las referencias allí citadas). A pesar


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de que los resultados preliminares de estos estudios son muy alentadores, comienzan también a evidenciar algunos problemas y no se dispone en este momento de una evaluación a largo plazo de los beneficios potenciales de esta terapia. Perspectivas A pesar del avance vertiginoso en el campo de la investigación de las células stem, es mucho todavía lo que nos queda por aprender de ellas. La investigación básica tiene aún un largo camino por recorrer y son muchas las preguntas fundamentales acerca de la biología de estas células que esperan una respuesta. Por ejemplo, ¿cuales son los factores que regulan los procesos de renovación y proliferación? ¿Qué mecanismos inducen en condiciones normales el proceso de diferenciación, y cuál es la verdadera pluripotencialidad de las diferentes poblaciones de células stem? ¿Cuales son los nichos naturales de estas poblaciones y cómo podemos acceder a ellos? ¿Hasta qué punto podemos manipular genéticamente estas células para utilizarlas con propósitos terapéuticos específicos? Solamente un esfuerzo formidable en investigación básica nos dará algunas respuestas, antes de que las células stem puedan ser aplicadas de manera rutinaria y segura en protocolos terapéuticos (2). Los nuevos conocimientos han llegado siempre acompañados de grandes temores y angustias y han generado actitudes de rechazo y prohibición. A finales de la década de 1930, Stalin favoreció las teorías neo-Lamarkianas de Trofim Lysenko, lo cual condujo a la emigración de muchos científicos soviéticos, uno de ellos Theodosius Dobzhansky, uno de los genetistas más importantes de siglo XX, y la Unión Soviética se vio relegada a un segundo plano en el campo de la investigación en genética. En la década de 1980, el congreso de los Estados Unidos consideró la posibilidad de prohibir la tecnología del DNA recombinante. En el año 2001, George Bush, el actual presidente de los Estados Unidos, firmó una ley prohibiendo la utilización de fondos públicos para investigación con células stem embrionarias. No obstante, es cada día más evidente la necesidad y la importancia de la investigación con las células stem, y más aún, la importancia de poder investigar la célula stem embrionaria paralelamente con las células stem del adulto. Se ha llegado incluso a plantear la necesidad de iniciar un “Proyecto de las Células Stem Humanas” de dimensiones y alcances similares a los del Proyecto del Genoma Humano (31). Francia y Suiza aprobaron a finales del año pasado legislaciones que permiten la utilización de embriones humanos, excedentes de programas de fertilización in vitro, para ser utilizados en investigación,


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pero continúan prohibiendo la creación de embriones para este fin específico. El estado de California en los Estados Unidos, aprobó recientemente mediante un referendo en las pasadas elecciones, la creación de un Instituto para la Investigación con Células Stem Embrionarias, con un presupuesto de US$ 300 millones para un programa a 10 años (32). El estado de New Jersey creó en el 2004 el Instituto para la Investigación en Células Stem, el cual en conjunto con las Universidades de Medicina y Odontología (UMDNJ) y la Universidad de Rutgers, contará para los próximos 5 años, con un presupuesto cercano a los US$ 70 millones provenientes de fondos estatales y privados (33). Es claro que la investigación en general, y en el campo de las células stem en particular, requiere de decisiones gubernamentales e institucionales, para invertir en la financiación de programas a largo plazo, que integren además los esfuerzos de los distintos investigadores y grupos de investigación. Quiero para terminar, citar al igual que la Dra. Sara M. Mariani, en su conferencia “Células Stem e Ingeniería de Tejidos: Soñando con cosas que nunca han sucedido”, en el Séptimo Congreso Anual de la Sociedad Americana de Terapia Génica, en Junio de 2004, a George Bernard Shaw: You see things, and you say, “Why?” But I dream things that never were, and I say, “Why not” Estamos apenas empezando a descubrir un mundo fantástico y maravilloso, lleno de dudas e incertidumbres, pero también lleno promesas y posibilidades. Permitámonos soñar y preguntémonos: ¿“Porqué no?” Referencias 1. Robey, Pamela, G. (2000). Stem cells near the century mark. J. Clin. Invest. 105: 1489-91 2. Merchant, A. S. and Flake, A. W. (2004). Surgeons and stem cells: A pragmatic perspective on shiftin paradigms. Surgery 136 (5): 975-980. 3. News and Views (2002). Stem cell competition. Nature 418: 25-27. 4. Reya T., Morrison S. J., Clark, M. F., and Weissman I. L. (2001). Nature 414: 105-111.


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5. Rosenthal Nadia (2003). Prometeus’s vulture and stem-cell promise. N. Engl. J. Med. 349 (3): 267-274. 6. Körbling M. and Estrov Z. (2003). Adult stem cells for tissue repair-A new therapeutic concept? N. Engl. J. Med. 349 (6): 570-582. 7. T. S. Kuhn. The structure of scientific revolutions. University of Chicago Press. 1962. 8. Ricki Lewis. (2000). A paradigm shift in stem cell research? The scientist 14 (5): 1-4. 9. Wilmut I., Schnieke A. E., McWhir J., Kind A. J., and Campbell K. H. (1997). Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385 : 810-813. 10. Thomson J. A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. S., et al. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastoysts. Science 282: 1145-1147. 11. Shamblot M. J., Axelman J. , Wang S., et al. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 (23): 13726-31. 12. Jiang Y., Jahagirdar B. N., Schwartz R. E., et al. (2002). Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418: 41-49. 13. Verfaille Catherine (2000). Stem cell plasticity. Graft 3: 296-298. 14. Verfaille C. M., Shwartz R., Reyes, M., and Jiang, Y. (2003). Ann. N. Y. Acad. Sci. 996: 231-234. 15. Long Y., and Yang K. Y. (2003). Bone marrow derived cells for brain repair: recent findings and current controversies. Curr. Mol. Med. 3: 719-725. 16. Deans R. J., and Moseley A. B. (2000). Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical uses. Exp. Hemat. 28: 875-884. 17. Pittenger M. F., Mackay A. M., Beck S. C., et al. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284: 143-147. 18. Eugene Russo (2001). The potential of human mesenchymal cells. The Scientist 15 (11): 19-20. 19. Jiang Y., Balkrishna, N., Jahagirdar, R., et al. (2002). Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418: 41-49. 20. Schwartz R. E., Reyes M. , Koodie L., et al. (2002). Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J. Clin. Invest. 109:1291-1302 21. Fuwang J., Juanwang L., Fanwu Y., et al. (2004). Mesenchymal stem/progenitor cells in human umbilical cord blood as support for ex vivo expansion of CD34+ hematopoietic stem cells and for chondrogenic differentiation. Haematologica 89: 837-844. 22. Erices A., Conget P., and Minguell J. A. (2000). Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br. J. Hemat. 109: 235-242.


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23. Fukuchi Y., Nakajima H., Sugiyama D., et al. (2004). Human Placenta-Derived Cells Have Mesenchymal Stem/Progenitor Cell Potencial. Stem Cells 22: 649-658. 24. Prusa A., and Hengstchläger M. (2002). Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med. Sci. Monit. 8(11): RA253-257.RA 25. Zvaifler N. J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G., et al. (2000). Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res. 2: 477-488. 26. Kassem M., Kristiansen M., and Abdallah B. M. (2004). Mesenchymal stem cells: cell biology and potential use in therapy. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 95: 209-214. 27. Pfendler K. C., and Kawase E. (2003). The potential of stem cells. Ostet. Gynecol. Survey 58 (3): 197-208. 28. Short B., Brouard N., Occhiodoro T., et al. (2003). Mesenchymal stem cells. Arch. Med. Res. 34: 565-571. 29. Frank P. Luyten (2004). Mesenchymal stem cells in osteoarthritis. Curr. Opin. Rheumatol. 16: 599-603. 30. Perin E. C., and Silva G. V. (2004). Stem cell therapy for cardiac diseases. Curr. Opin. Hematol. 11: 399-403. 31. News and Views (2004). A human stem cell proyect? Nature 418: 1 32. News and Views (2004). The stem-cell state. Nature 432: 131. 33. Alison McCook (2004). Stem cells in New Jersey. The Scientist , Agosto 19, 2004. http//www.biomedcentral.com/news/2004225/03/

STEM CELLS : DREAM AND REALITY

Orlando Chaparro, PhD Research Center, school of medicine

Nueva Granada Military University e-mail: [email protected]

The issue of stem cells has recently been the subject of important headlines in the mass media, and the public in general presently has in mind a world of eternal youth and organs to replace those that have stopped functioning properly, and which can be acquired in almost such an easy manner as when purchasing in a supermarket. Bioethicians, politicians and lay citizens debate whether it is or not convenient to do research on and make use of these cells as a new


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therapeutic strategy. From the scientific point of view, however, research on stem cells has much deeper implications. The human body has several billions of cells from around 225 different cell types which make up the tissues of its different organs. These different cell types originate as of an only cell (the zygote) through a complex differentiation process during which groups of particular genes activate or disactivate themselves, thus giving each celular type its characteristics of individuality. Most of the differentiated cells cannot replicate themselves, and its replacement, when it is required so, must be effected as of a group of undifferentiated cells that keep their capacity for self-replication: stem cells. It is necessary, in the first place, to define what we mean by "stem cell." The concept as such is not new, and it can already be found in the scientific and medical literature of the XIX Century. (See Pamela Gehron Robey's interesting review, 2000) (1). Two characteristics define the stem cell. In the first place, its capacity for differentiation which originates one or more celular types or lineages. Therefore, the concept of stem cell involves a wide range of cells with different capabilities for proliferation and differentiation (2, 3, 4). Frequently, within the operational criteria that define a stem cell, clone-genecity (?) is included, being this the undefined capacity to divide itself in a symmetrical manner, that is, to originate cells identical to itself (5, 6). Stem cells have been classified according to different criteria. In the first place, according to their capacity for differentiation, they are classified as totipotent, those capable of originating a complete organism including germinal tissue; pluripotent, the cells capable of originating cells from the three germinal layers; and multipotent, or specific organ, those that give origin to the cells of a specific tissue or organ (2). Stem cells can also be classified according to their origin in embryonic stem cells (ES), which are obtained from the embryo; germinal embryonic stem cells, obtained from the fetus' gonadic crest; and adult stem cells, originating from mature adult tissues. Each one of these cell types has different characteristics and, henceforth, depending on the circumstances, they have advantages and disadvantages over the others. A Change of Paradigm


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Dr. Nidia Rosenthal, in a publication on "The Stem Cells' Promise" makes a wonderful reference to the myth of Prometheus. The Greek titan who dared to violate the gods' rules and stole fire to give it to man, and to teach him about civilization and arts was brutally punished by Zeus. Jupiter chained him to the Caucasus Mount, where for more than 30,000 years, a vulture to gnaw at his liver, which would grow again, every day. We, mere mortals, do not posses a liver with such regenerative potential, but the legend makes us think about the body's extraordinary capacity to reconstruct itself (4). What is it that determines the capacity for a damaged tissue to repair itself? Until not such a long time ago, it was presumed that undifferentiated cell populations contributed in an exclusive manner to the regenerative capacity of the tissue were they resided. The results of experiments reported in the last years have led to a revision of this paradigm. Paradigm changes take place when exceptions accumulate in such a manner that it becomes necessary to re-evaluate prevailing theories. Regarding this, Thomas Kuhn wrote in 1962: "Such changes, together with the controversies that almost always accompany them, are the characteristics that define scientific revolutions" (7). The results of stem cell research are questioning the paradigm of animal embryo-genesis, which has been held for a long time. The idea that the destiny of a cell was already defined when the cell became part of the endoderm, the mesoderm or the ectoderm, had an almost dogmatic connotation (8). The cell's lineage specification had been considered lineal or irreversible. At a molecular level, such irreversibility had been attributed to changes in its conformation, and to events of chromatic methylation taking place during differentiation in such a manner that all the cells' regenerative capacity, except for those embryo-originated cells, was considered as restricted to a single type of tissue (2). Over the last decade, three outstanding achievements have shaken biology's traditional foundations of development, generating what has been called "a new paradigm": a stem cell can trans-differentiate itself: that is, it can originate cells from a germinal layer that is different from the one from where the cell comes. This paradigm change has more than a merely theoretical importance, as it widens up the horizon of possibilities for therapies based on the use of stem cells (2). The first achievement was the use of nuclear transfer technology in reproductive cloning (9). Far beyond the capacity to produce a complete organism under the control of a nucleus derived from an adult cell, it was the transcendental demonstration of the plasticity of


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the developmental process. This fact opened up the doors not only to reproductive cloning but also to the so called "therapeutic cloning", that is, to the possibility that an individual can be cloned in order to produce cells or tissues with therapeutic potential. The second achievement was the setting up of cultures of human embryo stem cells (ESCs) (10,11). The feasibility of having and expanding human ESCS paves the way for new possibilities, and allows for proposals for new therapeutic strategies. The third achievement dealt with the isolation of adult pluripotent cells (12). This accomplishment questioned biology's conventional principles regarding development, and suggested that adult tissues could be an alternative source for stem cells with a range of therapeutic applications as wide as or even wider than the one held by ESCs (2). To support this new paradigm, there exists a great number of experimental data, both in vitro and in vivo, that document the stem cells' "plasticity." Regarding this, Dr. John Gerhart, Gynecology and Obstetrics Professor at John Hopkins School of Medicine in Baltimore, says: "We are the ones imposing restrictions, always thinking that the stem cells' lineages are restricted. But what can clearly transcend a genetic program is the environment where we place a cell." (8) Adult Stem Cells The amazing capacity of ESCs to give origin to practically any type of tissue has incentivated research looking for similar celular lineages that can contribute to self-renovation and repair of damaged tissues. Is it possible that adult stem cells (ASCs) have the same clinical potential of the embryo stem cells (ESCs) thus allowing researchers to elude ethical questionings and technical problems inherent in the use of ESCs? Which are the similarities and the difference between these two types of cells? For quite a long time it was thought that ASCs had a more restricted capacity for self-renovation and differentiation than ESCs. Hematopoietic stem cells (HSCs), for instance, grow older and suffer the shortening of telomeres. They were considered multipotent, since they can give origin to all the cells of hematopoietic lineage, yet they are not pluripotent, since it was thought that they could not originate non-sanguineous cells. This concept was held true until at least the end of the 90s decade.


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In recent years, however, as the result of in vitro and in vivo experiments, the issue of ASCs true plasticity has been focused on (13, 14). The difference between HSCs and muscular cells has been reported, for instance, bringing back the definition of dystrophy, in an animal model of the disease known as muscular dystrophy. Even more unexpected are the results that show the differentiation in HSCs in bone marrow transplants in neurons and astrocytes (15). The main source of ASCs is the bone marrow. The bone marrow has three main celular systems: the hematopoietic, the endothelial and the estrome ones, that hold, likewise, a subjacent population, mesenchymal cells, which can differentiate themselves from osseous cells, cartilage, adipose tissues, and skeletal muscles, among others 16). In 1999, researchers from Osiris Therapeutics in Baltimore took a much important step in the field of stem cell research: by using the appropriate experimental conditions, they were able to differentiate mesenchymal cells from the human bone marrow in three different lineages (17). "Oh, this had not been done before, many researchers said, " the group director's, Dr. Mark F. Pittinger, commented. Before, cells as of the bone marrow had been grown for different purposes, yet it had not been proven than different lineages originated as of one single cell, not from multiple cell types." (18) Dr. Pittinger suggests that it was due to a rather careful characterization, trials and analyses of individual clones that led to the impact of the results. This celular population is known in scientific literature as Mesenchymal Stem Cells (MSCs). In 2002, a group led by Dr. Cathrine Verfaille, from the University of Minnesota, identifies in rats and mice as an animal model, an underpopulation of mesenchymal stem cells from the bone marrow called Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPCs), capable of differentiating themselves not only as mesenchymal cells, but also as cells bearing the characteristics of the mesoderm, the ectoderm and the endoderm. When injected into an earlier blastocyst an MAPC made its contribution to most of the somatic tissues (19). Later on, her research group expanded these observations to human's MAPCs, and showed their capacity to differentiate themselves from hepatic cells (20). MSCs have been isolated not only from the bone marrow. Other MSCs sources are made of the umbilical cord blood (21, 22), the placenta (23) the amniotic fluid (24) and peripheral blood (25), among others. The importance of being able to isolate MSCs as of the bone marrow and the peripheral blood lies in the possibility of carrying out autologous transplants (that is using the patient's same


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cells), thus avoiding problems dealing with immune rejection problems. Hundreds of works published in scientific literature have made evident the potential for these cells to be the ideal ASCs source for cell therapy (see, as an example, revisions 26-29). One of the areas to be applied and which has generated lots of expectations, has been the MSCs transplant to treat patients undergoing myocardial infarct. Several clinical trials are taking place, and among them there are various celular populations and different ways to administer ASCs (see revision 30 and the references made therein). In spite of the fact that the preliminary results of these studies are encouraging, there appear several evident problems, and right now there is not a long-term evaluation of this therapy's potential beneficial benefits. Perspectives* In spite of the vertiginous advancement of research on stem sells, we still have lots to learn from them. Basic research still has a long way to tread, and there are still too many fundamental questions to be asked regarding these cell's biology that are begging for an answer. For example: Which mechanisms, under normal conditions, induce the renovation and proliferation principles? Which principles, under normal conditions, the differentiation process, and which is the stem cells' true pluripotential. Which are the potential areas of such populations, and where can we access them? Up to what point can we genetically manipulate these cells in order to use them in specific therapeutic treatments?. Only a great effort in basic biological research will provide us with some answers before stem calls can be used in an everyday safe way for therapeutical protocols (2). New knowledge has always been accompanied by deep fears and anguish, and they have generated attitudes that go from rejection to prohibition. At the end of the decade of the 30s, Stalin favored the neo-Lamarkian theories of Trofim Lysenko, which lead to the emigration of many a soviet scientist, one of them Theodosius Dobshanky, one of the XX Century's most outstanding geneticists, and the Soviet Union saw itself being relegated to a second place in the field of genetic research. In the 80s, the US congress considered the possibility of prohibiting DNA recombinant technology. In the year 2001, George Bush, the US's present president, signed a law

* Just recently, the US congress has agreed, opposing the President's prohibition, to pass a law permitting the use of federal funds for such a purpose. (Translator's note.)


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forbidding the utilization of federal funds for research with stem cells (*). Nonetheless, every day it is more than evident the need for and the importance of doing research on stem cells, and more so, of being able to investigate embryo stem cells together with adult stem cells. It has even been proposed the need to start up a "Human Stem Cells Project" with size and reach similar the one of the Human Genome Project (31). France and Switzerland approved at the end of 2002 legislation allowing the use of human embryos, leftovers from in vitro fertilization programs, to be used in research, but they still continue with the prohibition of creating embryos for this specific purpose. The state of California, in the US, recently approved through a referendum in the last elections, the creation of an Institute for Embryo Stem Cell Research, with a starting budget of US $300 for a ten-year program (32). The State of New Jersey created in 2004 the Institute for Stem Cell Research which, together with the Universities of Medicine and Dentistry (UMDNJ), and Rutgers University, will have for the next five years a budget close to US $ 70 million from federal and private funds (33). It is evident that research in general, and in the field of stem cells specifically, requires governmental and institutional decisions to be made, in order to invest by financing long-term program that will integrate the efforts from the different researchers and research groups. I would like, to end this paper, to quote as, Dr. Sara M. Mariani did, in her lecture "Stem Cells and Tissue Engineering, dreaming things that have never happened" in the Seventh Annual Congress of the American Society of Genetic Therapeutics, in June 2004, George Bernard Shaw: You see things, and you say "Why"?

But I dream things that never were, and I say "Why not"?

We are just starting to discover a new fantastic and wondrous world, full of doubts and uncertainties, but also full of promise and possibilities. Let's allow ourselves to dream and to ask ourselves "Why not?"


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CÉLULAS TRONCALES Y BIOÉTICA1

Juan-Ramón Lacadena Departamento de Genética, Facultad de Biología

Universidad Complutense de Madrid, España La utilización de la terapia celular, basada en la transferencia de células o tejidos a los tejidos u órganos dañados, es una de las grandes esperanzas de la Medicina del futuro. El establecimiento de cultivos celulares de tejidos humanos en el laboratorio es a veces difícil y en determinados casos incluso imposible. Por ello, desde el punto de vista clínico sería innegable el avance que supondría la posibilidad de poner a punto técnicas que permitieran obtener cualquier tipo de cultivos de tejidos y, acaso, de órganos. En este contexto, no cabe duda que el uso de las células troncales2 puede resultar fundamental. Por célula troncal se entiende cualquier célula que tiene la doble capacidad de dividirse ilimitadamente y de dar lugar a diferentes tipos de células especializadas. De acuerdo con esta segunda capacidad, las células troncales pueden ser totipotentes, pluripotentes y multipotentes en razón a su mayor o menor versatilidad o potencialidad. Hay varias clases de células troncales (embrionarias, germinales embrionarias, adultas) cuya eficacia en el establecimiento de cultivos de tejidos en el laboratorio y sus valoraciones éticas y jurídicas son diferentes. En el presente trabajo se hará referencia tanto a las células troncales embrionarias (células ES) como a las células troncales adultas (células AS). I. CONSIDERACIONES GENÉTICAS Y BIOLÓGICAS SOBRE EL DESARROLLO EMBRIONARIO HUMANO

1 El presente trabajo está basado fundamentalmente en otros previos del autor (Lacadena, 2000, 2001, 2002) 2 Aunque en el lenguaje coloquial suele utilizarse el término “célula madre”, yo he preferido usar el término “célula troncal” como traducción más correcta del original inglés “stem cell”. De hecho, en el Vocabulario Científico de la Real Academia de Ciencias Exactas Físicas y Naturales (3ª edición, 1996) se incluye el término “célula tronco” como sinónimo de “célula pluripotencial” o “célula pluripotente”, pero no incluye “célula madre”. Asimismo, el Diccionario de la Lengua Española de la Real Academia Española (22ª edición, 2001) incluye el término “célula troncal” mientras que “célula madre” la define genéricamente como la “célula que se reproduce dando lugar a dos o más células hijas”.


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El ciclo vital humano se inicia a partir de una célula única -el cigoto- formado por la fecundación de dos gametos (óvulo y espermatozoide) que, tras el proceso de desarrollo, dará lugar a la formación del individuo adulto el cual, al alcanzar la madurez sexual, producirá a su vez gametos, iniciando así un nuevo ciclo de reproducción sexual. En el proceso biológico de la reproducción humana se pueden diferenciar cuatro etapas que representan situaciones genéticas y embriológicas muy distintas a las que pueden corresponder cuestiones éticas y jurídicas diferentes. Tales etapas son: 1) gametos → fecundación → cigoto; 2) cigoto → mórula → blastocisto → anidación; 3) anidación → feto; 4) feto → nacimiento. En el Cuadro 1 se incluye una cronología del proceso de la reproducción humana in vivo, bien entendido que la cuantificación de estos procesos debe tomarse siempre como valores aproximados con cierto grado de variación. Cuadro 1. CRONOLOGÍA DE LA FECUNDACIÓN IN VIVO

TIEMPO ESTADIO DE DESARROLLO 0 La fecundación, que ocurre en las trompas de Fallopio, da lugar al cigoto

o célula inicial única con los dos pronúcleos de origen masculino y femenino.

36 horas Embrión de 2 células (blastómeros) que inicia el camino hacia el útero. 60 horas Embrión de 4 células. 3 días Embrión de 6 – 8 células.

4 días Mórula: 16 células (todavía totipotentes) que forman un grupo compacto. Continúa la división hasta 32-64 células. Llega al útero y comienza la implantación o anidación.

5 – 7 días

Blastocisto: las células continúan dividiéndose hasta alcanzar un número aproximado de 100 y crean una cavidad central (blastocele), formándose una capa externa (trofoectodermo o trofoblasto, que originará la placenta y otras membranas extraembriónicas) que rodea a un grupo de 20-30 células que quedan pegadas a la pared interior (masa celular interna oembrioblasto). Las células de la MCI son pluripotentes.

14 días El blastocisto termina la anidación. La MCI da lugar al disco embrionariode un diámetro de 0,5 mm que contiene unas 2000 células. Aparece la línea primitiva.

3ª semana

En el proceso de gastrulación se transforma el disco embrionario bilaminar en trilaminar (ectodermo, mesodermo, endodermo). El embrión crece hasta 2,3 mm de longitud. Empiezan a aparecer los primordios que originarán los principales órganos.


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Final de 8ª semana Paso de embrión a feto, que contiene ya el diseño prácticamente completo del nuevo individuo.

La primera etapa del proceso supone un cambio drástico por cuanto se pasa de la existencia de dos realidades diferentes -los gametos- a una nueva realidad: el cigoto. Sin embargo, es conveniente ya resaltar aquí el aspecto de la continuidad de los procesos biológicos antes mencionada. Incluso en esta primera etapa, que es aparentemente la más clara en la problemática que afecta al comienzo de la vida humana, hay que señalar que el propio proceso de la fecundación es largo y complejo desde que el espermatozoide penetra en el citoplasma del ovocito hasta que se produce la aproximación de los pronúcleos masculino y femenino e inician simultáneamente la mitosis de la primera división celular. La segunda etapa (cigoto → mórula → blastocisto → anidación) es, a mi juicio y desde el punto de vista genético, la más crucial en relación con la problemática de la reproducción humana, tanto en el aspecto de la intercepción (por ejemplo, los dispositivos intrauterinos, DIUs, o cualquier otro mecanismo que impida la implantación) como en el de las nuevas técnicas de reproducción asistida que implican la manipulación de embriones (diagnóstico preimplantacional y selección de embriones, células troncales) ya que cuestiona la individualización del nuevo ser humano (propiedades de unicidad y de unidad, ver Lacadena, 1995). Como se indica más adelante, en el blastocisto (hacia el 5º o 6º día) se inicia un importante proceso de diferenciación por cuanto aparecen dos líneas celulares bien diferenciadas: una, que constituye el embrioblasto que dará lugar al embrión y, otra, el trofoblasto que dará lugar a la placenta embriónica. El blastocisto es el embrión en la fase de desarrollo que sigue a la mórula. Consta de una capa externa de células (trofoectodermo o trofoblasto) con una cavidad interior (blastocele) y un grupo de células pegadas a su cara interna que constituye el embrioblasto o masa celular interna (MCI). El futuro embrión sólo se desarrollará a partir de las células de la MCI que se diferencian en epiblasto, el cual se transformará en el disco embrionario (que dará lugar al embrión propiamente dicho), y en hipoblasto, que dará lugar al ectodermo amniótico. Por su parte, el trofoblasto no produce estructuras embriónicas, sino que dará lugar al corion, que es la porción embriónica de la placenta.


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II. LA TERAPIA CELULAR EN LA MEDICINA DEL FUTURO: FINES Y MEDIOS Como se indicaba al principio del presente trabajo, la utilización de la terapia celular, basada en la transferencia de células o tejidos a los tejidos u órganos dañados, es una de las grandes esperanzas de la Medicina del futuro (Medicina Regenerativa, ver Committee on the Biological and Biomedical Applications of Stem Cell Research, 2001). El establecimiento de cultivos celulares de tejidos humanos en el laboratorio es a veces difícil y en determinados casos incluso imposible. Por ello, desde el punto de vista clínico sería innegable el avance que supondría la posibilidad de poner a punto técnicas que permitieran obtener cualquier tipo de cultivos de tejidos y, acaso, de órganos. En este contexto, no cabe duda que el uso de las células troncales puede resultar fundamental. Por célula troncal se entiende cualquier célula que tiene la doble capacidad de dividirse ilimitadamente y de dar lugar a diferentes tipos de células especializadas. De acuerdo con esta segunda capacidad, las células troncales pueden ser totipotentes, pluripotentes y multipotentes en razón a su mayor o menor versatilidad o potencialidad, tal como se definen a continuación: Célula totipotente: Célula troncal que tiene la capacidad de diferenciarse en el embrión y en tejidos y membranas extraembriónicas. Las células totipotentes contribuyen a todos los tipos celulares de un organismo adulto. La totipotencia es la capacidad funcional de una célula de dar lugar a un individuo completo tras un proceso de desarrollo normal. Las células totipotentes de un embrión muy temprano tienen la capacidad de diferenciarse en membranas y tejidos extraembriónicos, en el embrión y en todos los tejidos y órganos postembriónicos. En el embrión humano, parece ser que solamente son totipotentes los blastómeros hasta el estadio de mórula de 16 células. Célula pluripotente: Célula troncal presente en los estadios tempranos de desarrollo embrionario que puede generar todos los tipos de células en el feto y en el adulto (unos 200 tipos distintos de células en el organismo humano) y es capaz de autorrenovación. Las células pluripotentes, sin embargo, no son capaces de desarrollarse en un organismo completo. La pluripotencia es la capacidad funcional de una célula de dar lugar a varios linajes celulares o tejidos diferentes. Las células troncales embrionarias o células ES (por embryo stem cell) presentes en la masa celular interna del blastocisto humano son pluripotentes, pero no totipotentes; es decir, pueden originar distintos tejidos u órganos pero no dar lugar al desarrollo completo de un embrión porque no pueden producir las membranas y tejidos


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extraembriónicos necesarios para el proceso de gestación. No obstante, podría ocurrir que una célula pluripotente de la masa celular interna se convirtiera en totipotente. Célula multipotente: Célula troncal presente en los tejidos u órganos adultos que tiene una capacidad limitada de reactivar su programa genético como respuesta a determinados estímulos que le permiten dar lugar a algunos, pero no todos, los linajes celulares diferenciados. La multipotencia es la capacidad funcional de una célula de dar lugar a alguno, pero no todos, los linajes celulares. Algunas células troncales presentes en tejidos u órganos adultos son multipotentes. A veces se utiliza el término plasticidad como equivalente a multipotencia. III. Hay varias clases de células troncales (embrionarias, germinales embrionarias, adultas) cuya eficacia en el establecimiento de cultivos de tejidos en el laboratorio y sus valoraciones éticas y jurídicas son diferentes. Una actualización sobre las células troncales fue publicada en una serie de artículos de la revista Nature el 1 de noviembre de 2001 (Lovell-Badge, 2001; Donovan y Gearhart, 2001; Spradling et al., 2001; Reya et al., 2001; Temple, 2001; Bianco y Robey, 2001; Surani, 2001; McLaren, 2001). ASPECTOS ÉTICOS Y LEGALES SOBRE LA UTILIZACIÓN DE CÉLULAS TRONCALES DE EMBRIONES HUMANOS PARA OBTENER CULTIVOS DE TEJIDOS Dicen Casado y Egozcue (2000) que el período embrionario no es ya solamente una etapa hacia la reproducción, sino que también puede ser fuente de vida para los ya vivientes, puesto que las células troncales pluripotentes de la masa celular interna (MCI) del blastocisto pueden facilitar el establecimiento de cultivos de tejidos aplicables en una terapia celular clínica (Bongso et al., 1994). En el organismo humano adulto se estima que existen en torno a 200 tipos de células diferentes cuyo origen se puede retrotraer a las células troncales pluripotentes. Desde el punto de vista científico, la cuestión está en llegar a conocer cuáles son las instrucciones por las que una célula pluripotente se diferencia hacia un determinado tipo celular. Las células troncales embrionarias (células ES) pueden obtenerse esencialmente de tres fuentes: • de la MCI de embriones producidos por fecundación in vitro (FIV) con el único propósito de obtener cultivos de tejidos; • de la MCI de embriones sobrantes de programas de FIV; • de la MCI de embriones somáticos obtenidos por técnicas de clonación mediante transferencia de núcleos: método idóneo para

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evitar el rechazo inmunológico del trasplante al facilitar un posible autotrasplante. Este sería el caso de la aplicación de la técnica de clonación no reproductiva con fines terapéuticos. Se trata, por tanto, de transferir el núcleo de una célula somática diferenciada al citoplasma de un ovocito previamente enucleado, convirtiéndolo así en el equivalente de un cigoto que puede iniciar un proceso de desarrollo embrionario normal. Sin embargo, el destino de este embrión no es el de ser transferido al útero de una mujer para dar lugar tras la gestación al nacimiento de un individuo clónico de la persona a quien perteneciera la célula somática donadora del núcleo, sino el de mantenerlo en el laboratorio durante un tiempo máximo de catorce días a partir del momento de la transferencia del núcleo y utilizar sus células troncales pluripotentes para tratar de establecer en el laboratorio determinados cultivos de tejidos u órganos (esto último parece, hoy por hoy, más difícil de conseguir). Es fácil imaginar lo que supondría para un paciente poder ser trasplantado con su propio tejido (u órgano si fuera posible), evitando cualquier problema de rechazo inmunológico. 1. Aspectos éticos En primer lugar habría que diferenciar dos situaciones en cuanto al origen de los embriones: que sean producidos ex profeso con tal fin mediante FIV o que se trate de embriones sobrantes3 de un programa de FIV. Es evidente, no obstante, que en ambos casos se trata de utilizar las células de la MCI del blastocisto para tratar de establecer los cultivos de células diferenciadas, con la consiguiente destrucción del embrión. Es obvio que en el juicio ético de estas situaciones, el punto de partida estará condicionado por la valoración que se tenga a priori sobre el “estatuto del embrión” durante los primeros catorce días de desarrollo cuando todavía no tiene fijadas las propiedades de unicidad (ser único e irrepetible) y de unidad (ser uno solo) que determinan su individualidad. Desde el punto de vista ético parece que es mayoritaria la posición contraria a la creación de embriones con el propósito de ser utilizados en la técnica mencionada. Sin embargo, cuando se trata de embriones sobrantes la reflexión ética puede variar aunque en ningún momento se olvide el punto de partida antes mencionado del estatuto del embrión.

3 Se utiliza la denominación “embriones sobrantes” siguiendo la terminología del Tribunal Constitucional español, sin que ello implique connotación peyorativa alguna. Véase la nota 4.


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En mi opinión, lo mejor sería que los programas de FIV se llevaran a cabo sin producir embriones sobrantes, de manera que prevaleciera esa prioridad frente al de eficacia médica que normalmente se utiliza. En algún país, como Alemania, la ley obliga a transferir al útero materno todos los embriones obtenidos. Sin embargo, dado que en la mayoría de los casos eso no ocurre, la pregunta es ¿cuál podría ser el destino de los embriones sobrantes de un programa de FIV? El mejor, sin duda, la utilización por sus propios progenitores o, en su defecto, la utilización por otras parejas si la ley lo permitiera (una especie de “adopción biológica”, todavía no contemplada por el ordenamiento jurídico español ni de otros muchos países). Dado que estas alternativas no han logrado evitar la existencia de los embriones sobrantes, la cuestión que se plantea es qué hacer con ellos: ¿Dejarlos en el “limbo” de la congelación para siempre? ¿Destruirlos cuando lo manden los plazos legalmente establecidos? ¿Utilizarlos en experimentación o con fines terapéuticos? En la valoración ética de este problema debe tenerse en cuenta que se trata de decidir entre dos alternativas posibles: destruir por imperativo legal el embrión interrumpiendo su crioconservación (en la legislación española vigente es de cinco años) o provocar su destrucción utilizándolo en investigación básica o aplicada, como puede ser la utilización de las células pluripotentes de su MCI para establecer determinados cultivos de tejidos. Muchos consideran que la preferencia por la utilización de los embriones sobrantes con fines de investigación antes que su destrucción directa (“muerte natural”) provocada por el cese de su crioconservación no se considera incompatible con el respeto y la protección que merece en todo caso el embrión humano, garantizando las condiciones y requisitos de desarrollo de la investigación de acuerdo con la Convención Europea sobre los Derechos Humanos y la Biomedicina. Por otro lado, aunque salvando las distancias, hay quien compara esta situación con la de la experimentación con un enfermo terminal por el hecho de que está condenado a morir. En cualquier caso, siempre habría que vigilar que no se cayera en la grave picaresca de fomentar la producción de embriones sobrantes en programas de FIV pensando en la posible utilización posterior de sus células ES. 2. Aspectos legales La situación legal es diferente según los países, tal como se indica a continuación: a) Estados Unidos En Estados Unidos y a requerimiento del Presidente Clinton, la Comisión Nacional Asesora de Bioética, en su informe Ethical Issues in Human Stem Cell Research (Septiembre, 1999) concluía que la utilización de fondos federales para el uso y derivación de células


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troncales embrionarias (ES) y células germinales embrionarias (EG) debería ser limitada a dos fuentes de tales materiales: los embriones sobrantes de programas de IVF y los fetos abortados, respectivamente. Se desaconsejaba, por el contrario, la subvención federal de investigaciones con células ES procedentes de embriones creados por IVF con tal único propósito de su utilización experimental posterior o de embriones obtenidos mediante técnicas de clonación por transferencia de núcleos a ovocitos (embriones somáticos). Aunque la recomendación del Comité se refiere exclusivamente a la subvención con fondos federales de este tipo de experimentación, sin embargo señala el informe que sería de desear que las instituciones privadas siguieran las mismas normas que se proponen en él. Sin embargo, tras la entrada de la nueva administración Bush la situación ha quedado estancada, si bien la American Association for the Advancement of Science y la National Academy of Sciences apoyaban la utilización de fondos federales en la investigación con células troncales embrionarias humanas. La presión es grande, tanto en la comunidad científica como en la sociedad. En cualquier caso lo que está en juego es si el fin justifica los medios. El 9 de Agosto de 2001, el Presidente Bush envió un mensaje televisado a toda la nación en relación con la utilización de fondos federales para investigar con células troncales y anunció su decisión de no subvencionar tales trabajos y ni siquiera para aquellos que pudieran utilizar células troncales obtenidas en el sector privado. Sin embargo, sí permitiría la subvención de la investigación realizada con las líneas celulares troncales embrionarias (ES) ya establecidas en diversos laboratorios del mundo porque −en palabras de Bush− “la decisión de vida o muerte ya había sido hecha”; es decir, se trata de una política de hechos consumados. En un principio se estimaba que hay unas 60 líneas celulares establecidas aunque algunos investigadores rebajan la cifra hasta menos de 30. Además el Presidente Bush anunció la creación de un Consejo, presidido por el bioeticista de la Universidad de Chicago Leon Kass, para vigilar el trabajo sobre células troncales embrionarias y elaborar la correspondiente normativa. Por su parte, los National Institute of Health (NIH) han elaborado un registro total de 72 líneas celulares ES (aunque algunas de ellas son subclones) que podrán ser utilizadas en las investigaciones subvencionadas con fondos públicos, fijándose la fecha tope del 27 de noviembre de 2001 para que los investigadores pudieran hacer sus solicitudes. Tales líneas se mantienen en diez centros públicos y privados en todo el mundo (cuatro en Estados Unidos y el resto repartidos entre Australia, Suecia, Israel e India). No obstante, algunos de esos diez centros dicen que no todas las líneas celulares consideradas por los NIH reúnen las condiciones apropiadas


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para ser consideradas como líneas celulares ES, rebajando el número hasta unas 25. Por su parte, un informe hecho público en Septiembre de 2001 por la National Academy of Sciences dice que el número de líneas celulares troncales establecidas es insuficiente para el adecuado progreso de la investigación, solicitando que se autorice la creación de nuevas líneas celulares ES. Por otro lado, como era de esperar, ya ha empezado –o se ha intensificado, mejor dicho– la lucha de las patentes de tales líneas celulares. Podría decirse que en los Estados Unidos de utiliza una doble moral en el sentido de que se prohíbe por razones éticas la utilización de fondos públicos para estas investigaciones, pero se tolera que se realicen con fondos privados: si algo es intrínsecamente malo, lo es en ambas circunstancias. b) Canadá En Canadá, un comité ad hoc de Bioética de los Canadian Intitutes of Health Research (CIHR) se ha manifestado también a favor de autorizar la utilización las células troncales de embriones sobrantes de los programas de FIV a la vez que prohibía la creación de embriones para investigación. c) Comunidad Europea En la Comunidad Europea, el Group on Ethics in Science and New Technologies (2000) elaboró un informe a petición del Presidente Prodi en el que se manifiesta en contra de crear embriones ex profeso para utilizar sus células ES y a favor de utilizar los embriones sobrantes. Pero en la Comunidad Europea la situación es más bien rocambolesca, tal como se infiere de lo que a continuación se expresa: Desde principios del año 2001 ha venido trabajando un Comité del Parlamento Europeo para estudiar diversos aspectos de la “Genética Humana en la Medicina Moderna”, incluyendo temas como la investigación con células troncales y la clonación humana terapéutica. El borrador del informe, conocido como Informe Fiori (Fiori Report on Human Genetics in Modern Medicine), era más bien conservador aunque mantenía una postura razonable respecto a los dos temas mencionados. Sin embargo, su paso por el tracto parlamentario lo fue convirtiendo en una “prohibición de todo” como consecuencia de las 550 enmiendas presentadas. En el informe final resultante, se prohibían, no solamente cualquier subvención con fondos de la UE para investigaciones que implicaran la producción de embriones humanos, sino también “cualquier otra forma de investigación que utilizara embriones humanos”. En relación con las técnicas de


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clonación (ver más adelante el apartado correspondiente) el informe final decía que no se podía hacer distinción entre las técnicas de clonación reproductiva y no reproductiva terapéutica y, seguía argumentando, que el único modo de parar la clonación reproductiva era deteniendo también la clonación terapéutica no reproductiva. Según un comentarista (J. Tizzard, [email protected], 133: 12 Noviembre 2001), las deliberaciones de la Comisión realizadas por los expertos durante meses fueron pirateadas por quienes no habían tenido nada que ver con tales deliberaciones. Finalmente, en noviembre de 2001 el Parlamento Europeo rechazó por amplia mayoría el Informe Fiori (316 votos en contra del informe, 37 a favor y 47 abstenciones). d) España En España, tal como se recoge en el I Informe Anual de la Comisión Nacional de Reproducción Humana Asistida (CNRHA) de 1998, se estima que hay más de 25.000 embriones sobrantes congelados, de los que una cierta proporción (en torno a un 15%) han sobrepasado los plazos legales de conservación (cinco años) y que, por tanto, deberían ser destruidos por imperativo legal. En Octubre de 2001, la Comisión de Ciencia y Tecnología del Congreso de los Diputados rechazó con los votos del Partido Popular y de Convergencia i Unió la propuesta del grupo parlamentario socialista para permitir la utilización de las células troncales de los “embriones sobrantes” de programas de FIV. La propia CNRHA elaboró un II Informe Anual en el mes de abril del año 2000 para abordar el problema de los “embriones sobrantes”4, pero, por razones ajenas a la propia Comisión, dicho Informe no fue recibido oficialmente por la Administración hasta año y medio después: el 26 de noviembre de 2001, autorizándose simultáneamente su publicidad. A continuación se incluyen los razonamientos éticos y jurídicos que se incluyen en el Resumen, así como las Conclusiones o recomendaciones del Informe:

4 El término “sobrantes” se ha tomado de la Sentencia del Tribunal Constitucional de 17 de Junio de 1999 sobre la constitucionalidad de la Ley 35/1988, sobre Técnicas de Reproducción Humana Asistida. Aunque en el lenguaje coloquial se sustituye por el de embriones “supernumerarios”, u otros equivalentes, se ha considerado más adecuado reproducir en este Informe el término acuñado por el Tribunal Constitucional, que se refiere en todo caso a embriones resultantes de la aplicación de las técnicas de reproducción humana asistida que, sin embargo, no van a ser utilizados en la reproducción de la propia pareja que los generó, por lo que se conservan congelados a la espera de determinar su destino.


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Resumen y conclusiones [ ... ] Aspectos Éticos 7. Desde el punto de vista ético, hay una coincidencia general entre la mayoría de los países en establecer el inicio de la individualidad a partir del día 14 del desarrollo embrionario. Esta valoración tiene su base en la consideración de algunas cualidades específicas del embrión producidas a partir de esa fecha, a los que se ha hecho referencia en el apartado anterior. Los nuevos hallazgos biológicos en esas primeras fases del desarrollo citado no han puesto en cuestión hasta ahora esa valoración general, y existe un consenso general entre la mayoría de los países en sustentar las regulaciones de las actuaciones con los embriones en las características y plazos citados. 8. Es asimismo común la consideración del embrión en esas fases como un bien que merece una especial protección y valoración. Por el contrario, no hay acuerdo en el grado de respeto y protección que merece el embrión en esas fases, que para algunos grupos sociales debe ser de intensidad idéntica al requerido por cualquier persona humana, mientras que para otros debe ser diferente. Estas distintas valoraciones se dan también en la sociedad española. 9. El carácter antagónico de algunas de las valoraciones citadas entre puntos de vista distintos es de unas características que han impedido hasta ahora en cuantos foros se ha planteado lograr un acuerdo sobre la naturaleza y el estatuto jurídico del embrión. Como consecuencia, la solución de cuantos problemas deben partir de la consideración que debe otorgarse al embrión en esas fases no han podido ser resueltos mediante el acuerdo previo sobre los aspectos citados. La otra vía posible de abordar estas cuestiones es la de tratar de llegar a acuerdos mínimos comunes entre los diferentes puntos de vista e ideologías sobre los problemas concretos, a medida que estos se vayan planteando. Este tipo de acuerdos sólo es posible mediante el debate permanente en instituciones y grupos como el constituido por esta misma Comisión. Para contribuir a resolver el problema de los embriones congelados, la Comisión ha adoptado el segundo de los métodos citados, tratando de alcanzar la definición de unos criterios éticos que resulten aceptables para una proporción mayoritaria significativa de la sociedad española respecto a esta cuestión 10. La Comisión estima que la sociedad española comparte la consideración del embrión como un bien protegible, y cuya protección debe ser tenida en cuenta en cuantas actuaciones se realicen con ellos. Sin embargo, considera mayoritariamente que esa protección,


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que no es idéntica a la que requiere la persona humana, no resulta vulnerada si se admite la posibilidad de investigación con los que resulten “sobrantes” de las técnicas de reproducción humana asistida como solución última a su destino, alternativa al cese de su conservación. A esa alternativa debe llegarse una vez descartada su transferencia, sea a su progenitora o a otras mujeres a las que pudieran donarse, con el consentimiento de los progenitores [la cursiva es mía], y con el control de las investigaciones desarrolladas por parte de esta Comisión Nacional, entre cuyas funciones se incluye el desempeño de esas tareas, y de comisiones locales de los centros en los que se desarrollen, cuya misión es la comprobación y el seguimiento de los requisitos precisos para el desarrollo de esas investigaciones. Por otra parte, las investigaciones a que se sometieran a los embriones en las condiciones citadas deben ser de interés científico relevante como para justificarse, y carecer de carácter predominantemente lucrativo, todo lo cual debe ser controlado por los comités y comisiones a que se ha hecho referencia. Esta consideración se refiere a embriones in vitro de menos de 14 días de desarrollo desde la fecundación, excluyendo de ese cómputo los plazos en los que los embriones hubieran permanecido congelados. Y resulta compatible con los criterios mantenidos en diferentes países de nuestro entorno, y en el Convenio Europeo de Biomedicina. Aspectos Jurídicos 11. Desde el punto de vista jurídico, la situación respecto a la posibilidad de utilizar embriones viables para investigación, en las condiciones y con las limitaciones señaladas, es variable en distintos países. En todo caso, como consecuencia de las nuevas perspectivas de investigación abiertas, se trata de una cuestión en debate en el seno de la Unión Europea y en la mayoría de los países desarrollados de nuestro entorno. 12. En España, la Ley 35/1988, que constituye la legislación de referencia, limita la posibilidad de investigación a embriones no viables, y excluye cualquier otra clase de investigación que no tenga carácter diagnóstico o terapéutico con embriones viables. 13. La Comisión se ha planteado qué procedimiento sería adecuado seguir si se quisiese abrir la posibilidad de desarrollar investigaciones con embriones “sobrantes” en las condiciones citadas. Una de las posibilidades debatidas ha sido la interpretación del concepto de viabilidad, entendiendo que un embrión no es viable en todo caso si no va a ser implantado. El seguimiento de esa vía tiene


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como inconveniente que el término “viabilidad” es un concepto muy preciso desde el punto de vista biológico. La interpretación del concepto de viabilidad por parte del Tribunal Constitucional está igualmente restringida a los criterios biológicos, y lo mismo se deduce de la lectura de algunos de los preceptos de la Ley 35/1988 de Reproducción Humana Asistida. Por otra parte, si no existieran esos pronunciamientos constitucionales, no parece tampoco que una vía de interpretación de los términos como la indicada, susceptible de ser sometida a un debate teórico, proporcione en la práctica márgenes de seguridad legal suficientes a quienes deberían llevar a cabo esas actuaciones. Y, finalmente, se considera que una cuestión relevante para la sociedad y que afecta a la sensibilidad y los criterios de muchos ciudadanos, como es la indicada, no debe ser sustraída al pronunciamiento más explícito por parte del legislador. Por las razones indicadas, la Comisión considera que, una vez aceptada la práctica de las actuaciones referidas desde el punto de vista ético, la vía más adecuada de reconocer tales prácticas es introducir esa posibilidad en las normas, modificando éstas con un pronunciamiento expreso de quien representa la voluntad popular, y estableciendo las condiciones que deben ser necesarias para la realización de esas prácticas, en el sentido que han sido descritas, de manera semejante a las que ya están legalmente establecidas para llevar a cabo investigaciones con embriones no viables. 14. La reciente Sentencia del Tribunal Constitucional referida a la Ley 35/1988 refrendó la constitucionalidad de ésta en los aspectos relativos a la investigación con embriones basándose, entre otras razones, en los requisitos establecidos para las prácticas de la investigación con embriones no viables, que suponen una garantía de la protección que debe darse al embrión, partiendo de la base de que ésta es diferente de la propia de la persona humana. Dado que la Ley 35/1988 excluye la posibilidad de investigación, salvo para los supuestos diagnósticos o terapéuticos citados, con embriones viables, al proponer una modificación legal que permita la investigación con éstos de manera condicionada al cumplimiento de los requisitos establecidos no se dispone de un pronunciamiento explícito del Tribunal Constitucional respecto a la constitucionalidad de una norma de ese carácter. A pesar de la referida situación, que sólo podrá resolverse con un pronunciamiento expreso si se llega a dictar una norma como la indicada, la Comisión considera que hay elementos de juicio suficientes como para presumir que, dados los repetidos pronunciamientos del Tribunal Constitucional respecto a la protección del embrión, y que las actuaciones que se proponen serían en todo caso alternativas a la destrucción de los embriones que se


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encontraran en las circunstancias repetidamente expresadas, la constitucionalidad de esa norma sería finalmente refrendada. 15. Al proponer una modificación legal de las normas vigentes como contribución a la solución del problema que constituyen los embriones congelados, la Comisión es consciente de que aboca esa solución a la adopción de las decisiones legislativas correspondientes, descartando la posibilidad de que pudieran utilizarse otras vías, como la citada, de recomendar una determinada interpretación de las normas. Ya se han señalado las razones de proponer esa vía de solución. Sin embargo, la importancia del problema requiere que se insista en la necesidad de que se le dé salida al mismo, y que la decisión de hacer las modificaciones legales recomendadas en este informe, así como las que se propusieron en el informe del año anterior, se adopten en el plazo más breve posible o, en todo caso, se promuevan dentro de los mismos plazos otras soluciones alternativas, que la Comisión ha considerado menos recomendables, para resolver las cuestiones citadas. Recomendación La Comisión Nacional de Reproducción Humana Asistida considera mayoritariamente que debe hacerse posible la investigación con embriones congelados “sobrantes” de la aplicación de las técnicas de reproducción humana asistida como alternativa a su destrucción, una vez alcanzados los plazos máximos de su conservación, bajo condiciones de consentimiento informado y control institucional que se han desarrollado más ampliamente en otros apartados, y con el establecimiento de las garantías de protección del embrión a las que se refiere el Convenio de Oviedo. El criterio mayoritario de la Comisión es que esa autorización debe hacerse posible mediante modificación de las leyes que regulan en la actualidad esa cuestión y, en concreto, de la Ley 35/1988, de Reproducción Humana Asistida... Esa modificación debe unirse a las promovidas por esta misma Comisión en su primer Informe de hace un año respecto a otras cuestiones relacionadas con la reproducción humana asistida, que todavía no se han llevado a cabo. En el contexto español, pero posiblemente aplicable a otros entornos, puede ser interesante recoger los datos aportados por el Instituto Universitario Dexeus de Barcelona sobre la opinión de las parejas sobre el futuro de sus embriones una vez pasados cinco años desde su congelación (Asensio et al., 2001). Según el estudio realizado, en el Centro había 1.419 embriones pertenecientes a 260 parejas que sobrepasaban los 5 años de crioconservación (643 embriones llevaban


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entre 5 y 7 años congelados, 428 entre 8 y 9 años, 301 entre 10 y 11 años y 47 entre 12 y 13 años). De las 260 parejas, 196 (75 %) poseen embriones originados tras FIV con gametos propios y 64 (25 %) con gametos donados (8 % de donación de ovocitos y 17 % de semen de donante). De las 260 parejas, sólo se enviaron cuestionarios a 219 de ellas porque 38 (14,6 %) estaban en paradero desconocido y 3 (1,2 %) no aceptaron participar, como manifestaron en conversación telefónica previa. Otro dato adicional es que la situación de las parejas había cambiado en 5 casos: 1 por separación o divorcio, 1 por tener nueva pareja y 3 por fallecimiento de uno de los cónyuges. En total, de las 260 parejas implicadas en la cuestión, transcurridos 4 meses solamente 89 parejas habían respondido al cuestionario enviado, con los siguientes resultados: Opinión de las parejas sobre las opciones legalmente establecidas:

Aceptarían su propia transferencia 24 (27 %) Aceptarían la donación a terceros 29 (32,5 %) No les complace ninguna opción legal 28 (31,5 %) Manifiestan respuestas discordantes 7 (7,9 %) No contestan 1 (1,1 %) Total: 89 (100 %)

Opinión de las parejas sobre las alternativas actualmente no permitidas por la ley:

Sí No Discordante No contesta Investigación

28 (31,5 %) 51 (57,3 %) 5 (5,6 %) 5 (5,6 %)

Destrucción 39 (43,8 %) 37 (41,6 %) 6 (6,7 %) 7 (7,9 %) En cualquier momento

18 (20,2 %)

Completado el plazo legal

21 (23,6 %)

Motivo por el que las parejas encuestadas no se han sometido a las transferencias de sus embriones congelados:

Satisfechos con el número de hijos actual

51 (57,3 %)

Actualmente no desean tener hijos 8 (9,0 %) Problemas médicos que lo contraindican

8 (9,0 %)

Dificultades económicas 6 (6,7 %) Otras circunstancias 7 (7,9 %) Respuesta discordante en la pareja 6 (6,7 %)


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No contesta 3 (3,4 %) Total: 89 (100 %)

No hace falta hacer comentario alguno a este trabajo porque los resultados indicados hablan por sí solos. En el Debate sobre el estado de la Nación, que tuvo lugar el día 16 de julio de 2002 en el Congreso de los Diputados, se aprobó una resolución del grupo parlamentario popular gubernamental por la que se instaba al Gobierno a “fomentar y priorizar la investigación con células madre humanas adultas”. El Partido Popular (PP), por tanto, apostó por la investigación con células troncales adultas frente a la posición del Partido Socialista (PSOE) que solicitaba la investigación con células troncales embrionarias, calificando de “antigua” la política del Gobierno del PP. e) Francia En Francia, la ley nº 94-654, de 29 de julio de 1994, relativa a la donación y utilización de elementos y productos del cuerpo humano y a la asistencia médica en la reproducción y en el diagnóstico prenatal, prohibía “la concepción in vitro de embriones humanos con fines de estudio, investigación o experimentación” (Artículo L. 152-8). Sin embargo, en el Artículo 21, la ley francesa establecía que “será objeto [... ] de un nuevo examen por el Parlamento dentro del plazo máximo de cinco años a partir de su entrada en vigor”. Con tal motivo, el Consejo de Estado de Francia emitió un informe sobre Les lois de Bioéthique: cinq ans aprés que fue adoptado por la Asamblea General del Consejo de Estado el 25 de noviembre de 1999. En dicho informe se planteaba la autorización, bajo condiciones estrictas, de realizar investigaciones con embriones in vitro, poniendo de relieve la necesidad de encontrar un nuevo punto de equilibrio entre el respeto del comienzo de la vida que, en su acepción más estricta, conduce a la prohibición de investigar en el embrión in vitro, por un lado, y el derecho de las personas afectadas por enfermedades muy graves a que la investigación médica progrese de manera que pueda beneficiarles, por otro lado. Se trata –decía el Informe– de conciliar dos principios éticos esenciales. Dado que la creación de embriones para el único propósito de la investigación supondría un cambio radical con relación a los fundamentos de la propia ley francesa e iría en contra del Artículo 18 de la Convención Europea sobre los Derechos Humanos y la Biomedicina, el Consejo de Estado se inclina por autorizar la investigación solamente en embriones sobrantes de programas de FIV, argumentando que “la donación de embriones sobrantes para la investigación no parece contrario al respeto del ser humano con la condición de que la pareja que ha producido estos


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embriones consienta formalmente en esta donación”. En definitiva, dice el Informe que “aunque hay una diferencia de principio, que es conveniente señalar, entre el cese de la conservación y, por tanto, la ‘muerte natural’ del embrión y las investigaciones sobre el mismo que producirán su destrucción, parece posible dejar a los genitores, después de ser informados con precisión de las consecuencias de su decisión, la libertad de elegir entre cesar la conservación y realizar la investigación con sus embriones”. El Consejo de Estado también propone una vigencia de cinco años para su nueva propuesta. En Junio de 2001, se propuso en Francia un proyecto de ley en el que se autoriza la utilización de embriones sobrantes para ciertos tipos de investigación, pero se prohíbe la creación de embriones con los únicos fines de experimentación. En enero de 2002, la Asamblea Nacional francesa aprobó la denominada “ley de bioética” por amplia mayoría (325 votos a favor, 21 en contra y 151 abstenciones). En este contexto, me parece oportuno señalar el acierto de la ley francesa de 1994 de incluir el artículo que hace referencia a la revisión de la propia ley al cabo de un número prudencial de años (cinco en este caso), lo mismo que, por ejemplo, contempla la Convención Europea de Bioética sobre los Derechos humanos y la Biomedicina. Dados los progresos vertiginosos de la ciencia en Genética, Biología y Medicina es de desear que todas las normativas legales que les afecten incorporen su propia cláusula de revisión para que se puedan modificar o suprimir algunos de sus preceptos o incorporar otros nuevos. f) Alemania En Alemania, la legislación actual permite investigar con células troncales fetales, pero no con células troncales embrionarias. Sin embargo, la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), principal institución que suministra fondos para la investigación, propuso unas nuevas normas en las que se autorizaría la importación de células troncales embrionarias humanas. Finalmente, el Parlamento federal alemán aprobó en enero de 2002 la importación de células troncales, aunque con limitaciones. g) Reino Unido En el ámbito europeo, el Reino Unido es el más permisivo por cuanto autoriza la creación de embriones humanos con fines de investigación aunque con determinadas normas de autorización y seguimiento.

IV. ASPECTOS CIENTÍFICOS, ÉTICOS Y LEGALES DE LA CLONACIÓN HUMANA NO


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V. REPRODUCTIVA: AYER LA OVEJA, HOY EL PASTOR Tal como se indicaba anteriormente, una tercera alternativa para la obtención de células troncales embrionarias es a partir de la MCI de embriones somáticos obtenidos por técnicas de clonación mediante transferencia de núcleos: método idóneo para evitar el rechazo inmunológico del trasplante al facilitar un posible autotrasplante. Este sería el caso de la aplicación de la técnica de clonación no reproductiva con fines terapéuticos5. Se trata, por tanto, de transferir el núcleo de una célula somática diferenciada al citoplasma de un ovocito previamente enucleado, convirtiéndolo así en el equivalente de un cigoto que puede iniciar un proceso de desarrollo embrionario normal. Sin embargo, el destino de este embrión no es el de ser transferido al útero de una mujer para dar lugar tras la gestación al nacimiento de un individuo clónico de la persona a quien perteneciera la célula somática donadora del núcleo, sino el de mantenerlo en el laboratorio durante un tiempo máximo de catorce días a partir del momento de la transferencia del núcleo y utilizar sus células troncales pluripotentes para tratar de establecer en el laboratorio determinados cultivos de tejidos. Es fácil imaginar lo que supondría para un paciente poder ser trasplantado con su propio tejido (u órgano si fuera posible), evitando cualquier problema de rechazo inmunológico. Aspectos científicos Entre la multitud de artículos periodísticos que se escribieron en febrero de 1997 con ocasión de la noticia de la existencia de la oveja Dolly, uno (cuyo autor lamento no recordar) llevaba por título “Hoy la oveja, mañana el pastor”. Pues bien, el 26 de noviembre de 2001, Cibelli y colaboradores (2001) publicaban en la revista The Journal of Regenerative Medicine un artículo en el que describían la obtención de tres embriones humanos mediante la técnica de transferencia nuclear

5 Clonación reproductiva: La que se utiliza para obtener individuos clónicos

entre sí o con un progenitor.

Clonación no reproductiva: La aplicación de técnicas de clonación en cultivos celulares o en embriones preimplantatorios sin intención de producir un individuo clónico vivo sino con objeto de establecer cultivos de tejidos -y si fuera posible de órganos- a partir de células troncales del embrión o células ES que son células inmaduras con capacidad de autorregeneración y diferenciación. Tales cultivos pueden ser establecidos con fines de investigación básica o clínica en la reparación de tejidos u órganos dañados, en cuyo caso algunos la denominan clonación terapéutica.


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(TN), lo cual permitiría titular un nuevo artículo periodístico como “Ayer la oveja, hoy el pastor”. En la siguiente tabla se resumen los resultados obtenidos por Cibelli y colaboradores:

Mujer donador

a∗

Tipo de célula

Huevos reconstruidos (cigotos)

Estadio de pronúcleos

Embriones que inician las divisiones celulares

3 Fibroblasto 2 0 0 4 Fibroblasto 5 4 (80 %) 0 5 Fibroblasto 4 3 (75 %) 0 6 Cumulus∗∗ 5 3 (60 %) 3 (100 %)∗∗∗

7 Cumulus 3 1 (33 %) 0 Total: 19 11 (58 %) 3 (27 %)

∗ Los números representan la clave de identificación utilizada por el laboratorio ∗∗ Cumulus oophorus: Masa de células epiteliales del ovario que sobresale en la cavidad de los folículos de Graaf y rodea a los ovocitos. ∗∗∗ Los tres embriones solamente llegaron a alcanzar el estadio de 6 células Como se indica en la tabla anterior, se hicieron un total de 19 transferencias de núcleos procedentes de fibroblastos obtenidos por biopsia de piel o de cumulus oophorus pertenecientes a cinco mujeres que actuaban asimismo como donantes de los ovocitos enucleados a cuyo citoplasma se transferían los respectivos núcleos en un intento de obtener embriones somáticos que produjeran células troncales autólogas. Sin embargo, el resultado puede interpretarse más como un fracaso que como un éxito ya que los tres embriones somáticos obtenidos no pasaron del estadio de seis células. Este intento de obtención de embriones humanos por transferencia nuclear puede ser comparado de alguna manera con lo sucedido en octubre de 1993 cuando Hall y Stillman hicieron públicas en un congreso de la American Fertility Society y de la Canadian Fertility and Andrology Society que tuvo lugar en Montreal sus investigaciones sobre la clonación de embriones humanos por gemelación (Hall et al., 1993). El experimento de Hall y colaboradores puso de manifiesto que se podía saltar la barrera ética en la manipulación de embriones humanos.

Aspectos éticos


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Dentro de la clonación no reproductiva, parece claro que no podría ponerse reparo ético alguno a la simple utilización de la técnica de transferencia de núcleos en cultivos de células humanas en un intento de establecer directamente un cultivo de tejidos y –si fuera posible– de órganos. Sin embargo, la obtención de un embrión artificial por transferencia de núcleo a un ovocito enucleado plantea el problema ético de haber creado un embrión somático humano que ha de ser destruido para poder establecer los cultivos celulares deseados a partir de las células troncales de la MCI. Con la denominación embrión somático se quiere poner de manifiesto su origen mediante la técnica de clonación por transferencia de núcleo, que es diferente a la fecundación de gametos que da lugar al embrión normal (embrión gamético). Desde el punto de vista ético habría que plantearse la cuestión de si el estatuto del embrión somático es igual al estatuto del embrión gamético. En relación con la técnica de clonación no reproductiva cabría preguntarse si el núcleo de la célula diferenciada que se transfiere es totipotente o solamente pluripotente. La diferencia es importante porque en el segundo caso el embrión somático producido no podría originar el trofoblasto y, en consecuencia, no podría decirse que el embrión somático es totalmente equivalente al embrión gamético al no poder desarrollar un proceso de gestación normal. Utilizando este argumento, algunos autores concluyen que el embrión somático no debe ser considerado como un embrión sino como un derivado de un cultivo de células troncales. No obstante, los experimentos de clonación por transferencia de núcleos de células diferenciadas realizados con éxito a partir de 1997 en la oveja “Dolly” y en otras especies de mamíferos (vaca, cabra, cerdo y ratón) parecen indicar que lo mismo sucedería en la especie humana, por lo que habría que aceptar que los embriones somáticos son de la misma naturaleza que los embriones gaméticos y, por tanto, deben compartir el mismo estatuto. Recientemente, en noviembre de 2001, se produjo un hecho en el Reino Unido que merece la pena ser considerado en este contexto. Se trata de la actuación legal de la asociación pro-vida ProLife Alliance que recurrió la ley que permitía la clonación terapéutica humana argumentando que el embrión somático no estaba amparado por la ley de 1990 sobre “Fertilización Humana y Embriología” (Human Fertilisation and Embryological Act) ya que, a juicio de los querellantes, no son equiparables los embriones obtenidos por transferencia de núcleo (embrión somático) y los obtenidos por fecundación entre gametos (embrión gamético). Puesto que el magistrado Crane del Tribunal Superior de Justicia les ha dado la razón, habría que inferir que puesto que biológicamente ambos tipos


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de embrión no son equiparables, tampoco lo deberían ser desde el punto de vista ético y, si esto es así, significaría, en mi opinión, que la demanda habría tenido un “efecto boomerang” contra la asociación pro-vida ya que deja en entredicho el valor ético de los embriones somáticos. Aspectos legales Desde el punto de vista de las declaraciones institucionales y de la normativa legal hay que decir que tanto la Declaración Universal de la UNESCO sobre el Genoma Humano y los Derechos Humanos de 11 de noviembre de 1997 en su Artículo 11 “No deben permitirse las prácticas que sean contrarias a la dignidad humana, como la clonación con fines de reproducción de seres humanos” como la Convención Europea sobre los Derechos Humanos y la Biomedicina en el Artículo 1.1 de su Protocolo Adicional de 12 de enero de 1998 “Se prohíbe toda intervención que tenga por finalidad crear un ser humano genéticamente idéntico a otro ser humano vivo o muerto” condenan y prohíben, respectivamente, la clonación reproductiva, pero no hacen alusión a la clonación no reproductiva. Es importante resaltar que cuando se afirma que las declaraciones anteriores no aluden a la clonación no reproductiva se está aceptando implícitamente que en las expresiones “clonar un ser humano” o “crear un ser humano” se excluye al embrión humano preimplantatorio (de menos de catorce días) porque no es todavía un ser humano. Esta es una cuestión que se viene debatiendo desde hace muchos años en foros interdisciplinares. Por su parte, la Directiva Europea relativa a la protección jurídica de las invenciones biotecnológicas (31 de julio de 1998) prohíbe patentar la clonación reproductiva como contraria a la moral y al orden público (Art.6). a) Estados Unidos: En Estados Unidos, en Junio de 2001, la administración Bush indicó su apoyo a la más restrictiva de los dos proyectos de ley sobre clonación propuestas: la “Human Cloning Prohibition Act 2001” y la “Cloning Prohibition Act of 2001”. Aunque en los dos proyectos de ley se prohíbe la clonación reproductiva humana, en la primera, además, se prohíbe prácticamente cualquier uso de la técnica de clonación por transferencia de núcleo, mientras que en la segunda se autorizaría la


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clonación no reproductiva. Efectivamente, en Agosto de 2001, la Cámara de Representantes del Congreso, tras 6 horas de discusión, aprobó (por 265 votos a favor y 162 en contra) la “Human Cloning Prohibition Act 2001” que prohíbe cualquier forma de clonación humana, tanto la reproductiva como la no reproductiva. Una enmienda al proyecto, que hubiera permitido la clonación terapéutica, fue rechazada por 251 votos contra 176. Para que el proyecto se transforme en ley tiene que ser aprobado en el Senado donde dominan los demócratas que tienen una posición más favorable hacia la utilización de la clonación como técnica de investigación (clonación no reproductiva). Todavía, a la fecha de escribir este texto (Julio de 2002), sigue sin pronunciarse el Senado debido, entre otras razones, a las fuertes presiones de uno y otro signo que se están produciendo. Parece ser que, finalmente, el Senado va a optar por establecer una moratoria de dos años en lugar de someter a votación las propuestas a favor o en contra de prohibir la clonación en cualquiera de sus formas. En este contexto, podíamos preguntarnos si la publicación por parte de la compañía Advanced Cell Technology de la investigación antes mencionada (Cibelli et al., 2001) en la que se habían obtenido tres embriones humanos por transferencia nuclear no fue sino un acto de fuerza ante la sociedad y el Senado norteamericanos para presionar a este último cuando tenga que ratificar o no el acuerdo previo del Congreso como diciendo: ¿cómo atreverse a prohibir algo que ya está prácticamente conseguido? Quizá esta impresión viene corroborada por el hecho de que dos científicos (el neurobiólogo francés Marc Peschansky y el norteamericano John Gearhart experto en células troncales) miembros del Comité Editorial de la revista The Journal of Regenerative Medicine dimitieron al considerar que el artículo publicado describía más bien un intento que fracasó y que la publicación debería haber sido pospuesta. b) Comunidad Europea En la Comunidad Europea las normas legales varían de unos países a otros. Una vez más, el Reino Unido destaca por su permisividad. Así, el Parlamento inglés aprobó la clonación de embriones humanos con fines terapéuticos en Diciembre del año 2000. Por el contrario, el Parlamento Europeo votó (septiembre 2000) en contra de la clonación terapéutica. También, por su parte, el Grupo Europeo de Ética en Ciencia y Nuevas Tecnologías (noviembre 2000) recomendó prudencia y precaución, concluyendo que era prematura la creación de embriones somáticos por transferencia nuclear.


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Ya en un apartado anterior se ha indicado que el Parlamento Europeo no se ha pronunciado aún de forma oficial sobre la clonación terapéutica humana porque la discusión del tema se había encargado a una Comisión que elaboró el denominado Informe Fiori sobre “Genética Humana en la Medicina Moderna”, pero dicho informe fue rechazado por el Parlamento Europeo a finales de noviembre de 2001. En la distribución de fondos europeos para la investigación dentro del VI Programa Marco para Investigación y Desarrollo, el Parlamento Europeo decidió que no se subvencionarán proyectos que impliquen la creación de embriones humanos con fines de investigación ni la clonación humana terapéutica no reproductiva ni, por supuesto, la clonación reproductiva. c) España En España, la Ley 35/1988 sobre Técnicas de Reproducción Asistida prohíbe la experimentación con embriones viables así como la obtención de embriones con fines distintos a la reproducción. Por otro lado, la situación legal respecto a la clonación es la siguiente: Aunque el Código Penal (1995) declara punible en su Art. 161.2 “... la creación de seres humanos idénticos por clonación u otros procedimientos dirigidos a la selección de la raza” y, además, España firmó el Convenio Europeo sobre los Derechos Humanos y la Biomedicina (Convención de Oviedo, 1997) y su Protocolo Adicional, en cualquier caso tales prohibiciones no incluyen a la clonación no reproductiva. Sin embargo, dado que la técnica de clonación no reproductiva considerada implicaría la producción de un embrión cuyo destino no es la procreación, parece lógico aceptar que le sería aplicable, por analogía, el Art.161.1 del Código Penal que castiga a “... quienes fecunden óvulos humanos con cualquier fin distinto a la procreación humana” si se acepta, como se señalaba anteriormente, la equivalencia de los embriones somáticos y los embriones gaméticos. d) Reino Unido En el Reino Unido, el Gobierno aprobó en Agosto de 2000 una ley que autorizaba la clonación humana no reproductiva y que el Parlamento británico ratificó en diciembre de 2000. Sin embargo, como ya se ha mencionado anteriormente, ante una impugnación presentada por el grupo ProLife Alliance, un juez anuló dicho acuerdo parlamentario aceptando la argumentación presentada que se basaba en que, al no ser homologables los embriones somáticos con los embriones gaméticos, no se podían acoger aquellos a la ley británica de 1990 que justificaba la investigación con células troncales embrionarias (de embriones gaméticos). Sin embargo, en enero de 2002, el Tribunal de


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Apelación ratificó la decisión del Parlamento, argumentando que el espíritu de la ley incluía los embriones clonados porque si el Parlamento hubiera conocido la técnica de clonación en 1990 −que es cuando se aprobó la ley (Human Fertilisation and Embryology Act)− la hubiera incluido en la legislación que controla la investigación y utilización de los embriones. Finalmente, el 27 de febrero de 2002, la Cámara de los Lores (Cámara Alta del Parlamento Británico) aprobó la clonación de embriones humanos con fines terapéuticos aunque bajo estrictas normas de control. V. CÉLULAS TRONCALES ADULTAS PROCEDENTES DE TEJIDOS U ÓRGANOS ADULTOS (CÉLULAS AS)6 En cualquier caso, hay que tener presente la noticia esperanzadora de que podría ser innecesaria la utilización de la clonación no reproductiva si llegan a hacerse una realidad clínica los datos experimentales que vienen produciéndose de un año a esta parte que parecen indicar la posibilidad de establecer los cultivos de tejidos a partir de células AS (por adult stem cell) que están presentes en los propios órganos adultos. Esto evitaría cualquier problema ético y legal puesto que la manipulación sólo afectaría a las células somáticas del organismo humano sin necesidad de crear un embrión. (Véase el informe de los National Institutes of Health, 2001). En el proceso de desarrollo normal del organismo adulto tiene lugar un proceso continuado de división celular para mantener constante el número de células diferenciadas de determinados tejidos que están sometidos a un desgaste natural (daño, enfermedad o muerte celular). Las células que tienen un elevado ritmo de recambio (turnover) son reemplazadas a través de un proceso regulado de proliferación, diferenciación y muerte programada (apoptosis).Tal es el caso, por ejemplo, de las células troncales hematopoiéticas de la médula ósea y de las células epiteliales de la piel o del intestino delgado. Estos tejidos contienen subpoblaciones de células troncales encargadas de reemplazar a las células diferenciadas de corta vida. En algunos tejidos u órganos puede haber células troncales capaces de reactivar su programa genético como respuesta a determinadas señales de estimulación y dar lugar a alguno, pero no todos, de los

6 Células troncales adultas (células AS): Células indiferenciadas presentes en tejidos diferenciados que son capaces de renovarse a sí mismas y a la vez dar lugar a una célula de cualquiera de los tipos celulares diferenciados del tejido del que proceden.


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linajes celulares posibles. Es decir, se trataría de células multipotentes con un grado potencial de diferenciación inferior al de las células pluripotentes. Tal podría ser el caso de las células troncales neurales y de las células troncales del mesénquima. Estas últimas pueden proliferar como células indiferenciadas, pero tienen la capacidad de dar lugar a diversos tejidos del mesénquima, tales como el hueso, cartílago, tendón, músculo y estroma de la médula ósea. Las células troncales neurales están siendo objeto de intensos estudios para el tratamiento mediante trasplante celular de enfermedades neurodegenerativas (trasplante de tejido fetal a cerebros adultos dañados), incluso se pueden modificar genéticamente o inducir la expresión de determinados genes antes de realizar el trasplante al paciente. Tal sería el caso de seleccionar células estimuladas para producir dopamina en tratamientos de la enfermedad de Parkinson. Por otro lado, en 1999, Vescovi y colaboradores (Bjornson et al., 1999) demostraron en ratón que células troncales neurales –células multipotentes precursoras de las neuronas, los astrocitos y los oligodendrocitos- podían transformarse en células troncales hematopoiéticas. Es interesante mencionar que en el año 2001 se anunció que el grupo de trabajo de PPL Therapeutics, la misma empresa que colaboró en la obtención de la oveja Dolly, había logrado en vacas obtener células de corazón a partir de células epiteliales y que se había solicitado la patente del método. No hay duda que este tipo de resultados es esperanzador pensando en su posible aplicación en la especie humana. El informe de los National Institutes of Health (2001) resumía el conocimiento sobre las células AS en los siguientes términos: • Las células AS pueden proliferar sin diferenciarse durante un largo período de tiempo (característica conocida como “autorrenovación a largo plazo”), pudiendo dar lugar a células maduras con formas características y funciones especializadas. • Algunas células AS tienen la capacidad de diferenciarse en otros tejidos diferentes a aquél del que proceden (plasticidad) • Las células AS son raras, difíciles de identificar y de origen desconocido. Los métodos actuales de caracterización están basados en la determinación de marcadores de superficie celular y sus patrones de diferenciación in vitro.


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• Hasta la fecha, los datos científicos indican que se han obtenido células AS a partir de cerebro, médula ósea, sangre periférica, pulpa dental, cuerda espinal, vasos sanguíneos, músculo esquelético, epitelios de la piel y del sistema digestivo, córnea, retina, hígado y páncreas; es decir, se han encontrado células AS en tejidos derivados de las tres capas germinales embriónicas. • Las células troncales hematopoiéticas de médula ósea son las más estudiadas y utilizadas en aplicaciones clínicas de trasplante de médula ósea para reparación del tejido sanguíneo y componentes del sistema inmune. En la médula ósea y en la sangre se han identificado además, por lo menos, otras dos poblaciones de células AS. • Varias poblaciones de células AS se han identificado en el cerebro, especialmente en el hipocampo, aunque su función es aún desconocida. La proliferación y diferenciación de las células AS del cerebro dependen de varios factores de crecimiento. • Se han descrito células AS en otros tejidos (muscular, sanguíneo, adiposo) que muestran plasticidad, pero hay poco información todavía sobre la posibilidad de ser clonadas. • Hay pocos experimentos que demuestren que las células AS generen células maduras y plenamente funcionales capaces de restaurar in vivo las funciones perdidas. • Junto a estos datos positivos habría que agregar otros tantos interrogantes todavía pendientes de solucionar. No obstante, el reto merece la pena por cuanto sería una forma de obviar los problemas éticos de esa terapia celular que demandan a gritos la sociedad y la comunidad científica. En la investigación el éxito puede depender de disponer de la financiación necesaria. Estoy seguro que si se invirtieran grandes cantidades de dinero en esta problemática se alcanzaría el éxito. Por eso, son bienvenidas las medidas económicas que la Comunidad Europea propugna para el VI Programa Marco de Investigación y Desarrollo (2002-2006), según anunció el responsable comunitario, el Comisario Philippe Busquin, coincidiendo con las recomendaciones del European Group on Ethics in Science and New Technologies (2000). En este mismo sentido, el Presidente Bush anunció en su intervención televisada antes mencionada la inversión de 250 millones de dólares de fondos federales para la investigación de células troncales adultas de cordón umbilical, placenta y otros tejidos humanos y animales.


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Muy recientemente, se ha publicado en la revista Nature (4 de julio de 2002, “Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow”) un artículo referente a células troncales adultas que merece un comentario. Se trata de la investigación realizada por un grupo de investigadores de la Universidad de Minnesota, dirigidos por la Dra. Catherine M. Verfaillie, en la que se demuestra que células troncales adultas de ratón procedentes de la médula ósea (células del mesénquima) tienen muchas de las características de las células troncales embrionarias (Jiang et al., 2002). En la primera parte de la investigación, se tomaron células del mesénquima de la médula ósea de ratón y se marcaron genéticamente con un gen “chivato” que produce fluorescencia azul. Algunas de estas células (entre 1 y 12) se inyectaron en embriones tempranos, comprobándose que en algunos casos los individuos quiméricos que se desarrollaron mostraban el marcador fluorescente hasta en un 45 % de sus tejidos, lo cual demuestra la versatilidad (pluripotencia o multipotencia) de las células troncales adultas originarias. En la segunda parte del experimento, Verfaillie y colaboradores inyectaron en un ratón adulto las células mesenquimales genéticamente marcadas y 24 horas más tarde comprobaron que estaban creciendo colonias de tales células en diversas partes del ratón, especialmente en intestino, pulmón e hígado. No cabe duda que este tipo de resultados experimentales ponen de manifiesto que no son infundadas las esperanzas depositadas en la utilización de las células troncales adultas en la terapia celular del futuro. No obstante, en un afán de mantener un equilibrio científico, la revista Nature publicó, junto al artículo que de alguna manera abre nuevas perspectivas respecto a las células troncales adultas, otro artículo de Ron McKay y colaboradores (Kim et al., 2002) en el que se demuestra que células troncales embrionarias de ratón funcionan en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. VI. CÉLULAS TRONCALES A PARTIR DE EMBRIONES PARTENOGENÉTICOS En el mismo artículo científico, Cibelli y colaboradores (2001) describían otros resultados experimentales que pasaron desapercibidos a los medios de comunicación, cegados sin duda por el tema de la clonación, y que yo considero de mucha importancia por lo que significan: me refiero a la obtención de seis embriones humanos


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partenogenéticos7 que llegaron a alcanzar una fase de desarrollo en la que se había iniciado la formación de la cavidad del blastocele8. Es importante resaltar que los embriones partenogenéticos avanzaron en su desarrollo más que los embriones somáticos obtenidos por transferencia nuclear. Los resultados obtenidos se incluyen en la siguiente tabla:

Mujer donadora∗

Número de

ovocitos

Pronúcleos Embriones con fase de división iniciada

Embriones con blastocele

1 5 4 (80 %) 4 (80 %) 0 2 14 13 (93 %) 13 (93 %) 4 (31 %) 6 3 3 (100 %) 3 (100 %) 2 (67 %) Total: 22 20 (90 %) 20 (90 %) 6 (30 %)

∗ Los números representan la clave de identificación utilizada por el laboratorio La obtención de embriones partenogenéticos en mamíferos de laboratorio como son los ratones se está intentando desde hace muchos años, pero hasta ahora los embriones obtenidos no han llegado a completar un desarrollo normal. El día que se dé con la técnica adecuada volverá a suceder como con lo ocurrido a partir de la oveja Dolly: la posible aplicación de la misma técnica en la especie humana. El que se haya publicado este trabajo científico de inducción de embriones humanos partenogenéticos por activación de ovocitos supone otro intento más de romper la barrera de los límites permitidos de la investigación. En cualquier caso, la publicación no dice si los embriones partenogenéticos obtenidos eran haploides o diploides (ver la nota 7 a pie de página). Para que sean de utilidad deben ser diploides porque si no las células troncales de su masa celular interna sería haploides y, por tanto, sin valor para una posible terapia celular.

7 Partenogénesis: En general, tipo de reproducción unisexual en el que las hembras originan descendencia sin fecundación por los machos. En animales, y por tanto aplicable a la especie humana, consiste en la producción de un embrión a partir de un gameto femenino no fecundado: • Partenogénesis haploide: El individuo formado sólo tiene un juego de

cromosomas (n) porque el gameto femenino de que deriva era de cons-titución cromosómica normal haploide.

• Partenogénesis diploide: El individuo formado tiene el numero cromosómico normal de la especie porque deriva de un gameto femenino “no reducido”; es decir, de constitución cromosómica diploide (2n).

8 Blastocele: Cavidad interior del blastocisto.


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Finalmente, es necesario aclarar que la inducción de la partenogénesis humana podría ser catalogable dentro de las técnicas de reproducción, pero no equiparable a la clonación porque el genotipo de los individuos así producidos no sería igual al de la madre en ninguno de los casos teóricos posibles de partenogénesis haploide y muy probablemente en el caso de la partenogénesis diploide. Por otro lado, y siempre hablando en términos teóricos, solamente podrían tener cierta posibilidad de desarrollarse las hijas partenogenéticas diploides porque en especies animales, a diferencia de las vegetales, la haploidía es un fenómeno muy infrecuente al afectar gravemente a la viabilidad de los individuos. En cualquier caso, la ley española 35/1988 de Técnicas de Reproducción Asistida considera como “infracción muy grave” la inducción de la partenogénesis [Art. 20.2B) m)]. En este contexto es importante hacer referencia al trabajo publicado recientemente (1 de febrero de 2002) en la revista Science por Cibelli y colaboradores (2002) en el que inducían en un macaco (Macaca fascicularis) la formación de 28 embriones partenogenéticos a partir de 77 ovocitos, llegando a alcanzar cuatro de ellos el estadio de blastocisto. Puestas en cultivo las células pluripotentes de su masa celular interna llegaron a obtener una línea celular estable que mantuvo su estado indiferenciado durante más de 10 meses y posteriormente fueron capaces de inducir la diferenciación de tejido neural (astrocitos y neuronas), células similares a cardiomiocitos con capacidad de latir espontáneamente, células de tejido muscular liso, adipocitos y epitelio ciliado. Ante este espectacular resultado, uno se pregunta si se volverá a repetir el caso de la oveja Dolly con un nuevo artículo periodístico que, en este caso, sería: “Hoy ‘Chita’, mañana Jane”, aludiendo a la compañera de Trazan, y quién sabe si dentro de unos años se publicaría otro artículo con el título .”Ayer ‘Chita’, hoy Jane” VII. EPÍLOGO Ante la afirmación de que “la Ciencia es imparable” cabe hacer dos lecturas: una, que el progreso científico es continuo y todos lo saludamos; otra, esta vez peyorativa, es que la ciencia es imparable “porque los científicos no están dispuestos a parar”. Ciertamente hay muchos que dicen que querer impedir ciertos avances científicos es como querer “poner puertas al campo” porque “todo lo que se pueda hacer, se hará”. Frente a estas posiciones habría que recordar también aquellas otras que defienden que “el fin no justifica los medios” ni que “todo lo que es técnicamente posible, tiene por qué ser éticamente deseable”. Recientemente falleció Erwin Chargaff (1905-2002) cuyas famosas “reglas de Chargaff” (1950) −que establecían la equiproporcionalidad


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en la composición del ADN de las bases adenina y timina, por un lado, y guanina y citosina, por otro lado− fueron uno de los pilares que utilizaron Watson y Crick para llegar a proponer en 1953 el modelo estructural del ADN de la doble hélice. Chargaff fue siempre un científico muy crítico. Poco antes de morir, Chargaff había dicho que “hay dos núcleos que el hombre no debió haber tocado jamás: el núcleo atómico y el núcleo celular. Y la ingeniería genética va a traer consecuencias mucho peores que la energía atómica”. Con estas palabras recordaba, quizá, lo que Fred Hoyle −el también recientemente fallecido astrónomo de la Universidad de Cambridge− profetizó hace muchos años previendo el enorme poder que iba a tener la manipulación genética: “dentro de 30 años, los físicos nucleares, que sólo fabrican inofensivas bombas de hidrógeno, trabajarán en libertad mientras que los genéticos moleculares trabajarán detrás de alambradas eléctricas”. ¿Quién debe decidir? Hoy día estamos todos convencidos que la decisión de promocionar, permitir, desaconsejar o prohibir una determinada investigación debe ser tomada tras una deliberación seria realizada por los comités de bioética pertinentes que deben ser independientes, pluridisciplinares y pluralistas. En la deliberación hay que utilizar una contabilidad de doble entrada donde se analicen los pros y los contras, no sólo de hacer una determinada investigación sino también de no hacerla. También decía el aludido Erwin Chargaff que “¿quién podrá impedir la producción industrial de embriones humanos? ¿quién parará la emergencia de una poderosa industria biotecnológica? Veo en el horizonte –continuaba Chargaff– un gigantesco matadero, un Auschwitz molecular (su madre murió en ese campo de exterminio nazi) en el que enzimas y valiosas hormonas serán extraídas como si de dientes de oro se tratara”. No me gusta ser tremendista, pero no hay duda que afirmaciones como las que él hizo nos tienen que interpelar. En el comportamiento social se dan a veces situaciones incongruentes que no tienen fácil explicación. Por ejemplo, no comprendo que se gasten ingentes cantidades de dinero en armamento o que se destruyan excedentes de productos alimenticios cuando hay tanta gente que se muere de hambre. No comprendo que muchas veces los mismos colectivos que se declaran defensores de las plantas y los animales, y por tanto de la vida en la naturaleza, sean partidarios del aborto. Tampoco es comprensible la diferente acogida que han tenido, en su momento, en los medios de comunicación social dos temas relevantes de la investigación genética como son las plantas y los alimentos transgénicos, por un lado, y la clonación no reproductiva


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terapéutica humana, por otro. En el primer caso hemos vivido una intensa actividad contestataria de ciertos grupos de presión y de los medios de comunicación social, mientras que en el caso de la clonación humana terapéutica parece como si la sociedad diera por bueno lo que los científicos pueden hacer, sin plantearse que no todo lo que es técnicamente posible puede ser éticamente deseable. Se habla mucho de la problemática de la manipulación genética sin que percibamos que, en muchas ocasiones, detrás está la manipulación social. Lo mismo que hace unos años, en el fragor de la batalla del aborto, se utilizaban a veces películas terroríficas para defender la postura antiabortista, en el debate actual de la utilización o no de las células troncales embrionarias en la terapia celular también se han producido situaciones equiparables a la anterior (aunque de signo contrario) cuando se han llevado a personas afectadas por enfermedades que quizá pudieran ser curadas con dicha terapia para que comparecieran como testigos en los foros políticos de debate y con su presencia pudieran influir en los legisladores. VIII. BIBLIOGRAFÍA ASENSIO, M.; BOADA, M.; VEIGA, A.; BARRI, P.N. 2001. Opinión de las parejas sobre el futuro de sus embriones pasados 5 años de congelación. Prog. Obstet. Ginecol., 44:199-204. BIANCO, P.; ROBEY, P.G. 2001. Stem cells in tissue engineering. Nature, 414:118-121. BONGSO, A.; FONG, C.-Y.; NG, S.-C.; RATMAN, S. 1994. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Human Reproduction, 9: 2110-2117. BJORNSON, C.R.R.; RIETZE, R.L.; REYNOLDS, B.A.; MAGLI, M.C.; VESCOVI, A.L. 1999. Turning brain into blood: A hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science, 283: 534-537. CIBELLI, J.B.; KIESSLING, A.A.; CUNNIFF, K.; RICHARDS, C.; LANZA, R.P.; WEST, M.D. 2001. Somatic cell nuclear transfer in humans: Pronuclear and early embryonic development. The Journal of Regenerative Medicine, 2:25-31. CIBELLI, J.B.; GRANT, K.A.; CHAPMAN, K.B.; CUNNIFF, K.; WORST, T.; GREEN, H.L.; WALKER, S.J.; GUTIN, P.H.; VILNER, L.; TABAR, V.; DOMINKO, T.; KANE, J.; WETTSTEIN, P.J.; LANZA, R.P.; STUDER, L.; VRANA, K.E.; WEST, M.D. 2002. Parthenogenetic stem cells in nonhuman primates. Science, 295:819. CASADO, M ; EGOZCUE, J. (coord.) 2000. Documento sobre investigación con embriones. Observatori de Bioètica i Dret, Barcelona, 16 pp. COMISIÓN NACIONAL DE REPRODUCCIÓN HUMANA ASISTIDA. 1998. I Informe Anual. Ministerio de Sanidad y Consumo, Madrid,146 pp.


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COMISIÓN NACIONAL DE REPRODUCCIÓN HUMANA ASISTIDA. 2000. II Informe Anual. Ministerio de Sanidad y Consumo, Madrid (hecho público el 26 de noviembre de 2001). COMMITTEE ON THE BIOLOGICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS OF STEM CELL RESEARCH, NATIONAL RESEARCH COUNCIL AND INSTITUTE OF MEDICINE. 2001. Stem Cells and the Future of Regenerative Medicine. National Academy Press, Washington D.C., 59 pp. CONSEIL D’ÉTAT DE LA FRANCE. 1999. Les lois de Bioéthique: cinq ans aprés. (Étude adoptée par l’Assemblée générale du Conseil d’Etat le 25 novembre 1999), pp. 26-31, 151-153. DONOVAN, P.J. ; GEARHART, J. 2001. The end of the beginning for pluripotent stem cells. Nature, 414 :92-97. EUROPEAN GROUP ON ETHICS IN SCIENCE AND NEW TECHNOLOGIES. 2000. Adoption of an Opinion on Ethical Aspects of Human Stem Cell Research and Use. European Commission, 218 pp. GEARHART, J. 1998. New potential for human embryonic stem cells. Science, 282:1061-1062. JIANG, Y.; JAHAGIRDAR, B.N.-; REINHARDT, R.L.; SCHWARTYZ, R.E.; KEENE, C.D.; ORTIZ-GONZALEZ, X.R.; REYES, M.; LENVIK, T.; LUND, T.; BLACKSTAD, M.; DU, J.; ALDRICH, S.; LISBERG, A.; LOW, W.C.; LARGAESPADA, D.A.; VERFAILLIE, C.M. 2002. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature, 418:41-49. KIM, J-H.; AUERBACH, J.M.; RODRÍGUEZ-GÓMEZ, J.A.; VELASCO, I.; GAVIN, D.; LUMELSKY, N.; LEE, S-H.; NGUYEN, J.; SÁNCHEZ-PERNAUTE, R.; BANKIEWICZ, K.; McKAY, R. 2002. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson’s disease. Nature, 418:50-56. LACADENA, J.R. 1995. Consideraciones genético-biológicas sobre el desarrollo embrionario humano. En “Genética humana” (ed. C. Romeo Casabona), Universidad de Deusto, Fundación BBV, Diputación Foral de Bizkaia, Bilbao, pp.77-103. LACADENA, J.R. 2000. Embriones humanos y cultivos de tejidos: reflexiones científicas, éticas y jurídicas. Rev Der G Hum, 12:191-212. LACADENA, J.R. 2001. Células troncales humanas: Ciencia y ética. Moralia, 24:425-468. LACADENA, J.R. 2002. Células troncales embrionarias humanas: Fines y medios. En (J.J. Ferrer y J.L. Martínez, eds.) Bioética: un diálogo plural. Homenaje a Javier Gafo Fernández, S.J., Publicaciones Universidad Pontificia Comillas, Madrid, pp.117-152. LOVELL-BADGE, R. 2001. The future for stem cell research. Nature, 414:88-91. McLAREN, A.2001. Ethical and social considerations of stem cell research. Nature, 414:129-131.


33

NATIONAL BIOETHICS ADVISORY COMMISSION, USA. 1999. Ethical issues in human stem cell research (Volume I), Rockville, Maryland, U.S. Government Printing Office, XI+111 pp. NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, USA. 2001. Stem cells: Scientific progress and future research directions. 105 pp. + Appendix A – G. PEDERSEN, R.A. 1999. Células madre embrionarias en Medicina. Invstigación y Ciencia, 273: 64-69. PONTIFICIA ACADEMIA PARA LA VIDA. 2000. Declaration on the Production and the Scientific and Therapeutic Use of Human Embryonic Stem Cells. L’Osservatore Romano, 25 Agosto 2000, pp. 147-152. REYA, T.; MORRISON, S.J.; CLARKE, M.F.; WEISSMAN, I.L. 2001. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature, 414:105-111. SHAMBLOTT, M. J.; AXELMAN, J.; WANG, S.; BUGG, E. M.; LITTLEFIELD, J. W.; DONOVAN, P. J.; BLUMENTHAL, P. D.; HIGGINS, G. R.; GEARHART, J. D. 1998. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc.Nat.Acad.Sci., 95: 13726-13731. SOLTER, D.; GEARHART, J. 1999. Putting stem cells to work. Science, 283: 1468-1470. SOLTER, D.; GEARHART, J. 1999. ¿Células aptas para todo? Mundo Científico203: 18-20. SPRADLING, A.; DRUMMOND-BARBOSA, D.; KAI, T. 2001. Stem cells find their niche. Nature, 414:98-104. SURANI, M.A. 2001. Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance. Nature, 414:122-128. TEMPLE, S. 2001. The development of neural stem cells. Nature, 414:112-117. THOMSON, J. A.; ITSKOVITZ-ELDOR, J.; SHAPIRO, S. S.; WAKNITZ, M. A.; SWIERGIEL, J. J.; MARSHALL, V. S.; JONES, J.M. 1998. Embryonic stem cells derived from human blastocystes. Science, 282: 1145-1147. THOMSON, J. A.; MARSHALL, V. S. 1998. Primate embryonic stem cells. Current Topics in Development, 38: 133-165.


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STEM CELLS AND BIOETHICS9

Juan-Ramón Lacadena Genetics Department, Faculty of Biology Universidad Complutense, Madrid, Spain

The use of cell therapy, based on the transferal of cells or tissues to damaged tissues or organs, is one of the greatest hopes held by the Medicine of the future. The setting up of cell cultures of human tissue in the lab is at times difficult, and in certain specific cases even impossible. That is why from the clinical point of view the advancement brought about by the possibility of using techniques that would allow the obtention of any type of tissue cultures and, perhaps, of organs would be undeniable. Within this context, there can be no doubt that the use of stem cells10 can be fundamental. By stem cell it is understood any cell with the double capacity to divide itself endlessly, and to originate different types of specialized cells. In agreement with this latter capacity, stem cells can be tri-potent, pluri-potent and whole-potent considering their higher or lesser versatility or potentiality. There are various types of stem cells (embryonic, germinal embryonic, adult ones) whose efficacy in the setting up of tissue cultures in the lab and its ethical and juridical valuations are different. In this work reference will be made to embryo stem cells (ES cells) as well as to adult embryo stem cells (AS cells). 1. GENETIC AND BIOLOGICAL CONSIDERATIONS ON HUMAN EMBRYONIC DEVELOPMENT

9 This paper is based on other previous ones by the author (Lacadena, 2000, 2001, 2002). 10 Even though in colloquial language the term “mother cells” is used, I have chosen to use the term “célula troncal” as the most correct translation from the original English “stem cell.” In fact, in the Scientific Vocabulary of the Royal Academy of Exact Physical and Natural Sciences (3rd Spanish edition, 1996), the term “células tronco” is introduced as the synonym for “ce´lula pluripotencial” or “célula pluripotente”, but “célula madre” is not included. Likewise the Dictionary of the Spanish language of the Royal Spanish Academy (22nd edition, 2001) includes the term “célula troncal” while “célula madre” is defined genetically as the “cell that reproduces itself thus generating two or more daughter cells.”


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The vital human cycle begins as of an only cell – the zygote – formed by the fecundation of two gametes (ovum and spermatozoid) which, after the development process will lead to the generation of the wholesome adult individual who, upon reaching sexual maturity will, in his turn, produce gametes, thus starting out a new sexual reproduction cycle. In the human reproduction biological process four stages can be differentiated which represent quite different genetic and embryological steps, to which quite different ethical and juridical issues can be attached. Such stages are: 1) gametes� fecundation � zygote; 2) zygote � morula � blastocyst � nesting (?); 3) nesting � fetus; 4) fetus � birth. In Chart 1 the chronology of the in vivo human reproduction process is described; it must be well understood that the quantification of these processes must always be taken considering approximate figures with a certain degree of variation. Chart 1. IN VIVO FECUNDATION CHRONOLOGY TIME DEVELOPMENT STAGE 0 Fecundation, taking place at Fallopio’s tubes, originates the zygote or only initial cell with two masculine and feminine pro-nuclei. 36 hours Two-celled embryo (blastomeres) which initiate the rout towards the uterus. 60 hours Four-celled embryo 3 days Six-to-eight celled embryo. 4 days Morula. 16 cells (still whole potent) which conform a compact group. The division goes on up to 31-64 cells. It reaches the uterus and starts the implanting or nesting. 5 – 7 days Blastocyst. Cells continue dividing themselves until they reach an approximate number of 100, and they create a central cavity (blastocoel); an external cover is formed (trophoectoderm or trophoblast which will originate the placenta and other extra embryonic membranes) surrounding a group of some 20 to 30 cells


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which remain stuck to the inner wall (inner cell mass or embryo blast (?)). The ICM cells are pluri-potent. 14 days The blastocyst ends nesting. ICM originates the embryonic disc, of 0.5 diameter, and which contains some 2,000 cells. The primitive line (?) appears. 3rd week During the gastrulation process the bilaminar embryonic disc transforms itself into a trilaminar one (ectoderm, mesoderm, endoderm). The embryo grows up to 2.3 cms in length. The primords (‘), which will give origin to the main organs start appearing. End of the 8th week The embryo becomes a fetus, which already contains the practically completed design of the new individual. The first stage of the process presupposes a drastic change since it goes from the existence of two quite different realities – the gametes – to a new reality: the zygote. However, it is convenient to emphasize now to the aspect dealing with the continuity of the biological processes mentioned earlier. Even in this first stage, apparently much clearer regarding the problem-issue affecting the beginning of human life, we must also pinpoint the fact that the fecundation process is a long and complex one, as of the moment the spermatozoid enters the cytoplasm of the ovum (?) until the approximation of the male and female pro-nuclei and simultaneously they begin the mitosis of the first cellular division. The second stage (zygote � morula � blastocyst � nesting) is, in my opinion, and from the genetic point of view the most crucial regarding the problem of human reproduction, both in the aspect dealing with interception (for example, intrauterine devices, IUDs, or any other mechanism used to prevent implanting) as well as regarding the new assisted reproduction techniques that imply embryo manipulation (pre-implanting diagnoses, embryo selection, stem cells,) as it questions the individual-making process of the new human being (properties of unicity and unity, see Lacadena, 1995). As will be pointed out below, within the blastocyst (towards the 5th or 6th day) there starts an important differentiation process as there appear two well-differentiated cell trends: one, conforming the embryo blast, which will give origin to the embryo, and the other, the trofo-blast, which will originate the embryonic placenta. The blastocyst is the embryo in its development phase following the morula. It is composed of an outer cell coat (trofo ectoderm or trobo


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blast) with an inner cavity (blastocoel) and a group of cells attached to its inner wall which conform the embryo blast or inner cell mass (ICM). The future embryo will transform itself into an embryonic disk (which will give origin to the embryo itself), and into hypo blast, which will originate the amniotic ectoderm. As to the trobo blast, it does produce embryonic structures, but it will originate the corium which is the embryonic portion of the placenta. II. CELL THERAPY IN FUTURE MEDICINE: ENDS AND MEANS As I pointed out at the beginning of this paper, using cell therapy, based on the transferal of cells or tissues to the damaged cells or tissues is one of the greatest expectations for the medicine of the future (Medicina Regenerativa , see Committee on Biological and Biomedical Applications of Stem Cell Research, 2001). The setting up in the lab of cell cultures from human cells is sometimes difficult and, in some specific cases, even impossible. That is why from the clinical point of view we could not deny the advancement that it would mean to implement techniques that would allow the obtention of any type of tissue, and in some cases, of organ cultures. Within this context, there is no doubt whatsoever that the use of stem cells may end up being fundamental. Stem cells is to be understood as any type of cell that has the double capacity to divide itself limitlessly, and to originate as well different types of specialized cells. According to the second definition, stem cells can be whole potent, pluri potent and , multi potent when considering the highest or lesser versatility or potentiality, as they are defined below: Whole-potent cell. Stem cell with the capacity differentiate itself in the embryo and in the extra-embryonic tissues and membranes. Whole-potent cells contribute to all types of cells in an adult organism. This whole-potency is a cell’s functional capacity to originate a wholesome individual after a normal developmental process. An embryo’s whole-potent cells have the rather early capacity to differentiate themselves in extra membranes and embryonic tissues, within the embryo and in all the post-embryonic tissues and organs. Within the human embryo, it seems that only blastomeres are whole-potent up to the morula stage reaching 16 cells. Pluri-potent cell. Stem cell present in the earlier stages of embryonic development , and which can generate all types of cells in a fetus and in the adult. (some 200 different types of cells in the human organism), and which is capable of self-renovation. Pluri-potent


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cells, however, are not capable of developing themselves within a complete organism. Pluri-potency is a cell’s functional capacity to generate several different cell or tissue lineages. Embryo stem cells (ES) present in the inner cell mass of the human blastocyst are pluri-potent, but not whole-potent ones; that is, they are capable of originating different tissues or organs, but they cannot give way to the wholesome development of an embryo as they cannot produce the extra-embryonic membranes and tissues necessary for the gestation process. Nevertheless, it could happen that a pluri-potent cell from the inner cell mass could become a whole-potent one. Multi-potent cell. Stem cell found in adult tissues or organs, that has the limited capacity to reactivate its genetic program as an answer to some determinate stimuli which allow it to generate some, but not all, the different cell lineages. This multi-potency is a cell’s functional capacity to generate some, but not all, cell lineages. Some stem cells present in adult tissues or organs are multi-potent. Sometimes the term plasticity is used as the equivalent to multi-potency. There are several types of stem cells (embryonic, germinal embryonic, adult) whose efficiency in the generating of cultures of tissues in the lab, as well as their ethical and juridical valuations, are different. Recent updating on stem cells has been published in a series of articles in Nature magazine on 1 November, 2001 (Lovell-Badge, 2001); Donovan and Gearhart, 2001; Spradling et al, 2001; Reya et al, 2001; Temple, 2001; Bianco and Robey, 2001; Surani, 2001; McLaren, 2001). III. ETHICAL AND LEGAL ASPECTS ON THE USE OF STEM

CELLS FROM HUMAN EMBRYOS TO OBTAIN TISSUE CULTURES

Casado and Egozcue (2000) say that the embryonic period is no longer a stage towards reproduction, but that it can also be a life source for those already living, since the pluri-potent stem cells part of the blastocyst’s inner mass cell (IMC) can facilitate the generating of tissue cultures that can applicable in a clinical cell therapy (Bongo et al, 1994). Within the adult human organism it is estimated that there exist around 200 different types of cells whose origin can be retraced to pluri-potent stem cells. From the scientific point of view, the gist of the issue lies in getting to know which are the instructions that make a pluri-potent cell different regarding a determinate celular type.


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Embryo stem cells (ES cells) can be obtained from mainly three sources: * From the IMC of embryos produced by in vitro fecundation (IVF) whose only purpose is to obtain tissue cultures; * From the IMC embryos left over from IVF programs; * From somatic IMC embryos obtained through cloning techniques by means of nucleus transference : suitable method to avoid inmunological rejection to transplant by facilitating a possible self-transplant. This would be the case of the application of the non-reproductive cloning technique with therapeutical purposes. It has to do, therefore, with the transferal of a somatically differentiated cell’s nucleus to the cytoplasm of a previously nucleated oocyte, thus transforming it into the equivalent of a zygote that can start off a normal embryonic development process. However, this embryo’s destination is not to be transferred to the woman’s uterus in order to, after gestation, give birth to a clonic individual from the person to whom the donor somatic cell belonged, but to preserve it in the lab for a maximum period of time of fourteen days as of the moment of the nucleus transferal; and to use the pluri-potent stem cells in order to create in the lab certain tissue or organ cultures (this seems to be, presently, quite hard to achieve). It is quite easy to imagine what it would mean for a patient to be the subject of a transplant with his or her own tissue (or organ, were this feasible), thus avoiding any potential problem regarding inmunological rejection. 1. Ethical aspects In the first place, we would have to establish differences regarding the two issues regarding the origin of the embryos: that they may be produced ex profeso with such an objective by means of IVF; or that it has to do with left-over embryos11 from an IVF program. It is obvious, nonetheless, that in both cases the use of the IMC blastocyst’s cells are meant to be used in order to generate differentiated cell cultures, with the embryo’s implicit foregoing destruction.

11 The term “embriones sobrantes” [left-over embryos] is used following the terminology used by the Tribunal Constitucional Español [Spanish Constitutional Court], with its implying any derogative connotation whatsoever.. See Note 4.


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It is obvious that in order to cast ethical judgement on these situations, the starting point would be conditioned by the a priori valuation of the “embryo’s statute” regarding the first fourteen days of its development, when the properties of unicity ( to be unique and not repeatable) and unity (to be one only) which determine its individuality are taken into consideration. From the ethical point of view, it seems that the position of the majority opposes the creation of embryos with the purpose of their being used in the technique mentioned before. Yet, when it has to do with left-over embryos, the ethical pondering may vary even though, at no moment whatsoever, the starting point dealt with earlier regarding the embryo’s statute is to be forgotten. In my opinion, it would be better if the IVF programs were carried out without their producing left-over embryos, in such a manner that this priority would prevail over the one dealing with medical efficacy normally used. In some countries, such as Germany, the law orders to transfer to the maternal uterus all the embryos obtained. However, since in most of the cases this does not happen, the question is: which could be the destination of the left-over embryos in a IVF program? It is better, no doubt, that they be used by their own progenitors or, in the lack of this, that they be used by other couples should the law allow it ( a sort of “biological adoption,” not yet being considered by the Spanish juridical ordering, nor by any other countries). Since these alternatives have not helped avoid the existence of left-over embryos, the issue to be discussed is what to do with them: leave them out in the “limbo” of freezing for ever? Destroy them when the legally set deadlines expire? Use them in experiments or for therapeutical purposes? In the ethical valuation of this issue, we must keep in mind that it has to do with a decision between two possible alternatives: to destroy, due to the legal imperative, the embryo thus interrupting its cryo-preservation (the Spanish legislation establishes five year as the deadline), or to provoke its destruction by using it in basic or applied research, as can be the use of the pluri-potent cells of its IMC to set up specific tissue cultures. Many consider that to prefer the use of left-over embryos for purposes of research instead of to directly destroy them (“natural death” generated by the ending of their cryo-preservation is not considered incompatible with the respect and protection under any circumstances by the human embryo, thus guaranteeing the conditions and requirements of the development of research in agreement with the European Convention on Human Rights and Biomedicine. On the other hand, even though preserving distances, there are people who compare this situation with the one


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dealing with the experiment with terminal patients considering that the latter is about to die. In any case, we must always keep watch so we won’t fall into the fallacy of promoting left-over embryos in IVF programs thinking in the use of its SC cells later on. 2. Legal aspects The legal standing is different according to the countries, as it is indicated below: a) The United States In the United States, and by requirement from president Clinton, the National Counseling Commission on Bioethics, in its report Ethical Issues in Human Stem Cell Research (September, 1999) concluded that the utilization of federal funds for the use and derivation of embryo stem cells (ES cells) and embryonic germinal cells (EG cells) should be limited to two sources for such materials: the left-over cells from IVF programs, and the aborted fetuses, respectively. It was advised, on the contrary, not to promote federal funding for research on ES cells from embryos created by IVF whose sole purpose was their later experimental use, or of embryos obtained through cloning techniques by nucleus transferal to ovocites (somatic embryos). Even though the Committee’s recommendation refers exclusively to funding through federal moneys in this type of experimentation, the report nonetheless points out that it would be desired that the private institutions would follow the same norms proposed in it. However, with the new Bush government, the situation has been standing still even though the American Association for the Advancement of Science and the National Academy of Sciences supported the utilization of federal funds for research on human embryo stem cells. Pressure is high, both from the scientific community and from society itself. In any case, what is at play is whether the end justifies the means. On 9 August, 2001, president Bush sent a t.v. message to the whole country regarding the utilization of federal funds for the research on stem cells, and announced his decision not to subsidize such projects, not even for the ones that could utilize stem cells obtained in the private sector. Yet, he would allow the subsidizing of research carried out on the lines of embryo stem cells (ES) already established in world-wide laboratories since – in Bush’s words – “the decision on life or death had already been made.” That is, it is not a policy of


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consummated facts. In the beginning it was estimated that there are some 60 cells established lines, although some researchers lower the figure down to less than 30. Besides, president Bush announced the creation of a Council presided by bioethicist Leon Kass from Chicago University, to oversee the work on embryo stem cells, and to elaborate the corresponding norm. Similarly, the National Institute of Health (NIH) has elaborated a total record of 72 ES cell lines (even though some of them are subdivisions) that could be used in subsidized public funded research, setting up the 27 November, 2001, deadline for researchers to submit their requests. Such lines are kept in public and private centers around the world (four in the United States and the rest split out in Australia, Sweden, Israel and India). Nonetheless some of these ten centers say that not all of the lines recorded by the NIH meet the appropriate cell conditions to be considered as ES cell lines, lowering the figure down to up to 25. On the one hand, a National Academy of Sciences report made public in September, 2001, states that the number of set stem cells is insufficient for the adequate progress of research, requesting that the conformation of new cell lines be authorized. On the other hand, as it was expected, the fight for the obtention of such patents for such cell lines has already started – or it has greatly increased. It could be said that in the U.S. a double set of moral standards is considered in the sense that it is prohibited for ethical reasons to utilize federal funds for such types of research, but private funded research is authorized: if something is intrinsically wrong, it is so for the two situations. b) Canada In Canada, an ad hoc bioethics committee of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) has announced its support for the authorization of the use of left-over embryo stem cells from the FIV programs while, at the same time, it has forbidden the creation of embryos for research. c) The European Community In the European Community, the Group on Ethics in Science and New Technologies (2000) elaborated a report upon request from president Prodi where it opposes the creation of ex profeso embryos to use their ES cells, but favors the use of left-over embryos. But in the European Community, the situation is somewhat at loggerheads, as can be inferred from what is expressed below:


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From the beginnings of 2001, a Committee from the European Parliament has been working in order to study diverse aspects of “Human Genetics in Modern Medicine,” including issues such as research on stem cells and therapeutic human cloning. The report’s draft, known as Fiori Report on Human Genetics in Modern Medicine was somewhat conservative even though it kept a reasonable standing regarding the two issues mentioned earlier. Yet, its going through the parliamentary tract turned it into a “prohibition for everything” as a result of the 550 amendments submitted. In the final report that resulted of it it was forbidden not only any subvention using EU funding for research that implied the production of human embryos, but also “any other type of research that used human embryos.” Regarding cloning techniques (see below in the corresponding section) the final report stated that no distinction could be made between reproductive cloning techniques and non therapeutical reproductive one and, it went on arguing, that the only way to stop reproductive cloning was stopping also non reproductive therapeutic cloning. According to a commentator (J. Tizzard, [email protected], 133: 12 November, 2001), the Commission’s talks carried out by experts for months were the subject of piracy by those who had had nothing to do with such talks. Finally, in November 2001 the European Parliament rejected by ample majority the Fiori Report (316 votes against the report, 37 in favor and 47 abstentions). d) Spain In Spain, as it is stated in the 1998 First Annual Report of the National Commission of Human Assisted Reproduction (CNRHA for its Spanish acronym), it is estimated that there are over 25,000 frozen left-over embryos, out of which some percentage (around a 15%) have gone over the legal preservation limits (five years) and that, therefore, they should be destroyed due to legal imperatives. In October, 2001, the Commission of Science and Technology of Congressmen rejected with votes from the Popular and Convergence Party i Unió the proposal from the socialist parliamentary group to allow the use of stem cells of the FIV “left-over embryos” program. CNRHA itself elaborated a II Annual Report in the month of April of the year 2000 to discuss the issue of “left-over embryos”12 but, for

12 The term “leftover” has been taken from the Ruling from the 17 June, 1999, Constitutional Court on the constitutionality of Act 35/1988 on Human Assisted Reproduction Techniques. Even though in colloquial language it is substituted by the one of “supernumerary” embryos or other equivalents, it has been considered more adequate to reproduce in this report the term


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reasons unknown to the Commission itself, the said report was not formally received by the Administration until a year and a half later: on 26 November, 2001, its publication being simultaneously authorized then. Below are included the ethical and juridical reasons included in the Summary, as well as the Report’s conclusions or recommendations: Summary and conclusions [...] Ethical Aspects 7. From the ethical point of view, there is a general agreement among most of the countries’ members as to the establishment of the beginning of individuality as of the 14th day of the embryonic development. This valuation is based upon the consideration of some specific qualities of the embryo itself that are produced as of this date, which have been referred to in the previous section. The new biological findings regarding these first phases of the mentioned development have not questioned so far this general valuation, and there is the general consensus among most of the countries to support regulation regarding what is to be done with the embryos with the characteristics and deadlines mentioned above. 8. It is, likewise, considered that there is common agreement as to regard the embryo in these phases as a good that deserves special protection and valuation. On the contrary, there is no agreement as to the degree of respect and protection the embryo deserves in these phases which, for some social groups, must bear identical emphasis to the one required by any human being while, for others, it must be different. These differing valuations are also present within Spanish society. 9. The antagonistic character of some of the valuations mentioned among different points of view is one of the characteristics that has prevented so far, in whatever forum it has been proposed, to reach an agreement on the embryo’s nature and juridical standing. As a result, the solution to so many problems has not been reached as there has not been previous agreement on the issues mentioned.

coined by the Constitutional Court, which in any way refers to embryos resulting from the application of human assisted reproduction techniques that, however, will not be used in the reproduction of the same couple that generated them, so they are preserved frozen waiting for their destiny to be determined.


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The other possible way to approach these issues is to try to reach common minimum agreements among the various viewpoints and ideologies on concrete problems as they are being proposed. This type of agreements is only feasible through permanent debate in institutions and groups as the one created by this same Commission. In order to contribute to the solution of the problem of frozen embryos, the Commission has adopted the second of the methods mentioned, trying to reach the definition of some ethical criteria that be acceptable to a meaningful proportional majority of the Spanish society regarding this issue. 10. The Commission considers that the Spanish society shares the consideration of the embryo as a good to be protected, and whose protection must be kept in mind regarding actions to be carried out with them. However, a majority considers that this protection, which is not identical to the one required by the human being, is not violated if the possibility of research with the embryos that end up becoming “left over” is on assisted human reproduction techniques as the ultimate solution to their destiny, an alternative to the ceasing of their preservation. This alternative must be reached once their transferal is rejected, be this to its progenitor or to other women to whom it could be donated, with its parents’ consent [my italics], and through the control exerted by this National Commission, among whose function it is included the execution of these duties; and of local commissions in the centers where research is being carried out, whose mission is the verification and following up of precise requirements for this type of research. On the other hand, the research to which these embryos are subjected under the conditions already mentioned must have a relevant scientific character in order to be justified, and must lack any predominantly lucrative character, and all this must be controlled by the said committees and commissions. This consideration refers to in vitro embryos with fewer than 14 days of development as of their fecundation, excluding from this computation the time when the embryos have been frozen. And it ends up being compatible with the criteria by certain countries in our surrounding, and in the European Agreement on Biomedicine. Juridical Aspects 11. From the juridical point of view, the standing as to the feasibility of using embryos for research, under the conditions and limitations pointed out, changes in different countries. In any case, as a consequence of the new perspectives regarding research, it has to


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do with a debate in the heart of the European Union and in most of the neighboring developed countries. 12. In Spain, Act 35/1988, which becomes the legislation of reference, limits the possibility of research to non-viable embryos, and excludes any other type of research that does not have a diagnostic or therapeutical character with viable embryos. 13. The Commission has asked itself what procedure would be the most adequate to follow should we want to open the possibility to carry out research with “left-over” embryos under the conditions mentioned. One of the possibilities debated has been the interpretation of the concept if viability, with the understanding that an embryo is not viable in any case if it is not going to be implanted. To take this stand has as an inconvenience: that the term “viability” is a very precise concept under the biological point of view. The interpretation of the concept of viability by the Constitutional Court is, likewise, restricted to biological criteria, and the same can be deducted from the reading of some of the precepts of Act 35/1988 on Assisted Human Reproduction. On the other hand, if these constitutional sentences did not exist, it does not seem either that a way to interpreting terms such as the one we are dealing with, susceptible to theoretical debate, will provide those who should carry out such acts with sufficient practical parameters of legal safety. And, finally, an issue that is so relevant to society, and which affects the sensibility and criteria of so many a citizen, cannot be subtracted from the legislator’s most explicit sentencing . Because of these reasons, the Commission considers that, once the practice of the actions mentioned under an ethical point of view is accepted, the most adequate way of acknowledging such practices is to introduce such a possibility in the norms, modifying them through an express pronouncement by whom is a representative of the popular will, and establishing the conditions that are necessary to carry out these practices, in the sense in which they have been described, in a manner similar to the ones that are legally established in order to carry out research with non-viable embryos. 14. The recent ruling from the Constitutional Court regarding Act 35/1988, validated the constitutionality of the latter regarding the aspects dealing with embryo research, based on, among other reasons, the requirements set for non-viable embryo research, which suppose a guarantee for the protection to be given to the embryo, as of the basis that this type of embryo is different from the human


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being. Since Act 35/1988 excludes the possibility of research, except for the supposed diagnoses or therapies mentioned, with viable embryos, by proposing a legal modification that allows for research with them under a way conditioned to the fulfillment of established requirements, an explicit sentence from the Constitutional Court regarding the constitutionality of a norm such as this is not available. In spite of this standing, which can only be resolved by express sentencing if a norm such as the one mentioned is enacted, the Commission considers that there are sufficient elements of judgement so as to presume that, considering the repeated sentences by the Constitutional Court on embryo protection, and that the actions proposed would be in any case alternative to the destruction of the embryos to be found under the repeated circumstances already mentioned, the constitutionality of such a norm would be finally validated. 15. By proposing a modification of the legal norms in force as a contribution to solving the problem of frozen embryos, the Commission is aware that this solution depends on the adoption of the corresponding legislative decisions, putting aside the possibility that other alternatives could be considered, such as the one mentioned, of recommending a specific interpretation of the norms. The reasons for proposing such a solution have already been mentioned. However, the importance of the problem requires that the need to solve it be insisted upon, and that the decision to effect the legal modifications recommended in this report be carried out, as well as those proposed in last year’s report, and that they be implemented as soon as possible or, in any case, that within the same time limits other alternative solutions be proposed, and which the Commission has deemed not as recommendable,. to solve the mentioned issues Recommendation The majority of the members of the Commission of Assisted Human Reproduction considers that it is feasible to carry out research on “left-over” frozen embryos with the application of assisted human reproduction techniques, once the maximum preservation deadlines are reached, the conditions of informed consent and institutional control have been widely developed in other aspects, and with the establishment of guaranties for the protection of the embryo, referred to by the Oviedo Agreement.


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The Commission majority’s criterion is that an authorization must be made possible through a modification of the laws presently regulating this issue and, concretely, Act 35/1988, on Assisted Human Reproduction. This modification must become part of the modifications proposed by last year’s Report regarding other issues related to assisted human reproduction, which so far have not been implemented. Within the Spanish context, by with the possibility of its application to other environs, it could be interesting to study the data provided by the Instituto Universitario Dexeus de Barcelona on the opinion of couples regarding the future of their embryos once five years have passed after their freezing (Asencio et al, 2001). According to the study, in the Center there were 1,419 embryos belonging to 260 couples, which were over five years of cryo-preservation (643 embryos had been frozen from five to seven years; 428, from eight to nine years; 301, from ten to eleven years; and 47, from 12 to 13 years). From the 260 couples, 196 (75%) belong to embryos originated after IVF with their own gametes, and 64 (25%) with donated gametes (8% through the donation of oocytes and 17% from the donor’s semen). Of the 260 couples, surveys were sent to only 219 since 38 (14,6%) had unknown locations, and 3 (3%) did not agree to participate, as they stated so in previous phone conversation. Another additional datum is that the couples’ standing had changed in five cases: One through separation or divorce; one as it had a new partner; and three, as one of the spouses had died. In total, of the 260 couples part of the research, after four months, only 89 couples had answered the survey sent to them, with the following results: The couples’ opinion regarding legally established options: Would accept their own transferal 24 (27%) Would accept donating to a third party 29 (32.5%) Are not pleased with any legal option 28(31.5%) Provide discordant answers 7 (7.9%)


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Did not answer 1 (1.1%) Total 89 (100%) The couples’ opinion on alternatives presently not permitted by law: Yes No Discordant No answer Research 28% (31.5%) 51% (57.3%) 5 (5.6%) 5 (5.6%) Destruction 39% (43.8%) 37% (41.6%) 6% (6.7%) 7 (7.9%) At any time 18% (20.2%) Once the legal 21 (23.6%) Term expired Reason why the surveyed couples have not gone through transferal of frozen embryos: Satisfied with the present number of children 51 (57.3%) Do not wish children presently 8 (9.0 %) Medical problems as contraindications 8 (9.0%) Economic difficulties 6 (6.7%) Other circumstances 7 (7.9%)


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Couples’ discordant response 6 (6.7%) Did not answer 3 (3.4%) There is no need to comment on this work as the indicated results speak for themselves. During the Debate on the State of the Nation that took place on 16 July, 2002, in the Congress, a resolution from the popular government parliamentary group asking the Government to “support and prioritize research on adult stem cells” was approved. The Popular Party (PP), therefore, place a bet on research on adult stem cells confronting the standing of the Socialist Party (PSOE) which demanded research on embryo stem cells, calling the PP Government’s policy “old fashioned”. e) France In France, Act 94-654, 29 July, 1994, regarding the donation and usage of elements and products from the human body, and the medical assistance in prenatal reproduction and diagnosis forbade “ the in vitro conception of human embryos for the purpose of study, research or experimentation.” (Article L. 152-8). However, in Article 21, French law established that “ [...] it would be object [...] of new examination by the Parliament within the maximum time limit of five years, as of its being in force.” With such a purpose, the Council of State sent out a report on Les lois de Boiéthique: cong ans aprés, which was adopted by the Council of State’s General Assembly on 25 November, 1999. In the said report, the authorization, under strict conditions, to carry out research on in vitro embryos, was proposed, pointing out the need to find a new point of equilibrium regarding the beginning of life which, in its most strict definition, leads to the prohibition of researching on the in vitro embryo on the one hand, and the right of people suffering from very grave illnesses, on the other hand, so that medical research may advance in such a way that they can benefit from this. It has to do, said the report, with getting two essential ethical principles into agreement. Since the creation of embryos for the sole purpose of research would suppose a radical change regarding the foundations of the French law itself, and would go against Article 18 of the European Convention on Human Rights and Medicine, the Council of State is inclined to authorize the said research only on left-over embryos for research, part of IVF programs, with the argument that “the donation of left-over embryos for research does not seem opposed to the respect for the human being,


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with the condition that the couple who have produced such embryos formally consents to such donation.” All in all, the report states that “even though there is a difference in principle, which is convenient to pinpoint, between the embryo’s ceasing of preservation and, therefore, its “natural death” and the research on it, generated by its destruction, it seems possible to allow its progenitors, once they have been informed of the consequences derived from their decision, the freedom to choose from ceasing preservation, and carrying out research upon their embryos.” The Council of State also proposes a new time limit of five years for its new proposal. In June 2001, in France, a new proposal was made for a project of law to authorize the usage of left-over embryos for some types of research, but the creation of embryos for the sole purposes of experimentation was prohibited. In January, 2002, the French National Assembly approved the so-called “Bioethics Act” by a wide majority (325 votes in favor, 21 against, and 151 abstentions). Within this context, it seems to me that this is the time to pinpoint the wisdom of the 1994 French Act of including the article that refers to the revision of the act itself after a prudential number of years (five, in this case), as well as, for example, the European Convention on Bioethics views Human Rights and Biomedicine. Considering the surprising achievements of science in Genetics, Biology, and Medicine, it is to be wished that all legal regulations affecting them will add their new revision clause so that they can modify or suppress some of their precepts, or to incorporate some new ones. f) Germany In Germany, present legislation allows to do research on fetal stem cells, but not with embryonic stem cells. However, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), main institution that provides research funds proposed new norms through which the importation of human embryonic stem cells would be authorized. In the end the German parliament approved in January 2002 the importation of stem cells, even though subject to limitations. g) United Kingdom Within the European milieu, the United Kingdom is the most permissive country since it authorizes the creation of human embryos for research purposes even though with specific norms regarding authorization and following up.


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IV. SCIENTIFIC, ETHICAL AND LEGAL ASPECTS OF NON-REPRODUCTIVE HUMAN CLONING: YESTERDAY THE SHEEP, TODAY THE SHEPHERD As it was pointed out earlier, a third alternative for the obtention of embryonic stem cells is as of the ICM from somatic embryos obtained by the cloning techniques through nucleus transfer : a suitable method to avoid inmunological rejection of the transplant by facilitating a possible self-transplant. This would be the case of the application of the technique of non reproductive cloning for therapeutic purposes13. It has to do, consequently, with the transferal of the nucleus of a differentiated somatic cell to the cytoplasm of a previously nucleated one, thus turning it into the equivalent of a zygote that can start up a normal process of embryonic development. Yet, this embryo’s destiny is that will not be transferred to a woman’s uterus in order to, after gestation, give birth to a cloned individual from the subject to whom the donor somatic cell of the nucleus belonged, but to keep it in the nucleus, and to use its pluri-potent stem cells to try to set up in the lab determinate tissue cultures. It is easy to imagine what it would suppose for a patient to be able to be transplanted himself or herself with his or her own tissue (or organ if possible), avoiding any problem whatsoever of inmunological rejection. Scientific aspects Among the vast number of newspaper articles written in February 1997 related to the news of the existence of the sheep Dolly, one (whose author I regret not to remember) was titled “Today the sheep, tomorrow the shepherd.” Well, on 26 November, 2001, Cibelli and collaborators (2001) published in The Journal of Regenerative Medicine an article describing the obtention of three human embryos through the nuclear transfer (NT) technique, which would allow for titling a new newspaper article as “Yesterday the sheep, now the shepherd.”

13 Reproductive cloning: The one used to obtain individuals clonal between themselves or with one progenitor. Non reproductive cloning: The application of cloning techniques in cell cultures or in pre-implanted embryos without the intention to produce a live clonal individual for the purpose of setting up tissue cultures – and if feasible of organs – as of stem cells from the embryo or ES cells which are immature cells with the capacity for self-regeneration and differentiation. Such cultures can be established in for purposes of basic or clinical research to repair damaged tissues or organs, in which case some call it therapeutic cloning.


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In the following table the results obtained by Cibelli and collaborators are summarized: Donor Cell Reconstructed eggs Study of Embryos that start Woman Type Zygotes pro-nuclei cellular divisions a* 3 Fibroblast 2 0 0 4 Fibroblast 5 4 (80%) 0 5 Fibroblast 4 3 (75%) 0 6 Cumulus** 5 3 (60%) 3 (100%)*** 7 Cumulus 3 1 (33%) 0 Total: 19 11 (58%) 3 (27%) * The numbers represent the identification code by the laboratory. ** Cumulus oophorus: Mass of epithelial cells from the ovary that stands out in the cavity of Graaf’s follicles and surrounds the oocytes. *** The three embryos reached only the stage of six cells. As indicated in the table above a total of 19 transferals of nuclei were effected from fibroblasts obtained by skin biopsy or from cumulus oophorus belonging to five women who acted, likewise, as donors of the nucleated oocytes to whose cytoplasm the corresponding nuclei were transferred in an attempt to produce autologous (?) stem cells. However, the result can be interpreted more as a failure than as a success since the three somatic embryos obtained did not reach the stage of six cells. This attempt to obtain human embryos by nuclear transferal can somehow be compared to what happened in October 1993, when Hall


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and Stillman made public, in a congress of the American Fertility Society and the Canadian and Andrology Society that was held in Montreal, their research on the cloning of human embryos by gemelation (hall et al, 1993). Hall’s and his collaborators’ experiment made it evident that it was possible to jump over the ethical barrier regarding the manipulation of human embryos. Ethical aspects Within the boundaries of non reproductive cloning, it seems clear that no ethical restrain whatsoever can be placed as to the simple use of the nucleus transfer technique in human cell cultures in an attempt to directly set up a tissue culture and – if feasible – of organs. Nevertheless, the obtention of an artificial embryo by nucleus transfer to a nucleated oocyte poses the ethical problem of having created a human somatic embryo that has to be destroyed in order to set up the desired cell cultures as of the stem cells from the ICM. By naming it somatic embryo we mean to pinpoint its origin through the cloning technique by nucleus transferal, which is different from the gamete fecundation which leads to the creation of a normal embryo (gametic embryo). From the ethical point of view we would have to ask ourselves whether the statute of the somatic embryo is similar to the statute of the gametic embryo. Regarding the non reproductive cloning technique, it is worthwhile to ask if the nucleus of the differentiated cell that is transferred is toti-potent or only pluri-potent. The difference is important as in the latter case the produced somatic embryo would not be able to originate the trophoblast and, consequently, we could not say that the somatic embryo is the exact equivalent of the gametic embryo when the normal gestation process cannot take place in a normal way. Using this mode of argumentation, some authors conclude that the somatic embryo must not be considered as an embryo but as a derivative from a stem cell culture. Yet, experiments in transfer cloning of differentiated cell nuclei successfully carried out as of 1997 in the sheep Dolly and other species of mammals (cow, goat, pig, and mouse) seem to indicate that the same would happen in the human species, so we would have to accept that somatic embryos are of the same nature of genetic embryos and, therefore, they must share the same [genetic] statute. Recently, in November 2001, there took place an event in the United Kingdom that is worthwhile considering within this context. It has to do with the legal procedure taken by ProLife Alliance, which made use of the act that allowed human therapeutic cloning arguing that the somatic embryo was not protected by the 1990 Human


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Fertilization and Embryological Act since, from the plaintiffs’ point of view, embryos obtained through nucleus transfer (somatic embryos) are not equivalent to the ones obtained through gamete fecundation ( gametic embryos). Because justice Crane from the Higher Court of Justice has said that they are right, we would have to infer that since biologically both types of embryos are not equivalent, they should not be so from an ethical point of view, and if this is true, it would mean, in my opinion, that the claim would have had a “boomerang effect” against the pro-life association since it questions the ethical value of somatic embryos. Legal aspects From the point of view of the institutional declarations and the legal norms, we must say that both UNESCO’s 11 November 1997 Universal Declaration on the Human Genome and Human Rights in its Article 11 “Practices contrary to human dignity such as cloning for human reproduction purposes must not be permitted.” or the European Convention on Human Rights and Bioethics in Article 11 of its Additional Protocol dated 12 January 1998: “Any intervention whose finality is to create a human being genetically identical to another live or dead human being is forbidden.” respectively condemn and prohibit reproductive cloning, but they also allude to non reproductive cloning. It is important to emphasize that since the latter declarations do not allude to non reproductive cloning, it is implicitly accepted that the expressions “cloning a human being” or “creating a human being” exclude the pre-implanted human embryo (with fewer than 14 days of formation) as it is not a human being yet. This is an issue that has been debated for many years in interdisciplinary forums. Likewise, the European Directive Related to the Juridical Protection of Biotechnological Inventions (31 July 1998) prohibits the patenting of reproductive cloning as contrary to the moral and the public order (Art. 6). a) The United States In the United States, in November 2001, the Bush administration declared its support for the most restrictive of the two law projects on


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cloning proposed: the “Human Cloning Prohibition Act, 2001” and the “Cloning Prohibition Act 2001.” Even though in the two projects human reproductive cloning is prohibited, in the first, in addition, it is practically prohibited to carry out any use of the nucleus transfer cloning technique, while in the second, non reproductive cloning would be authorized. In fact, in August 2001, the Congress’s Chamber of Representatives, after a six-hour discussion, approved (by 265 votes in favor and 163 against) the “Human Cloning Prohibition Act 2001” that forbids any type of human cloning, both the reproductive and the non reproductive ones. An amend to the project, that would have allowed therapeutical cloning, was rejected by 251 votes versus 176. For the project to become a law it must be approved by the Senate where Democrats, who hold a more favorable position regarding the use of cloning non reproductive cloning) as a research technique, are a majority. Yet, to the date this work was being written, (July 2002) the Senate has not voiced its opinion due, among other reasons, to strong pressures from one and another side. It seems that, finally, the Senate is going to favor a two-year moratoria instead of subjecting the proposals to a vote in favor or against the prohibition of cloning in any of its ways. Within this context, we could ask ourselves whether the publication by the Advanced Cell Technology company of its research, mentioned earlier, (Cibelli et al. 2001) in which three human embryos had been obtained through nuclear transfer was not but a way to pressure both society and the North American Senate to pressure the latter when the previous Congress’s agreement is to be or not to be ratified, as if to say: How dare you to prohibit something which has already been accepted? Maybe this impression can be proof tested by the fact that two scientists (French neurologist Marc Peschansky, and North American stem cell expert John Gearhart ) both members of the Editorial Committee of The Journal of Regenerative Medicine) resigned when they considered that the article that had been published described more a failed attempt, and that the said publication should have been postponed. b) The European Community In the European Community legal norms will change from some countries to others. Once again, the United Kingdom stands out for its permissiveness. Thus, the English Parliament approved the cloning of human embryos for therapeutic purposes in December, 2000. On the contrary, the European Parliament voted (September 2000) against therapeutic cloning. Also, in turn, the European Group of Ethics in Science and New Technologies (November 2000)


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recommended prudence and caution, concluding that it was premature to create somatic embryos by nuclear transferal. In the previous section we indicated that the European Parliament has not made any official statement regarding therapeutic human cloning since a Commission had been placed in charge of the discussion on the issue. This Commission elaborated a report named the Fiori Report on “Human Genetics in Modern Medicine,” but the said report was rejected by the European Parliament at the end of November 2001. While distributing European funds for research within the VI Framework Program for Research and Development, the European Parliament decided not to fun projects that imply the creation of human embryos for research purposes nor non reproductive therapeutic cloning nor, of course, reproductive cloning. c) Spain In Spain Act 35/1988 ON Assisted Reproduction Techniques prohibits experimenting with viable embryos as well as the obtention of embryos for purposes different from reproduction. On the other hand, the legal position regarding cloning is thus: Even though the Penal Code (1995) declares punishable in its Art. 161.2 “...the

creation of identicalhuman beings by cloning or other procedures directed to the selection of the race”

and, additionally, Spain signed the European Agreement on Human Rights and Biomedicine (Oviedo Convention, 1977), in any case such prohibitions do not include non reproductive cloning. However, since the non reproductive cloning technique considered would imply the production of an embryo whose destiny is not procreation, it seems logical to accept that Art. 161.1 of the Penal Code, which punishes

“...those who fecundate human ovules with any purpose different

from human procreation”

would be applicable, by analogy if we accept, as pointed out earlier, the equivalence of somatic embryos and gametic embryos.


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d) United Kingdom In the United Kingdom the Government approved in August 200 a law authorizing non reproductive human cloning, which the British Parliament ratified in December 2000. Nonetheless, as mentioned earlier, in the face of the objection submitted by the ProLife Alliance group, a judge annulled the said parliamentary agreement accepting the argumentation made based on the fact that, as somatic embryos cannot homologized with gametic embryos, the former could not be under the 1990 British act that approved research with embryonic stem cells (from gametic embryos). Still, in January 2002, the Court of Appeals ratified the Parliament’s decision, declaring that the act included cloned embryos as, if the Parliament had known the cloning technique in 1990 – when the law was passed (Human Fertilisation and Embryology Act)- it would have included it in the legislation controlling embryo research and utilization. Finally, on 27 February 2002, The Chamber of Lords (High Chamber of British Parliament) approved the cloning of human embryos with therapeutic purposes although under strict control norms. V. ADULT STEM CELLS FROM ADULT TISSUES OR ORGANS) AS CELLS)14 In any case, we must keep in mind the hopeful news that the une of non reproductive cloning could be unnecessary if experimental data being published for over a year until now or so should become a clinical reality, indicating the possibility of setting up tissue cultures as of AS cells (for adult stem cell), which are present in the adult organs themselves. This would avoid any ethical and legal problem since manipulation would only affect somatic cells from the human organism without the need to create an embryo. (see the report from the National Institutes of Health, 2001). In the normal development process of the adult organism there takes place a continue process of cell division to keep constant the number of differential cells from certain tissues subject to natural wearing out (damage, illness or cellular death). Cells with a high turnover rate are replaced through a regulated process of proliferation, differentiation and programmed death (apoptosis). Such is the case, for example, of hematopoietic stem cells of the bone marrow and of the skin’s epithelial cells or those of the small intestine. These tissues contain

14 Adult stem cells (AS cells) : Undifferentiated cells in differentiated tissues capable of renovating themselves and, at the same time, originate a cell of any of the differentiated cell types from the tissue they come from.


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sub-populations of stem cells that are in charge of replacing short-lived differential cells. In some tissues or organs there may be stem cells that are capable of reactivating their genetic program in answer to some determined stimulus signals thus creating to some, but not all, the possible cell lines. That it, they would be multi-potent cells with a potential degree of differentiation inferior to that of pluri-potent cells. Such could be the case of neural stem cells and of mesenchymal stem cells. The latter ones could proliferate as non differential cells, but they have the capacity to generate various tissues, such as the bone, cartilage, tendon, muscle and stroma of the bone marrow. Neural stem cells are being subject to numerous studies for the treatment through cell transplant of neuro-degenerative illnesses (transplant of the fetal tissue to adult damaged brains); they can even be genetically modified or induced to express determinate genes before the transplant to the patient is made. Such would be the case of selecting stimulated cells to produce dopamine in treatments for Parkinson’s disease. On the other hand, in 1999, Vescovi and collaborators (Bjornson et al, 1999) showed in a mouse that neural stem cells – multi-potent cells that are precursors of neurons, astrocytes, and oligodendrocytes – could transform themselves in hematopoietic stem cells. It is interesting to mention that in the year 2001 it was announced that the PPL Therapeutics work group, the same company that collaborated in the obtention of the sheep Dolly, had obtained in cows heart cells as of epithelial cells, and that the patent of the method had been applied for. There can be no doubt that this type of results is hopeful when thinking of its possible application in the human species. The report from the National Institutes of Health (2001) summed up the knowledge about AS cells thus: * AS cells can proliferate without differentiating themselves for a long period of time (characteristic known as “long-term self-renovation”) thus being able to originate mature cells with characteristic forms and specialized functions. * Some AS cells have the capacity to differentiate in other tissues different from the one from which they come (plasticity). * AS cells are rare, difficult to identify and from unknown origin. The present methods of characterization are based on the


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determination of markers of cellular surface and their patterns of differentiation in vitro. * Up to now scientific data indicate that AS cells have been obtained from the brain, bone marrow, peripheral blood, dental pulp, spinal cord, blood vessels, bone muscle, skin epithelia and from the digestive tract, cornea, retinue, liver, and pancreas; that is, AS cells have been found in the tissues derived from the three embryonic germinal layers. * Hematopoietic stem cells from the bone marrow are the most studied ones and the ones most used in clinical applications for bone marrow transplant to repair the blood tissue and components from the immune system. In addition, in the bone marrow and the blood at least two other populations of AS cells have been identified. * Several populations of AS cells have been identified in the brain, especially in the hippocampus, even though their function is still unknown. The proliferation and differentiation of brain AS cells depend on various growth factors. * AS cells have been described in other tissues (muscular, sanguineous, adipose), which show plasticity, but there is still little information on the possibility of their being cloned. * There are few experiments showing that AS cells generate mature and fully functional cells capable of restoring in vivo lost functions. Together with the positive data, an equal number of questions would have to be added, questions whose answers are still pending. Yet, the challenge is worthwhile as it would be one way to avoid the ethical problems inherent in cell therapy, and for which society and the scientific community eagerly demand a solution. In research success can depend on the availability of the necessary funding. I am certain that if enormous amounts of money were invested in this issue, success would be achieved. That is why, the economic measures that the European Community proposes for the VI Framework Program of Research and Development (2002-2006) are welcome, as the community responsible, Commissar Philippe Busquin, announced, coinciding with the recommendations from the European Group on Science and New Technologies (2000). In the same sense, President Bush announced in his television intervention mentioned earlier the investment of 250 million dollars from federal funds for research on adult stem cells from the umbilical cord, placenta, and other human and animal tissues.


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Nature magazine (4 July, 2002) “Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow”) published an article about adult stem cells which deserves a commentary. It has to do with some research carried out by a group of researchers from Minnesota University, under the direction of Dr. Catherine M. Verfaillie, where it is demonstrated that a mouse’s adult stem cells from the bone marrow ( cells from the mesenchym) have many of the characteristics of embryonic stem cells (Jiang, et al, 2002). In the first part of the research, cells from the mesenchym of the mouse’s bone marrow were taken and marked genetically with a “telltale” gene that produces blue fluorescence. Some of these cells (between 1 and 12) were injected in early embryos, finding that in some cases the chimerical individuals that developed shoed the blue fluorescent marker up to a 45% of their tissues, which shows the versatility (pluripotency or multipotency) of the original adult stem cells. In the second part of the experiment, Verfaillie and collaborators injected in an adult mouse the mesenchymal cells genetically marked, and 24 hours later they found that colonies of such cells were growing in different parts of the mouse, especially in the intestine, lung, and liver. There can be no doubt that this type of experimental results demonstrate that the expectations on the use of adult stem cells the cell therapy of the future are not unfounded. However, to try to preserve scientific balance, Nature published together with the article that somehow opens up the new perspectives regarding adult stem cells, another article by Ron Mckay and collaborators (Kim et al., 2992) in which it is demonstrated that the mouse’s embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson’s disease. VI. STEM CELLS AS OF PARTHENOGENETIC EMBRYOS In the same scientific article, Cibelli and collaborators (2001) described other experimental results that were overlooked by the mass media, no doubt blinded by the issue of cloning, and which I consider extremely important for what they entail: I refer to the obtention of six human parthenogenetic embryos 15 which reached a

15 Parthenogenesis: In general, type of unisexual reproduction in which the females originate descendents without the males fecundation. In animals, and therefore applicable to the human species, it consists of the reproduction of an embryo as of a female not fecundated gamete.


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stage of development in which the formation of the cavity of blastocysts16 had been started. It is important to point out that the parthenogenetic embryos went further ahead in their development than the somatic embryos obtained through nuclear transferal. The results obtained are included in the chart below: Female Number Pronuclei Embryos with initiated Embryos with blastocoel Donor* of phase of division oocytes 1 5 4 (80%) 4 (80%) 0 2 14 13 (93%) 13 (93%) 4 (31%) 6 3 3 (100%) 3 (100%) 2 (67%) Total 22 20 (90%) 20 (90%) 6 (30%) * The numbers represent the identification code used by the lab. The obtention of parthenogenetic embryos in lab mammals such as mice has been tried for many year, but until now the embryos obtained have not reached normal development. The day the adequate technique is found, it will happen the same that took place when the sheep Dolly: the possible application of the same technique in the human species. The fact that the scientific work on the induction of human parthenogenetic embryos through the activation of oocytes has been published supposes another attempt to break the barrier of the allowed limits by research. In any case, the publication does not state whether the obtained parthenogenetic embryos were haploid or diploid (see footnote 7). For them to be useful, they must

* Haploid parthenogenesis: The individual formed has only one set of

chromosomes (n) since the female gamete from which it derived was of normal haploid chromosomal constitution.

* Diploid parthenogenesis: The individual formed has the normal chromosomal number of the species since it derives from a “non reduced” female gamete, that is, of diploid (2n) chromosomal constitution.

16 Blastocoel : the blastocyst’s inner cavity.


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be diploid; otherwise the stem cells in their nucleus would be haploid and , consequently, useless for a possible cell therapy. Finally, it is necessary to make clear the fact that the induction of human parthenogenesis could be listed as one of the reproduction techniques, but cannot be compared with cloning, since the genotype of the individuals thus produced would not be similar to the mother’s in any of the possible theoretical cases of haploid parthenogenesis, and quite probable in the case of diploid parthenogenesis. On the other hand, and always under a theoretical scenario, only diploid parthenogenetic daughters would have some chance of development since in animal species, different from vegetables, haploid is a not frequent phenomenon as it severely affects the individuals’ viability. In any case, Spanish Act 35/1988 on Assisted Reproduction Techniques considers the induction to parthenogenesis “a grave infraction” (Art. 20.28)m. Within this context, it is important to refer to the work published in Science magazine by Cibelli and collaborators (2002) in which they induced in a macaque (Macaca fascicularis) the formation of 28 parthenogenetic embryos as of 77 oocytes; four of them reached the stage of blastocysts. When the pluri-potent cells of their cell mass were set up for culture, they obtained a stable cell line which preserved its undifferentiated stage for over ten months and, later on, they were able to induce the differentiation of neural tissue( astrocytes and neurons) cells similar to cardiomyocites (?) with the capacity to pulsate spontaneously, cells from the flat muscular tissue, adipocites (?) and ciliate epithelium. In the face of such spectacular result, one asks oneself if the case of the sheep Dolly will repeat itself, with a new newspaper article which, in this case, would be: “Today Chita, tomorrow Jane”, alluding to Tarzan’s companion, and who knows if within two years or so, another article will be published entitled: “Yesterday Chita, today Jane.”

VII. EPILOGUE When faced with the statement that “Science is unstoppable” two readings must be made: one, that scientific progress is a continuum, and we all hail it; another, this time perhaps in a pejorative manner, is that science is unstoppable “because scientists are not willing to stop.” True, there are many that say that to want to stop certain scientific advancements as if to want “to put up doors in the country” as “everything that can be done, will be done.” Before these points of view it would be worth remembering also the other ones who defend the standpoint that “the end does not justifies the means” nor that


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“everything that is technically feasible, is necessarily ethically desirable.” Erwin Chargaff (1905-2002) was famous for “Chargaff’s rules” (11950) – which set the equiproportionality in the composition of the DNA of the adenine and timine bases on the one hand, and guanine and cytosine on the other – and which were one of the foundastions used by Watson and Crik to propose in 1953 the DNA structural model of the double helix. Chargaff was always a very critical scientist. Shortly before his death, Chargaff had said that “there are two nuclei that man should have never touched: the atomic nucleus and the celular nucleus. And genetic engineering is going to bring about worse consequences than atomic energy” With these words he remembered, perhaps, what Fred Hoyle – the a University of Cambridge astronomer – prophesized many years ago, foreseeing the enormous power that genetic manipulation would hold: “Within 30 years, nuclear physicists, who no only manufacture inoffensive hydrogen bombs, will work in freedom while molecular geneticists will work behind electric barbed wires.” Who is to decide? Today we are all convinced that the decision to promote, allow, advise on or prohibit some determinate research must be taken after deliberation carried out by the pertinent bioethics committees, which ought to be independent, pluri-disciplinary, and pluralistic. With the deliberation, double-entry accounting must be used so the pros and cons are analyzed, not only as to do some specific research but also as to not do it. Erwin Chargaff also said that “Who will prevent the industrial production of human embryos? Who will stop the emergence of a powerful biotechnological industry? I see in the horizon –added Chargaff – a gigantic slaughterhouse, a molecular Auschwitz (his mother had died in a Nazi extermination camp) where enzymes and valuable hormones will be extracted as if they were gold teeth.” I do not like being a bearer of bad tidings, but there is no question that statements such as those must make us aware. In social behavior sometimes there happen incongruent situations that have no easy explanation. For example, I do not understand that enormous amounts of money be spent in weaponry or that surpluses of food products be destroyed when there are so many people starving to death. I do not understand that many times the same groups that declare themselves defenders of plants and animals, and therefore of life in nature, are in favor of abortion. Nor is it understandable that social mass media has welcome, at certain times, two relevant issues of genetic research such as transgenic


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plants and animals on the one hand, and non reproductive therapeutic human cloning on the other. In the first case, we have lived we have gone through intense questioning activity from certain pressure groups and social mass media, while in the case of non reproductive therapeutic cloning, it seems as if society believed whatever scientific can do is good, without realizing that not everything that is technically feasible can be ethically desirable. Much is talked about the issue of genetic manipulation without our perceiving that, on many occasions, there is the issue of social manipulation. Like several years ago, in the midst of the abortion battle, horrific movies were sometime used to defend the anti-abortionist’ stand, in the present debate as to use or not to use embryo stem cells in celular therapy, solutions comparable to the former one have been used (even though of contrary bent) when people affected by illnesses that could have been cured with the said therapy are taken as witnesses in political debate forums, so that with their presence they could exert some influence on the legislators.


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OBTENCIÓN IN VITRO Y CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS STEM DEL CORDÓN UMBILICAL HUMANO COMO ALTERNATIVA DE LAS CÉLULAS STEM DE ORIGEN

EMBRIONARIO PARA LA MEDICINA REGENERATIVA. Munévar Niño Juan Carlos. Odontólogo, MSc Biología Osea, D.E.A. Especialista en Bioética.

Profesor Asistente, Instituto U.I.B.O. Universidad El Bosque. 2005. e mail: [email protected]

__________________________________________________________________ Resumen. Durante siglos el hombre ha tratado de comprender la capacidad del cuerpo para reparar y reemplazar las células y tejidos del organismo. Después de años de trabajo dilucidando el como y el por qué de los mecanismos de reparación y regeneración tisular, los científicos se han enfocado en las células Stem. La identificación y aislamiento de células Stem de numerosos tejidos embrionarios y posnatales provee objetivos apropiados para una variedad de prácticas biotecnológicas denominadas generalmente como Medicina Regenerativa e Ingeniería Tisular. Desde el descubrimiento sobre la capacidad de las células Stem adultas para formar diferentes tipos de tejidos in vivo e in vitro, como una fuente alternativa para las células Stem embrionarias, lo que ofrece amplios potenciales terapéuticos para los seres humanos. La obtención de éstas células a partir del cordón umbilical humano es un sustituto interesante porque es un órgano fetal, fácil de obtener, descartable, lo que disminuye las dificultades bioéticas. En la Universidad El Bosque estamos aislando y caracterizando in vitro células Stem mesenquimatosas de la gelatina de Wharton del cordón umbilical de neonatos, obtenido previo consentimiento informado. Este sistema permitió obtener células precursoras viables de rápida proliferación que expresaron patrones de marcaje FGFR 3 (+), abriendo la puerta para poder diferenciarlas in vitro con fines terapéuticos. Abstract. For centuries, the man have been seeking to understand the body's ability to repair and replace the cells and tissues of the organism. After years of work pursuing the how and why of tissue repair and regeneration mechanisms, scientists have focused their attention on Stem cells. The identification and isolation of Stem cells from a number of embryonic and posnatal tissues provides appropriate targets for varied biotechnological practices referred to generally as Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Since the discovery that adult stem cells have the capacity to form many different tissue types in vivo and in vitro and can be an alternative source for embryo Stem cells offering wide therapeutic potentials for human beings. The human umbilical cord as a source of Stem cells, can be an interesting substitute because it is a fetal organ, easy to obtain, discarded, diminishing bioethics dilemma. At the Universidad El Bosque we are isolating and characterizing in vitro Mesenchymal Stem cells from the Wharton's jelly of the umbilical cord of new born subjects, previous informed consent. This system permits to obtain viable precursor cells, of rapid proliferation that revealed FGFR 3 (+) marker patterns, opening the door for in vitro differentiation for therapeutic purposes. INTRODUCCION. Durante siglos, el hombre ha estado investigando la capacidad del cuerpo para reparar y reemplazar las células y tejidos de

algunos órganos desde diferentes disciplinas del conocimiento con metodologías a veces científicas. En efecto, desde la antigüedad, el hombre ha tratado


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de identificar e incluso emplear sustancias que le permitan curar y prevenir sus dolencias. En un principio se emplearon productos naturales y se llegó al aislamiento de sustancias activas. Posteriormente se logró alcanzar la síntesis artificial de muchas de ellas e incluso se generaron compuestos mejorados con respecto a su actividad terapéutica. En la actualidad estos métodos tradicionales para el descubrimiento de medicamentos han sido complementados por una aproximación o enfoque más directo, lograda por el actual nivel de comprensión de las bases moleculares e interacciones que están detrás de la enfermedad. Estos avances fueron posibles luego de la aparición de nuevas áreas del conocimiento como la biología celular, la biología y la genética moleculares, más recientemente la bioquímica y la biofísica estructurales, la biología molecular computacional y la bioinformática. Los enfoques terapéuticos recientes permiten recorrer el camino desde el gen que codifica para cierta proteína, resolver la estructura tridimensional de esta molécula identificada en alguna patología. Luego, con este conocimiento es posible diseñar y sintetizar una sustancia química que pueda interactuar con la molécula blanco para modular su actividad biológica en el sentido deseado. Existen otras formas de establecer enfoques terapéuticos de pertinencia exclusiva del diseño moderno de medicamentos, como son: la química combinatoria y toda una serie de técnicas asistidas por computador. Los principales objetivos de la terapéutica clínica actual para el reemplazo y reconstrucción de tejidos se centraron en aliviar el dolor y restaurar la estabilidad mecánica, así como la función. En el transcurso de este siglo, la revolución médica se encargará de aumentar el promedio de vida de las personas, pues la ingeniería genética posee el potencial de conquistar el cáncer, la farmacogenómica permitirá bloquear el desarrollo de vasos sanguíneos en los tumores, la ingeniería de tejidos podrá desarrollar nuevos órganos biosintetizados in vitro a partir de células troncales o células madre (Stem cells) obtenidas del mismo paciente, con la posibilidad de ser previamente congeladas en un Banco de Células altamente especializado. Incluso se podría reprogramar la codificación genética

primordial que causa el envejecimiento celular. (1, 2, 3) En la práctica clínica médica esencialmente se han tratado las consecuencias de las patologías. Sin embargo, estamos asistiendo al diseño y desarrollo de estrategias terapéuticas biológicas que podrían cambiar la esencia de los tratamientos médicos. Dentro de las aplicaciones terapéuticas recientes para las células Stem podemos mencionar: las leucemias agudas, las leucemias crónicas, los síndromes mielo-displásicos, los desordenes de células madre, los desordenes linfoproliferativos, las enfermedades de almacenamiento liposomal, los desordenes histolíticos, las anomalías hereditarias de los eritrocitos, los desordenes congénitos o hereditarios del sistema inmune, las anomalías hereditarias de las plaquetas, los desordenes de células plasmáticas, enfermedades auto inmunes y procesos neoplásicos como el sarcoma de Ewing, el neuroblastoma, el cáncer de ovario, el carcinoma de células renales y el cáncer pulmonar de células pequeñas entre otros. Las futuras estrategias terapéuticas hacia donde se enfoca la investigación con células Stem incluyen; infarto del miocardio, la diabetes, la distrofia muscular, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, patologías de la médula espinal, el Lupus eritematoso sistémico y la enfermedad de Lou Gehrig. (4). Hace tan solo unos años, se pensaba que los tejidos humanos sólo podrían reemplazarse por transplantes procedentes de donantes o por dispositivos artificiales. Era difícil vislumbrar que se diseñarían órganos sintetizados en el laboratorio, para el alivio del sufrimiento causado por el daño irreversible de los tejidos (3). Se desarrolló entonces la ingeniería de tejidos como alternativa para generar novedosas estrategias terapéuticas con distintas aplicaciones en la práctica médica y odontológica, mediante el diseño in vitro de sustitutos o análogos de órganos y tejidos denominados "biomiméticos", para reemplazar órganos lesionados irreversiblemente sin importar el origen del agente lesionante. Esta disciplina también se encarga de utilizar principios bioactivos que biomimeticen los procesos biológicos alterados que se efectúan normalmente


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durante la organogénesis, para así propiciar la regeneración de los tejidos lesionados. (Figura 1) Del mismo modo, se genero la Terapia Tisular con el propósito de utilizar células aisladas in vitro para reemplazar aquellas presentes localmente en los tejidos enfermos o lesionados. (1, 3, 13, 15).

En Odontología, las aplicaciones terapéuticas de las células Stem primordiales generan la posibilidad de nuevos tratamientos que presentan ventajas sobre los enfoques terapéuticos actuales (5, 6). De este modo, la caracterización in situ de Células Stem o Células Madre Primordiales en el complejo pulpodentinal ofrece interesantes perspectivas para la práctica clínica y en ciencias básicas odontológicas (6). En el 2002, Young y colaboradores demostraron por primera vez la generación de coronas dentales constituidas por esmalte y dentina a partir de tejidos dentales disociados, sugiriendo la presencia de células stem en el mesenquima dental (5, 7, 8) Posteriormente, un grupo de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (N.I.H) en Estados Unidos, dirigido por el científico Songtao Shi, publicó en la revista The Lancet en el 2004, la presencia, aislamiento y caracterización de células stem postnatales multipotenciales en el ligamento periodontal humano que podrán emplearse para regenerar los tejidos periodontales alterados (9). Este descubrimiento conservará intacto ese tejido conectivo altamente especializado en cuyo interior encontramos múltiples poblaciones celulares, moléculas y factores solubles e insolubles de la matriz extracelular, encargado de preservar la homeostásis de los tejidos dentales y periodontales.

Recientemente el profesor Paul T. Sharpe, en Londres, fundó en el año 2002, la compañía "Odontis", que permitirá diseñar in vitro órganos dentales a partir del aislamiento y caracterización bioquímica e inmunológica de células stem propias del paciente. Estos órganos dentales biosintéticos al ser implantados in situ en los mismos pacientes como transplantes autólogos, permitirán el desarrollo y erupción de dientes biocompatibles con el mismo volumen, forma y propiedades ópticas que los originales perdidos. Es así como en la práctica clínica se abre la

puerta para estudios en Bioingeniería y Regeneración Tisular, incluso aparecen disciplinas clínicas como la Medicina Regenerativa. Dentro de las principales líneas de investigación en Ingeniería Tisular y Medicina Regenerativa está el interés que despierta las células Stem o células Troncales, denominadas a veces "Células Madre". La célula Stem o célula madre, aunque difícil de definir por su complejidad, podemos decir que es una célula progenitora, con capacidad de auto renovación ilimitada, capaz de generar uno o más tipos celulares diferenciados (2, 4, 12, 13). Sin embargo, sólo las células Stem de ratón embrionarias obtenidas in vitro cumplen estos requisitos. En este artículo se mostrará con evidencia por qué las células Stem de la sangre y de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano podrían reemplazar en el futuro las células Stem embrionarias para aplicaciones en terapia tisular y medicina regenerativa, evitando los distintos conflictos bioéticos, religiosos, de legislación y prácticos que despiertan las células Stem embrionarias humanas.

En los animales superiores, las células madre se han clasificado en dos grupos. Por un lado, las células madre embrionarias (Embrionyc Stem Cells o ECS's), originadas de la masa celular interna del embrión en estadio de blastocisto (7-14 días), estructura a partir del cu la se originarán las tres capas que darán origen a todos los tejidos del cuerpo humano: ectodermo, mesodermo y endodermo. Estas células son capaces de generar los diferentes tipos celulares del cuerpo, por ello se llaman células pluripotenciales, pues conservan el potencial de formar tejidos diferenciados lo que serviría para aplicaciones terapéuticas en múltiples enfermedades. De estas células se derivaran, tras múltiples divisiones celulares, las células madre órgano-específicas. Estas células multipotenciales, son capaces de originar las células de un órgano en el embrión y en el individuo adulto.

Las células madre embrionarias murinas y humanas tienen un comportamiento similar; ambos tipos celulares requieren in vitro una capa subyacente de fibroblastos


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embrionarios (feeder layer) para permanecer indiferenciadas; sin embargo las células Stem embrionarias humanas requieren adicionalmente la presencia de Factor de Crecimiento Fibroblástico Básico (bFGF) o Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) (2, 4). Vale la pena destacar, la reciente publicación en la literatura científica de cultivos de células Stem sin la presencia de feeder layer, puesto que estas capas de fibroblastos murinos pueden causar la transferencia de moléculas responsables de rechazo a las células Stem humanas. Así mismo, la presencia de factores de transcripción y proteínas especificas, dirigen la nueva célula, tejido u órgano que debe formarse; por ejemplo la proteína Nanog promueve la auto – renovación y la pluripotencialidad de las células embrionarias, evento que no ocurre con las células Stem hematopoyéticas HSC; probablemente uno de los factores de transcripción más importantes en este tipo celular es el Oct-4 que regula la expresión de otras proteínas como Rex-1. Al estimular estas células con ácido retinóico, los niveles del factor Oct-4 disminuyen observándose la diferenciación de la célula Stem, razón que permite pensar la importante relación de esta molécula con el proceso de pluripotencialidad (14). Así mismo, se ha analizado la expresión genética de las células Stem embrionarias mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y se ha obtenido proliferación en condiciones específicas de cultivo celular para determinar la capacidad de formar una amplia variedad de tejidos diferenciados. Ambos tipos de células Stem embrionarias tienden a formar in vitro acúmulos celulares descritos como cuerpos embrioides que se asemejan al blastocisto y adquieren características de endodermo, mesodermo y ectodermo (15, 16). Está reportada en la literatura científica, la capacidad de las células Stem embrionarias humanas para diferenciarlas en miocitos contráctiles, células semejantes a neuronas y células hematopoyéticas (4, 13, 15, 16).

El uso terapéutico de la células madre embrionarias humanas para reemplazar los tejidos y órganos afectados o lesionados irreversiblemente, es un objetivo excitante aunque bastante controvertido. Una fuente opcional para este tipo de tratamientos, es el uso de células madre específicas de tejido con un potencial más limitado y

comprometido de diferenciación, por ejemplo, las células madre hematopoyéticas que dan origen a todas las líneas celulares sanguíneas, con capacidad genéticamente restringida de diferenciarse a otros tipos celulares. Como las células Stem específicas de tejidos provienen de múltiples fuentes, cada una con potencial único propio, podría utilizarse esta capacidad combinada para cubrir un amplio espectro de terapias tisulares, lo que eliminaría la necesidad de emplear las células Stem embrionarias en un futuro.

Entre las células madre específicas de tejido mejor estudiadas encontramos las células Stem hematopoyéticas, capaces de generar todos los tipos celulares de la sangre y del sistema inmune en el transcurso de la vida del individuo, pero con capacidad limitada para diferenciarse en otras líneas celulares (13, 16, 17, 18, 19). Estas poblaciones de células Stem existen en muchos tejidos adultos del cuerpo humano, como ya se han aislado células Stem en la sangre del cordón umbilical como sustitutos de células hematopoyéticas de médula ósea, células Stem de tejido nervioso para auto - renovar sólo células nerviosas, células Stem de la piel, grasa subcutánea, células Stem de músculo cardíaco, células Stem de músculo esquelético (Side Population cells o células satélite), células Stem de retina, células Stem de páncreas, células Stem hepáticas (células ovales). (4, 13) Teniendo en cuenta el enorme potencial para la aplicación clínica de las células Stem procedentes de embriones humanos, se han despertado grandes controversias a nivel mundial en el ámbito ético, religioso y político. Por esa razón se han buscado nuevas fuentes de células Stem, como en la sangre de cordón umbilical donde se han aislado y caracterizado células Stem hematopoyéticas (13, 16 18); así mismo en la Universidad El Bosque estamos identificado células Stem mesenquimatosas en la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano (20).

Las células madre hematopoyéticas (HSC) son preprogramadas durante el desarrollo embrionario, pero el medio ambiente y la programación genética interna influyen igualmente. Las células multipotenciales de la línea primordial de embriones murinos permiten reproducir la formación de tejidos


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específicos. Sin embargo, si células más comprometidas en una vía de diferenciación dentro un linaje primordial más avanzado son transplantadas, modificarán su fenotipo en otros tipos celulares similares al sitio huésped, dependiendo del sitio específico del transplante. Sin embargo es probable la existencia de alguna predeterminación, debido a la capacidad de respuesta a las señales del medio circundante retenidas durante el paso a través de la línea primordial.

Diferenciación de las células madre específicas de tejido.

A primera vista, parece sorprendente la multipotencialidad característica de las células Stem específicas de tejido. La restricción de linaje celular puede ser un mecanismo muy importante que evolucionó en el transcurso del tiempo para aumentar la probabilidad de reproducir el desarrollo del embrión y asegurar que ocurra una restricción del desarrollo como respuesta a señales celulares externas, más que por limitaciones inherentes al potencial de las células madre especificas de tejido. Entonces podríamos plantearnos el interrogante: ¿Podrán modificarse estas células Stem específicas de tejido para producir células multipotentes similares a las células Stem embrionarias? Estudios in vivo describen la obtención de clones de poblaciones celulares multipotenciales, o únicamente células similares a las Stem embrionarias sugiriendo una respuesta afirmativa. De todos modos, son necesarias más investigaciones, que permitan verificar si las células Stem específicas de tejido podrían reemplazar el tejido lesionado o enfermo, por células funcionales.

Para poder utilizar estas células como terapia tisular de manera segura, primero se debe determinar el (los) mecanismo(s) de diferenciación de las células Stem. ¿Son capaces las células madre de responder a las distintas señales involucradas en un proceso de reparación y/o regeneración tisular? Se han realizado transplantes de células madre hematopoyéticas (HSC: Hematopoietic Stem cells) en ratones irradiados severamente inmunosuprimidos induciendo daño tisular en la médula ósea, hígado, y otros tejidos. En estos casos se ha observado que diversos estímulos localizados en los tejidos afectados pueden

desencadenar mediante mecanismos de transducción de señales, la reparación tisular, así como un mecanismo de diferenciación similar al fenotipo del tejido lesionado. Recientemente se utilizaron células madre hematopoyéticas para tratar un modelo de la enfermedad de Parkinson en ratones, donde se demostró la presencia de células Stem hematopoyéticas (HSC) en la sustancia nigra, luego de ser transplantadas en las neuronas productoras de dopamina (21).

Un mecanismo alterno podría ser la fusión celular más que la transdiferenciación, en donde las células Stem no se transforman sino que se fusionan con otras adquiriendo las características particulares de éstas últimas. Recientemente se han cultivado células madre neuronales junto con una línea celular muscular (C2C12), lo que dio como resultado la conversión de las células neuronales en musculares; sólo sí las células Stem neuronales establecían contacto con las células C2C12. Vale la pena destacar que esta conversión es irreversible; es decir una vez las células Stem se diferencian en músculo, pierden la capacidad de volver a ser células Stem neuronales (22). A pesar de no saber si las células Stem se fusionan o se transdiferencian, el resultado final es la reparación del tejido lesionado.

Evidencia Clínica de la Multipotencialidad de la Células Stem hematopoyéticas.

En un interesante estudio clínico, células de la médula ósea donadas se diferenciaron en hepatocitos funcionales en el hígado de un individuo receptor luego de un transplante. Se trató de un estudio retrospectivo en el cual las células de la médula ósea transplantadas eran de un donante de diferente sexo al receptor. Usando una combinación de hibridización in situ y de fluorescencia especifica de cromosomas sexuales (FISH), combinada con técnicas de inmunohistoquímica para marcadores específicos de hepatocitos, fue posible mostrar claramente que las células de la médula ósea contribuyeron en la formación de células hepáticas funcionales en los individuos receptores (23). Sin embargo estos pacientes fueron sometidos a dosis altas de radiación causando depleción total de las células de la médula ósea;


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probablemente esa radiación ocasionó algún daño hepático al momento de realizar el transplante de medula ósea. Esto pudo desencadenar una señalización apropiada inducida por el tejido lesionado produciendo la transdiferenciación de las células de la médula ósea en hepatocitos. Debe mencionarse la posibilidad de formación de los hepatocitos por mecanismos de fusión celular. Por lo tanto se deben realizar más estudios usando marcadores específicos para las células del receptor y el donante para determinar cuál es el mecanismo que se activa.

Clonación Terapéutica.

El nacimiento de Dolly en 1997 sugiere que el núcleo de una célula somática adulta diferenciada, reprogramada mediante transferencia nuclear somática (SNT), puede inducir la transdiferenciación de una célula Stem específica de tejido (25, 26). Recientemente Hochedlinger y Jaenisch usaron el núcleo de una célula B en un experimento de SNT para generar células Stem embrionarias funcionales (24). Estos estudios demuestran que las células adultas diferenciadas pueden ser reprogramadas para producir múltiples tipos celulares. La clonación terapéutica es algo atractiva ya que evita el problema de rechazo de tejidos por marcadores específicos de HLA. Sin embargo, embriones obtenidos por clonación pueden no ser normales en diferentes aspectos, incluyendo inestabilidad epigenética, función telomerasa alterada y no alcanzan el estadio de blastocisto para permitir la formación de las células Stem embrionarias desde la masa celular interna (26). Otro aspecto a considerar es la necesidad de oocitos humanos para realizar la SNT. Por el momento estos problemas hacen impracticable, si no inalcanzable la clonación terapéutica.

Células Stem Adultas derivadas de la Médula Ósea.

Las células estromales y las células hematopoyéticas derivadas de la médula ósea son capaces de diferenciarse en múltiples tipos celulares, lo que demuestra propiedades similares a las células Stem embrionarias. Las HSC purificadas de la médula ósea y transplantadas en ratones pueden diferenciarse en hepatocitos y

recuperar una lesión hepática, lo cual demuestra funcionalidad (23). En otro estudio las HSC fueron purificadas y se examinaron las poblaciones clonales para determinar si experimentaban auto renovación o diferenciación. Al observarse la repoblación celular a largo plazo de hospederos irradiados se demuestra que estas células no sólo migran a la médula ósea, sino que también se pueden diferenciar en células epiteliales del hígado, pulmón, tracto gastrointestinal y piel, aunque en poca cantidad. Las células progenitoras mesenquimatosas derivadas del estroma de la médula ósea también tienen la capacidad de producir diversos tipos celulares, a partir de una población clonal, tanto in vivo como in vitro.

¿Son las Células Stem Hematopoyéticas de la Sangre de Cordón Umbilical Multipotentes?

La sangre de cordón umbilical fue usada exitosamente como sustituto de transplante de médula ósea en un paciente con anemia de Fanconi en 1988 (18). Las células Stem hematopoyéticas se encuentran en la circulación fetal, en 100 ml de sangre de cordón umbilical y de la placenta; tejidos que siempre se descartan después del parto. En las siguientes horas después del parto, las células Stem hematopoyéticas migran a la médula ósea en donde proveerán los progenitores de todos los elementos figurados de la sangre, incluyendo eritrocitos, leucocitos y plaquetas.

Por estas razones ha sido fundamental demostrar que las células Stem de la sangre de cordón umbilical poseen las mismas propiedades que las células Stem embrionarias. En efecto, en experimentos preliminares con células CD34+ de sangre de cordón umbilical humano, se demostró crecimiento in vitro, de células con morfología similar a mesenquima, y mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se observo que las células Stem expresaron positividad para el anticuerpo vimentina, confirmando una morfología mesenquimatosa. La diferenciación de estas células Stem, se comprobó al demostrar la expresión de marcadores de hueso (TRAP), músculo (desmina), neuronas (nestina), y astrocitos (Gfap). Estos resultados demuestran el


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múltiple potencial de las células de la sangre del cordón umbilical, además que confirmo hallazgos previos.

Expansión de las Células Stem de Sangre de Cordón Umbilical.

En la sangre de cordón umbilical hay suficientes células Stem hematopoyéticas presentes para remplazar la médula ósea de un niño; solo el 25% de las muestras criopreservadas en un banco de células Stem, contienen un número suficiente de células para transplantar a un adulto. La expansión in vitro de las células Stem por lo tanto es la meta, no sólo para incrementar el uso de las HSC del cordón umbilical como reemplazo del transplante de médula ósea, sino también para la terapia tisular. La obtención de un número suficiente de células Stem para hacer posible la terapia tisular, será un gran obstáculo a superar en un futuro no muy lejano. Las HSC pueden dividirse y dar origen a una célula hija Stem, y una célula progenitora, la cual puede producir células sanguíneas maduras. Reproducir este proceso de división in vitro sólo debe ser suficiente para mantener los niveles de la población inicial; además es difícil que las HSC proliferen dado que este proceso causa diferenciación al estimularlas con factores de crecimiento que modulan tanto la proliferación como la diferenciación. La barrera clave para lograr la expansión in vitro, es la pérdida de la autorenovación que ocurre durante la inducción de la proliferación celular. Para que una célula Stem dé origen a dos nuevas células Stem, las vías de diferenciación celular deben ser bloqueadas desencadenando proliferación, antes que inicie la programación interna de diferenciación celular (13, 27, 28).

Eficiencia de Diferenciación en Varios Tipos de Células Stem hacia Células Diferenciadas.

Aunque el porcentaje de HSC de sangre de cordón umbilical que demuestra marcadores no sanguíneos es bajo, otros tipos de células Stem presentan una baja tasa de diferenciación hacia células maduras. Las células Stem embrionarias murinas tiene una alta eficiencia de producción de células maduras específicas entre todas las células Stem.

Dang y col. incrementaron la producción de cuerpos embrioides al 42% con una diferenciación continua a HSC de cerca del 5%, incluso la conversión a marcadores neurales fue del 0.2%. También demostraron que cerca del 1% de las células aisladas en el día 9.5 producían esferas neurales, con un 20% de esferas primarias que eran capaces de producir esferas secundarias, de estas el 80% fueron positivas para oligodendrocitos, neuronas, y astrocitos, sin embargo la tasa de diferenciación fue de menos del 16% de la población de esferas primarias.

Cerca del 5% de las células aisladas de una biopsia de piel proliferan en cultivo y demuestran la capacidad de formar células neurales. Con células mesenquimatosas de la médula ósea, cerca de 1/10.000 de las células mononucleares adherentes (CD45-) producen una colonia proliferativa con múltiples potenciales. De estos aislamientos, al colocarse en distintos cultivos, el 90% empiezan o ser endotelio o neuronas, el 60% son albúmina positivas en cultivos, lo que favorece el desarrollo de hepatocitos. Algunos estudios recientes demuestran que cerca del 10% de una población enriquecida de células Stem de sangre de cordón umbilical pueden proliferar en cultivo y demostrar un rango de diferenciación. De las células que proliferan, el 80% pueden ser positivas para marcadores in vitro neurales, endoteliales, musculares o mesenquimatosos.

Las células Stem aisladas de diferentes fuentes, demuestran tasas similares de diferenciación. Lo que distingue una célula de otra, como candidato a terapia celular, es su capacidad de proliferar superando las bajas tasas de diferenciación. Actualmente las células Stem embrionarias poseen la más eficiente proliferación in vitro, pero en el futuro se buscará lograr condiciones que permitan obtener niveles altos de proliferación de células madre específicas de tejido.

¿Son las Células Stem de la Gelatina de Wharton de Cordón Umbilical Multipotentes?

La obtención de células Stem a partir del cordón umbilical humano es una alternativa interesante porque éste es un órgano fetal,


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fácil de obtener, descartable, lo que disminuye las dificultades bioéticas. El cordón umbilical humano es el órgano encargado de la circulación feto placentaria y nutrición del embrión. En su interior se localiza un tejido conectivo mucoide embrionario denominado la gelatina de Wharton rodeando los elementos vasculares que lo conforman. En estudios previos se utilizó el cordón umbilical humano como revestimiento biológico en pacientes quemados (Banerjee y col. 1987) donde se utilizó como apósito en cirugías experimentales en perros acelerando la cicatrización, estimulando la regeneración tisular y favoreciendo el control de infecciones (29). Por esas razones, en el Instituto Unidad de Investigación Básica Oral de la Universidad El Bosque estamos efectuando investigaciones para determinar la presencia de células Stem multipotenciales en la Gelatina de Wharton del cordón umbilical humano (20), además de la presencia ampliamente descrita de células Stem en la sangre del cordón umbilical.

Se han identificado diferentes marcadores que permiten la caracterización in - vitro de células Stem como la molécula CD 34, expresada por células Stem y células progenitoras hematopoyeticas (31); la expresión de la molécula SB 10, miembro de la familia de moléculas de adhesión leucocitaria ALCAM (32), la síntesis de pro colágeno IIa por células precursoras de condrocitos (33) y por último la presencia del receptor 3 del Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGFR 3) como marcador de células mesenquimatosas precursoras esqueléticas (34, 35, 36, 37, 38). La familia de Factores de Crecimiento Fibroblástico (FGF) participa en la regulación de la producción de tejido mesenquimatoso (36). Los Factores de Crecimiento Fibroblástico ácido y básico (FGF-1 / FGF- 2) pertenecen a la familia de factores de crecimiento que desempeñan un papel activo durante el crecimiento, diferenciación y regeneración de una gran variedad de tejidos. Se han descrito al menos 4 receptores de alta afinidad y sus variantes sintetizados por splicing alternativo de RNA m. Los receptores de la familia de Factores de Crecimiento Fibroblástico son miembros de la familia de receptores tirosina cinasa, que desempeñan un papel crucial durante el crecimiento y desarrollo de los tejidos

cartilaginosos (37, 38). La asociación del FGFR 3 con el mesenquima y la formación temprana del hueso y cartílago explica los aspectos característicos de enfermedades que involucran mutaciones en este gen. El gen del receptor 3 del FGF (FGFR 3) está sobreexpresado en la Acondroplasia, un síndrome que involucra anomalías en la fisiología de células Stem mesenquimatosas (34, 36). La proteína FGFR 3 se localiza en las células periféricas de las articulaciones, expresándose principalmente en células de la zona pericondral. Posiblemente esto indicaría que la expresión de FGFR 3 se observa en las células mesenquimatosas antes de diferenciarse (34, 35). Los condrocitos presentes en muestras de biopsias de cartílago articular humano no expresan FGFR 3. Sin embargo, en cultivo las células sufren un proceso de desdiferenciación permitiendo de nuevo la expresión de FGFR 3 y no secretan la matriz extracelular cartilaginosa especifica (33, 36). Robinson y col en 1999 demostraron que las células precursoras del pericondrio y otras células precartilaginosas que expresan el receptor 3 del Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGFR 3) son buenas células para implantarlas en la corrección de defectos del cartílago articular (33, 34, 35).

La presencia del FGFR3 en las células aisladas del cordón umbilical no había sido descrita anteriormente, parámetro a resaltar en una artículo original. Realizamos entonces nuestro estudio utilizando muestras de cordón umbilical de neonatos donantes, obtenidas previo consentimiento informado. En condiciones de esterilidad, se obtuvo la gelatina de Wharton y se probaron dos métodos para la obtención de las células: sembrando explantes de 3 mm3 o por disociación enzimática. (Microfotografía 1.) Se analizó la dinámica de proliferación celular en los cultivos, mediante la inmunodetección de Bromodeoxiuridina (BrdU) y además se evaluó por inmunocitoquímica la expresión del receptor 3 para Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGFR3, como marcador de células progenitoras conjuntivas) (Microfotografía 2) El porcentaje de células que entraron en fase S en los cultivos primarios fue de 19.07% + 5.45, y de 24.01% + 12.11 y 26.02% + 4.65 en los subcultivos uno y dos respectivamente (Gráfica 1) La inmunoreactividad para


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FGFR3 se ubicó en la mayoría de células simultáneamente en núcleo y citoplasma (73.90% + 3.80), en menor porcentaje solo el núcleo (17.74% + 3.52) y escasamente solo en citoplasma (0.22% + 0.13). La expresión del marcador FGFR3 en el núcleo aumenta en los subcultivos (Gráfica 2) Este sistema permitió obtener células precursoras viables y abre la puerta para poder diferenciarlas in vitro con fines terapéuticos con potenciales aplicaciones en patologías que comprometen los tejidos cartilaginosos (artritis degenerativas), o enfermedades que involucran ampliamente los huesos (osteosarcomas) (20).

Por esa razón continuamos nuestras investigaciones con la aplicación de distintos estímulos in vitro como factores solubles específicos a distintas concentraciones en varios períodos de tiempo a las células Stem precursoras mesenquimatosas aisladas de la Gelatina de Wharton del cordón umbilical humano. Si estas células Stem precursoras mesenquimatosas llegan a estar dotadas de propiedades y características primordiales, serán una herramienta indispensable para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a tratar diversas enfermedades en la práctica clínica, según las necesidades clínicas y las condiciones fisiológicas del paciente individual.

Consideraciones bioéticas.

La utilización de células Stem embrionarias como terapéutica celular y tisular está limitada en últimas por aspectos éticos, puesto que estas células provienen de embriones humanos. La necesidad de practicar una tipificación HLA a los tejidos derivados de células Stem embrionarias para efectuar transplantes alogénicos, requerirá en un futuro la producción y almacenamiento en un banco de células altamente especializado, de varios miles de líneas de células Stem embrionarias para hacer viable la terapia tisular y la medicina regenerativa. Este requisito necesita cientos de miles de embriones, debido a que aislar células Stem embrionarias a partir de embriones humanos resulta hasta el momento un procedimiento ineficiente e impracticable por los enormes conflictos bioéticos que se generan. Por esta razón se cree que una fuente no embrionaria de

células Stem ayudará a superar los conflictos bioéticos asociados con la utilización de células Stem embrionarias. De los estudios realizados con células Stem adultas, los que llaman más la atención son aquellos con células Stem de cordón umbilical porque se obtienen de material que se descarta después del parto. De este modo, se puede concluir que el desarrollo de varios miles de muestras de sangre de cordón umbilical dirigido a resolver el problema de compatibilidad de HLA es más práctico ya que depende solo del número de partos en una región particular y del consentimiento de los padres para donar la sangre del cordón umbilical. (Microfotografía 1.)

(Microfotografía 2.)

(Gráfica 1).

Cultivo celular % BrdU

Primario 19.07 + 5.45

Subcultivo 1 24.01 + 12.11

Subcultivo 2 26.02 + 4.65

Gráfica 2. Porcentaje de immunoreactividad de las células de la gelatina de Wharton a la


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Bromodeoxiuridina en diferentes pasajes y sus desviaciones estándar. (Gráfica 2) Cultivo celular % núcleo Primario 22.81 + 4.37 Subcultivo 1 24.97 + 3.74 Subcultivo 2 27.92 + 3.0 Cultivo celular % citoplasma Primario 1.43 + 0.33 Subcultivo 1 0.91 + 0.25 Subcultivo 2 0.33 + 0.14 Cultivo celular % Núcleo /

citoplasma Primario 75.88 + 4.63 Subcultivo 1 74.09 + 3.96 Subcultivo 2 71.74 + 2.93 Gráfica 2. Porcentaje de distribución de la expresión de FGFR3 en la gelatina de Wharton’s del cordón umbilical humano en diferente pasajes y sus desviaciones estándar. CONCLUSIONES.

De manera natural, los tejidos del cuerpo a lo largo de la vida sufren un deterioro, del que se defienden desarrollando la capacidad intrínseca de remodelar esos tejidos que se desgastan. De no existir esta regeneración, se reduciría considerablemente la esperanza de vida de los seres vivos. Por otro lado, diversas enfermedades que afectan al ser humano, se basan en la degeneración y muerte de los distintos tejidos que conforman nuestro cuerpo, ya sea de manera aguda (infartos) o crónica (degeneración-envejecimiento). El avance de la medicina ha desarrollado técnicas que consiguen reparar los tejidos a través de los trasplantes. Sin embargo, se abren ahora nuevas posibilidades: La nueva medicina regenerativa, que se propone regenerar desde el punto de vista estructural/funcional y no sólo reparar los tejidos dañados utilizando mecanismos similares a los que de forma natural usa el organismo para este fin, y que por razón de la rapidez del daño, no es capaz de hacer eficazmente. Entran entonces a jugar un papel muy importante las células Stem.

No cabe duda de que estos nuevos descubrimientos, marcarán una estrategia de impacto en el campo de los nuevos tratamientos en medicina. La medicina regenerativa, basada en el uso terapéutico

de las células Stem, sale al paso del aumento en la incidencia de enfermedades de tipo degenerativo asociadas irreversiblemente al incremento en la esperanza de vida mundial y al envejecimiento de la población. (1) (4) Además de los nuevos conocimientos en embriología, en biología del desarrollo, de las vías de señalización y de los mecanismos bioquímicos y biofísicos que desencadenan la formación de diversos tejidos para su potencial uso en la terapia tisular o celular en el área de la salud.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Robert L, William C., Cell and Molecular Engineering of Bone Regeneration. Principles of Tissue Engineering. Landes Company, 1997. 2. Thomson J A., Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Watnitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, y cols. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145-7 3. Langer R. Tissue Engineering. Science.1993; 260(5110):920-932. 4. Edwards Bob. Stem cells today: A. origin and Potential of embryo stem cells. Reproductive BioMedicine on line. 2004; Vol. 8. 5. 275 - 306. 5. Gronthos. S, Mankani. M, Brahim.J, Geronh. R and Shi. S. Posnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. 97; 25: 13625-13630. 6. Paul H. Krebsbach, 2002. Dental and skeletal stem cells: Potential cellular Therapeutic for craniofacial regeneration. J. of dental education. 66 (6): 766-773 7. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Gehron Robey P, Shi S. Posnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 5, 2000. 97. Vol 25: 13625 - 630. 8. Gronthos S. et al. 2002. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J. Dent Res. 81 (8): 531-535. 9. Byoung M. S, Masako M., Gronthos S., Bartold P. M., Batouli S., Young M., Geron Robey P., Wang C., Shi S. The Lancet. Investigation of multipotent postnatal stem cells


11

11

from human periodontal ligament. 2004. Vol. 364, 149 - 155. 10. Goldberg M., Six N., Decup F., Bourd K., Palmier K., Salih E., Veis A., Lasfargues J. J. Minéralisation de la pulpe dentaire: apports de l'ingénierie tisulaire aux thérapeutiques de demain en odontologie. Pathol Biol. 2002; 50: 194 - 203. 11. SHI S. 2001. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 ( 6): 532-539. 12. Fuchs E, Segre J. A. 2000. Stem cell: a new lease on life. Cell 100: 143-155. 13. Verfaillie, C.M. Adult stem cells: assessing the case for pluripotency. 2002 TRENDS in Cell Biology 12; 11: 502-508. 14. Wilmut I, Schnieke A. E, McWhir J, Kind A. J, Campell K. H. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385: 810 – 3. 15. Schuldiner M,Yanuka O, Itskovitz – Eldor J, Melton D. A, Benvenisty N. From the cover: effects of eigth growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 1307 – 12. 16. Harder F, Henschler R, Jungham I, Lamers M. C, Muller A. M. Human hematopoiesis in murine embryos after injecting human cord blood derived hematopoietic stem cells. Blood 2002; 99: 719 – 21. 17. Laggase E, Connors H, Al-Dhalimy M, Reitsma M, Dohse M, Osborne L. Purified Hematopoietic Stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 2000;6: 1229 – 34. 18. Gluckman E, Broxmeyer H. A, Auerbach A. D, Friedman H. S, Douglas G. W, Devergie A. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s Anemia by means of umbilical cord blood from an HLA identical sibling. N Engl J Med. 1988; 321: 1174 – 8. 19. Madlambayan G. J, Rogers I, Casper R. F, Zandstra P. W. Controlling culture dynamics for the

expansion of hematopoietic stem cells. J Hematother Stem Cell Research. 2001; 10:: 481 – 92. 20. Munévar J. C., Castellanos J. E., Martinez M, Acosta L. P., Hurtado H., Lafaurie G. Immunocytochemical characterization of Mesenchymal Stem cells from de human umbilical cord. In vitro cell animal biology. 2004. Submitted 21. Nagatsu T. Parkinson’s disease: changes in apoptosis related factors suggesting possible gene therapy. J Neural Trans. 2002;109: 731 – 45. 22. Gali R, Borello U, Gritti A, Minasi M. G, Bjornson C, Coletta M. Skeletal myogenic potential of human and mouse neural stem cells. Nat Neurosci. 2000; 3: 986 – 91. 23. Theise N. D, Nimmakayalu M, Gardner R, Illei P.B, Morgan G, Teperman L. Liver from bone marrow in humans. Hepatology 2000; 32: 11 – 6. 24. Hochedlinger K, Jaenisch R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T donor cells. Nature 2002; 415: 1035 – 8. 25. Betts D, Bordignon V, J, Hill J, Winger Q, Westhusin M, Smith L. Reprogramming of telomerase activity and rebuilding of telomerase length in cloned cattle. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98: 1077- 82 26. Mann M. R, Bartolomei M. S. Epigenetic reprogramming in the mammalian embryo: struggle of the clones. Genome Biol. 2002; 3. 27. Constantinescu S. Stemness, fusion and renewal of HSC and ESC. J Cell Mol Med. 2003 Apr-Jun;7(2):103-12 28. Stem cell research - second update. The Royal Society, Policy document 0/01, June 2001, London. 29. Ryynanen, ET, Tan, E, Hoffren J. Type VII Gene Expression In Human Umbilical Tissue And Cells. Lab. Invest, 69, (3):300-304, 1993. 30. Caplan, A. I: The mesengenic Process. Clinics in Plastic surgery, 21(3) : 429, 435. 1994. 31. Pittenger M, Mackay A, Beck S,. Multilineage potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 1999. 284 2 April.


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32. Bruder S, Lawrence E. G, Haynesworth S. E. The generation of monoclonal antibodies against human osteogenic cells reveals embryonic bone formation in vivo and differentiation of purified mesenchymal stem cells in vitro. Trans Ortho Res Soc. 1995. 20: 8 33. Oganesian A, Zhu Y, Sandell L. Type IIa procollagen amino propeptide is localized in human embryonic tissues. Journal of Histochemistry and Citochemistry. 1997. Vol 45, 1469 - 80. 34. Dror Robinson, Amir Hasharoni, Nir Cohen; Fibroblast Factor Receptor-3 as a Marker For Precartilaginous Stem Cells; Clin Orthop. 367: 163-175. 1999. 35. Dror Robinson, Amir Hasharoni, Nahum Halperin, Avner Yayon, Zvi Nevo. Mesenchymal cells and growth factors in bunions. Foot and Ankle International. 727 - 32. 1999. 36. Hasharoni A, Robinson D, Hecht D, Dekel S, Halperin N, Yayon A, Nevo Z. Fibroblast Growth Factor Receptor 3 as a marker of mesenchymal precartilaginous stem cells which dissapears in mature chondrocytes. Ortho. Bull, 16: 53, 1996. 37. Abraham, K. B. ; Givol, D. ; Avivi, A. ; Yayon, A. ; copeland, N. G. ; Jenkins, N. A. : Mapping of murine fibroblast growth factor receptors refines regions of homology between mouse and human chromosomes. Genomics 21: 656-658, 1994. 38. Keegan, K.; Jonson, D.E.; Williams, L.T.; Hayman, MJ.: Isolation of an additional member of the

fibroblast growth factor receptor family, FGFR-3. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 1085-1099, 1991. 39. Gill P, Jarjoura D. Wharton's Jelly in the umbilical cord. A study of its quantitative variations and clinical correlates. Journal of Reproductive Medicine. Vol 38; 8. 611 - 14. 1993. 40. Franc S, Rousseau, JC; Gorrene R. Microfibrilar Composition of umbilical cord matrix: Characterization of fibrillin, collagen VI and intact collagen V. Placenta, 19(1):9104, 1998. 41. Ghezzi, L. Raio, E. Di Naro, M. Franchi, D. Balestreri and V. D’Addario; Nomogram of wharton’s jelly as depicted in the sonographic cross section of the umbilical cord; Ultrasound Obstet Gynecol, 18: 121-125.2001. Goodman SR.: Medical Cell Biology, J.B. Lippincott Company Pennsylvania, 193-200, 1994. 42. Takechi, K, Kuwabara, Y, Mizuno, M.: Ultraestructural And Immunohistochemical Studies Of Wharton's Jelly Umbilical Cord Cells, Placenta, 14(2): 235-245, 1993. 43. Nanaev. A. K, Kohnen. G, Milovanov. A. P, Domogatsky y Kaufmann;1997, Stromal differentation and architecture of the human umbilical cord; Placenta 18 .53-64. 44. Sobolewiski, K, Bankowski, E, Chyczewiski, l, Jaworsky, s: Collagen and Glicosaminoglicans of Wharton’s jelly. Biol-Neonate, 18(1):11-21, 1997.

ANEXOS.


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Figura 1. La identificación y aislamiento de células Stem de numerosos tejidos embrionarios y postnatales provee objetivos apropiados para una variedad de prácticas biotecnológicas denominadas generalmente como Medicina Regenerativa e Ingeniería Tisular.


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IN VITRO OBTENTION AND CHARACTERIZATION OF STEM

CELLS FROM THE HUMAN UMBILICAL CORD AS AN ALTERNATIVE OF EMBRYONIC STEM CELLS FOR

REGENERATIVE MEDICINE. Munévar Niño Juan Carlos, Dentist, Msc. Bone Biology. D. E. A. Specialist in Bioethics. Assistant Professor, Institute U. I. B. O, El

Bosque University. 2005. e-mail: [email protected]

Abstract For centuries man has been seeking to understand the body’s ability to repair itself and to replace cells and tissues of the organisms. After years of pursuing the how and the why of tissue repair and regeneration mechanisms, scientists have focused their attention on Stem Cells. The identification and isolation of stem cells from a number of embryonic and postnatal tissues provides appropriate targets for varied biotechnological practices referred to generally as Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Since the discovery that adult stem cells have the capacity to form many different tissue types in vivo and in vitro. And ca be an alternative source for embryo stem cells offering wide therapeutic potentials for human beings. The human umbilical cord as a source of stem cells can be an interesting substitute because it is a fetal organ, easy to obtain, discarded, diminishing bioethics dilemmas. At El Bosque University we are isolating and characterizing in vitro Mesenchymal Stem cells from the Wharton’s jelly of the umbilical cord of new born subjects, previous informal consent. This system permits to obtain viable precursor cells, of rapid proliferation that revealed FGFR 3 (+) marker patterns, opening up the door for in vitro differentiation for therapeutic purposes.

INTRODUCTION For centuries man has been researching the body’s capacity to repair and replace cells and tissues of some organs, from different disciplines of knowledge and with sometimes scientific disciplines. In effect, from antiquity, man has tried to identify and even use substances that allow him to cure and prevent his illnesses. At the beginning natural products were used, and the isolation of active substances was obtained. Later on the artificial synthesis of some of them was obtained , and improved composites in relation to the therapeutic activity were generated. Presently, these traditional


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methods for the discovery of medications have been complemented by a more direct approximation or focusing reached at due to the present level of understanding of the molecular bases and the interactions taking place behind the disease. These advancements were possible after the appearance of new fields of knowledge such a cell biology, molecular biology and genetics, and more recently biochemistry and structural biophysics, computational molecular biology and bioinformation technology. Recent therapeutical focuses allow to thread the path from the gene that codifies for certain protein the tridimensional structure of this molecule identified in some pathology. Then, with this knowledge it is possible to design and synthesize a chemical substance that can interact with the target molecule to modulate its biological activity in the sense desired. There exist other ways to establish therapeutic focuses that belong exclusively to the modern design of medications such as: combinatory chemistry and a whole series of computer-assisted techniques. The main objectives of the present therapeutic clinic to replace and reconstruct tissues were centered on the alleviation of pain and the restoration of the mechanical activity and its function. Throughout this century the medical revolution will be in charge of increasing the people’s life expectancy average, since genetic engineering has the potential to overcome cancer; pharmacogenomics will allow to block the development of blood vessels in tumors; tissue engineering will be able to develop new biosynthesized organs in vitro as of stem cells obtained from the same patient, with the possibility of their being previously frozen in a highly specialized Cell Bank. It will even be possible to program again the primordial genetic coding that causes celular aging (1,2,3). In practical medical clinic what has been treated is, in essence, the consequences of pathologies. Nevertheless, we are witnessing the design and development of biological strategic therapies that could change the essence of medical treatments. Among the recent therapeutic applications for stem cells we can mention: acute leukemia, chronic leukemia, myelo-displacic (?) syndromes; stem cells disorders; liposomal storage diseases; histolytic disorders; hereditary anomalies of erythrocytes; congenital or hereditary disorders of the immune system;. Hereditary anomalies of platelets, disorders of plasmatic cells; self-immune diseases and neoplasia processes such as Ewing’s sarcoma, neuroblastoma, cancer of the ovary, carcinoma of renal cells, and lung cancer of small cells among others. The future therapeutical strategies towards which research is focused using stem cells include: infarct of the myocardium, diabetes, muscular


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dystrophy, Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease, pathologies of the spinal chord, the systemic erythematous Lupus, and Lou Gehrig’s disease. (4) Until not many years ago, it was thought that human tissues could only be replaced by transplants from donors or by artificial devices. It was difficult to foresee the lab design of synthesized organs, to alleviate suffering caused by irreversible damage in the tissues (3). Tissue engineering was then developed as an alternative to generate novel strategic therapies with different applications in medical and dental practice through the in vitro design of substitutes or analog organs and tissues called “bio-mimetic,” to replace irreversibly damaged organs regardless of the origin of the damaging agent. This discipline is also in charge of utilizing bioactive principles that bio-mime (?) the altered biological processes that normally take place during organogenesis to, this way, provide the regeneration of the damaged tissues. Likewise Tissular Therapy was developed in order to use isolated cells in vitro to replace those present locally in the diseased or damaged tissues. In dentistry the therapeutical applications of primordial stem cells generate the possibility of new treatments that provide advantages over present therapeutical focuses (5, 6). Thus, the characterization in situ of stem or primordial cells in the pulp-dentinal (?) complex offers interesting perspectives for clinical practice and in basic dental sciences (6). In 2002, Young and collaborators showed for the first time the generation of dental crowns conformed by enamel and dentine as of disassociated dental tissues, thus suggesting the presence of stem cells in the dental mesenchymal (?) (5, 7, 8). Later on, a research group from the U S National Institutes of Health (N.I.H.) under the direction of scientist Songtao Shi, published in The Lancet magazine in 2004, the presence, isolation and characterization of multipotent postnatal stem cells in the human periodontal ligament that could be used to regenerate altered periodontal tissues (9). This discovery will preserve intact that highly specialized connective tissue in whose interior we find multiple celular, molecular and soluble and insoluble populations of the extra-celular matrix, in charge of preserving the homeostasis of the dental and periodontal tissues. In 2002 professor Paul T. Sharpe founded in London the company Odontis, which will allow to design in vitro dental organs as of the isolation and biochemical and immunologic characterization of the patient’s own cells. These biosynthetic dental organs, when implanted in situ in the same patients as autologous transplants, will


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allow for the development and appearance of bio-compatible teeth with the same volume, shape and optical properties of the original lost ones. So it is than in clinical practice the door is open to carry out studies in Bioengineering and Tissular Regeneration; even clinic disciplines such as Regenerative Medicine make now their appearance. Along the main lines of research in Tissular Engineering and Regenerative Medicine there lies the interest in stem cells. We can say that the stem cell, even though difficult to define because of its complexity, is a progenitor cell, with the capacity for limitless self-renewal, capable of generating one or more differentiated cell types (2, 4, 12, 13). However, only embryonic mouse stem cells obtained in vitro fulfill these requirements. In this article this will be shown with ample evidence since stem cells from the blood of Wharton’s jelly from the human umbilical cord could replace in the future embryonic stem cells for application in tissular therapy and in regenerative therapy, thus avoiding the different bioethical, religious, legal and practical conflicts generated by human stem cells. In higher animals, stem cells have been classified in two groups. On the one hand, embryonic stem cells (ECS’s), originated in the embryo’s internal cell mass at the blastocyst stage (7 – 14 days), structure as of which they will originate the three layers which will give origin to all the human body’s tissues: ectoderm, mesoderm and endoderm. These cells are capable of generating the body’s different celular types; that is why they are called pluripotential cells, as they preserve the potential to form differentiated tissues, which would be useful for therapeutic applications in multiple diseases. From these cells will derive, after multiple celular divisions, the organ-specific stem cells. These multipotential cells are capable of originating an organ both in the embryo and in the adult individual. Murine and human embryo stem cells both have a similar behavior; both cell types require in vitro an underlying layer of embryonic fibroblasts (feeder layer) to remain undifferentiated, However, human embryonic stem cells require in addition the presence of the Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) of Leukemia Inhibitor Factor (LIF) (2, 4). It is worthwhile to point out the recent publication in scientific literature regarding stem cell cultures without the presence of feeder layers, since these layers of murine fibroblasts can cause the transferal of molecules responsible for the rejection to human stem cells. Likewise, the presence of transcription factors and specific proteins lead the new cell, tissue or organ that ought to be formed; for example, the Nanog protein incentivates the self-renovation and the pluripotentiality of embryonic cells, event that does not happen


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with hematopoietic stem cells (HSC). Probably one of the most important transcription factors in this celular type is Oct-4, which regulates the expression of other proteins such as Rex-1. By stimulating these cells with retinal/retinoic (?) acid, the levels of factor Oct-4 diminish, a differentiation of the stem cell being observed. For this reason it can be thought of the important relation existing between this molecule and the pluripotentiality process (14). Likewise, the genetic expression of stem cells has been analyzed through the polymerase chain reaction, and proliferation has been obtained in specific conditions of cell cultures to determine the capacity to form a wide variety of differentiated tissues. Both types of embryonic stem cells tend to form in vitro cell cumuli described as embryo-like bodies that are similar to the blastocyst, and that acquire the characteristics of the endoderm, mesoderm and ectoderm (15, 16). The capacity of human embryo stem cells to differentiate in contractile myocyte/miotic (?), cells similar to neurons and hematopoietic cells, is reported in scientific literature. he therapeutical use of human embryonic stem cells to replace affected or irreversible damaged tissues and organs is an exciting objective although rather controverted. One optional source for this type of treatment is the use of specific stem cells from the tissue with a more limited and compromised differentiation potential. For example, hematopoietic stem cells that originate all the blood cell lines, with the genetically restricted capacity to differentiate from other celular types; since specific stem cells come from multiple sources, each one with its own unique potential, this combined capacity could be used to cover a wide spectrum of tissular therapies, need to use embryonic stem cells in the future. Among the best studied specific tissue stem cells we find hematopoietic stem cells, capable of generating all cell types of the blood and immune system throughout the individual’s life, but with the limited capacity to differentiate themselves in other celular lines (13, 16, 17, 18, 19). These stem cell populations exist in many adult tissues of the human body. The isolation of stem cells has already taken place in the blood of the umbilical cord as hematopoietic cells of the bone marrow; stem cells of the nervous tissue for the renovation of only nervous cells; skin stem cells; subcutaneous fat; stem cells of the cardiac muscle; stem cells of the skeletal muscle (side population or satellite cells); retina stem cells; pancreas stem cells; hepatic (oval) cells (4, 13). Keeping in mind the enormous potential for the clinical application of stem cells from human embryos, great controversies have arisen world wide in the ethical, religious and political environs. Because of


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this, new sources of stem cells have been looked for, such as in the blood of the umbilical cord where hematopoietic stem cells have been isolated and characterized (13, 16, 18); likewise, at El Bosque University we are presently identifying mesenchymal stem cells in Wharton’s jelly in the human umbilical cord (20). Human hematopoietic stem cells (HSC) are pre-programmed during the embryonic period, but the environment and the internal genetic programming, likewise, have an influence. Multipotent cells of the primordial line of murine embryos allow to reproduce the formation of specific tissues. Nevertheless, if cells that are more compromised in a line of differentiation within a more advanced primordial lineage are transplanted, they will modify their phenotype in other types of cells similar to the host site depending on the specific place of the transplant. Yet, the existence of some predetermination is probable due to the capacity of answering to the signals of the surrounding environment that are retained during the going through the primordial line. Differentiation of stem cells from specific tissue At first sight, the multipotent characteristic stem cells from specific tissue seems surprising. The restriction of celular lineage can be a very important mechanism that evolved throughout time to increase the probability to reproduce the embryo’s development, and to make sure that a developmental restriction take place as an answer to external signals, more than due to limitations inherent to the potential stem cells from specific tissue. Then we could ask ourselves the following question: Could these stem cells from specific tissue be modified in order to produce multipotent cells similar to embryonic stem cells? In vitro studies describe the obtention of clones of multipotent cell populations similar to embryonic stem cells, thus suggesting an affirmative answer. Anyway, more research is necessary that will allow to verify whether stem cells from specific tissue could replace the injured or damaged tissue for functional cells. To be able to use these cells as tissular therapy in a safe way, the differentiation mechanism(s) of the stem cells must be determined first. Are the stem cells capable of responding to the different signals involved in the tissular repair and/or regeneration process? There have been transplants of hematopoietic stem cells (HSC) in irradiated mice severely immuno-suppressed inducing tissular damage in the bone marrow, liver and other tissues. In these cases it has been observed that diverse stimuli located in the affected tissues can unleash, through signal transduction mechanisms, tissular repair, as well as a differentiation mechanism similar to the phenotype of the


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damaged tissue. Recently, hematopoietic stems cells were used to treat a model of Parkinson's disease in mice, through which the presence of hematopoietic stems cells was shown in the nigra (?) substance after they were transplanted in the neurons that producer dopamine. (21) An alternate mechanism could be celular fusion more than trans-differentiation, in which stem cells do not transform themselves; they fusion themselves with others acquiring the specific characteristics of the latter ones. Recently, neuronal stem cells have been cultured together with the muscular cell line (C2C12), which resulted in the conversion of neuronal cells in muscular ones only if the neuronal stem cells made contact with the C2C12 cells. It is worthwhile to note that this conversion is irreversible; that is, once the stem cells are differentiated, they lose their capacity to become again neuronal stem cells (22). In spite of the fact that it is not known whether the stem cells fusion themselves or they trans-differentiate themselves, the final outcome is the repair of the injured tissue. Clinical Evidence of the Multipotentiality of Hematopoietic Stem Cells In an interesting clinical study, stem cells from donated bone marrow cells differentiated themselves into functional hepatocytes in the liver of a receptor individual after a transplant. It was a retrospective study in which the transplanted cells of the bone marrow belonged to a donor of different sex from the receiver's. Using a combination of in situ hybridization and the specific fluorescence of sexual chromosomes (FISH), combined with immunohistochemical (?) techniques for specific hepatocyte markers, it was possible to show clearly that the bone marrow cells contributed in the formation of functional hepatic cells in the receptor individuals (23). However, these patients were subjected to high doses of radiation generating total depletion of the bone marrow stem cells; probably this radiation caused some hepatic damage when the bone marrow was being transplanted . This may have unleashed some appropriate signaling induced by the injured tissue producing the trans-differentiation of the bone marrow cells into hepatocytes. The possibility of formation of hepatocytes by mechanisms of celular fusion must also be mentioned. Therefore, more studies using specific markers for the receptor individual's cells and the donor's must be carried out in order to determine which is the mechanism being activated. Therapeutic Cloning


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Dolly's birth in 1997 suggests that the nucleus of an adult differentiated somatic cell, re-programmed through nuclear somatic transference (NST) can induce the trans-differentiation of a stem cell from specific tissue (25, 26). Recently, Hochedlinger and Jaenich used the nucleus of a B cell in a NST experiment to generate functional embryo stem cells (24). These studies show that adult differentiated cells can be reprogrammed to produce multiple cell types. Therapeutic cloning is somewhat attractive since it avoids the problem of tissue rejection by specific HLA markers. However, embryos obtained through cloning may not be normal in different aspects, including epigenetic instability and altered telomere function, and they do not reach the blastocyst stage to allow for the formation of embryo stem cells as of the internal cell mass (26). Another aspect to consider is the need for human oocytes to carry out NST. Presently these problems make therapeutic cloning not only impractical but also out of reach. Adult Stem Cells Derived from Bone Marrow Stromal cells and hematopoietic cells derived from the bone marrow are capable of differentiating themselves in multiple celular tissues, which shows properties similar to those of embryo stem cells. Purified HSCs from the bone marrow that are transplanted into mice can differentiate themselves in hepatocytes and cure a hepatic injury, which shows functionality (23). In another study, HSCs were purified, and clonal populations were examined to determine if they experimented self-renewal or differentiation. When observing cell re-population throughout irradiated hosts, it is shown that these cells not only migrate to the bone marrow, but they can also differentiate themselves into liver, lung, gastro-intestinal tract and skin epithelial cells, even though in small amounts. Progenitor mesenchymal cells derived from the stroma of the bone marrow also have the capacity to produce diverse cell types as of a clonal population, both in vivo and in vitro. Are Hematopoietic Stem Cells from the Umbilical Cord Blood Multipotent? Blood from the umbilical cord was used as a substitute for bone marrow transplant in a patient suffering from Faconi's anemia in 1988 (18). Hematopoietic stem cells can be found in fetal blood circulation, in 100 ml of blood from the umbilical cord and placenta, tissues that are always discarded after delivery. In the hours following after birth, hematopoietic cells migrate to the bone marrow where they will supply progenitors with all the blood's regular elements, including erythrocytes, leukocytes, and platelets.


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For these reasons it has been essential to show that blood stem cells from the umbilical cord possess the same properties of embryo stem cells. As a matter of fact, in preliminary experiments with CD34+ cells from the human umbilical cord in situ, growth of cells with similar morphology to mesenchym's was demonstrated; and through polymerase chain reaction (PCR), it was observed that stem cells expressed positiveness towards the vimentin antibody, thus confirming mesenchym morphology. The differentiation of these stem cells was proved when bone (TRAP), muscle (desmina) (?) neurons (nestina) (?), and astrocytes (Gfan) markers were expressed. These results show the multiple potential of the blood cells from the umbilical cord, plus the fact that it confirmed previous findings. Expansion of Stem Cells from Umbilical Cord Blood In the umbilical cord blood there are enough hematopoietic stem cells present to replace a child's bone marrow; only 25% of the cryo-preserved samples in a stem cell bank have a sufficient number of cells to be transplanted into an adult. In vitro expansion of stem cells is, therefore, the goal not only to increase the use of HSC from the umbilical cord as a replacement for bone marrow transplant, but also for tissular therapy. The obtention of a sufficient number of stem cells to make tissular therapy possible will be a great obstacle to overcome in the not very distant future. HSCs can divide themselves and give origin to a stem daughter cell and to a progenitor cell that can produce mature blood cells. To reproduce this in vitro division process must only be sufficient to preserve the initial population levels; besides, it is difficult that HSCs proliferate since this process causes differentiation by stimulating them with growth factors that modulate both proliferation and differentiation. The key barrier to achieve in vitro expansion is the loss of self-renewal which takes place during the induction of celular proliferation . For a stem cell to give origin to two new stem cells, the paths of celular differentiation must be blocked, thus unleashing proliferation before the internal cell differentiation programming starts. (13, 27, 28). Efficiency of Differentiation in Various Types of Stem Cells towards Differentiated Cells Even though the percentage of HSCs of umbilical cord blood that shows non sanguineous markers is low, other types of stem cells do show a low rate of differentiation towards mature cells. Murine embryonic stem cells have a higher production efficiency for the production of specific mature cells among all stem cells.


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Dang and collaborators increased the production of embryoid bodies to 42% with a continued differentiation towards HSCs of around 5%; even the conversion to neural markers was 0.2%. They also showed that almost 1% of the isolated cells during day 9.5 produced neural spheres with a 20% of primary spheres that were capable of producing secondary spheres; from these, an 80% were positive for oligodendrocytes, neurons and astrocytes. However, the differentiation rate was less than 16% of the population of primary spheres. Around 5% of the isolated cells from a skin biopsy proliferate in a culture and show the capacity to form neural cells. With mesenchymal cells from the bone marrow, nearly 1/10,000 of adherent mononuclear cells (CD45-) produce a proliferating culture with multiple potentials. From these isolations, when placed in different cultures, 90% start becoming endothelia or neurons; 60% are positive albumin in cultures, which favors the development of hepatocytes. Some recent studies show that around 10% of a population enriched with stem cells from the umbilical cord blood can proliferate in a culture and can show a differentiation rank. Of all the cells that are proliferating, 50% can be positive for in vitro neural, endothelial, muscular or mesenchymal markers. Isolated stem cells from different sources show similar differentiation rates. What distinguishes one cell from another, as a candidate for tissular therapy, is its capacity to proliferate, overcoming the low differentiation rates. Presently, embryonic stem cells posses the most efficient in vitro proliferation, but in the future it will be sought to achieve conditions that will allow to obtain higher proliferation levels of stem cells of specific tissue. Are Stem Cells from Wharton's Jelly in the Umbilical Cord Multipotent? The obtention of stem cells as of the human umbilical cord is an interesting alternative since the umbilical cord is a fetal organ, easy to obtain and to discard, which diminishes bioethical difficulties. The human umbilical cord is the organ in charge of the embryo's fetal placental circulation and nutrition. Inside it a mucous connective embryonic tissue is found, named Wharton's Jelly, which is surrounded by the vascular elements that conform it. In previous studies, the human umbilical cord was used as biological coating in burned patients (Banerjee and col., 1987) in which it was used as an apposite in experimental surgeries in dogs accelerating cicatrizing, incentivating tissular regeneration and favoring infection control (29). Because of these reasons, in the Institute Unit of Basic Oral Research


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of El Bosque University, we are carrying out research to determine the presence of multipotent stem cells in Wharton's Jelly of the human umbilical cord (20) , in addition to the already described presence of stem cells in the umbilical cord blood. Different markers that allow the in vitro characterization of stem cells such as the CD 34 molecule have been identified. This molecule, is characterized by stem cells and hematopoietic progenitor cells (31). Also the expression of the SB 10 molecule, a member of a family of molecules of the oocyte adhesion ALCAM is characterized (32). And so is the synthesis of the Ha collagen by cells precursor of condrocytes (?) (22); and lastly, there is the presence of receptor 3 of the Fibroblast Growth Factor (FGFR 3) as marker of precursor mesenchymal precartilaginous cells (34, 35, 36, 37, 38). The family of the Fibroblast Growth Factors (FGF) participates in the regulation of the production of mesenchymal tissue (36). The acid and basic Fibroblast Growth Factors (FGF-1/FGF 2) belong to the family of growth factors that play an active role during the growth, differentiation and regeneration of a great variety of tissues. At least four high affinity receptors and their synthesized variants have been described by alternative splicing of the DNA m. The receptors of the Fibroblast Growth Factor are members of the tyrosine cinasa (?), which plays a crucial role during the growth and development of cartilaginous tissues (37, 38). The association of FGFR 3 with mensechym and the early bone and cartilage formation explains the characteristic aspects of diseases that involve mutations in this gene. The receptor 3 FGF gene (FGFR 3) is over expressed in Achondroplasia, a syndrome that involves anomalies in the physiology of mesenchymal stem cells (34, 36). The FGFR 3 protein is found in the peripheral cells of joints, expressing itself mainly in cells of the perichondrial area. This would probably indicate that the expression of FGFR 3 is observed in mesenchymal stem cells before differentiating itself (34, 35). The present condrocytes (?) present in biopsy samples of human joint cartilage do not express FGFR 3. However, in a culture the cells go through a di-differentiation period thus allowing again the expression of FGFR 3; and they do not secret the specific cartilagenous extracelular matrix (33, 36). Robinson and col. in 1999 demonstrated that precursor cells of the perichondrium and other precartilaginous cells that express receptor 3 of the Fibroblast Growth Factor (FGFR 3) are good cells to be implanted in the correction of defects in the joint (?) cartilage (33, 34, 35) The presence of FGF 3 in isolated cells from the umbilical cord had not been described previously, a parameter to be underlined in an original article.


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We then carried out our study using samples of umbilical cord from donor neonates, obtained after previous informed consent. Under conditions of sterility, Wharton's jelly was obtained, and two methods to obtain cells were tested: implanting 3 mm3 explants (?) or by enzymatic disassociation. (Microphotography I). The dynamics of celular proliferation was analyzed in the cultures through the immuno detection of Bromodeoxiuridine (BrdU), and besides, through immunocytochemistry (?) the expression of receptor 3 for the Fibroblast Growth Factor (FGFR 3 as marker for conjunctive progenitor cells) was evaluated. (Microphotography 2). The percentage of cells that entered phase S in primary cultures was 19.07% ± 5.45, and 24.01% ± 12.11 and 26.02% ± 4.65 in sub cultures one and two respectively (Chart 1). Immunoreactivity for FGFR 3 was located in most of the cells in nuclei and cytoplasm (73.90% ± 3.80); in a lesser percentage only in the nucleus ( 17.74% ± 0.13); and scarcely only in cytoplasm (0.22% ± 0.13). The expression of the FGFR 3 factor in the nucleus increases in subcultures (Chart 2). This system allowed to obtain viable cells and opens up the door to be able to differentiate them in vitro with therapeutical purposes and potential applications in pathologies involving cartilaginous tissues (degenerative arthritis) or illnesses widely involving the bones (osteosarcomas) (20). Because of this, we will continue our research with the application of different in vitro stimuli, such as specific soluble factors, to different concentrations in several periods of time to the isolated mesenchymal precursor stem cells of Wharton's jelly of the human umbilical cord. If these mesenchymal precursor stem cells are endowed with primordial properties and characteristics, they will be an essential tool for the development of new therapeutical strategies geared towards the treatment of diverse illnesses in clinical practice according to the individual patient's clinical needs and his or her physiological conditions. Bioethical considerations The use of embryonic stem cells as celular and tissular therapeutics is, in the end, limited by ethical aspects, since these cells come from human embryos. The need to carry out a HLA typification to tissues derived from embryonic stem cells in order to effect allogenic transplants would require in the future the production and storage in a highly specialized cell bank, of several thousands of lines of embryonic stem cells so tissular therapy and regenerative medicine are viable. This requirement demands hundreds of thousands of


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embryos, due to the fact that to isolate embryonic stem cells as of human embryos is, up to now, an inefficient and impractical process due to the numerous ethical problems originated. Because of this, it is believed that a non embryonic source of stem cells would help overcome the bioethical conflicts associated with the use of embryonic stem cells. From the studies carried out with adult stem cells, the ones that call more our attention are those dealing with umbilical cord stem cells, as they are obtained from material that is discarded after delivery. This way, it can be concluded that the development of several thousands of blood samples from the umbilical cord geared to solve the HLA compatibility problem is more practical, as it depends only on the number of deliveries in a specific area, and on the parents' consent to donate the blood from the umbilical cord.

CONCLUSIONS In a natural manner, body tissues throughout life suffer some deterioration, from which they defend themselves by developing the intrinsic capacity to remodel those tissues that are wearing out. Should this regeneration do not exist, life expectancy of living beings would be reduced considerably. On the other hand, diverse illnesses affecting the human being are based on the degeneration and death of the different tissues conforming our body, be this in an acute manner (infarcts) or in a chronic one (degeneration, aging). The advancement of medicine has developed techniques that manage to repair tissues through transplants. However, new possibilities are breaking through. The new regenerative medicine, which has set out to regenerate from the structural/functional point of view, and not only to repair damaged tissues, using mechanisms similar to those which in the natural way that the organism uses for such a purpose and , due to the speed of the damage, it is not capable of doing in an efficient way. Stem cells then start playing a very important role. There is no doubt that these new discoveries will be a decisive strategic point in the field of the new medical treatments. Regenerative medicine, based on the therapeutical use of stem cells forestalls the increase in the incidence of degenerative diseases irreversibly associated to the increase in world-wide life expectancy and the population's aging (1, 4). All this in addition to the new knowledge in embryology and in developmental biology, of the new ways of signaling and of the biochemical and biophysical mechanisms that unleash the formation of diverse tissues for their potential use in tissular or celular therapy.


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las cÉlulas stem: sueÑo y realidad orlando chaparro

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