Le Diagnostic Génétique Outils et Applications

Pascale Richard

UF Cardiogénétique et Myogénétique

Le contexte du diagnostic moléculaire

Les outils

L’étape clinique • Examiner attentivement

• histoire du patient

• Interroger sur ses antécédents

Définir un phénotype

• L’électromyogramme (EMG)

• L’imagerie musculaire (IRM)

• Le bilan cardiorespiratoire

Les examens

paracliniques

Les examens

biologiques

• La biopsie musculaire

• Constantes biologiques

L’analyse moléculaire

Anomalies de l’ADN

Mutations génomiques: anomalies du nombre des chromosomes

Mutations chromosomiques: réarrangement chromosomique

Mutations géniques: mutation d’une ou plusieurs bases

Sur un même Chromosome

Entre Chromosomes différents

cellule somatique ou germinale

Caryotype

Cytogénétique

Génétique Moléculaire

Maladies génétiques

Maladie récessive

Maladie dominante

Maladie multigénique

Maladie monogénique

Plusieurs gènes mutés

1 gène muté

Gène A

Gène B

Gène C

Gène D

Gène E

ou

Gène K

Gène J

Gène L

Gène P

Gène M

et

génétiquement hétérogènes

GENE

MUTE

Maladie 1

Maladie 2

Maladie 3

L’outil diagnostique est choisi en fonction du type de mutation

Le gène et ses altérations

• Mutations de type substitutions

o EXONIQUES

• Faux sens

• Non sens

o INTRONIQUES

• Sans effet : polymorphismes

• Effet sur l’épissage

• Mutations de type Insertions/délétions

o De petite taille

• Décalant le cadre de lecture

• Ne décalant pas le cadre de lecture

o De grande taille

• D’un ou plusieurs exons

• Du gène entier

100 000 mutations décrites

Identifier la mutation(s)

Séquençage complet du/des gène(s)

1. Exon par exon 2. A partir du cDNA

Recherche de mutation ciblée

1. Mutations récurrentes (SMA, or repeat expansions;

Myotonic dystrophy, OPMD …)

Analyses spécialisées

1. Deletions/duplications d’exons 2. FISH – pour grandes délétions 3. DNA combing & painting

Eg. FSHD

Analyse de liaison: Puces SNPs Dépends de la structure de la famille et du diagnostic de apparentés • Permet d’exclure des gènes • Permet de trouver de nouveau gènes

Long et cher

Limitations Danger des mutations de novo

Pour des gènes spécifiques

Pour des maladies specifiques

Différentes approches

Matériel Biologique ADN Prélèvement sanguin, Cellules Buccales (écouvillon) Cellules amniotiques * Séquençage standard d’un ou plusieurs gènes * Southern Blot

ARNm: Biopsie musculaire, foie, ….. peau (fibroblastes) * Séquençage du cDNA d’un ou plusieurs gènes * Analyse des conséquences d’épissage

Démarche diagnostique 1. Extraction des Acides Nucléiques (ADN / ARN)

2. Amplification des séquences géniques d’intérêt

• Cibler les régions • Augmenter la quantité d’ADN de ces régions

3. Détection d’une anomalie

4. Identification de l’anomalie

Analyse de l’ADN Détection d’anomalies: HRMA

Maladies dominantes: Anomalies Hétérozygotes

• Permet d’analyser de nombreux patients simultanément • Analyse fragment / fragment • Bien adapté a la détection des mutations privées dans les maladies dominantes • Les variants non pathogènes Interfèrent • N’identifie pas la mutation • Cout faible, rapide

Analyse de l’ADN Identification d’anomalies: séquençage

• Adapté aussi bien aux maladies dominantes qu’aux maladies récessives • Distinction immédiate lors de l’analyse des mutations vs polymorphismes • Analyse fragment par fragment et gène par gène

Séquence Normale

Patient

COL6A3

c.6220G>T

p.Gly2074Cys

Ne détecte pas les recombinaisons

Affectant un ou plusieurs exons du gène

Voire le gène entier

Recherche de grands remaniements

La PCR quantitative repose sur l’exploitation

de la cinétique de la PCR qui comprend

o Une phase exponentielle, modélisable

o Une phase en plateau

Ct‘s

Log copy number

Ct

va

lue

s

0 1 2 3 4 5 6 7

Certaines pathologies sont dues a des mutations particulières

qui ne sont pas détectées par le séquençage après amplification:

• Perte de la totalité d’un des deux allèles du gène (recombinaison)

• Perte de 1 ou plusieurs exons sur un allèle

• Duplication partielle ou totale d’un allèle

Amplification simultanée de plusieurs séquences cibles en condition quantitative

QMPSF et MLPA

Analyse de liaison Puces SNPs

• Permet de génotyper de nombreuses variations polymorphes en même temps

• Différentes puces (CHIPS) avec un nombre variable de SNPs

• Enrichissement en SNPs exoniques o Etudes d’association

o Copy number variations

~2.5 million (fixed)

up to 500K (custom)

Une révolution technologique Next generation Sequencing (NGS)

• Aujourd’hui

• Les gènes sont séquencés individuellement et selon une approche séquentielle qui dépends de la clinique

• Le séquençage d’un gène se fait par amplification de chaque exon (500 bp) individuellement

o Long et fastidieux

o Non exhaustif

o Cher en personnels

• Bientôt

o Tout le génome d’un individu

pourra être séquencé en 1 fois

o L’exome (toutes les séquences

codantes) de plusieurs patients

peuvent être séquencés

ensemble (60Mb)

o Plusieurs genes ciblés pour de

nombreux patients peuvent être

séquencés en 1 fois (20Gb)

Séquençage a haut débit de grandes quantités de séquences

• Séquençage simultané de grandes quantités de séquences :

Séquençage haut débit NGS: Next generation sequencing

• 3500 Mb (3,5 milliards de

paires de nucléotides) - haploide

• 27000 à 30000 gènes

• 30 megabases (Mb) • 180 000 exons

• 1% du génome

• 1Kb à 100Kb • 1 à 100 exons • (max 360 exons)

Génome Exome Gène

° Sélectionner les séquences d’intêret

° Les amplifier

° Les séquencer

NGS Amplification multiplex de gènes d’intérêt

0

50

100

150

200

250

300

Exo

n 1

a >

c.2

10

Exo

n2

Exo

n 4

Exo

n 6

Exo

n 8

Exo

n 1

0

Exo

n 1

b>

21

5E

xon

3E

xon

5 m

issi

ng

Exo

n 7

Exo

n 9

Exo

n 1

1E

xon

12

Exo

n 1

a >

c.2

10

Exo

n2

Exo

n 4

Exo

n 6

Exo

n 8

Exo

n 1

0

Sample

Forward reads

Reverse reads

Total

LMNA

NGS Capture des séquences de gènes d’intêret

Choose probes according to

the genes that you want to capture

Fragment your patient(s) DNA(s)

and Tag it(them)

Mix the probes with the patients dans

and purify the targetted sequences

Amplify all the

captured

sequences together

Sequence all the

Amplified

DNA

Bioinformatique Nouvel outil et nouveau métier pour les généticiens moléculaires

• Appliquer les critères de qualité o MQ: Score de qualité de l’alignement (MQ>20)

o QUAL: Score de qualité de détection du variant (QUAL>20)

o DPused: Robustesse de détection du variant (DP>30)

o GQ: score de qualité de l’attribution du génotype (GQ>20)

• Eliminer les régions non ciblées (untargeted) o Intergéniques, Downstream and upstream, 5’UTR et 3’UTR

o Génes non capturés (miRNA, ….)

o Introns ??

• Trier les variants restants en fonction de leur fréquence allèlique o Enlever SNVs de fréquence 0.01 >> 0.99

• Eliminer sous réserve o Variants homozygotes : Attention Chromosome X

o Variants Synonymes : Attention aux sites cryptiques d’épissage

• Interpréter en fonction des scores «in silico»

Validation et tri des variants

Exemples de représentation des résultats

p.Ala1834Thr

Mutation ponctuelle Hétérozygote

Mutation de type Indel

Mutation de type CNVs

Variants faux sens Comment interpréter le rôle pathogène

Cette interprétation n’est pas toujours possible 1. Faux positif: faux diagnostic, faux conseil génétique, faux traitement 2. Empêche d’avancer dans la réflexion de recherche du diagnostic

• Une mutation qui ne change pas l’acide aminé n’est pas toujours un polymorphisme • Un codon stop n’est pas toujours pathogène • des variations faux sens sont souvent des polymorphismes

Le problème n’est pas de trouver des mutations mais de leur attribuer un rôle pathogène en relation avec la maladie

Critères de pathogénicité d’un variant 1. Modification de l’acide aminé (analyses in silico) 2. Région protéique impliquée 3. Région conservée dans l’évolution des espèces 4. Coségrégation familiale si possible 5. Absence dans les bases de données de populations contrôles

Outils

HiSeq 2000

Life Science

Illumina

Roche 454

pyrosequencing

platforms GS FLX: 720 MB

GS Junior: 35MB

PGM: 10 MB to 1 GB

MySeq: 120 MB –7.5 GB

HiSeq: 600 GB

Avantages et limites

• Obtention de la séquence de nombreux gènes simultanément

o Analyse exhaustive des gènes impliqués dans un phénotype

o Diagnostic plus complet et plus rapide

o Cout moindre que l’analyse gène à gène

• Analyse Bioinformatique

• Interprétation des variants identifiés / faux positifs

• Manipulation délicate sans automatisation

• Cout élevé (1000/1500 euros par patient) mais relatif

o Non adapté à l’analyse de mutations ciblées (apparentés, ) o Non adapté à un diagnostic d’urgence (DPN…) o Essential de corréler les variants identifiées avec la clinique, les examens paracliniques

Conclusion

• Le premier outil essentiel est la correcte définition du phénotype

• Collaboration étroite entre praticiens de disciplines complémentaires

• L’analyse génétique est en pleine évolution technologique

• Le diagnostic moléculaire apporte un diagnostic de certitude et est indispensable au conseil génétique, la prise en charge et la thérapeutique éventuelle