A

280 nm 250 nm 220 nm

Lehrstuhl für Allgemeine Lebensmitteltechnologie

Prof. Dr. K.-H. Engel

Seminarunterlagen (W. Weiss)

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LebensmittelchemischesSeminar

Walter Weiss

Wintersemester 2011/12

• Lebensmittelchemische Analytik: Notwendigkeit, Praxis-

anforderungen, Methoden

• Versuchsvor- und Nachbereitung, Probenvorbereitung,

Durchschnittsprobe, statistische Auswertung, Fehler

• Mineralstoffbestimmung (Veraschung)

• Wassergehalts- bzw. Trockenmasse-Bestimmung

• Protein- und Aminosäureanalytik

• Kohlenhydratanalytik

• Fettanalytik (Fettgehalt; Kennzahlen; Fettsäurespektrum)

• Enzymatische Analysen

• Optische Methoden (UV/Vis-Photometrie)

• Schnellmethoden (Teststäbchen, Reflektometrie)

• Chromatographische Trenntechniken (DC, GC, HPLC)

• Anwendungsbeispiele

Lebensmittelchemische Analysen Liefern objektive Kriterien zur Beurteilung eines Lebensmit- tels, z.B. hinsichtlich seines Genuss- bzw. Nährwerts, der Anwesenheit unerwünschter bzw. gesundheitsschädlicher Inhaltsstoffe, seiner Haltbarkeit/Lagerstabilität etc.

Einsatz lebensmittelchemischer Analysen in der1) amtlichen LM-Überwachung: Schutz der Gesundheit des Verbrauchers sowie Schutz vor Irreführung und Täuschung

2) LM-Produktion: Qualitätskontrolle, Rohstoff- und End- kontrolle, Prozessüberwachung, Anlagenreinigung etc.

3) LM-Forschung und -Entwicklung: Entwicklung neuartiger Produkte oder Herstellungsverfahren

Rechtliche Aspekte:• Hersteller sind verpflichtet, ausschließlich sichere Lebens- mittel in den Verkehr zu bringen

• Verbraucherschutz und LM-Sicherheit liegen an erster Stelle in der Verantwortung des Herstellers (Produkthaftung!)

-> umfassende Qualitätskontrollen (Eigenkontrollen) nötig

• Hersteller trägt die Beweislast, dass nicht er einen Fehler seines Produktes verursacht hat!

Lebensmittelchemische Analytik:• Hauptbestandteile eines Lebensmittels: Proteine, Fette, Koh- lenhydrate, Mineralstoffe, Wasser; ggf. Alkohol u.a.

• Spezielle Inhaltsstoffe, z.B. Vitamine, Spurenelemente, Cof- fein, Zusatzstoffe (Konservierungs-, Süß-, Farbstoffe; Anti- oxidantien), toxische Inhaltsstoffe, Schwermetalle, Allergene

• Ausserdem: Verfälschungen; Frische- bzw. Verderbszustand; Lagerstabilität; Erhitzungsverfahren bei Milch etc.

Begriffsbestimmung:

„Nachweis“ = „vorhanden / nicht vorhanden“ (qualitativ)„Bestimmung“ = „wie viel?“ (quantitativ)

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Methoden

1) „Klassische“, meist nasschemische Verfahren• meist gravimetrisch/titrimetrisch (Wägung: sehr präzise!)• oft: amtliche Methode (Schieds- oder Referenzmethode)• für „Notfälle“ (z.B. bei Ausfall eines Analysenautomaten)• niedrige Anschaffungs- und Gerätekosten• werden oft zur Kalibrierung von Schnellmethoden eingesetzt

Nachteile / Einschränkungen:• meist nur Summenparameter (Fett, Protein etc.) bestimmbar• arbeits- und zeitaufwändig• z.T. hoher Chemikalienverbrauch; Abfallentsorgung (teuer)

2.) Schnellbestimmungsmethoden• z.B. Dichte- oder Volumenmessung; Refraktometrie; Test- stäbchen (Dip-Stick); Reflektometrie; DC (halbquantitativ)• schnell, preiswert -> für Routineanalytik• meist zur Prozesskontrolle während der LM-Produktion• ideal zum Nachweis einer Grenzwertüber- oder Unter- schreitung oder zur „Vorselektion“ von Analysenproben

Nachteil: weniger präzise als Referenzmethoden

3) Instrumentelle (teil- bzw. vollautomatisierte) Verfahren• HPLC, GC, FT-IR, NMR, enzymatische Analysen, ELISA• z.T. simultane Bestimmung mehrerer Parameter (Fett, Zucker, Protein; z.B. mittels Milkoscan oder Winescan)

• meist sehr schnell; z.T. auch sehr präzise

• Nachteile• hohe Anschaffungs- (Geräte-) Kosten• z.T. häufige Kalibrierung erforderlich• z.T. komplizierte Auswertung

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Beispiel: Dichtebestimmungsverfahren

Aräometer(Schnellmethode,

volumetrisch)

Biegeschwinger(instrumentelle Analytik,

vollautomatisiert)

Pyknometer(Referenzmethode,

gravimetrisch)

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Vor- und Nachbereitung quantitativer Messungen

• Auswahl der geeigneten Analysenmethode• Probenahme und Probenvorbereitung / -aufbereitung• eigentliche Bestimmung des Analyten• Auswertung

Auswahl der Methode: je nach Anforderungsprofil• Routineanalytik (Zeitbedarf!) -> schnell; meist aber weniger exakt• falls hohe Präzision erforderlich -> Referenzmethoden; zur Kalibrierung• hoher Probendurchsatz -> parallele anstelle serieller Analysen• Sensitivität (Nachweisgrenze) und Spezifität• Analysenkosten (pro Analyse; Anschaffungskosten; Verbrauchsmaterial;

Kosten für Abfallentsorgung etc. )• Automatisierbarkeit• ist speziell ausgebildetes Personal erforderlich?• werden spezielle Laboreinrichtungen benötigt? (Abzug, Isotopenlabor)• Sicherheitsaspekte (-> toxische Chemikalien; Unfall- / Brandgefahr)

Probenvorbereitung bzw. Probenaufbreitung• repräsentative Probe; Durchschnittsprobe -> zerkleinern, homogenisieren• Beispiele: Käse, Wurst, Milch• nach dem Homogenisieren: luftdicht verpacken (dicht schließendes

Schraubdeckelgefäß); vor jeder Probeentnahme durchmischen!• ggf. Abtrennung störender Inhaltsstoffe (z.B. durch Carrez-Klärung)• ggf. Anreicherung bestimmter Inhaltsstoffe (Spurenbestandteile)

Auswertung-> Mehrfachbestimmung, Durchschnittswert, Standardabweichung,

Präzision und Richtigkeit, „wahrer“ Wert, Fehlererkennung ...

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Repräsentative Probe / Durchschnittsprobe

Käselaib: Segment(„Kuchenstück“)homogenisieren

Milch

Milch: rahmt auf-> vorsichtig mischen

(Lufteintrag vermeiden,sonst Dichteänderung!)

Wurst; pflanzliche LM:nichtessbare Anteile

(Pelle, Schale) entfernen!

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Bestimmung von Mineralstoffen („Asche“)

Hauptsächlich zwei Verfahren angewandt:• Trockene Veraschung• nasse (feuchte) Mineralisierung

1) Trockene VeraschungAsche = „der bei der vollständigen Verbrennung der organischen Substanzverbleibende Rückstand“ (= überwiegend Mineralstoffe; evtl. auch Sand!)

Arbeitsweise• Porzellan- oder Platintiegel glühen und wiegen

• Probe in den Porzellan- /Platintiegel einwiegen

• Verkohlen mit IR-Strahler + Bunsenbrenner

• dann Verbrennen der organischen Substanz imMuffelofen bei ca. 520-550°C; Zeitbedarf: 2-3 h

• Temperatur: < 550°C, da Alkalihalogenide beiTemperaturen > 550°C flüchtig! (-> Salz-Verluste!)

• Nach vollständiger Veraschung: Tiegel im Ex-sikkator abkühlen lassen und zurückwiegen

• Meist: Zusatz von Reaktionsbeschleunigern(„Veraschungshilfen“) z.B. H2O2, Mg-Acetat

• Magnesiumacetat:

- Peroxidbildung -> Sauerstoffüberträger

- thermische Zersetzung -> Aufblähen -> Ober-

flächenvergrößerung -> besserer Luftzutritt

-> schnellere Verbrennung der organischen Substanz

Nachteil: Mg-Acetat verbrennt nicht rückstandsfrei

-> „Blindversuch“ mit Mg-Acetat erforderlich

EinschränkungNicht geeignet zur Bestimmung leicht flüchtigerMetalle (insbesondere für toxische Spurenele-mente, z.B. As-, Hg-, Cd-, Pb-Verbindungen), dazu hohe Verluste auftreten - > in diesem Fall:„nasse“ Mineralisierung durchführen

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2) Nasse (feuchte) Mineralisierung („nasse Veraschung“)

Bei der nassen (feuchten) Mineralisierung wird die Analysensubstanz mitflüchtigen Oxidationsmitteln in der Hitze behandelt, bis die gesamteorganische Substanz zersetzt ist. Meist in einem Druckaufschlussgefäßoder unter Rückflusskühlung -> Verluste werden weitgehend vermieden

Oxidationsmittel:• konz. Schwefelsäure + Salpetersäure• Perchlorsäure (60%)• 65%-ige Salpetersäure (HNO3)• seltener: 50%-iges Wasserstoffperoxid (H2O2)

Hauptanwendungsgebiet:• Probenvorbereitung zur Bestimmung leicht

flüchtiger (v.a. toxischer) Spurenelemente• Eigentliche quantitative Bestimmung: mittels

Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)

Rückfluss-apparatur

Zerstäuber

Linienstrahler(Hohlkathoden-

lampe)

Mono-chromator

Detek-tor

Flamme mitsalzhaltiger

Probe

Prinzip der AAS

Druckaufschluss-gefäss

Kontinuierliches, sowie Emissions-und Absorptionsspektrum

Flammeohne Probe

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Bestimmung des Feuchtigkeitsgehaltes(Wasser- bzw. Trockenmassebestimmung)

• chemische Methoden (Wassergehalt direkt bestimmbar)• physikalische Methoden (nur indirekt, d.h. Trocknungsverlust)

Chemische Methoden

1) “Carbid-Methode“ (selten angewandt)

CaC2 + 2 H2O -> Ca(OH)2 + C2H2

Messung des Volumens oder Drucks

Vorteile:• sehr schnelle und einfache Messung

-> „Feldmethode“ bei pflanzlichen Produkten• Anhand der Einwaagemenge des Messgutes

und dem angezeigten Druck kann der jeweiligeFeuchtigkeitsgehalt direkt auf dem Manometerabgelesen werden

Nachteil: Bestimmung ist nicht allzu genau

2) Karl-Fischer-Titration (in der Praxis von großer Bedeutung)

SO2 + I2 + 2 H2O <--> H2SO4 + 2HI (Prinzip)

Vorteile• sehr spezifisch und empfindlich• automatisierbar• ideal für geringe Wassermengen;

Referenzmethode bei LM mit H2O-Gehalt < 10% (z.B. Mehl)

• Kristallwasser wird mit erfasst(z.B. bei Glucose-Monohydrat)

Nachteile• relativ langsam (Titration)• hohe Chemikalienkosten,

insbesondere bei LM mithohem Wassergehalt Karl-Fischer-Apparatur

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Physikalische Wasserbestimmungmethoden(-> Bestimmung des Trocknungsverlustes)

1) Trocknen im Trockenschrank („Seesandmethode“)Prinzip: Es wird die Differenz zwischen dem Probengewicht (Masse)vor und nach dem Trocknen unter Normaldruck und erhöhter Tem-peratur (meist 103°C) ermittelt

Durchführung:

• Probe homogenisieren und gut zerkleinern

• flache Metallschale (Alu) mit Seesand (zwecksOberflächenvergrößerung) sowie Glasstabmit abgeplattetem Ende bei 103°C vortrocknenund auf ± 1 mg genau wiegen

• Probe auf ± 1 mg genau einwiegen und bei 103°C2-3 h lang bis zur Massenkonstanz trocknen(-> Masse darf nicht mehr abnehmen)

• eventuelle Massenzunahme (aufgrund vonFettoxidation) nicht berücksichtigen

• Alu-Schale vor dem Zurückwiegen im Exsikkator abkühlen lassen

Fehlermöglichkeiten:• Temperatur zu niedrig oder Zeit zu kurz gewählt (-> Wasser nicht

vollständig verdampft) -> Kontrollthermometer!

• Bildung von Wasser durch chemische Reaktionen (z.B. Maillard-Rkt.)-> ggf. Vakuumtrockenschrank bei ca. 70°C verwenden

• Falls Gewichtszunahme während des Wägevorgangs:Hygroskopische Proben absorbierenFeuchtigkeit aus der Luft

-> Alu-Schale sofort nach der Entnahmeaus dem Exsikkator wiegen

-> notfalls Massezunahme gegen die Zeitauftragen und graphisch oder rechnerischauf den Zeitpunkt t = 0 extrapolieren

Massenzunahme bei hygroskopischen Proben

Glasstäbchen, an einem Endeabgeplattet

Flache Alu-Schale mit Seesand,vorgetrocknet und genau gewogen

t [min]

[g]

0 2 5

100

101

XX

XX

11

Vorteile• relativ preiswert (Trockenschrank, Waage, Alu-Schalen, Seesand)• „parallele“ Methode (simultane Analyse mehrerer Dutzend Proben)• relativ geringer Arbeitsaufwand• gute Reproduzierbarkeit der Werte-> vielfach als Referenzmethode (amtliche Methode) vorgeschrieben

Nachteile• Hoher Zeitaufwand (3-4 h)• Andere flüchtige Stoffe (Alkohole, ätherische Öle) werden mit erfasst• Eigentlich wird nicht der Wassergehalt, sondern der Trocknungs-

verlust bestimmt -> ggf. Kalibrierung mit einer chemischen Wasser-bestimmungsmethode (z.B. nach Karl-Fischer) empfehlenswert

• Bei thermolabilen Stoffen (z.B. Honig) zu hohe Werte aufgrund vonZersetzungen bzw. chemischen Reaktionen (z.B. Maillard-Reaktion)

• Variante: Vakuumtrockenschrank bei 70°C

2) Infrarot-Trocknung

Vorteile• schneller als Trockenschrankmethode

(10-30 min)• in Kombination mit integrierter Waage

automatisierbar; On-line Messung

Nachteile• Probe nur in dünner Schicht einbringen• Kalibrierung durch Referenzmethode

(z.B. Trockenschrank-Seesand oder Karl-Fischer- Methode) erforderlich

Anwendungsgebiete• Schnellmethode, v.a. während der LM-

Produktion z.B. bei Fleischwaren, Fisch

3) Mikrowellen-Trocknung

Vorteil: sehr geringer Zeitbedarf (5-10 min)

Nachteile: ähnlich wie IR-Trocknung

Mikrowellen-Trockner

IR-Trockner

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Prinzip:Das im Lebensmittel enthaltene Wasserwird mit einer hydrophoben Flüssigkeit(„Schlepper“), meist Toluol oder Xylol,aus der Analysenprobe abdestilliert.

Nach Kondensation in einem graduiertenRöhrchen kann das Volumen des abge-schiedenen Wassers abgelesen werden.

Vorteil• Einsatz großer Probemengen möglich

-> ideal für inhomogene Lebensmittel(z.B. Sauerkraut) oder fettreiche,hochviskose Proben (z.B. Cremes)

Nachteil• relativ ungenau, da Volumenmessung

4) Azeotrope Destillation

5) Spezielle Methoden zur Bestimmung eines Wasserzusatzes

5.1 Kryoskopie (Gefrierpunktsbestimmung)

Prinzip: Durch Zusatz von Wasser wird der Gefrier-punkt einer Lösung (z.B. Milch) angehoben-> Nachweis / Quantifizierung einer Verwässerung

Vorteile• prinzipiell sehr genau; beste Methode bei Milch• automatisierbar (in diesem Fall auch sehr schnell)

Nachteil• sehr exakte Temperaturmessung nötig (bei Milch:< 0.01°C um 2% Wasserzusatz festzustellen)

Beispiel:• Gefrierpunkt von unver- fälschter Milch: - 0,53°C• Gefrierpunkt einer ver- wässerten Milch: - 0,48°C-> ca. 10% Wasserzusatz

Kryoskop; 30 Proben/h13

Heizplatte

Probe mit„Schlepper“

Rückfluss-kühler

Sk

ala

konden-siertesWasser

5.2 Weitere Methoden zum Nachweis eines Wasserzusatzes

• Dichtemessung (Pyknometer, Aräometer, Biegeschwinger)

• Refraktometrie (z.B. „Serumrefraktion“ bei Milch)

ZUSAMMENFASSUNG: Wasserbestimmung - warum?• Nachweis von Verfälschungen bzw. Verwässerungen (Milch!)

• Haltbarkeit eines LMs hängt vom Wassergehalt (exakter: von seinerWasseraktivität) ab (-> Mikroorganismen; Enzymaktivitäten)

• Zur Brennwertberechnung: Kohlenhydratbestimmungen sind meistschwierig -> daher oft: % KH = 100 - (Wasser + Fett + Protein + Asche),sofern keine größeren Mengen anderer Bestandteile im LM vorhan-den sind (z.B. Ballaststoffe)

• Prinzip: Dichte bzw. Brechungsindex einer Lösung verändern sichbei Wasserzusatz. Änderung ist (innerhalb gewisser Grenzen) pro-portional zur zugesetzten Wassermenge

• Vorteil: sehr schnelle Messung (Ausnahme: Pyknometer)

• Beachte: exakte Temperierung erforderlich, da Volumen (-messung)stark temperaturabhängig!

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Protein- und Aminosäureanalytik

• Proteine sind aus Aminosäuren aufgebaut; ihr Stickstoffgehalt schwankt nur innerhalb enger Grenzen (N � 15-18%; ø 16%)

• andere Stickstoffquellen im LM sind i.a. zu vernachlässigen• Aus diesen Gründen wird der Proteingehalt eines Lebensmittels üblicherweise über dessen Stickstoffgehalt bestimmt• In der Praxis zwei Verfahren: a) nach Kjeldahl b) nach Dumas

• Probe wird mit konz. Schwefelsäure in Gegenwart eines Katalysators(meist Kupfersulfat) oxidativ aufgeschlossen. Zusätzlich Zugabe von

K2SO4 zur Erhöhung des Siedepunktes (ca. 370°C !)-> Proteinstickstoff wird in Ammoniumsulfat übergeführt:

Proteinstickstoff (NH4)2SO4

konz. H2SO4

Katalysator, ��T

• Nach beendetem Aufschluss: Kolben abkühlen (!) lassen. Nach Zu-gabe von dest. Wasser und NaOH im Überschuss (alkalische Reaktionüberprüfen!) wird aus dem Ammoniumsulfat [(NH4)2SO4] Ammoniak(NH3) freigesetzt (die starke Base NaOH verdrängt die schwache BaseNH3 aus ihrem Salz) und durch Wasserdampfdestillation in eine säure-haltige Vorlage (meist Borsäure) übergetrieben

(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 H2O + 2 NH3 + Na2SO4

Verfahren nach Kjeldahl

Ve

rein

fac

hte

Da

rste

llu

ng

!

15

konz. H2SO4 + Kat. + �T

+ NaOHH3BO44

HCl

• NH3 wird durch die Borsäure (schwache Säure) in der Vorlage gebunden:

H3BO3 + NH3 (NH4)H2BO3(vereinfachte Darstellung)

• Die Menge des gebundenen Ammoniaks (NH3) wird durch Titrationmit 0.1 M Salzsäure (HCl) („Verdrängungstitration“) bestimmt

(NH4)H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO3

• Aus dem HCl-Verbrauch lässt sich der Stickstoffgehalt N der Probe, undaus diesem der Rohproteingehalt P unter Zuhilfenahme eines LM- bzw.proteinspezifischen Faktors F („Kjeldahlfaktor“) (meist 6,25) berechnen:

Lebensmittel LM-/protein-spezifischer

Faktor F

Milch 6,38Fleisch, Fisch, Ei 6,25Gelatine 5,55Nüsse 5,40

Kjeldahl-Kolben

Wasserdampf-Destillation

(vereinfachte Darstellung)

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NaOH-Überschuss

H3BO3

Kühler

P = N x F

Beispiel:N-Gehalt (Ei) = 2,0%Proteingehalt = (2,0 x 6,25)%

= 12,5%

Apparative Ausstattung

Kjeldahl - Originalapparatur Konventionelle Apparaturfür parallele Analysen

Vollautomatische Apparaturfür multiple Analysen

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Hauptvorteile des Kjeldahl-Verfahrens• zuverlässige und robuste Methode; offizielles Referenzverfahren

• preisgünstig bei Verwendung der „konventionellen“ Apparatur; kannohne hohe Investitionskosten in kleineren Labors etabliert werden

• sowohl für Serien- als auch für Einzelbestimmungen geeignet• „parallele Methode“ -> simultane Analyse von bis zu 24 Proben

• Mikro-, Halbmikro- und Makroverfahren (0,1 - 5 g Probeneinwaage)

Nachteile des Kjeldahl-Verfahrens• relativ hoher Chemikalienverbrauch (zusätzlich:

Abfallentsorgung -> Kosten!)

• umweltschädliche bzw. aggressive Chemikalien

• beim Aufschluss werden saure/korrosive Dämpfefreigesetzt! Gesundheitsgefahr! -> spezielle La-borausstattung (Abzug, Absaugung) erforderlich

• relativ lange Aufschlusszeit (ca. 120 min) -> Zeit-bedarf ca. 3 h (aber: simultaner Aufschluss undDestillation von bis zu 24 Proben möglich)

• hoher Arbeits- und Zeitaufwand bei nicht-auto-matisierten Verfahren So nicht!

Melamin(Cyanursäuretriamid)

Fehlermöglichkeiten• unvollständiger Aufschluss (z.B. zu niedrige Temperatur; Schwefel-

säure nicht konzentriert genug; ungeeignete Katalysatoren etc.)

• N-Verluste beim Aufschluss durch Eindampfen bis zur Trockene(zu geringe Schwefelsäuremenge; Temperatur zu hoch gewählt)

• Ammoniakverluste bei der Destillation (Destillationsapparatur un-dicht; Destillationszeit zu kurz; Ende des Kühlerröhrchens tauchtnicht in die säurehaltige Vorlage ein)

• pH-Wert der zu destillierenden Flüssigkeit nicht alkalisch -> pH-Wertmit Indikatorpapier überprüfen und ggf. ausreichend NaOH zugeben

• methodischer Fehler bei Anwesenheit größerer Mengen andererstickstoffhaltiger Verbindungen (z.B. Nucleinsäuren)(kommt in der Praxis jedoch kaum vor)

• Vortäuschung eines höheren Proteingehaltesin Lebensmitteln durch einen (verbotenen!)Zusatz stickstoffhaltiger Verbindungen, wiez.B. Melamin in Milchpulver (China 2006/08)

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Stickstoffbestimmung nach Dumas

Vorteile im Vergleich zum Kjeldahl-Verfahren

• Extrem kurze Analysenzeit (nur 3-5 min pro Probe)• Keine aggressiven Chemikalien erforderlich• Hoher Automatisierungsgrad• Ideal für Serienanalysen

Nachteile• Hohe Investitionskosten; ausserdem hochreine Gase erforderlich

• neben Amino- (Protein-) Stickstoff werden auch andere Stickstoff-verbindungen (z.B. Nitroverbindungen (R-NO2) erfasst

• für Einzelanalysen: Kjeldahl-Verfahren günstiger

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O2

CO2

CuO + CuO Cu-NetzSubstanz ca. 900°C

50% KOH

N2

Apparativer Aufbau (Prinzip)

2 Cu + 2 NO 2 CuO + N2

O

O

N2

Prinzip• Vollständige Oxidation des organischen Materials in der Probe

durch Verbrennung in einer Sauerstoff-Atmosphäre bei Tempe-raturen von 900°C - 1000°C

• Die Verbrennungsgase (CO2, H2O, NOx und N2 werden überheisses Kupfer geleitet um Sauerstoff zu entfernen und vor-handene Stickoxide (NOx) in Stickstoff (N2) umzuwandeln

• Das resultierende Gasgemisch wird durch eine CO2- / H2O-Fallegeleitet

• Das verbliebene N2 wird volumetrisch (traditionelle Methode)oder -bei vollautomatischen- Apparaturen mittels eines Wärme-leitfähigkeitsdetektors bestimmt und aus der Stickstoffmengeder Proteingehalt anhand einer Umrechnungsformel ermittelt

Automatisierte Stickstoffbestimmung nach Dumas

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Detektor

Probe

Helium

O2 -Zufuhr

Ofen

CuO

Kupfer

Wasser-Konden-

sator

CO2-Entfernung

GC-Säule

WLDWLD

Spezielle Protein- und Aminosäure-bestimmungsverfahren

Beispiele:• kolorimetrisch-photometrische Proteinbestimmungsmethoden

(z.B. nach Lowry oder Bradford)

• Formoltitration

• Hydroxyprolinbestimmung (Bindegewebe)

Prinzip: In Gegenwart von Proteinen undsaurem pH-Wert -> Verschiebung desAbsorptionsmaximums von CBB 250 Gvon 465 nm zu 595 nm (rot-violett)-> photometrische Bestimmung

Coomassie Brilliant Blue 250 G

Einsatzgebiet: Vor allen in der klinischen Chemie und Biochemie; sel-tener in der LM-Analytik (früher: Proteingehaltsbestimmung von Milch)

Farbstoffbindungsmethode nach Bradford

Formol-Titration

• Zur summarischen Erfassung von freien Aminosäuren, z.B. in Fruchtsaft

• Die Formolzahl bezeichnet die Menge an 0.1 M NaOH-Lösung in ml, diezur Neutralisation der H+-Ionen verbraucht wird, die bei der Reaktion von100 ml Untersuchungsflüssigkeit mit einer wässrigen Formaldehyd-

Lösung freigesetzt werden

R-CH-COO- + 2 HCHO R-CH-COO - + H+

I INH3

+ N-(CH2OH)2

Aminosäure FormaldehydTitration mit0.1 M NaOH 21

Kalibrierkurve

Hydroxyprolin-(Bindegewebs-)Bestimmung

• Die Aminosäure 4-Hydroxyprolin kommt nur in Bindegewebe vor, undzwar in einem konstanten Anteil von ca. 12.5%

• Sie kann somit zur Bestimmung des Bindegewebsanteils (Sehnen,Knorpel, Haut) in Fleischwaren dienen

Prinzip• Hydroxyprolin (I) wird durch saure Hydrolyse aus dem Bindegewebs-

eiweiß freigesetzt und durch Chloramin T zu einen Pyrrol (II) oxidiert

• Dieses Oxidationsprodukt bildet mit zugesetztem p-Dimethylamino-benzaldehyd (III) ein rotgefärbtes Kondensationsprodukt (IV), dessenKonzentration bei 558 nm photometrisch bestimmt wird.

(I) (II) (III) (IV)

+

+

Saure Protein-Hydrolyse

Farbreaktion (s.o.)

Photometrische MessungHyp-Konzentration aus der

Kalibrierkurve ablesen

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Ox.

6N HCl

Kohlenhydrat- / Zuckeranalytik

• Gesamt-Kohlenhydratbestimmung: z.B. zur Brennwertberechnungeines Lebensmittels

• Oder: Bestimmung einzelner Zucker (Glucose, Fructose etc.) zurBeurteilung der Eignung eines Lebensmittels für Diabetiker

• Oft sehr komplexe Zucker- /Kohlenhydratzusammensetzung vielerLM (z.B. Glucose, Fructose, Saccharose, Lactose, Stärke, Inulin)-> Analytik gestaltet sich demzufolge manchmal als schwierig

• Meist einfacher: % KH = 100 - (Protein + Fett + Wasser + Asche)sofern im LM keine nennenswerten Mengen anderer Inhaltsstoffe(z.B. Ballaststoffe) enthalten sind

• Zuverlässigste Bestimmungsmethoden: Enzymatik und HPLC

Quantitative Zuckerbestimmung durch chemischeSummenmethoden (z. B. Methode nach Luff-Schoorl)

• Basieren auf dem Reduktionsvermögen verschiedener Zucker gegen- über Cu2+ - Ionen: Die reduzierenden Zucker reagieren mit den Cu2+-

Ionen und werden dabei oxidiert, während Cu2+ zu Cu+ reduziert wird:

2 Cu2+ Cu2O

• Anschliessend: Bestimmung des Überschusses an Cu2+ -Ionendurch Zugabe von Kalium-Iodid -> Bildung von schwerlöslichemKupfer(I)iodid, bei gleichzeitiger Oxidation von Iodid zu Iod, dessenMenge durch Titration mit Natriumthiosulfat-Maßlösung ermittelt wird:

2 Cu2+ + 4 I- 2 CuI + I2

Einschränkungen• exakte Einhaltung der Reaktionsbedingungen,

da die Reaktion nicht exakt stöchiometrisch!

• Störend wirken: Reduktone, Ascorbinsäure etc.

• Saccharose: wirkt nicht reduzierend (s. Abb.)-> erst nach saurer Hydrolyse bestimmbar

• 1 g Lactose oder Maltose � 0.5 g Glucose

-> wichtig für Analytik: Kenntnis der genauenZuckerzusammensetzung des LMs

-> dünnschichtchromatographische Analyse

Titration mit Na2S2O3

Reduktionsvermögeneinzelner Zucker

Glc Frc Sacch

(blau -> rot)

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Dünnschichtchromatographischer Nachweis einzelner Zucker

• Ermittlung der Zuckerzusammensetzung eines Lebensmittels

• schnelle, einfach durchführbare, preiswerte und zuverlässige Methode

• Fleckengröße und -intensität ermöglichen eine halbquantitative Abschätzung der Menge der einzelnen Zucker

• oft auch zur „Vorselektion“ von Proben für weitere Analysen eingesetzt

Enzymatische Bestimmung einzelner Zucker

• UV-photometrische Tests zur Bestimmung von Monosacchariden (z.B. Glucose, Fructose), Disacchariden (Saccharose, Lactose, Maltose) und Polysacchariden (Stärke, Inulin)

• Vorteile: hochspezifische Bestimmung einzelner Zuckerarten in Gemischen

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A AV1 V2

Analytik von Speisefetten und -ölen1) Bestimmung des Fettgehaltes (Gesamtfett oder „freies“ Fett)2) Charakterisierung von Fetten und Ölen: chemische Kennzahlen;

Fettsäurezusammensetzung; Frische- oder Verderbszustand etc.

3) Analytik von Fettbegleitstoffen (Sterole; fettlösliche Vitamine etc.)

Methoden zur Erfassung der Lipide („Fettbestimmung“)• z.B. zur Nährwertberechnung: Früher galt Fett in LM als wertgebender

Bestandteil; heute („Schlankheitskult“) eher als unerwünschter Be-standteil, den es zu minimieren gilt (Light-Produkte)

• ausserdem: Isolierung des Fettanteils für weitergehende Analysen,z.B. zur Bestimmung des Milchfettanteils im LM, oder der Menge anessentiellen Fettsäuren (Linol-, Linolensäure) in Lebensmitteln

Gesamtfett = �� [freies (ungebundenes) Fett + gebundenes Fett]

Extraktionsverfahren

• ohne Aufschluss: nur Bestimmung des „freien“ Fettes• mit Aufschluss: Bestimmung des Gesamtfettgehalts• kontinuierliche oder diskontinuierliche Extraktionsverfahrten

Schnellmethoden

Prinzip:• zerkleinerte, homogenisierte und getrocknete

Probe mit einem organischem Lösungsmittel(z.B. Diethylether, Petroleumbenzin, Hexan,Dichlormethan etc.) extrahieren

• dann fetthaltige Phase abtrennen, z.B.durch Zentrifugation, Filtration oder (nachPhasentrennung) im Scheidetrichter

• Extraktion mehrmals wiederholen• Fettgehalt der org. Phase bestimmen:

- Dichtemessung- Refraktometrie- gravimetrisch nach Abdampfen des organ.Lösungsmittels und Wiegen des Rückstands(genaueste Methode, aber zeitaufwendig)

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FetthaltigeProbe

Lösungsmittelzugabe Fettextraktion Dekantieren

Extrakt

Prinzip:

• zerkleinerte, wasserfreie Analysenprobemit organischem Lösungsmittel extrahieren

• ca. 15 - 20 Durchläufe (entscheidend fürdie Effizienz ist nicht die Extraktionszeit,sondern die Anzahl der Durchlaufzyklen!)

• Lösungsmittel abdampfen

• Kolben mit Fett bei 103°C trocknen

• Kolben zurückwiegen (Differenzwägung)

In der Extraktionshülse befindet sich das zu extra-hierende Material. Durch das rechte Rohr (Dampf-rohr) steigt aus dem darunter befindlichen Kolbendas Lösungsmittel auf, das im Kühler (oben) kon-densiert und dann in die Extraktionshülse tropft.Dort löst das Lösungsmittel das Fett aus der Probeheraus. Durch weiter zutropfendes Lösungsmittelsteigt der Flüssigkeitsspiegel in dem Soxhlet-Auf-satz, bis er die Höhe der Biegung des dünnen Heber-röhrchens erreicht hat. Auf Grund der dann auftre-tenden Saugheberwirkung wird die Flüssigkeit mitdem Fett in den darunter liegenden Kolben mit demLösungsmittel überführt. Dieser Vorgang wird ca.15 - 20 mal wiederholt („erschöpfende“ Extraktion).

Vorteile der Methode• gute Erfassung der Lipide (in Abhängigkeit vom Extraktionsmittel)• vielfach als Referenzmethode empfohlen bzw. vorgeschrieben• liefert gut reproduzierbare Werte• in Kombination mit einem vorgeschalteten Aufschlussverfahren (z.B.

nach Weibull-Stoldt) auch Gesamtfettgehaltsbestimmung möglich

Nachteile• Brand-/Explosionsgefahr bei unsachgemäßem Arbeiten!• relativ arbeits- und zeitaufwendig

Fehlermöglichkeiten• Falls Analysensubstanz ungenügend vorgetrocknet (nicht wasserfrei):

-> evtl. Kohlenhydrate/Salze aus dem LM mit extrahiert -> zu hohe Werte• Nicht erschöpfend extrahiert (-> zu wenige Durchläufe; Temperatur zu

niedrig oder Extraktionsmittel mit zu hohem Siedepunkt verwendet)• Kolben nach dem Abdampfen des Lösungsmittels nicht ausreichend

lange oder bei zu niedriger Temperatur (< 103°C) getrocknet

Extraktionsverfahren nach Soxhlet

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Soxhlet-Extraktionsapparatur

Rück-fluss-kühler

Dampf-rohr

Heber-rohr

Hülsemit

Extrak-tions-

gut

Rund-kolben

Lösungs-mittel

Heiz-haube

Kühl-wasser-eintritt

Kühl-wasser-austritt

Aufschlussverfahren zur Bestimmung des Gesamtfetts

103°C

Vorteile der Methode• zuverlässig und genau -> oft als Referenzmethode vorgeschrieben• nahezu universell einsetzbar

Nachteile• Arbeiten mit aggressiver Salzsäure• sehr arbeits- und zeitaufwendig• Phospho- und Glykolipide (z.B. in Ei) werden z.T. zersetzt -> Verluste

• Gesamtfett = �� [freies (ungebundenes) Fett + gebundenes Fett]

• Fett liegt in manchen Lebensmitteln (Milch, Ei) in gebundener Formvor (z.B. von einer Protein- oder Lipoproteinhülle eingeschlossen)

• Zur Bestimmung des Gesamtfettgehaltes muss diese Proteinhüllezerstört werden, um das gebundene Fett freizusetzen

• anschliessend Fettextraktion, z.B. in einer Soxhlet-Apparatur

Aufschluss mit:• Säuren (Salz-, Schwefel- oder Perchlorsäure) -> universell anwendbar

(z. B. Verfahren nach Weibull-Stoldt oder Gerber)• Alkali (Ammoniak); v.a. bei Milch (Verfahren nach Röse-Gottlieb)• Enzymen (z. B. Proteasen); selten angewandt; jedoch sehr schonend

Verfahren nach Weibull-Stoldt (Referenzmethode)

Prinzip• zerkleinerte Probe ca. 20-30 min mit 12-14%-iger Salzsäure kochen• Aufschlusslösung durch ein angefeuchtetes (!) Faltenfilter filtrieren• Faltenfilter säurefrei (!) waschen und > 6 h bei 103°C trocknen• Filter (mit Fett) mit org. Lösungsmittel extrahieren (Soxhlet)• Lösungsmittel abdampfen und Kolben zurückwiegen

27

Schnellmethode nach Gerber(Acidobutyrometrisches Verfahren)

Prinzip• Probe in einem Butyrometer (= Spezialzentri-

fugenglas) mit Schwefelsäure (ca. 60-90%-ig,je nach Wassergehalt des Lebensmittels) ver-setzen und mischen, wobei Erwärmung eintritt

• Butyrometer im Wasserbad bei 65°C erwärmen;mehrmals kräftig durchschütteln

• Die heisse Schwefelsäure setzt die Lipide frei(-> saurer Aufschluß)

• Nach Zugabe von Amylalkohol (zur besserenPhasentrennung) sammelt sich das geschmol-zene Fett nach dem Zentrifugieren im oberen,graduierten Teil des Butyrometers

• Nach Temperieren auf 65°C kann der Fettgehalt(Volumen) meist direkt abgelesen werden (Milch)ggf. Umrechnung auf genormte Einwaage (Käse)

Butyrometer für MilchVorteile der Methode

Nachteile• Verwendung stark ätzender H2SO4

• etwas weniger genau als die Verfahrennach Weibull-Stoldt oder Röse-Gottlieb

• relativ schnell (15-30 min, je nach Le-bensmittel) und wenig störanfällig

• bis zu 48 Proben können simultananalysiert werden

• gut für Serienanalysen geeignet• kostengünstig• für viele Lebensmittel tierischen Ur-

sprungs einsetzbar (v.a. Milch, Milch-pulver, Sahne, Rahm, Käse, Wurst)

Butyrometer+ Becher fürKäse oder

Wurst

Gerber-Zentrifuge für 48Butyrometer-Röhrchen

Fehlermöglichkeiten• zu lange bei 65°C temperiert -> evtl. Hydro-

lyse der Triglyceride• Aufschlusszeit zu kurz -> Fettverlust• falsche Konzentration der H2SO4 (bei Milch

90%-ige H2SO4, bei Wurst und Käse ca.60%-ige Schwefelsäure verwenden!)

• falschen Amylalkohol verwendet28

Fettbestimmung nach Röse-Gottlieb

Vorteile der Methode

Nachteile• für andere Lebensmittel nicht ohne weiteres anwendbar• zeit- und arbeitsaufwendiges Verfahren• Verwendung leichtentzündlicher Lösungsmittel -> Brandgefahr!

• Genauestes Verfahren zur Gesamtfettbestimmung bei Milch und Milch-produkten (Referenzmethode)

Fehlermöglichkeiten• Fettverluste beim Schütteln aufgrund undichter Stopfen• versehentlich einen Teil der wässr. Phase in den Kolben dekantiert

-> zu hoher „Fettgehalt“

Mojonnierrohr

Prinzip:• Der Aufschluß erfolgt mit Ammoniak bei Raumtemperatur

• Alle Arbeitsschritte mit Ausnahme des Abdampfens des Lösungs-mittels und dem Wiegen erfolgen in einem speziellen, gebogenenGlasgefäß, dem sog. Mojonnierrohr

• Zur Vermeidung einer Emulsionsbildung wird Ethanol zugegeben,welches zum besseren Erkennen der Grenzschicht zwischen wäss-riger und organischer Phase mit Phenolphthalein versetzt wird(-> Rotfärbung der wässrigen Phase)

• Das freigesetzte Fett wird anschliessend mit organischen Lösungs-mitteln (Dietylether und Petrolether) durch Schütteln extrahiert unddie obere Phase in einen getrockneten, gewogenen Kolben dekantiert

• Extraktion 2 x wiederholen u. organische Phasen im Kolben sammeln

• Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wird der Kolben mit demisolierten Fett bei 103°C getrocknet und anschließend gewogen (gra-vimetrische Bestimmung; Differenzwägung)

29

Abdekantieren derorgan. Phase mitdem extrahierenFett in einen ge-wogenen Kolben

wässrigePhase

organische PhaseKork-Stopfen

Fettgehaltsbestimmung mittels NIR-Spektrometrie

• Instrumentelles Analysenverfahren

• Schnelle, einfache, zerstörungsfreieMessung

• unkomplizierte Probenaufbereitung

• Einsatzbereiche: v.a. während derLM-Produktion u. für Serienanalysen

• Aber: Kalibrierung anhand einerReferenzmethode erforderlich!

Fettgehaltsbestimmung: Zusammenfassung • Bestimmung des freien Fettes oder des Gesamtfetts

• Aufschlussreagenzien zur Fettfreisetzung: Säure oder Alkali (je nach LM)

• Fettabtrennung: meist durch Extraktion mit organischen Lösungs-mitteln; ggf. auch durch Zentrifugation (-> Methode nach Gerber)

• Eigentliche Bestimmung der freigesetzten Fettmenge:- wiegen (Gravimetrie): sehr genau, aber zeitaufwändig- Volumenmessung- Dichtemessung schnell, aber temperaturabhängig -> Fehlerquelle!- Brechungsindex

• Konventions- / Schieds- /Referenzmethoden:

- sehr genau, jedoch arbeits- und zeitaufwändig, Verfahren nachWeibull-Stoldt (universell einsetzbar) bzw. Röse-Gottlieb (v.a. bei Milch)

• Schnellmethoden- Meist weniger genau als Referenzmethoden, jedoch erheblich schneller- v.a. für Serienanalysen während der LM-Produktion. Früher: Methoden

nach Gerber (Volumenmessung) oder Foss-Let (Dichtemessung)- Heutzutage: zunehmend Einsatz von auf NIR- oder FT-IR- basierenden

Verfahren. Nachteil: häufige Kalibration erforderlich!

Densitometrische Fettgehaltsbestimmung (Foss-Let Methode)

Prinzip:• Probe mit Tetrechlorethen verrühren und filtrieren bzw. zentrifugieren• Bestimmung des spezifischen Gewichtes des Fett-Tetrachlorethen-

Gemisches durch einen Schwimmer mit einem Magnetkern, der voneinem elektromagnetischen Feld umgeben ist

• spezif. Gewicht von Fett: ca. 0.9 g/cm3, Tetrachlorethen: 1.614 g/ cm3

30

CH2-Schwingungen von Fettsäuren

Charakterisierung von Fetten und Ölen• z.B. Frische- bzw. Verderbszustand (Fettoxidation); Lagerstabilität,

Rein- /Unverfälschtheit (Authentizitätsnachweis); technologischeBehandlung (Hydrierung; Trans-Fettsäuren); Fettsäurespektrum

• Analytik: früher meist mithilfe sog. „Fettkennzahlen“; heute über-wiegend mittels GC / HPLC sowie mit spektroskopischen Verfahren

Beispiele• Autoxidation -> Peroxidzahl (POZ); Epihydrin- bzw. Malondialdehyd

• Hydrolyse von Triglyceriden -> freie Fettsäuren -> Säurezahl

• Oxidationsbreitschaft -> POZ nach Wärmebehandlung oder Rancimat

• Ungesättigter Charakter von Fetten/Ölen -> Iodzahl

• Milchfettanteil am Gesamtfett -> Buttersäurezahl oder GC-FAME

• Essentielle Fettsäuren (Linol-/Linolensäure) -> Enzymatik oder GC

Frische- bzw. Verderbszustand eines Fettes; Lagerstabilität

Autoxidation

Peroxidzahl

• Hydroperoxide sind die bei der Autoxidation von Fetten entstehendenprimären Oxidationsprodukte; Bestimmung mittels Peroxid-Zahl (POZ)

• POZ ist ein Maß für den peroxidisch gebundenen Sauerstoff in Fetten• Die POZ ermöglicht innerhalb gewisser Grenzen Aussagen über den

Verderbszustand bzw. die Lagerfähigkeit eines Fettes / Öls

• POZ < 10: Fett genussfähig (Ausnahme: natives Olivenöl POZ < 20)

• Achtung: Bei fortgeschrittenem Verderb zerfallen die Hydroperoxidewieder -> POZ kann folglich sinken!

Hauptursachen für Fettverderb:• enzymatische Hydrolyse von Triglyceriden (durch Lipaseaktivität)

-> Freisetzung von Fettsäuren -> ranziger Geschmack (v.a. bei Butter- säure); Nachweis u.a. mittels Säurezahl (-> Titration mit KOH)

• autoxidative Vorgänge: Radikalketten-Reaktion -> Induktionsperiode,danach schneller Anstieg, v.a. bei mehrfach ungesättigten Fettsäuren(Linol-, Linolensäure). Primärprodukte: Hydroperoxide, welche zu ge-ruchsintensiven Aldehyden und Ketonen weiterreagieren könnenNachweis: Peroxidzahl; Epihydrin- / Malondialdehyd; ggf. sensorisch

31

Prinzip der Bestimmung der POZ• definierte Menge an Fettprobe in Chloroform / Eisessig lösen

• mit Kaliumiodid (KI) versetzen

• durch Redoxreaktion mit Hydroperoxiden entsteht freiesIod (I2) (-> Gelb-Braunfärbung)

• Bestimmung der Menge des entstandenen I2 durch Titrationmit Natriumthiosulfat-Maßlösung (Indikator: Stärke)

R1 - CH-R2 + 2 I + 2 H+ R1 - CH - R2 + H2O + I2I IOOH OH

I2 + 2 S2O32- 2 I- + S4O6

2-

Nachweis / Bestimmung von Epihydrin- bzw. Malondialdehyd

Malondialdehyd(ist tautomer zu

Epihydrinaldehyd)

2-Thiobarbitur-säure

farbiges /fluoreszierendes

Kondensationsprodukt

+ 2

• Weiterreaktion bzw. Zerfall der Hydroperoxide -> Aldehyde / Ketone

• Nachweis einzelner Aldehyde am Ende der Abbaukette (v.a. Epihydrin-und Malondialdehyd) erfolgt durch eine Farbreaktionen (je intensiverdie Färbung, desto mehr Aldehyd ist vorhanden) oder mittels HPLC

+

+

+

32

Oxidationsbereitschaft eines Öls / Fettes

• POZ allein erlaubt nur begrenzte Aussagen zur Lagerstabilität eines Öls,da der Gehalt an Radikalfängern (z.B. Tocopherole, Vitamin E) ebenfallseine wichtige Rolle spielt (diese Radikalfänger hemmen die Autoxidation)

• Beschleunigung der Autoxidation nach Verbrauch dieser Antioxidantien

-> Messung der Oxidationsbereitschaft nach Lagerung bei erhöhter Tem-peratur durch Bestimmung der POZ oder mittels Rancimat

Bestimmung der Oxidationsstabilität von Fetten/Ölen mittels Rancimat

• Durch die Probe bei 50–220 °C (je nach Fett/Öl) eine Luftstrom leiten

• Die leichtflüchtigen Oxidationsprodukte (u.a. flüchtige Säuren) werdenmit dem Luftstrom in ein Messgefäß mit einer Absorptionslösung über-führt und anschließend durch eine Leitfähigkeitsmessung quantifiziert

Induktionszeit bei___ 120°C 3 h___ 110°C 6 h___ 100 °C 12 h

Luft-einlass

Reaktions-gefäß

Öl-/Fett-Probe

Heizblock(50-200°C)

Messzelle mitAbsorptions-

lösung(Wasser)

Mess-sonde

0 5 h 15 h10 h

Rancimat- Messapparatur

Rancimat: schematischer AufbauInduktionszeiten der Autoxidationin Abhängigkeit von der Tempera-

turbelastung eines Fettes/Öls

33

120°C 110°C

100°C

Le

itfäh

igk

eit

Induktionszeit

Zeit

Iodzahl (IZ)• Die Iodzahl (IZ) charakterisiert den Gehalt an ungesättigten Fettsäuren

(-> ungefähre Anzahl der Doppelbindungen)• Definition: IZ = Menge an Halogen, berechnet als Iod, die von 100 g Fett

gebunden wird. Je größer die Anzahl der -C=C-, desto größer die Iodzahl:Reine Ölsäure (1 x -C=C- ) IZ � 90; reine Linolsäure (2 x -C=C-) IZ � 180;reine Linolensäure (3 x -C=C-) IZ � 270Fette/Öle: Iodzahl zwischen 10 und 180, je nach FS-Zusammensetzung

• Die IZ erlaubt Aussagen über Reinheit,Herkunft, Authentizität eines Fettes/Öls

• Prinzip der Bestimmung: ElektrophileAddition eines Reagenzes (Br2) an dieDoppelbindungen der ungesättigtenFettsäuren

• Durchführung:- Fett in CHCl3 lösen- Reagenzzugabe (im Überschuss)- nach 1-2 h (im Dunkeln): Freisetzung

von I2 aus zugesetztem KI durch dasunverbrauchte Reagenz

- Rücktitration mit Natriumthiosulfat

Bestimmung essentieller Fettsäuren• Mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit einer cis-cis-1,4-Pentadienstruktur (Linol- und Linolensäure) können vom menschlichen Organismus

nicht synthetisiert werden; sie haben Vitamincharakter und müssen da-her mit der Nahrung zugeführt werden

• Die Bestimmung der essentiellen Fettsäuren kann entweder enzymatisch(summarische Bestimmung) oder gaschromatographisch (GC) nach Um-estern der Triglyceride zu Fettsäuremethylestern (FAME) erfolgen

��Linolensäure (Omega-3-Fettsäure)

Linolsäure (Omega-6-Fettsäure)

34

Iodzahlen typischer Fette und Öle

butter

Enzymatische Bestimmung essentieller Fettsäuren

Isolierte Doppelbindung

-C=C-CH2-CH2-C=C-� max � 200 nm

konjugierte Doppelbindung

-C=C-CH2-C=C-CH-� max � 234 nm

Prinzip der Bestimmung

• Die cis-cis-1,4 Dienstruktur (isolierte Doppelbindungen) wird in Gegen-wart des Enzyms Lipoxidase (auch als Lipoxygenase bezeichnet) undLuftsauerstoff (O2) zu Dienhydroperoxiden oxidiert (s.u.)

• Hierbei bildet sich eine konjugierte Doppelbindung aus, deren charak-teristische Absorption bei ca. 234 nm die Messgrundlage bildet

• Doppelbindungen in isolierter Stellung weisen hingegen ein Absorpti-onsmaximum im kurzwelligeren UV-Bereich bei ca. 200 nm auf

• Aus Linol-, Linolen- und Arachidonsäure entsteht jeweils nur ein MolDienhydroperoxid, d.h. sie werden summarisch erfasst

Durchführung

• Da das Enzym Lipoxidase wasserlöslich ist, Fett (Triglycerid) jedochnicht, muß das Fett zunächst mit alkoholischer KOH verseift werden

• Es entstehen wasserlösliche Kalium-Salze der Fettsäuren (= Seifen)

• Dann den Versuchsansatz mit HCl neutralisieren und pH-Wert miteinem Puffer auf das Optimum (pH 9) der Lipoxidase einstellen

• Messung der Extinktion bei 234 nm (Quarzküvetten verwenden!)

• Dann Aufteilen des Versuchsansatzes: zum Hauptversuch aktiveLipoxidase zugeben und einwirken lassen; zum Kontrollversuch

(„Blindwert“) inaktive (d.h. erhitzte) Lipoxidase geben

• Nach 30 min erneute Messung der Extinktion bei 234 nm

• Aus der Extinktionsdifferenz (nach und vor Enzymzugabe), abzüglichdes Blindwertes den Gehalt an essentiellen Fettsäuren berechnen

Gaschromatographische Bestimmung essentieller FettsäurenDie gaschromatographische Bestimmung von Linol-, Linolen- und Ara-chidonsäure erfolgt prinzipiell genau so wie bei der Bestimmung derButtersäure beschrieben (s. dort), nämlich nach Umesterung der Fett-säuren zu Fettsäuremethylestern (FAME).

35

Bestimmung des Milchfettgehaltes

Prinzip:• Buttersäure (CH3H7-COOH) ist eine kurzkettige

Fettsäure, die fast ausschließlich in Milchfettvorkommt

• Da ihr Gehalt in Milchfett relativ konstant ist (ca. 3.5%), wird sie häufig zur Bestimmung des

Milchfettanteils in einer Fettmischung (z.B. inButterkuchen, Butterkeks, Milchschokolade)herangezogen

Buttersäure

• Die Bestimmung der Buttersäure erfolgt entweder über die „Butter- säurezahl“ oder gaschromatographisch nach Umesterung zu FAMEs

1) Durch Bestimmung der Buttersäurezahl• Die „Buttersäurezahl“ (BsZ) ist ein Maß für den Gehalt eines Fettes

(bzw. einer Fettmischung) an Milchfett• Die BsZ von reinem Milchfett (Butterschmalz) beträgt ca. 20, während

alle anderen reinen Fette eine BsZ < 1 aufweisen

Durchführung (vereinfachte Darstellung)• Fett (nach Isolierung z.B. mittes Soxhlet-Extraktion) mit alkoholischer

KOH verseifen -> Kaliumsalze aller im Fett enthaltenen Fettsäuren

• längerkettige Fettsäuren (> 10 C-Atome) durch Zugabe von Kaliumsulfatausfällen („aussalzen“) und durch abfiltrieren entfernen

• kurzkettige, leicht flüchtige Fettsäuren (v.a. Buttersäure) durch Ansäurenaus ihren Salzen freisetzen und durch Wasserdampfdestillation abtrennen

• Bestimmung des Buttersäuregehaltes im Destillat durch Titration desDestillates mit 0,01 N NaOH. Blindwert ist erforderlich!

36Verseifung Filtration Destillation Titration

Luftkühler

Fett +alkohol.

KOH

Heiz-pilz

2) Durch GC-FAME (Fettsäurespektrum)• zur Bestimmung des Milchfettanteils in einer Fettmischung• auch: zur Tierartunterscheidung• Herkunfts- bzw. Authentizitätsnachweis von Fetten/Ölen• zur Bestimmung essentieller Fettsäuren in einem Fett oder Öl

Prinzip:

Fette sind Triglyceride = Ester von Fettsäuren mit dem dreiwertigenAlkohol Glycerol; sie weisen hohe Siedepunkte auf (schwerflüchtig)

-> Umestern der Fettsäuren, z.B. mit Natriummethylat -> Methylesterder Fettsäuren (= fatty acid methyl ester, FAME) -> niedrigere Siede-punkte als Triglyceride -> leicht flüchtig -> mittels GC analysierbar

TriglyceridFett/Öl

Methanol +Katalysator

bzw. Na-Methylat

Glycerol

Fettsäure-methylester

(FAME)

• Bestimmung der FAME nach gaschromatographischer Auftrennung

• Quantifizierung: über die Peakhöhen oder die Peakflächen, entwedermit Hilfe eines externen, oder - besser- eines internen Standards

Fettsäurespektrum von Milchfett (GC-FSME)Quantifizierung mittelsinternem Standard (IS)

37

Buttersäure-methylester

Enzymatische Analysen

Haupteinsatzgebiete von Enzymen in der LM-chemischen Analytik:• Nachweis von Enzymaktivitäten als Indikatorreaktion zur Beurteilung

der Beschaffenheit eines Lebensmittels (z.B. ausreichende Erhitzungvon pasteurisierter Milch)

• Zur quantitativen Bestimmung von Lebensmittelinhaltsstoffen (z.B.Glucose, Lactose) mit Hilfe von Enzymen

• Als Indikatoren in Enzym-Immunoassays (ELISA)

1. Enzymaktivitätsbestimmung• Das im Lebensmittel enthaltene Enzym stellt hier den Analyten dar

• Bestimmung der Geschwindigkeit der enzymkatalysierten Reaktiondurch Ermittlung des Substratumsatzes pro Zeiteinheit

• Messung von Enzymaktivitäten: sowohl qualitativer Nachweis alsauch quantitative Bestimmung möglich

• meist photometrische Messung über ein gefärbtes Reaktionsprodukt

• Beispiele:- Kurzzeit- oder Hocherhitzung von Milch (Nachweis der Aktivität der

alkalischen Phosphatase bzw. Lactoperoxidase)- ausreichendes Blanchieren von Gemüse (-> Peroxidase-Aktivität)- Eutererkrankungen bei Milch (-> Katalase-Aktivität)- bakterielle Verunreinigungen in Milch (Anwesenheit von

Reduktasen)

Nachweis einer ausreichenden Kurzzeiterhitzung von Milch

• Inaktivierung der alkalischen Phosphatase (71-74°C, 20-40 Sekunden)• Nachweis der Phosphatase-Aktivität mit Lactognost-Reagenz:

Blaufärbung: Phosphatase stark positivGrünfärbung: Phosphatase schwach positivGraufärbung: Phosphatase negativ

38

- HCl

AlkalischePhosphatase

+ H2O

Farbstoff(blau)

Nachweis einer ausreichenden Hocherhitzung von Milch

NH2H2N

NH2H2N NHHN ==+ H2O2

+ 2 H2OPeroxidase

Guajakolp-Phenylendiamin

2. Bestimmung von Substraten (Lebensmittelinhalts-stoffen) mit Hilfe von Enzymen

• Vorreinigung: Flüssige Analysenprobe (Fruchtsaft, Wein, Milch) bzw.wässrigen Extrakt des Lebensmittels klären (z.B. mit Carrez-Reagenz)

• Mit geeignetem Enzym, ggf. Co-Enzym, sowie Aktivatoren (z.B. Mg2+)und Puffer (zur Einstellung des optimalen pH-Werts) versetzen undReaktion ablaufen lassen, bis das Substrat komplett verbraucht ist

Messung- in den meisten Fällen eine photometrische Messung (UV/Vis) einer

Substanz, deren Konzentration sich im Verlauf der Reaktion propor-tional zu der des Analyten ändert, z.B. das bei der Reaktion gebildeteProdukt, die Abnahme des Edukts, oder das umgesetzte Co-Enzym(meist NAD(P)H)

- aber auch andere Messtechniken möglich, z.B. Titrimetrie, falls eineSäure entsteht oder verbraucht wird (v.a. bei Analysenautomaten)

• Nachweis der Peroxidase-Aktivität: z.B. mit Guajak-Reagenz:

• aktive Lactoperoxidase spaltet aus Wasserstoffperoxid (H2O2)atomaren Sauerstoff ab und überträgt ihn auf einen Akzeptor(z.B. Guajakol oder p-Phenylendiamin) unter Bildung einerfarbigen Verbindung

• Lactoperoxidase wird bei Temperaturen> 85°C (10 Sekunden) inaktiviert

• Achtung: Bei zu kurzer Erhitzungs-dauer kann Peroxidase renaturieren!

MHD

39

Beispiele

Isolierte Doppelbindung�� max < 200 nm

konjugierte Doppelbindung�� max � 234 nm

Enzymatische Bestimmung essentieller Fettsäuren• photometrische Messung der Extinktionszunahme bei 234 nm

Enzymatische Bestimmung von Lactose in Milch/ -produkten

(I) Lactose + H2O Galactose + Glucose

(II) Galactose + NAD+ Galactonsäure + NADH + H +

ß-Galactosidase

Galactose-

Dehydrogenase

Vorteile enzymatischerBestimmungen

• hochspezifisch• hohe Sensitivität• gute Reproduzierbarkeit• einfache Probenvorbereitung• unkomplizierte Arbeitsweise• relativ schnell (20-30 min)• teil- bzw. vollautomatisierbar• keine toxischen Chemikalien

erforderlich• umweltfreundlich

Nachteile• nur auf eine begrenzte Anzahl

von Analyten anwendbar• Testkombinationen z.T. teuer• Störungen durch:- Schwermetallionen- oxidierende Substanzen- Gerbstoffe (Polyphenole)- unreine Enzyme

(I) (II)

Ab

so

rpti

on

be

i34

0n

mA

bso

rpti

on

Extinktions-zunahme(-> NADH)

��E

Zeit (min)

Wellenlänge (nm)

40

340 nm

Optische Verfahren

Prinzip / Beispiele:Wechselwirkungen von elektromagnetischer Strahlung und Materie:

• Absorption von Strahlung (UV/Vis - Photometrie)

• Emission von Strahlung (z.B. Fluoreszenzmessung)

• Messung von Streulicht (Nephelometrie, Turbidimetrie)

• Brechung von Licht (Refraktometrie)

• Drehung der Schwingungsebene polarisierten Lichtes (Polarimetrie)

Refraktometer Polarimeter

Unterscheidung: Spektrometrie und Spektroskopie (vereinfacht):„Spektrometrie“ = meist quantitative Messung (-> Intensität)„Spektroskopie“ = Spektrum aufnehmen (-> Lage der Linien)

41

Licht-quelle

Polari-sator

Proben-behälter

Analy-sator

Photometer

0.257

Kolorimetrie / Photometrie

. .

Kolorimetrie

d1

d2c1

c2

• Konzentrationsbestimmung einesfarbigen Stoffes durch Vergleich miteiner Referenzlösung bekannter Kon-zentration (i.d.R. visuell)

• Veränderung der Schichtdicke, bisidentische Farbintensitäten

• in diesem Fall gilt:

c1 x d1 = c2 x d2

• Vorteil: einfach und billig• Nachteil: nur für gefärbte Lösungen;

Messung: teilweise subjektiv, v.a. beiunterschiedlichen Farbtönen

Kolorimetrie (Prinzip)

Absorptionsmessung

„Bouguer-Lambert-Beersches“ Gesetz: E = �� c d

E = Extinktion; � = molarer Extinktionskoeffizient; c = Konzentration der

absorbierenden Substanz (meist in mol/l); d = Schichtdicke der Küvette

• Schwächung der Strahlungsintensität E mit der Weglängebeim Durchgang durch eine absorbierende Substanz

• Schwächung der Strahlungsintensität in Abhängigkeitvon der Konzentration der absorbierenden Substanz

• Gilt streng genommen nur für monochromatischesLicht und verdünnte, sowie klare (d.h. nicht-trübe)Lösungen (andernfalls Lichtstreuung)Beispiel: E = 1.0 -> 90% des einfallenden Lichtes werden absorbiert

(für E = 2.0 -> 99%; für E = 3.0 -> 99.9% Absorption )

c1 > c2

42

10nm

200 nm 2500 nm

fernes UV nahes UV nahes Infrarot (IR)

Photometrische Messungen

sichtbarer Bereich (Vis)

400 nm 700 nm

UV/Vis-PhotometrieVergleichende Messung von Lichtintensitäten

Strahlungsquellen

Vorteile von Linienstrahlern gegenüber Kontinuumstrahlern• höhere Lichtintensität• schmale Wellenlängenbereiche, die mit relativ geringem Aufwand

erhalten werden können (z.B. mit Interferenzfiltern) -> preisgünstig

Nachteile von Linienstrahlern gegenüber Kontinuumstrahlern• es steht nur Licht bestimmter Wellenlängen zur Verfügung, die nicht

immer mit der optimalen Absorption der zu messenden Substanz zu-sammenfallen (z.B. NADH: �max = 340 nm; Hg-Lampe: 334 nm / 365 nm)

Wichtig: Lampen mindestens 15 min vor der Messung einschalten, dasich die Strahlungsintensität bei Erwärmung verändert!

Linienspektrum(Hg-Lampe)

Kontinuierliches Spektrum (Wolframfadenlampe)

• Kontinuumstrahler: strahlen Licht kontinuierlich über einen bestimm-ten Wellenlängenbereich ab- Wolframfadenlampe (engl. „Tungsten“; Glühbirne); Bereich von 300 -

1000 nm; jedoch schwache Leistung im UV-Bereich < 340 nm- Deuteriumlampe: 180-360 nm; Einsatz im UV-Bereich � 340 nm

• Linienstrahler: strahlen nur Licht ganz bestimmter Wellenlängen ab,z.B. Hg-Lampe: 254, 265, 280, 334, 365, 405, 492, 578 nm etc.Werden meist nur in preisgünstigen Filter-Photometern eingesetzt

43

0.257

Strahlungsquelle

Intensitäts-einstellung

(Blende)

Monochromatorzur Wellenlängen-

einstellung

Blende Blende

Detektor /Empfänger

Signalmessung

Probenbehälter(Küvette mit

Probe)

Anzeige-instrument

Intensitätseinstellung

Absorptionsfilter Interferenzfilter

Je nach Spaltbreite oder Stel-lung der Kämme tritt mehroder weniger Licht hindurch-> Intensitätseinstellung

• verstellbarer Spalt, Kammblende etc.

Herstellung von monochromatischem Licht• Isolierung von Licht einer genau definierten Wellenlänge

• Entweder durch Filter (Absorptions- oder Interferenzfilter)Absorptionsfilter: (Gefärbte) Gläser, die nur Licht eines bestimmten,jedoch relativ breiten Wellenlängenbereichs (> 30 nm) durchlassen.Sinnvoll nur in Kombination mit Linienstrahlern (z.B. Hg-Lampe)

• Oder durch Monochromatoren (Prisma, Beugungsgitter) -> Zerlegungvon weissem Licht in seine Spektralfarben

Spektrale Bandbreite: Ausschnitt des Spektrums, welcher durch dieMeßküvette geschickt wird. Je enger die SB, desto besser: Prismen u.Gitter: < 5 nm; Interferenzfilter: 10-20 nm; Absorptionsfilter > 30 nm

44

Prisma

Interferenz

Beugungsgitter

Probenbehälter (Küvetten)

Lichtdurchlässigkeit (Transmission) in Abhängigkeit von der Wellenlänge• Glasküvetten (optisches Spezialglas; Bezeichnung: „OS“): > 320 nm• Quarzglas („UV“ oder „QS“ = „Quarz-Suprasil“): > 180 nm• Kunststoff (z.B. „PS“ = Polystyrol) meist > 340 nm (je nach Kunststoff)

Chemikalien- bzw. Lösungsmittelbeständigkeit:• Glasküvetten („OS“)

• Quarzglasküvetten („UV“, „QS“)

• Kunststoff („PS“ u.a.): ±, je nach Material; z.B. Polystyrol (PS):

- nicht beständig gegen organische Lösungsmittel (Aceton, Chloro-form, Dioxan, DMF, Essigsäure (100%), Ethylacetat, Hexan) ....

- beständig gegen: Ammoniak, Isopropanol, Natronlauge, Salzsäure

100

200 300 400 500 600 nm

80

60

40

20

Tra

ns

mis

sio

nin

%

Quarzglas (UV, QS) Optisches Spezialglas(OS)

Poystyrol (PS)

Spektrale Durchlässigkeitunterschiedlicher Glas-

und Kunsstoffsorten

45

+++ (ausser gegen starke Laugen)

• Küvettenmaterial: Glas, Quarzglas und Kunststoffe

• Kriterien:- spektrale Durchlässigkeit (UV/Vis- oder nur Vis-Bereich)- Chemikalien- bzw. Lösungsmittelbeständigkeit- Preis: zwischen 0,05 � (Kunststoffküvette) und 200,- � (Quarzküvette)- Füllmenge (Mikro-, Halbmikro- und Makroküvetten)- Präzision (Schichtdicke: 10 mm oder 10.00 mm)- Länge des Strahlengangs (10 mm, 20 mm, 50 mm)

50

Signalmessung - Empfänger / Detektor

• Detektor = lichtempfindliches Element, das das optische Signal in einelektrisches Signal umwandelt. Die Stärke des elektrischen Stromsist proportional zum einfallenden Licht

• Photozelle, Photomultiplier, Photodiodenarray

Anzeige-Einrichtung• Digitalanzeige; Analoganzeige (Zeiger, Schreiber); Computerbildschirm

UV-/Vis-Spektroskopie• zur„qualitativen“ Analyse, d.h. zur Strukturaufklärung von Molekülen;• heute nur noch selten eingesetzt; v.a. zur Abschätzung der Anzahl

konjugierter Doppelbindungen in einem Molekül

��max � 220 nm

�max � 265 nm

Fotozelle Diodenarray-Detektor (simultane Messung bei vielen Wellenlängen)

46

0.225

220 240 260 280 nm

A

��max � 134 * � n + 31 [nm]

n = Anzahl konjugierter Doppelbindungen

UV-Absorptionsspektrumvon Benzene

R

R

Photometrie: Quantitative Analyse• Lebensmittel enthalten oft Mischungen unterschiedlicher Substanzen,welche im UV- und/oder /Vis-Bereich Licht absorbieren-> entweder: Vortrennung erforderlich-> oder: spezifische Detektion nach Derivatisierung (-> „Farbreaktion“)

Einzelkomponenten

220 250 280 nmWellenlänge

Vortrennung• Extraktion (z.B. mittels Scheidetrichter; vgl. Chininbestimmung) oder

Wasserdampfdestillation und anschließende photometrische Mes-sung bei der für die Substanz charakteristischen Wellenlänge

• Falls nach der Vortrennung ein Gemisch zweier Substanzen vorliegt(z.B. Sorbinsäure und Benzoesäure), die sich in ihren Absorptions-maxima unterscheiden, ist eine Simultanbestimmung durch Mes-sung bei zwei Wellenlängen möglich (-> Lösung von zwei Gleichun-gen mit zwei Unbekannten)

• Heutzutage: meist chromatographische Auftrennung (HPLC) undquantitative Bestimmung mittels UV/Vis-Durchflussphotometer

Spezifische Farbreaktionen

Analyt farbige VerbindungSpezifische chemische

Reaktion („Farbreaktion“)

Beispiel

• Nitrit-Bestimmung (-> Azofarbstoff)+ +

+

+linearerBereich

Kalibrier-kurve

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280 nm 250 nm 220 nm

Remissionsphotometrie• Prinzip: Teststäbchen („Dip-Stick“), basierend auf enzymatischer oder

spezifischer chemischer Messmethodik (-> „Farbreaktion“)

• Anschließend: Messung des an dem Teststäbchen reflektierten Lichtsmit Hilfe eines Remissionsphotometers („Reflektometer“)

• Bestimmung der Konzentration bestimmter LM-Inhaltsstoffe anhand derIntensitätsunterschiede zwischen emittiertem und reflektiertem Licht

• Vorteile:- (sehr) schnell (15 sek - 5 min); einfache Handhabung- niedrige Analysen- und Anschaffungskosten; umweltfreundlich- Ideal für vor-Ort-Analysen zur schnellen Ermittlung wichtiger Parameter

• Genauigkeit: Messfehler i.d.R. < 10 %

• Einsatzbereiche: Rohstoffuntersuchung, Prozess- und Produktkontrolle,Einhaltung von Grenzwerten, Überprüfung von Reinigung / Desinfektion,zur Vorselektion von Proben für exakte Analysen etc.

Kunststoff-Trägerfolie

Teststäbchen in die zuuntersuchende

Flüssigkeit eintauchen

Das Testfeld mit derFarbskala auf derDose vergleichen

Remissionsmessung(Prinzip) Reflektometer (Merck)

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Io = 100%Reaktions-

zone

Ireflektiert (< 100%)

Photo-zelle

Chromatographische Trenntechniken

Chromatographie = Verfahren zur Stofftrennung, die auf unterschiedlichstarken Wechselwirkungen des Analyten mit einer mobilen Phase undeiner stationären Phase beruhen

• Mobile Phase: Flüssigkeit oder Gas (-> Flüssig- /Gas-Chromatographie)

• Stationäre Phase:- Feststoffe, z.B. Kieselgel (-> Adsorptionschromatographie)- dünner Flüssigkeitsfilm (-> Verteilungschromatographie)

• Besitzen die zu analysierenden Komponenten der Probe unterschied-liche Affinität zur mobilen bzw. stationären Phase, so können sie von-einander getrennt werden

• Sind die Wechselwirkungen mit der stationären Phase stark, so bewegtsich die Substanz langsam, im umgekehrten Fall schnell

• Anschließend müssen die getrennten Substanzen detektiert / visu-alisiert werden

Chromatographische Trennverfahren in der LM-Analytik• Niederdruck-Säulenchromatographie (SC) (selten eingesetzt)

• Dünnschicht- bzw. Papierchromatographie (DC bzw. PC)• Gaschromatographie (GC)• Hochleistungs- (bzw. Hochdruck-)Flüssigchromatographie (HPLC)

Säulenchromatographische Trennung undIsolierung von Pflanzenfarbstoffen M. Tswett

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Proben-gemisch,z.B Farb-

stoffe

Dünnschichtchromatographie (DC)• entweder als Adsorptionschromatographie (stationäre Phase: Kieselgel)

• oder als Verteilungschromatographie (stationäre Phase: Cellulose mitdünnem Flüssigkeitsfilm)

• Papierchromatographie: Verteilungschromatographie; jedoch auf Chro-matographiepapier anstelle von mit Cellulose beschichteten DC-Platten

• überwiegend für qualitativen Nachweis / halbquantitative Bestimmung

Durchführung• Probenauftragung: möglichst kleiner Startpunkt; ggf. mehrmals kleine

Volumina (1-2 �l) auftragen und zwischendurch mit dem Fön trocknen

• Eigentliche chromatographische Trennung („Entwicklung“): 10-90 min,je nach Fließmittel, stationärer Phase und Länge der Trennstrecke

• Nach der Entwicklung: Trocknen mit dem Fön (Abzug!); ggf. bei 100°C

• Nachweis (Detektion) der getrennten Substanzen

- selten: direkt sichtbar (nur bei farbigen / fluoreszierenden Substanzen)- meistens: Besprühen mit einem Farbreagenz + Erhitzen bei ca. 100°C

Deckel

Fließ-mittel-front

DC-Platte

Fließ-mittel-

Auftragen der Probe Entwicklung Rf-Wert

Nachweisreagenzien• universelle Nachweis-Reagenzien (z.B. KMnO4 oder konz. H2SO4)

-> (fast) alle Bestandteile des Extrakts detektierbar (selten angewandt)

• spezifische (selektive) Nachweisreagenzien -> nur bestimmte Kom-ponenten werden gezielt detektiert (Beispiel: Ammoniummolybdat-Reagenz zum Nachweis kondensierter Phosphate in Wurst)

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Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)• wesentlich höhere Trennleistung als die DC

• deutlich schneller als DC durch Anwendung hoher Drücke (5 - 25 MPa)

• ausgezeichnete Quantifizierbarkeit der getrennten Substanzen

• vor allem für Verbindungen, die nicht flüchtig sind bzw. die sich nichtunzersetzt verdampfen lassen -> polare Substanzen (Zucker, Amino-

säuren, organische Säuren etc.)

Aufbau einer HPLC-Anlage

Pumpe

Proben-aufgabe-

vorrichtung

Elutions-mittel

Trenn-säule

Detektor

Signal-Verstärker/-Umwandler

Elutionsmittel-abfall

Rekorder /Computer

• Säulenfüllung: überwiegend „Umkehrphasen“ (Reversed-Phase)= modifiziertes Kieselgel (z.B. RP-8, RP-18); seltener „Normalphasen“

• Elutionsmittel: meist Wasser/Methanol oder Wasser/Acetonitril-Gemische

• Trennzeiten: je nach Säulenlänge (10 - 25 cm), Druck (5-25 MPa) und Elu-tionsmittelzusammenstzung: 2 - 40 min

• Detektor: meist UV-/Vis-Durchflussphotometer; seltener RI-Detektor

• Quantifizierung: meist mittels Kalibrierkurve über „externen“ Standard“= Vergleichssubstanz bekannter Konzentration; Quantifizierung über

die Peakhöhen oder -flächen. Voraussetzungen hierfür:

- identische Trennbedingungen (Elutionsmittelzusammensetzung, Druck,Flussrate, Temperatur, Säulenfüllung etc.)

- identische Probenauftragevolumina (Probenschleife, 10 oder 20 �l)

HPLC-Anlage

Probenaufgabe-vorrichtung

(Probenschleife)

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Gaschromatographie (GC)• Trennverfahren für Stoffgemische, die gasförmig vorliegen, oder die

sich unzersetzt verdampfen lassen; v.a. für (unpolare) Substanzen mitniedrigen Siedepunkten, z.B. Kohlenwasserstoffe, kurzkettige Alkohole

• Nichtflüchtige, polare Verbindungen (z.B. Zucker, Aminosäuren) lassensich nach Derivatisierung (z.B. Methylierung, Umesterung, Silylierung)so weit stabilisieren, daß sie ebenfalls analysiert werden können

• Extrem hohe Trennleistung, v.a. bei Verwendung von Kapillarsäulen

• Detektoren: Flammenionisationsdetektor (FID), Wärmeleitfähigkeits-detektor (WLD), Elektroneneinfangdetektor (ECD), Stickstoff-Phos-phordetektor (NPD), oder Massenspektrometer (MS)

Aufbau einer GC-Anlage Gepackte Säule (oben)Kapillarsäule (unten)

Qualitative Analyse (Identifizierung unbekannter Substanzen)• Vergleich der Retentionszeiten bekannter Substanzen („Standards“)• Zumischung von bekannten Substanzen („Aufstocken“)• Identifizierung mit Hilfe homologer Reihen (z.B. Alkohole)• Identifizierung mit Hilfe unterschiedlicher Detektoren (z.B. FID/ECD)• Identifizierung mit Hilfe anderer Analysenverfahren ( z.B. Massen-

spektrometrie (MS), NMR- oder IR-Spektroskopie)

Quantitive Analyse• Mit externem Standard (= Vergleichssubstanz bekannter Konzentration)

Voraussetzung: identische Probenvolumina und Trennbedingungen• Mit internem Standard = zusätzliche Substanz, die in der Probe natür-

licherweise nicht vorkommt, und die sich von den Probenkomponentengut trennen lässt, wird der Analyse und dem Vergleichsstandard zurNormalisierung der Peakflächen zugesetzt.

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