lc/ms/ms を用いた環境試料中の農薬分析
DESCRIPTION
LC/MS/MS を用いた環境試料中の農薬分析. 兵庫県立公害研究所 中野 武. はじめに. 環境庁の内分泌撹乱物質分析マニュアルに指定された 方法を、実際の水質や底質に適用すると、環境濃度レベル 測定には不十分な検出感度と夾雑物による妨害のため、 モニタリング調査自体の限界性を感じる場合がある。 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
LC/MS/MS を用いた環境試料中の農薬分析
兵庫県立公害研究所 中野 武
はじめに
環境庁の内分泌撹乱物質分析マニュアルに指定された 方法を、実際の水質や底質に適用すると、環境濃度レベル 測定には不十分な検出感度と夾雑物による妨害のため、 モニタリング調査自体の限界性を感じる場合がある。
そこで今回は、河川水質、底質のモニタリングを目的 として、ベノミルの分解物であるカーベンダジム（ MBC) に 関して、環境濃度レベルが把握できる検出感度と妨害物質に影響されない選択性を実現するために、 ESI 法による LC/MS/MS 法を用いた ng/L レベルでの分析法を 検討したので報告する。
LC/MS 、 LC/MS/MS の分析条件
HPLC : HP1100 MS : LCQDevelosil C30- UG- 5カラム： ESI Positive Modeイオン化法： （ ）A=移動相： アセトニトリル 225℃加熱ｷｬﾋ ﾗ゚ﾘｰ温度：
B=5mM 酢酸ｱﾝﾓﾆｳﾑ 4.5kVスプレー電圧：A=40%‐ 15min‐ 80%1min（ ） Sheath Gas 70arb：
0.5mL/ min流速： Aux Gas 10arb：20μ Lサンプル注入量：
MS/ MS条件Precursor Ion m/ z 192：
24%相対ｺﾘｼ ｮ゙ﾝｴﾈ ﾙ ｷ ﾞー ：
MS/MS の有用性
環境分析における二つの必要条件
感度（感度の向上） ・四重極型－ SIM 技術
・イオントラップ型－ Full Scan 感度の向上選択性（複雑なマトリックスの除去） ・クロマトグラフィーの分離技術の最適化
・高分解能質量分析計（磁場型）
・タンデムマススペクトロメトリー（ MS/MS ）による 化学的バックグランドから分析対象物のシグナルを 確認する能力（ S/N の向上）、確実性の向上（プロダクトイオンによるスペクトル）
Single Stage Mass Spectrum MS/MS Mass Spectrum
Isolation Event CollisionalActivation Event
MS/MS の原理
イオントラップによる MS/MS
1. Inject
2. Isolate
3. Fragment
4. Detect
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Relative Collision Energy(%)
Rel
ativ
e A
rea
m/ z160m/ z192
Collision Energy の検討
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Relative Collision Energy(%)
Rel
ativ
e A
rea
m/ z160m/z192
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Relative Collision Energy(%)
Rel
ativ
e A
rea
m/ z160m/z192
MBC Standard 2ppm
0.18ppm
0.017ppm
60 80 100 120 140 160 180 200m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
192.1
58.8
99.5193.1
74.1
100
60 80 100 120 140 160 180 200
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Rel
ativ
e A
bund
ance
160.3
192.1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Time (min)
0
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
NL: 1.96E7
NL:3.71E6
Full Scanm/z 192
MS/MSm/z 192→160
Full Scan Mass Spectra
MS/MS Spectra
MBC 標品（ 2ppm ）の分析結果[M+H]+
NH
N
NH
O
O
+
O
NH
NH
N
Rel
ativ
e A
bund
ance
m/z
Rel
ativ
e A
bund
ance
河川水中における分析例
Full Scanm/z192
MS/MSm/z160
Time (min)
Rel
ativ
e A
bund
ance
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100
60 80 100 120 140 160 180 2000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100192.1
193.199.558.8 113.8
m/z
60 80 100 120 140 160 180 2000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100160.3
192.2
161.6
Time (min)
Rel
ativ
e A
bund
ance
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100
m/z
Rel
ativ
e A
bund
ance
60 80 100 120 140 160 180 2000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
74.1192.1
138.2
57.9178.5
104.6123.997.1
m/z
Rel
ativ
e A
bund
ance
60 80 100 120 140 160 180 2000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100160.3
192.2
Full Scanm/z192
MS/MSm/z160
底質中における分析例
検量線
濃度（ ppm ）
Y = -176525+3.36667e+007*X R^2 = 1.0000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.00
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
60000000
70000000
Are
a
定量結果
サンプル 面積値 濃度（ｐｐｍ）
河川水 18870118 0.566
底質 14324366 0.431
MS/MS 分析
1. 絶対感度低下 1/10
2. 妨害・ BG 低下 BG 1/100
選択性と S/N 比の向上
Br-NP-1EC-10ppm_010215212737#21 RT: 0.54 AV: 1 NL: 5.93E4T: - c Full ms2 [email protected] [ 95.00-1000.00]
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
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75
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85
90
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297.2
Br-NP-1EC-10ppm_010215212958#34 RT: 0.90 AV: 1 NL: 7.39E4T: - c Full ms2 [email protected] [ 95.00-1000.00]
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
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lativ
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297.2
355.1
311.3
Br-NP-1EC-10ppm_010215213122#13 RT: 0.34 AV: 1 NL: 1.10E6T: - c Full ms2 [email protected] [ 95.00-1000.00]
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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75
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85
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355.0
354.4
20%
25%
30%
40%
MS/MS 分析 （ Br-NP-1EC ）
m/z 355
m/z 355
297
297
m/z 355
297OBr
OBr
OBrO
O
OBrO
O
OBrO
O
分析例 環境河川水
1. 淡路島 三原川 脇田橋 農業地帯 たまねぎ・白菜・米 ベノミル散布2. 加古川市 別府川 十五社橋 都市域 COD 有機物汚染 ワースト 5 ＋農業
wakita_03_000712150346 07/12/00 03:03:46Collision 24%
RT: 0.00 - 20.00 SM: 7G
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Rel
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danc
e
RT: 6.55MA: 29461580
RT: 6.55MA: 25388877
NL: 2.05E6TIC MS wakita_03_000712150346
NL: 1.82E6m/z= 159.0-161.0 F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00] MS wakita_03_000712150346
wakita_03_000712150346#315 RT: 6.22 AV: 1 NL: 4.66E4F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
m/z
0
20
40
60
80
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160.3
192.2
123.6 172.7119.0 199.9
淡路島 三原川 脇田橋
ESI MS/MS 192 =>160
ESI MS/MS 192 =>50-200
2900 万
2500 万
MBC
MBC
RT:6.46 分MBC
ESI MS/MS 192 =>50-200
jyugosya_03_000712155625 07/12/00 03:56:25Collision 24%
RT: 0.00 - 19.98 SM: 7G
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
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nc
e
RT: 6.46MA: 25724412
RT: 6.46MA: 22919319
NL: 1.87E6
TIC MS jyugosya_03_000712155625
NL: 1.63E6
m/z= 159.0-161.0 F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00] MS jyugosya_03_000712155625
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
m/z
100
0
50
9
0
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191.2
174.3 192.2132.1 146.6 160.3 175.1172.5120.899.0 104.8 192.9
160.3
192.1159.6 161.6146.2 199.8174.0130.9
jyugosya_03_000712155625#266 RT: 5.25 AV: 1 NL: 1.50E5 T: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
jyugosya_03_000712155625#327 RT: 6.46 AV: 1 NL: 1.63E6 F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
加古川市別府川十五社橋
RT:5.25 分
A
MBC
MBC
RT:6.46 分
A
MBC
ESI MS/MS 192 =>160
ESI MS/MS 192 =>50-200
2600 万
2300 万
ESI MS/MS 192 =>50-200
分析例 環境河川底質
1. 淡路島 三原川 脇田橋 農業地帯2. 加古川市 別府川 十五社橋 都市域3. 尼崎市 神崎川 辰巳橋
4. 明石市 明石川 嘉栄橋
wakita_03_000712171509 07/12/00 05:15:09Collision 24%
RT: 0.00 - 19.99 SM: 7G
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
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RT: 6.46MA: 21489811
RT: 6.46AA: 18899343
NL: 1.63E6
TIC MS wakita_03_000712171509
NL: 1.41E6
m/z= 159.0-161.0 F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00] MS wakita_03_000712171509
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
m/z
100
0
50
7
0
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191.2
192.3174.1
193.3100.1 164.1 177.3
160.3
192.1161.5 199.8173.3133.0 140.9 159.5150.4
wakita_03_000712171509#266 RT: 5.25 AV: 1 NL: 1.10E5 T: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
wakita_03_000712171509#327 RT: 6.46 AV: 1 NL: 1.55E6 F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
淡路島 三原川 脇田橋
ESI MS/MS 192 =>50-200
MBC
A
ESI MS/MS 192 =>50-200
ESI MS/MS 192 =>160
MBC
MBCA
jyugosya_03_000712174122 07/12/00 05:41:22Collision 24%
RT: 0.00 - 20.00 SM: 7G
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Rel
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e A
bund
ance
RT: 6.56MA: 4536919
RT: 6.54AA: 3084399
NL: 3.15E5TIC MS jyugosya_03_000712174122
NL: 2.26E5m/z= 159.0-161.0 F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00] MS jyugosya_03_000712174122
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
m/z
100
0
50
40
0
10
20
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191.2
173.3192.3114.9 160.2132.4123.880.6 163.4148.9 193.3
160.3
191.3100.3 173.9159.5 161.557.8
jyugosya_03_000712174122#271 RT: 5.35 AV: 1 NL: 9.45E4 T: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
jyugosya_03_000712174122#330 RT: 6.52 AV: 1 NL: 2.39E5 F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
加古川市別府川十五社橋
MBC
A
ESI MS/MS 192 =>50-200
ESI MS/MS 192 =>160
ESI MS/MS 192 =>50-200
MBC
MBC
A
Tatsumi_04_000712183407 07/12/00 06:34:07Collision 24%
RT: 0.00 - 20.00 SM: 15G
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Rel
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e A
bun
danc
e
RT: 6.46AA: 2241581
RT: 6.46AA: 1544641
NL: 1.91E5TIC MS Tatsumi_04_000712183407
NL: 1.08E5m/z= 159.0-161.0 F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00] MS Tatsumi_04_000712183407
60 80 100 120 140 160 180 200
m/z
100
0
50
30
0
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11
0
5
100.0
191.2
91.1 136.0 194.185.8 160.9149.0 173.6133.2100.7
191.3100.1
91.2 192.2172.7132.3114.7 193.3149.284.2 99.2 158.9 176.8147.0100.8
160.4
192.1 199.6132.8 161.8 173.3 179.6
Tatsumi_04_000712183407#213 RT: 4.20 AV: 1 NL: 1.55E4 T: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
Tatsumi_04_000712183407#270 RT: 5.33 AV: 1 NL: 4.44E4 T: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
Tatsumi_04_000712183407#327 RT: 6.46 AV: 1 NL: 1.47E5 F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
ESI MS/MS 192 =>50-200
ESI MS/MS 192 =>160
尼崎市 神崎川 辰巳橋
ESI MS/MS 192 =>50-200
AB
A
B
MBC
MBC
MBC
D:\0706Benomyl\...\kaei_03_000712141105 07/12/00 02:11:05Collision 24%
RT: 0.00 - 20.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19Time (min)
0
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100
Rel
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e A
bund
ance
6.56
6.60
5.455.37 6.30 6.78 7.85 8.15 8.43 9.978.86 11.22 12.13 18.3912.9410.29 15.02 16.014.38 14.903.99 16.13 18.35 19.0713.08 17.003.011.370.58 19.602.361.956.56
6.307.06 12.617.325.89 12.941.110.88 10.218.011.37 16.4113.9511.758.684.923.732.06 14.57 17.503.49 15.009.042.46 4.60 18.5515.9011.46 19.62
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50
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2
4
Re
lativ
e A
bu
nd
an
ce
191.2
192.2172.9160.1136.297.2 149.2 193.0132.2114.9
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明石市 明石川 嘉栄橋
ESI MS/MS 192 =>50-200
ESI MS/MS 192 =>160
A
MBC
MBC
ESI MS/MS 192 =>50-200
MBC
A
MBC の MS/MS による開裂パターンの推測
－計算化学へのアプローチー
100
60 80 100 120 140 160 180 200
m/z
0
10
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30
40
50
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80
90
Rel
ativ
e A
bund
ance
160.3
192.1
NH
N
NH
O
O
+
O
NH
NH
N
メーリングリストによる情報共有内部標準として添加する標識化合物の情報をはじめとして、 MS分析のノウハウ、失敗の共有などを進める。
日本水環境学会MS 技術研究委員会
ダイオキシン分析
Web サーバーによる情報共有
ダイオキシン国際シンポの abstract翻訳http://www.ee-net.ne.jp/dioxin2000/share.html
内分泌かく乱・ダイオキシン最新情報
<volume, page no.>47, 9-12<English title>Relative Contribution of Chlorinated Naphthalenes, Biphenyls, Dibenzofurans and Dibenzo-p-Dioxins to Toxic Equivalents in Biota from the South Coast of the Baltic sea. <Japanese title>バルト海南岸生物相の PCN, PCB, PCDD, PCDF 、毒性等価量への相対的寄与<authors>J. Falandysz, K. Kannan, M. Kawano and C. Rappe<key words>TCDD TEQs, Baltic sea , PCN, PCB, PCDD, PCDF, sediment, plankton, mussel, crab, fish, cormorant, wildlife, seafood<Japanese key words>TCDD毒性等価量 , バルト海 , PCN, PCB, PCDD, PCDF, 底質 , プランクトン , イガイ , カニ , 魚 , 鵜 , 野生動物 , 海産食品<captions>Table l. TCDD Equivalents (H4IIE EROD or H4IIE-Luc) of dioxin-like PCBs, PCNs, PCDFs and PCDDs in varioussamples from the southern of the Baltic Sea(pg/g lipid wt)Table l. バルト海南部の各種試料中ダイオキシン様の PCBs 、 PCNs 、 PCDFs 、 PCDDs の TCDD毒性当量（ H4IIE-EROD または H4IIE-ルシフェラーゼ）（ pg/g脂質重量） <summary>研究の目的は、バルト海南岸の海産生物の PCN, PCB, PCDD, PCDF におけるダイオキシン様活性、毒性等価量への相対的寄与を、提出することである。底質 , プランクトン , イガイ , カニ , 魚 , 鵜 , 野生動物 , 海産食
まとめ
マトリックスの影響を抑えたクロマトグラムによる S/N の向上、プロダクトイオンによるスペクトルから正確性の向上を図ることができた。
MS/MS の効果
より確実性が高く、高感度の定性、定量が可能。さらに複雑なマトリックス（食品中など）の へのｻﾝﾌﾟﾙ適用が期待できる。
情報の共有
メーリングリスト・ Web サーバーの活用
参考文献1 ） T.A.Roberts et al, Metabolic Pathways of Agrochemicals,1113-1137