Le CiclineLe Cicline

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI TORINOSCUOLA UNIVERSITARIA INTERFACOLTA’ PER LE

BIOTECNOLOGIE

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI

Corso di biochimicaCorso di biochimicaprof. Tiziana Crepaldiprof. Tiziana Crepaldi

Luca OrlandoLuca Orlando

Le CiclineLe Cicline

Cicline Mitotiche (M) B1/B2 Cdk1Cicline Mitotiche (M) B1/B2 Cdk1

D1/D2/D3 Cdk4/6 D1/D2/D3 Cdk4/6 E1/E2E1/E2 Cdk2Cdk2

Altre ciclineAltre cicline

Cicline G1Cicline G1

A1/A2A1/A2 Cdk2/1Cdk2/1F, G, HF, G, H

BBDD EE AA

Cicline G1/SCicline G1/S

Cicline SCicline S

Cicline MitoticheCicline Mitotiche

Mitosi scatenata da complesso B-Cdk1 attivato dopo Mitosi scatenata da complesso B-Cdk1 attivato dopo completamento della fase Scompletamento della fase S

L’attivazione B-Cdk comincia con l’accumulo della L’attivazione B-Cdk comincia con l’accumulo della ciclina mitotica durante fase G2ciclina mitotica durante fase G2

Alberts, 4th edition

Il complesso B-Cdk1 attivato media tutti gli eventi Il complesso B-Cdk1 attivato media tutti gli eventi cellulari necessari per la mitosi (condensamento cellulari necessari per la mitosi (condensamento cromosomi, assemblamento fuso mitotico,riarrangiamentocromosomi, assemblamento fuso mitotico,riarrangiamentocitoscheletro di actina/microtubuli, dissassemblamentocitoscheletro di actina/microtubuli, dissassemblamentodella lamina nucleare…)della lamina nucleare…)

Uno dei ruoli più importanti è mediare l’attivazione diUno dei ruoli più importanti è mediare l’attivazione diAPC (anafase promoting complex)La sua attività proteolitica APC (anafase promoting complex)La sua attività proteolitica permette lo svolgimento dell’anafase e la proteolisi della permette lo svolgimento dell’anafase e la proteolisi della ciclina B, terminando la mitosi.ciclina B, terminando la mitosi.

Alberts, 4th edition

Negli embrioni precoci Negli embrioni precoci l’inattivazione di B-CdK1 è l’inattivazione di B-CdK1 è datadatainteramente dall’azione di interamente dall’azione di Cdc20-APCCdc20-APC

Cellule però con fase G1 hanno bisogno di meccanismo Cellule però con fase G1 hanno bisogno di meccanismo protettivo da riattivazione di CdKprotettivo da riattivazione di CdK

Interviene molecola simile a cdc20 attivante APC: Interviene molecola simile a cdc20 attivante APC: Htc1Htc1

Alberts, 4th edition

Quindi l’attività di Htc1-APC inizia quando cdc20-APC Quindi l’attività di Htc1-APC inizia quando cdc20-APC comincia la distruzione della ciclina Bcomincia la distruzione della ciclina B

Cdc20-APCCdc20-APC attivato da B-Cdk1attivato da B-Cdk1Htc1Htc1-APC-APC inibito da B-Cdk1 (fosforilazione inibito da B-Cdk1 (fosforilazione

diretta di Hct1)diretta di Hct1)

Alberts, 4th edition

Alberts, 4th edition

ko delle cicline Bko delle cicline B

cicline B1 e B2 sono entrambe coespresse nella maggiorcicline B1 e B2 sono entrambe coespresse nella maggiorparte delle cellule dividentiparte delle cellule dividenti

B1B1 citoplasmatica, associata a microtubulicitoplasmatica, associata a microtubuliB2B2 associata alla membrana internaassociata alla membrana interna

Hanno inoltre diverso pattern di espressione duranteHanno inoltre diverso pattern di espressione durantespermatogenesi murinaspermatogenesi murina ruoli specializzatiruoli specializzati

diversidiversi

diversa localizzazione subcellularediversa localizzazione subcellulare

vengono generati ceppi omozigoti per il gene ciclina B vengono generati ceppi omozigoti per il gene ciclina B deleto della Ciclin Box, sito di contatto con Cdk1deleto della Ciclin Box, sito di contatto con Cdk1

Brandeis et al., 1998

B2B2-/- -/- Vitali, leggermente più piccoli, fertili ,Vitali, leggermente più piccoli, fertili ,nessun tessuto anormale.nessun tessuto anormale.

B1B1-/- -/- Letalità embrionale. Letalità embrionale. B1 gene fondamentaleB1 gene fondamentale

B1 probabilmente riesce a sopperire alla mancanza di B2 B1 probabilmente riesce a sopperire alla mancanza di B2 portando Cdk1 sui substrati di B2. portando Cdk1 sui substrati di B2. B2 essendo associato alla membrana non riuscirebbe B2 essendo associato alla membrana non riuscirebbe a sopperire alla mancanza di B1a sopperire alla mancanza di B1

Cicline G1Cicline G1

Cicline D (1/2/3) agiscono precocemente complessando Cicline D (1/2/3) agiscono precocemente complessando con Cdk4/6 sotto stimolo di mitogenicon Cdk4/6 sotto stimolo di mitogeni

Persiste o viene risintetizzata in base al tipo cellularePersiste o viene risintetizzata in base al tipo cellulare

La sua azione opera su gli inibitori Rb e p27La sua azione opera su gli inibitori Rb e p27

Sherr., 2004

Cicline G1Cicline G1

Attivazione E-Cdk2 amplifica effetto su Rb e p27Attivazione E-Cdk2 amplifica effetto su Rb e p27ma in modo diverso: passaggio a indipendenza da mitogenima in modo diverso: passaggio a indipendenza da mitogeni

(Sherr., 2004)

I substrati sono coinvolti direttamente nel ciclo cellulareI substrati sono coinvolti direttamente nel ciclo cellulare(istoni, centrosomi, origine di replicazione...) (istoni, centrosomi, origine di replicazione...)

La ciclina E viene poi degradata per P diretta da Cdk2La ciclina E viene poi degradata per P diretta da Cdk2GSK-3B. Cdk2 lega poi con ciclina A estendendo ruolo sinoGSK-3B. Cdk2 lega poi con ciclina A estendendo ruolo sinoa fase G2a fase G2

ko delle cicline Dko delle cicline D

D1D1-/- -/- : Vitale, più piccolo, anomalie alla retina/mammella: Vitale, più piccolo, anomalie alla retina/mammella

D2D2-/--/-: Vitale, femmine non fertili, difetti celebrali e in LB: Vitale, femmine non fertili, difetti celebrali e in LB

D3D3-/--/-: Vitale. no maturazione LT nel Timo: Vitale. no maturazione LT nel Timo

tessuto colpito specifico per quella ciclina: Ridondanzatessuto colpito specifico per quella ciclina: Ridondanza

Doppio Ko: combinazione dei Ko singoliDoppio Ko: combinazione dei Ko singoli

Es:D2/3Es:D2/3-/--/- (solo D1): Morte prenatale per anemia (solo D1): Morte prenatale per anemia megaloblastica (no linfociti maturi)megaloblastica (no linfociti maturi)

C’è però sviluppo e organogenesiC’è però sviluppo e organogenesi

Basta una sola ciclina?Basta una sola ciclina?

Proliferazione indipendente da Proliferazione indipendente da ciclina D?ciclina D?

Triplo KO: morte intrauterina ma dopo organogenesiTriplo KO: morte intrauterina ma dopo organogenesi

(Kozar et al., 2004)

Proliferazione indipendente da DProliferazione indipendente da D

Livello di E, A Cdk2 nonLivello di E, A Cdk2 nonmodificato (compensazione Cdk2modificato (compensazione Cdk2/altri meccanismi)/altri meccanismi)

MEFs incapaci di uscire da GoMEFs incapaci di uscire da GoD fondamentale per sviluppo SCD fondamentale per sviluppo SC

KO Cdk4/6KO Cdk4/6

Singolo: VitaleSingolo: VitaleDoppio: Simile effetto KO cicline DDoppio: Simile effetto KO cicline D

Cdk2 capace di legare D in vitro: complementazione?Cdk2 capace di legare D in vitro: complementazione?

KO Cdk2KO Cdk2

Vitali (fino a 2 anni!), sterili.Vitali (fino a 2 anni!), sterili.

MEFs proliferano bene dificoltà passaggio G0/ G1MEFs proliferano bene dificoltà passaggio G0/ G1

KO Cicline EKO Cicline E

Singolo E1/E2: Vitale.Singolo E1/E2: Vitale.

Doppio: Aborto per malformazione trofoblastiDoppio: Aborto per malformazione trofoblasti Embrioni tetraploidi: morte prenatale per Embrioni tetraploidi: morte prenatale per anomalie cardiacheanomalie cardiache

MEFs incapaci di uscire da G0MEFs incapaci di uscire da G0

Gene essenziale:Gene essenziale:Fenotipo più grave che mancanza Fenotipo più grave che mancanza di Cdk2: ciclina E indipendente da Cdk2 o altro partner di Cdk2: ciclina E indipendente da Cdk2 o altro partner sconosciuto.sconosciuto.

CONCLUSIONICONCLUSIONI

Negli eucarioti la presenza di Cdk molteplici permetteNegli eucarioti la presenza di Cdk molteplici permetteaumento di combinazioni (più specificità) ma ancheaumento di combinazioni (più specificità) ma anchepossibilità di interscambio possibilità di interscambio

La perdita di complessi G1- Cdk è complementato da La perdita di complessi G1- Cdk è complementato da isoforme o da altre cicline conosciute/sconosciuteisoforme o da altre cicline conosciute/sconosciute

IL fatto che vengano attivati effettori a valle anche conIL fatto che vengano attivati effettori a valle anche conko indica la presenza di meccanismi alternativi ko indica la presenza di meccanismi alternativi

Complesso D-Cdk e Cdk2 non sono essenziali per ilComplesso D-Cdk e Cdk2 non sono essenziali per ilciclo cellulare cellule somatiche. Sono però fondamentaliciclo cellulare cellule somatiche. Sono però fondamentaliassieme ad E per l’uscita dalla quiescenza (G0)assieme ad E per l’uscita dalla quiescenza (G0)

IMPLICAZIONI NEL CANCROIMPLICAZIONI NEL CANCRO

Cicline D/E fondamentali per uscita quiescenza di SCCicline D/E fondamentali per uscita quiescenza di SCImportanza in Cancer Stem Cells?Importanza in Cancer Stem Cells?

MEFs mancanti di cicline MEFs mancanti di cicline G1 o relative Cdk resistenti G1 o relative Cdk resistenti all’azione di oncogeni come all’azione di oncogeni come Ras, Myc p53DNRas, Myc p53DN

IN VIVO: IN VIVO: Cdk4Cdk4-/--/- : refrattari a tumori alla pelle mediato : refrattari a tumori alla pelle mediato da Ras, mentre i cheratinociti proliferanoda Ras, mentre i cheratinociti proliferano normalmentenormalmente D1D1-/--/- : protezione da tumore alla mammella e : protezione da tumore alla mammella e intestinaleintestinale

(Kozar et al., 2004)

Cicline G1 possibile target antitumorale?Cicline G1 possibile target antitumorale?

PRO PRO Mancanza di G1- Cdk attivato non sembra Mancanza di G1- Cdk attivato non sembra coinvolgere la funzionalità e proliferzione coinvolgere la funzionalità e proliferzione delle cellule somatichedelle cellule somatiche

Un solo target conferisce resistenza Un solo target conferisce resistenza

CONTRO CONTRO Implicazione delle cicline non ancora chiarita Implicazione delle cicline non ancora chiarita

Effetto solo con alcuni oncogeni (es Ras)Effetto solo con alcuni oncogeni (es Ras)

G1- Cdk fondamentale per differenziazioneG1- Cdk fondamentale per differenziazione stem cells.stem cells.

BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAFIA

Development of mice expressing a single D-type cyclinMaria A. Ciemerych, Anna M. Kenney, Ewa Sicinska, Ilona Kalaszczynska,Roderick T. Bronson, David H. Rowitch, Humphrey Gardner, and Piotr icinski1

GENES& DEVELOPMENT 16:3277–3289

Anticancer drug targets: cell cycle and checkpoint controlGeoffrey I. Shapiro and J. Wade Harper

Cyclin B2-null mice develop normally and are fertile whereascyclin B1-null mice die in uteroMICHAEL BRANDEIS, IAN ROSEWELL, MARK CARRINGTON, TESSA CROMPTON, MARY ANN JACOBS, JANE KIRK,JULIAN GANNO, AND TIM HUNTProc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 4344–4349, April 1998

Journal of Clinical Investigation December 1999 | Volume 104 | Number 12 1645

Mouse Development and Cell Proliferation in the Absence of D-CyclinsKatarzyna Kozar Maria A. Ciemerych,Vivienne I. Rebel Hirokazu Shigematsu,Agnieszka Zagozdzon, Ewa Sicinska,Yan Geng, Qunyan Yu, Shoumo Bhattacharya, Roderick T. Bronson, Koichi Akashi,Cell, Vol. 118, 477–491, August 20, 2004,

Living with or without cyclinsand cyclin-dependent kinasesCharles J. Sherr1, and James M. Roberts

GENES & DEVELOPMENT 18:2699–2711