leonida kovaČiČ vpeljava metode doloČitve mutacij … · 2011. 2. 16. · mastocitoza,...
TRANSCRIPT
-
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
LEONIDA KOVAČIČ
VPELJAVA METODE DOLOČITVE MUTACIJ W515L IN W515K V RECEPTORJU ZA TROMBOPOETIN, Z
NAČINOM VERIŽNE REAKCIJE S POLIMERAZO V REALNEM ČASU, PRI BOLNIKIH Z ESENCIALNO
TROMBOCITEMIJO
THE THROMBOPOIETIN RECEPTOR W515L AND W515K MUTATIONS DETECTION BY REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION IN ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA
PATIENTS
DIPLOMSKA NALOGA
Ljubljana, 2011
-
Diplomsko nalogo sem opravljala v Specializiranem hematološkem laboratoriju Kliničnega
oddelka za hematologijo, Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana, pod mentorstvom
doc. dr. Uroša Mlakarja, dr. med. in somentorstvom asist. dr. Tadeja Pajiča, spec. med.
biokem.
Zahvala Iskreno se zahvaljujem vsem, ki so mi pri izdelavi diplomske naloge nesebično pomagali s
svojimi strokovnimi nasveti in praktičnimi izkušnjami. Na prvem mestu gre zahvala
somentorju asist. dr. Tadeju Pajiču, spec. med. biokem, ki me je vzel pod svoje okrilje in
mentorju doc.dr. Urošu Mlakarju, dr. med. za vodenje in pravilen potek diplomske naloge.
Posebna zahvala gre tudi celotnemu osebju Specializiranega hematološkega laboratorija
UKC Ljubljana, še posebno osebju, ki dela na področju molekularne genetike (Nejcu
Lamovšku, Martini Fink, Mariji-Jedrt Mandelc Mazaj, Anici Mihajlović in Urški Baruca),
ki me je zelo lepo sprejelo medse in mi omogočilo prijetno delovno okolje, v katerem se
strokovno izpopolnjujem že dobro leto in pol.
Na tem mestu pa se seveda zahvaljujem tudi vsem ostalim, predvsem staršem, bratu, moji
(naj)boljši polovici Damjanu in vsem sošolcem in prijateljem, ki ste me pri mojem študiju
vzpodbujali in bodrili ter mi vedno stali ob strani. Upam da vas nisem razočarala…
Izjava
Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr. Uroša
Mlakarja, dr. med. in somentorstvom asist. dr. Tadeja Pajiča, spec. med. biokem.
Predsednik komisije: izr. prof. dr. Darko Černe, mag. farm., spec. med. biokem.
Član komisije: doc. dr. Tomaž Vovk, mag. farm.
Ljubljana, 2011
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
I
VSEBINA
VSEBINA.......................................................................................................I
KAZALO SLIK......................................................................................... III
KAZALO PREGLEDNIC ........................................................................ III
POVZETEK ................................................................................................ V
SEZNAM OKRAJŠAV..............................................................................VI
1 UVOD......................................................................................................... 1 1.1 MIELOPROLIFERATIVNE NOVOTVORBE (MPN)........................................1
1.1.1 ESENCIALNA TROMBOCITEMIJA (ET) .......................................................2
1.2 MUTACIJE V GENU MPL ...................................................................................5
1.3 KVANTITATIVNA VERIŽNA REAKCIJA S POLIMEZARO V REALNEM ČASU............................................................................................................................9
1.3.1 ALELNA DISKRIMINACIJA.........................................................................11
2 NAMEN DELA........................................................................................ 13
3 PREISKOVANCI IN METODE ............................................................ 14 3.1 PREISKOVANCI.................................................................................................14
3.2 METODE..............................................................................................................15 3.2.1 IZOLACIJA GRANULOCITOV IZ VZORCEV VENSKE KRVI Z GRADIENTNIM CENTRIFUGIRANJEM PREKO FIKOLA............................................................................15 3.2.2 IZOLACIJA CELOKUPNE DNA IZ GRANULOCITOV................................................18 3.2.3 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOČE VZORCEV DNA .....................................20 3.2.4 KVANTITATIVNA DOLOČITEV MUTACIJ MPL W515L IN MPL W515K Z VERIŽNO REAKCIJO S POLIMERAZO V REALNEM ČASU................................................................21
3.3 STATISTIČNA OBDELAVA VZORCEV..........................................................24
4 REZULTATI IN RAZPRAVA ............................................................... 25 4.1 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOČE DNA IZOLIRANE IZ GRANULOCITOV PERIFERNE KRVI..................................................................26
4.2 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO V REALNEM ČASU .....................28 4.2.1 VREDNOSTI CQ POZITIVNIH, NEGATIVNIH KONTROLNIH IN RAZMEJITVENIH VZORCEV PRILOŽENIH H KOMPLETU MPL MUTASCREENTM KIT..................................28 4.2.2 DOLOČANJE VREDNOSTI CQ VZORCEV BOLNIKOV Z ET ......................................30
4.3 REZULTATI ALELNE DISKRIMINACIJE .....................................................34
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
II
5 ZAKLJUČKI........................................................................................... 38
6 LITERATURA ........................................................................................ 39
7 PRILOGE ................................................................................................ 42
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
III
KAZALO SLIK
Slika 1: Princip kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času (qPCR). Prirejeno po Real-Time PCR Applications Guide (16) .....................................................10
Slika 2: Krivulja pomnoževanja pri PCR v realnem času. Prirejeno po Real-Time PCR Applications Guide (16). ..................................................................................................11
Slika 3: Prikaz rezultatov alelne diskriminacije ................................................................12
Slika 4: Ločitev posameznih frakcij celic z gradientnim centrifugiranjem preko fikola.....17
Slika 5 : Shema nanosa reakcijskih mešanic in vzorcev na mikrotitrsko ploščico.............23
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Razvrstitev mieloproliferativnih novotvorb po SZO (2008) (2) .....................1
Preglednica II: Diagnostični kriteriji za esencialno trombocitemijo po SZO 2008 (2) .........3
Preglednica III: Sestava reakcijske mešanice za MPL W515L in MPL W515K..................22
Preglednica IV: Pogoji qPCR...........................................................................................23
Preglednica V: Alelna diskriminacija- program Post read ...............................................24
Preglednica VI: Rezultati merjenja koncentracije in čistoče (A260/A280) DNA izolirane iz granulocitov periferne krvi s kompletom QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) .......................27
Preglednica VII: Vrednosti Cq pozitivnih, negativnih kontrolnih in razmejitvenih vzorcev za mutaciji MPL W515K in MPL W515L, pridobljene v štirih reakcijah............................1
Preglednica VIII: Vrednosti Cq bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515K........................................................................................................................................30
Preglednica IX: Cq vrednosti bolnikov, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515L........32
Preglednica X: Vrednosti Cq vzorcev 4 bolnikov, ki so imeli prisotni mutaciji MPL W515L/K..........................................................................................................................34
Preglednica XI: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela razmejitvenega vzorca za mutacijo MPL W515K in mutacijo MPL W515L, pridobljenih v 4 analiznih poskusih ......35
Preglednica XII: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela pozitivne kontrole za mutacijo MPL W515L in mutacijo MPL W515K, pridobljenih v 4 analiznih poskusih ......36
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
IV
Preglednica XIII: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela negativne kontrole za mutacijo MPL W515L in mutacijo MPL W515K, pridobljenih v 4 analiznih poskusih ......36
Preglednica XIV: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela vzorcev bolnikov z ET in prisotno mutacijo MPL W515L ........................................................................................37
Preglednica XV: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela vzorcev bolnikov z ET in prisotno mutacijo MPL W515K ........................................................................................37
Preglednica XVI: Rezultati alelne diskriminacije za vzorce bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515L.........................................................................................42
Preglednica XVII: Rezultati alelne diskriminacije za vzorce bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515K ........................................................................................45
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
V
POVZETEK
Pri večini bolnikov s policitemijo vera (PV) in pri približno polovici bolnikov z esencialno
trombocitemijo (ET) in primarno mielofibrozo (PM) lahko dokažemo pridobljeno
somatsko mutacijo JAK2 V617F. Nadaljnje raziskave so pokazale, da v približno 1-9 %
bolnikov z ET in v 5-11 % bolnikov s PM ugotovimo somatske mutacije v genu za
trombopoetinski receptor MPL. Slednje se pri drugih mieloproliferativnih novotvorbah
(MPN) pojavijo redko. Določitev mutacije JAK2 V617F in mutacij v genu MPL sta
pomembni dodatni preiskavi pri postavitvi diagnoze mieloproliferativnih novotvorb.
Zamenjavi aminokisline triptofan za levcin (MPL W515L) in lizin (MPL W515K) na
mestu 515 aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin sta najpogosteje
ugotovljeni pridobljeni mutaciji trombopoetinskega receptorja pri bolnikih z ET in PM.
Mutaciji najverjetneje povzročata, da je beljakovina aktivna brez vezanega liganda.
Namen našega dela je bil vpeljava metode določitve mutacij MPL W515L/K v receptorju
za trombopoetin, z načinom verižne reakcije s polimerazo v realnem času (uporaba
reagenčnega kompleta MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija)) in določitev deleža
bolnikov z ET, ki so imeli mutaciji MPL W515L/K. Oblikovali smo delovni hipotezi in
sicer, da reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija) omogoča
določitev mutacij MPL W515L/K in da se mutaciji MPL W515L/K pojavljata pri 1-9 %
bolnikov z ET.
Da bi hipotezi dokazali smo iz vzorcev venske krvi 77 bolnikov z ET izolirali granulocite z
gradientnim centrifugiranjem preko fikola. Iz granulocitov smo izolirali celokupno DNA in
ji spektrofotometrično izmerili koncentracijo ter čistočo. Prisotnost mutacij MPL
W515L/K smo nato določili s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času
(qPCR) in alelno diskriminacijo.
Prisotnost mutacije MPL W515L/K smo dokazali pri štirih (5 %) bolnikih z ET, kar je v
skladu s podatki iz literature. Ugotovili smo tudi, da je mutacija MPL W515L pogostejša,
saj smo jo dokazali pri treh (4 %) bolnikih z ET. Mutacijo MPL W515K smo dokazali pri
enem (2 %) bolniku. Reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija)
omogoča določanje mutacij MPL W515L/K.
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
VI
SEZNAM OKRAJŠAV COS razmejitveni vzorec (ang. Cut-Off Sample) Cq cikel pri katerem fluorescenčni signal preseže predviden prag DNA deoksiribonukleinska kislina DNaza encim, ki cepi DNA EDTA etilendiamintetraocetna kislina ET esencialna trombocitemija FAM 6-karboksifluorescein Hb hemoglobin HU hidroksiurea JAK2 Janus kinaza 2 KML kronična mieloična levkemija KNL kronična nevtrofilna levkemija LDH holesterol majhne gostote M molarnost, koncentracija mol/L MDS mielodisplastični sindrom MPL gen za trombopoetinski receptor (ang. Myeloproliferative Leukemia
Virus Oncogene) MPN mieloproliferativne novotvorbe NC negativna kontrola PBS fosfatni pufer s soljo PC pozitivna kontrola PCR verižna reakcija s polimerazo Ph-kromosom spremenjen kromosom 22 PM primarna mielofibroza PV policitemija vera PVSG Polycythemia Vera Study Group qPCR kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času RNA ribonukleinska kislina RNaza encim, ki cepi RNA STAT molekule, ki posredujejo signal in aktivirajo prepis DNA SZO Svetovna zdravstvena organizacija Taq -polimeraza polimeraza iz organizma Thermophilus aquaticus Tm temperatura taljenja UPD uniparentalna disomija WT divji tip, nemutiran (ang. Wild Tipe)
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
1
1 UVOD
1.1 MIELOPROLIFERATIVNE NOVOTVORBE (MPN) Mieloproliferativne novotvorbe so klonske bolezni, za katere je značilno zvečano
nastajanje krvnih celic zaradi motnje na ravni matične krvotvorne celice in kroničen potek
bolezni. Hematopoeza je še učinkovita, zato v odvisnosti od vrste MPN lahko poraste
število eritrocitov, levkocitov ali trombocitov v periferni krvi. Razraščajo se celice
kostnega mozga z znaki dozorevanja brez displastičnih sprememb. Bolezen opredelijo na
osnovi kliničnih znakov, krvni sliki in drugih laboratorijskih preiskavah, citoloških in
histoloških preiskavah kostnega mozga in drugega tkiva in v vse večjem obsegu na osnovi
molekularno genetskih sprememb. Bolezni imajo precej skupnih kliničnih značilnosti.
Potek je večinoma dolgotrajen, v končnem obdobju pa pospešen ali pa ima značilnosti
akutne levkemije. Ena oblika bolezni lahko prehaja v drugo, vendar to ni običajno. Bolniki
so nagnjeni h krvavitvam in trombozam v skladu z znaki in simptomi, povezanih z
razrastjo hematopoetske vrste (1).
Z izjemo kronične mieloične levkemije (KML), molekularno genetsko ozadje drugih MPN
dolgo ni bilo pojasnjeno.
Preglednica I: Razvrstitev mieloproliferativnih novotvorb po SZO (2008) (2) ______________________________________________________________________
kronična mieloična levkemija, BCR/ABL1 pozitivna (KML),
kronična nevtrofilna levkemija (KNL),
policitemija vera (PV),
primarna mielofibroza (PM),
esencialna trombocitemija (ET),
kronična eozinofilna levkemija,
mastocitoza,
neklasificirane MPN
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
2
1.1.1 ESENCIALNA TROMBOCITEMIJA (ET) Esencialna trombocitemija (ET) je klonska bolezen, ki jo uvrščamo v skupino
mieloproliferativnih novotvorb. Pojavnost bolezni je 1 do 2,5 na 100,000 prebivalcev.
Najbolj pogosta je med petdesetim in sedemdesetim letom starosti, nekoliko manj pogosta
pri ljudeh v tretji in četrti dekadi življenja, občasno se pojavi tudi pri otrocih. Pogosteje
obolevajo ženske (Ž:M = 2:1).
Za ET je značilno razraščanje velikih, zrelih megakariocitov v kostnem mozgu in zato se
posledično zveča število trombocitov v periferni krvi. Tvorba trombocitov je lahko šest do
petnajstkrat večja od normalne, njihova življenjska doba pa je lahko tudi normalna. Pri ET
ne ugotavljajo značilne genetske oziroma kromosomske spremembe. Značilna je
nagnjenost h krvavitvam in trombozam. Krvavitve so posledica motene funkcije
trombocitov.
Klinična slika
Dve tretjini bolnikov ob odkritju bolezni nimata simptomov. Redki znaki prisotnosti ET so
znaki povečane presnove, npr. izguba telesne teže, znojenje, utrujenost. Okoli 40 %
bolnikov ima povečano vranico, zato se pojavi napetost v trebuhu in tope bolečine pod
levim rebrnim lokom. Jetra so redko povečana. Pri 20 do 50 % bolnikov se bolezen
manifestira v obliki tromboz ali krvavitev, ki so tudi glavni vzrok smrti bolnikov.
Krvavitve so lahko v prebavila, v kožo, sluznice, iz nosu, po poškodbah in operacijah.
Arterijske tromboze so malo bolj pogoste kot venske, od venskih pa jih je četrtina v venah
spodnjih udov. Tromboza hepatične in vraničnih ven je zelo pogosta. Žilje je lahko
prizadeto tudi na ravni arteriol in kapilar in se klinično izraža kot ishemija prstov rok in
nog, kar imenujemo eritromelalgija.
Diagnoza
Diagnoza temelji na kliničnih znakih, krvni sliki, citoloških in histoloških preiskavah
kostnega mozga in v vse večjem obsegu na osnovi molekularno genetskih sprememb.
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
3
Sprva so uporabljali za opredelitev in zdravljenje ET klinična diagnostična merila PVSG
(Polycythemia Vera Study Group), danes pa bolezen opredeljujejo na osnovi kriterijev
Svetovne zdravstvene organizacije, ki s histološkim pregledom kostnega mozga ločijo ET
od obdobja prefibroze in zgodnje fibroze primarne mielofibroze. Histološki pregled
kostnega mozga s poudarkom na oceni stopnje fibroze ima diagnostični, predvsem pa
napovedni pomen. Praviloma ga morajo opraviti pred zdravljenjem z zdravili za
zmanjšanje števila trombocitov. Danes za potrditev ET redno določajo somatsko mutacijo
JAK2 V617F, ki je prisotna pri nas pri 61 % bolnikov z ET. Približno pri 9 % bolnikov z
ET dokažejo tudi mutacije v genu MPL. Izjemoma se zadovoljimo z opredelitvijo ET po
kriterijih PVSG pri starejših prizadetih bolnikih, ki že prejemajo zdravila za zmanjšanje
števila trombocitov (3).
Število trombocitov pri ET praviloma presega 450 × 109/L, pogosto je med 1000 in 2000 ×
109/L. Trombociti imajo večji volumen, posamezni so lahko zelo veliki in nepravilnih
oblik. Njihova funkcija je lahko zmanjšana.
Pri biopsiji kostnega mozga lahko dobijo normocelularen kostni mozeg ali pa blago
hipercelularen. Najbolj značilno je razraščanje zelo velikih, skoraj gigantskih
megakariocitov, ki imajo hiperlobulirana jedra in obilno citoplazmo (1).
Preglednica II: Diagnostični kriteriji za esencialno trombocitemijo po SZO 2008 (2)
Za potrditev ET vsa našteta merila:
stalno zvečano število trombocitov v krvi: > 450 × 109/L
značilne histološke spremembe v kostnem mozgu: povečano število pretežno
velikih zrelih megakariocitov s hiperlobuliranim jedrom in zrelo citoplazmo,
normalna celularnost kostnega mozga, odsotnost ali mejno povečana količina
retikulina brez proliferacije ali pomnožitve nezrelih granulocitov, normalna
normoblastna eritropoeza
prisotnost klonskega označevalca: JAK2 V617F, drugi klonski označevalci
Za izključitev ET, odsotnost meril SZO za:
prava policitemija, KML, MPN, MDS
odsotnost JAK2 V617F ali ni znakov za reaktivno trombocitozo
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
4
Diferencialna diagnostika: ET morajo razlikovati od reaktivne trombocitoze, prave policitemije, KML in mielofiboze.
Za razliko od ET pri reaktivnih trombocitozah ni krvavitev in tromboz, pa tudi število
trombocitov v krvi običajno ni večje od 1000 x 109/L. Trombociti so morfološko normalni,
tako kot tudi njihova funkcija.
Pri pravi policitemiji najdejo povečano maso eritrocitov, povečano aktivnost alkalne
fosfataze nevtrofilcev, v makrofagih kostnega mozga ne najdejo železa.
KML se od ET razlikuje po prisotnosti kromosoma Ph, ki je posledica translokacije med
kromosomoma 9 in 22 (t(9;22)), večinoma zmanjšani aktivnosti alkalne fosfataze
nevtrofilcev in izrazitem razrastu granulocitne vrste v kostnem mozgu. Izrazita
trombocitoza je le redko prisotna.
Mielofibrozo z mieloidno metaplazijo ločijo od ET po veliki vranici in po tem, da so v
razmazu kapljice periferne krvi pri PM značilni dakriociti.
Zdravljenje:
Osnovni namen zdravljenja je zmanjšati bolnikove težave, predvsem pa preprečevati
življenjsko ogrožajoče tromboze, trombembolije in krvavitve. Verjetnost krvavitev
zmanjšajo, če z zdravili zmanjšajo število trombocitov v krvi pod 1000 × 109/L in v času
zmanjševanja števila trombocitov prenehajo dajati antiagregacijska zdravila. Med
antikoagulacijskimi zdravili najpogosteje uporabljajo acetilsalicilno kislino (Aspirin), v
dnevnem odmerku 50 do 100 mg ali 100 mg vsak drugi dan. Acetilsalicilna kislina je pri
bolnikih z ET učinkovita pri preprečevanju arterijskih tromboz, posebno pri ishemiji v
predelu prstov rok in nog (eritromelalgija), preprečevanju gangrene in cerebrovaskularne
ishemije.
Hidroksiurea (HU) je zdravilo za zmanjšanje števila trombocitov. Zaradi možnosti, da po
daljši uporabi (okoli 10–15 let) povzroči pojav sekundarne akutne mieloične levkemije, se
naj ne bi uporabljalo pri mlajših bolnikih. Kljub temu pa hidroksiureo pogosto uporabijo za
nekajtedensko hitro zmanjševanje velikega števila trombocitov tudi pri mlajših bolnikih.
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
5
Trombofereza je indicirana za hitro zmanjšanje števila trombocitov, a le za kratek čas. Za
trajno zdravljenje uporabljajo interferon alfa. Rekombinantni interferon alfa učinkovito
zavre rast nenormalnega klona megakariocitov v kostnem mozgu.
Najnovejše zdravilo za zdravljenje ET je anagrelid. Dnevni odmerek 2 do 3 mg anagrelida,
ki zavira proliferacijo megakariocitov in ni citostatik, zelo hitro zmanjša število
trombocitov in skoraj ne vpliva na ostale celice v kostnem mozgu (4).
Potek in prognoza: ET velja za neozdravljivo bolezen, s kroničnim potekom. Življenjska doba bolnikov z ET
predvidoma ni skrajšana, odvisna je od mnogih dejavnikov, med drugim od naravnega
poteka bolezni in njenih zapletov ter načina zdravljenja. Najpogostejši vzrok smrti so
krvavitve in tromboze. S prihodom zdravila anagrelid na slovenski trg zdravil so poenotili
način zdravljenja ET z drugimi evropskimi državami. Kljub številnim raziskavam zaenkrat
še ni povsem pojasnjen pomen določanja mutacije V617F v genu JAK2 za oceno napovedi
izida bolezni.
1.2 MUTACIJE V GENU MPL Onkogen v-mpl so prvič odkrili leta 1990 pri miših z mieloproliferativnim levkemičnim
virusom (ang. Myeloproliferative leukemia virus). Leta 1992 so klonirali človeški
homolog, imenovan C-MPL. Gen C-MPL kodira protein, ki je homologen članom
hematopoetske receptorske naddružine. Trombopoetin, ki je ligand proteina C-MPL pa je
bil kloniran leta 1994. Trombopoetin je primarni in najpomembnejši regulator rasti in
diferenciacije megakariocitov ter nastanka trombocitov (5).
Gen MPL (ang. Myeloproliferative Leukemia Virus Oncogene, MPL) je sestavljen iz 12
eksonov, pri človeku se nahaja na kromosomu 1p34. Gen MPL kodira membranski protein,
ki je sestavljen iz 635 aminokislin, z dvema zunajceličnima receptorskima domenama za
citokine in dvema znotrajceličnima aktivacijskima domenama. Protein na površini celice
imenujejo tudi CD110 (ang. Cluster of Differentiation 110) (5, 6).
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
6
Najpogostejše somatske mutacije so MPL W515L, MPL W515K in MPL W515A.
Nahajajo se v juxtamembranski domeni receptorja za trombopoetin. Mutacije se zgodijo
znotraj eksona 10 gena MPL. Mutacija G→T na mestu 1544 nukleotidnega zaporedja
povzroči zamenjavo aminokisline triptofan z levcinom na mestu 515 aminokislinskega
zaporedja receptorja za trombopoetin (W515L). Mutacija GT→AA na mestih 1543 in 1544
nukleotidnega zaporedja povzroči zamenjavo aminokisline triptofan z lizinom na mestu
515 aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin (W515K). Tretja omenjena
mutacija pa povzroči zamenjavo aminokisline triptofan z alaninom na mestu 515
aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin (W515A).
Mutacija MPL W515L povzroča proliferacijo hematopoetskih celic neodvisno od citokinov
ter povečano odzivnost receptorja za trombopoetin in posledično konstantno fosforilacijo
signalnih proteinov in aktivacijo signalnih poti, kot so STAT3, STAT5, MAPK in
PI3K/AKT. Prvič je bila opisana leta 2006 pri bolnikih z JAK2 V617F-negativno primarno
mielofibrozo. Mutacija MPL W515L je najpogostejša izmed vseh opisanih mutacij v genu
MPL (7, 8, 9).
Triptofan na mestu 515 se nahaja v juxtamembranskem delu citoplazemske domene
proteina MPL in je del ohranjenega amfipatskega motiva (RWQFP), ki je pomemben pri
ohranjanju receptorja za trombopoetin v neaktivni obliki, ob odsotnosti trombopoetina
(10).
Zelo redko se pri bolnikih z ET pojavi mutacija MPL S505N. Mutacija (1073G→A)
povzroči zamenjavo aminokisline serin z asparginom na mestu 505 aminokislinskega
zaporedja. Mutacija MPL S505N je bila prvič opisana pri Japonski družini z avtosomno
dominantno trombocitozo. Identično mutacijo so odkrili tudi pri miših in sicer z mutacijsko
analizo, pri kateri so uporabili retroviruse. Pred kratkim so jo opisali tudi kot sporadično
mutacijo pri ET (10, 11, 19).
Poleg že omenjenih mutacij MPL W515L/K/A in MPL S505N so raziskovalci pri bolnikih
s primarno mielofibrozo odkrili še štiri mutacije in sicer MPL S204P, MPL A506T, MPL
L510P in MPL A519Y, katerih funkcija in pomen je še neznan (10).
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
7
Mutaciji S204F in Y591D so odkrili pri bolnikih z uniparentalno disomijo na kromosomu
1p (1pUPD). Tudi njuna funkcija je še neznana (12).
Pri približno 7 % afriških Američanov so odkrili mutacijo MPL K39N, imenovano tudi
MPL Baltimore, ki naj bi se nahajala na N-terminalni regiji proteina MPL. Mutacija G→T
na mestu 1238 nukleotidnega zaporedja povzroči zamenjavo aminokisline lizina z
asparginom na mestu 39 aminokislinskega zaporedja (K39N). Heterozigotni bolniki imajo
blago trombocitozo oz. število trombocitov na zgornji meji referenčnih vrednosti.
Homozigoti pa imajo število trombocitov med 600-800 x 109/L (10, 13).
Pred kratkim so pri družinah arabskega rodu odkrili tudi mutacijo MPL P106L.
Homozigotni bolniki imajo število trombocitov > 1000 x 109/L, medtem ko heterozigotni
bolniki izražajo blago trombocitozo ali pa imajo normalno število trombocitov. Bolniki
imajo v serumu povišano raven trombopoetina, kar kaže na to, da mutacija MPL P106L
interferira, sodeljuje z internalizacijo in/ali razgradnjo trombopoetina, ohrani pa zmožnost
vezave trombopoetina in aktivacijo receptorja (10).
Somatske mutacije v genu MPL so redke in ponavadi povezane z MPN. Pojavljajo se
predvsem pri bolnikih z ET in PM, pri bolnikih z PV niso prisotne. Ugotovili pa so jih tudi
pri bolnikih z akutno megakariocitno levkemijo (11,14). Pogostost pojavljanja mutacij
W515L in W515K je najvišja pri bolnikih s PM, pojavi se v 5 do 11 % (10, 15, 20).
Nekoliko nižjo pojavnost so ugotovili pri bolnikih z ET. Pojavi se v 1 do 9 % (10, 15, 20)
Razponi v pojavnosti mutacij so lahko posledica uporabe različnih kriterijev za postavitev
diagnoze (Polycythemia Vera Study Group ali Svetovne zdravstvene organizacije) in
verjetno tudi od občutljivosti testa s katerim so mutacije določili.
Istočasno prisotnost mutacije JAK2 V617F in MPL W515L/K so odkrili le pri redkih
bolnikih. Nejasno je tudi, ali so te mutacije pri istem bolniku prisotne v istem klonu ali
ločenih subklonih (8, 15).
Skupina raziskovalcev je leta 2008 pri bolnikih z ET ocenjevala povezavo med mutacijami
MPL, mutacijo JAK2 V617F in kliničnimi ter laboratorijskimi parametri, na osnovi katerih
so želeli nadalje opredeliti bolnike z ET v podskupine. Ugotovili so, da imajo bolniki s
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
8
prisotno mutacijo JAK2 V617F višjo raven hemoglobina in višje število nevtrofilcev ter
nižje število trombocitov, serumskega feritina in eritropoetina v primerjavi z bolniki, ki
nimajo prisotne mutacije JAK2 V617F. Ugotovili so tudi, da imajo bolniki z ET pri katerih
so prisotne mutacije v genu MPL, večje število trombocitov in nižjo raven hemoglobina
kot bolniki z ET pri katerih je prisotna mutacija JAK2 V617F, vendar se ne razlikujejo od
bolnikov z JAK2/MPL-divjim tipom. Poleg tega so številne študije pokazale, da lahko
endogene megakariocitne kolonije, ne pa tudi eritroidne, zrastejo iz MPL W515-pozitivnih
celic. Ti podatki kažejo na to, da lahko bolnike z ET opredelimo glede na različno stopnjo
megakariopoeze in eritropoeze. Tako je za bolnike z ET in prisotno mutacijo MPL W515
ali bolnike z JAK2/MPL-divjim tipom značilna višja stopnja megakariopoeze, višje število
trombocitov in nižja raven hemoglobina. Za bolnike z ET in prisotno mutacijo JAK2
V617F pa je značilna višja stopnja eritropoeze, nižja raven eritropoetina in višja raven
hemoglobina (8, 10). Vsekakor bodo potrebne še nadaljnje raziskave za potrditev teh
raziskav in vpeljavo v redno klinično prakso.
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
9
1.3 KVANTITATIVNA VERIŽNA REAKCIJA S POLIMEZARO V REALNEM ČASU Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR) predstavlja nadgradnjo
klasičnega ali konvencionalnega PCR. Omogoča namreč sprotno zaznavanje in spremljanje
količine pridelka reakcije PCR v vsakem ciklu med samo reakcijo PCR. Detekcija
pridelkov reakcije PCR je mogoča zaradi fluorescenčnih molekul, ki prikazujejo povečanje
količine pridelkov DNA s sorazmernim povečanjem fluorescenčnega signala. Izmerjena
fluorescenca odraža količino podvojenih pridelkov PCR v vsakem ciklu (16).
Prednosti PCR v realnem času pred konvencionalnim PCR se odražajo v hitrosti izvajanja,
visoki občutljivosti in ponovljivosti, kot tudi v minimalni možnosti kontaminacije, saj
reakcija in vrednotenje podatkov poteka v zaprtem sistemu. Odlikuje ga široko dinamično
območje, kar omogoča sočasno analizo vzorcev z zelo različnimi koncentracijami.
Rezultati PCR v realnem času so lahko kvalitativni (prisotnost ali odsotnost zaporedja) ali
kvantitativni (število kopij DNA). Vrednotenje rezultatov poteka brez gelske elektroforeze,
kar skrajša čas preizkusa in poveča pretočnost vzorcev.
Za zaznavanje nastalega pridelka PCR se uporablja več načinov, med katerimi so najbolj
pogosti nespecifičen način zaznave z barvilom SYBR Green I in specifični načini zaznave
s hidrolizirajočimi sondami in dvojno hibridizacijskimi sondami.
Pri analizi s hidrolizirajočimi sondami se v reakcijski zmesi poleg začetnih
oligonukleotidov, nahaja še dvojno označena sonda (TaqMan), ki ima Tm (temperatura
taljenja) za 510 °C višjo od obeh začetnih oligonukleotidov. Sonda TaqMan je označena
s fluorescenčnim barvilom (ang. reporter) na 5´ koncu in z dušilcem fluorescenčnega
signala (ang. quencher) na 3´ koncu sonde. Ker dušilec signala ujame signal, ki ga pošilja
fluoresecenčno barvilo na drugi strani sonde, sonda ne fluorescira. Ko pa se med reakcijo
PCR izgrajuje preiskovano zaporedje (tarčni gen), se sonda TaqMan veže na ustrezno
mesto v novo nastajajoči verigi. Encim Taq-polimeraza s 5´ eksonukleazno aktivnostjo
sondo hidrolizira, zato se razdalja med fluorescenčnim barvilom in dušilcem poveča in
tako je onemogočeno prestrezanje fluorescence. Fluorescenca barvila zato poraste in je
sorazmerna s količino produkta PCR (Slika 1) (16).
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
10
Slika 1: Princip kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času (qPCR).
Prirejeno po Real-Time PCR Applications Guide (16).
Metoda qPCR temelji na merjenju fluorescence v eksponentni fazi, in sicer na osnovi
izmerjenih podatkov narišemo krivuljo, ki podaja odvisnost intenzitete fluorescenčnega
signala posameznih vzorcev od števila ciklov. Krivulja pomnoževanja je razdeljena na dve
fazi: eksponentna faza in plato faza (Slika 2). V eksponentni fazi se količina produkta PCR
v vsakem ciklu podvoji. V poznejših ciklih se reakcija pomnoževanja postopno
upočasnjuje zaradi porabe sestavin reakcijske zmesi, manjše aktivnosti DNA-polimeraze in
kopičenja inhibitornih produktov in zaradi tega preide v plato fazo (cikli 2840 na Sliki 2).
V začetnih ciklih (cikli 118 na Sliki 2) intenziteta fluorescence ne preseže intenzitete
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
11
fluorescenčnega ozadja. Sčasoma pa je količina pridelka dovolj velika, da lahko zaznamo
fluorescenčni signal. Cikel, pri katerem se to zgodi, imenujemo cikel kvantifikacije (angl.
quantification cycle) oz. Cq (Slika 2) (21).
Vrednost Cq je sorazmerna številu kopij matrice v začetku reakcije. Pri večjem začetnem
številu kopij matrice signal prej preseže prag in tako določimo nižji Cq. Vrednosti Cq so
torej obratno sorazmerne z začetnim številom kopij matrice in na osnovi njih primerjamo
vzorce med seboj.
Slika 2: Krivulja pomnoževanja pri PCR v realnem času. Prirejeno po Real-Time PCR
Applications Guide (16).
1.3.1 ALELNA DISKRIMINACIJA Po končanem qPCR lahko v neeksponentni fazi krivulje qPCR izvedemo še alelno
diskriminacijo (ang. Allelic Discrimination). To je način ugotavljanja določene genske
spremembe po izvedenem qPCR-ju. Za učinkovito alelno diskriminacijo potrebujemo
smerni in protismerni oligonukleotidni začetnik ter par hidroliznih sond TaqMan,
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
12
označenih s 5´ reporterskim barvilom. Prva sonda ima na 5´ koncu vezano reportersko
barvilo, ki se razlikuje od reporterskega barvila druge sonde, na 3´ koncu pa imata obe
sondi vezan enak dušilec, ki je lahko fluorescenčno ali nefluorescenčno barvilo z
dodatkom za izboljšano vezavo na ciljno zaporedje DNA. Običajno je mutiran alel (alel 2)
označen z reporterskim barvilom FAMTM, nemutiran (alel 1) pa z VIC®. Z merjenjem
povečanja intenzitete fluorescence posameznega barvila po qPCR pridobimo podatke o
genotipu za gensko spremembo, ki jo želimo ugotoviti. Če izmerimo povečanje intenzitete
le fluorescenčnega barvila VIC® je vzorec homozigot za prvi alel. Če izmerimo povečanje
intenzitete le fluorescenčnega barvila FAMTM je vzorec homozigot za drugi alel. V primeru
da izmerimo povečanje intenzitete obeh fluorescenčnih barvil, potem je vzorec heterozigot
za preiskovana alela (Slika 3).
- homozigot alel Y (FAM) - heterozigot - homozigot alel X (VIC) - H2O
Slika 3: Prikaz rezultatov alelne diskriminacije
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
13
2 NAMEN DELA Mutaciji MPL W515L in MPL W515K sta pomemben dodaten diagnostičen kriterij pri
opredelitvi MPN (2). Sta dokaz klonalnosti in se pojavljajata pri približno 1 do 9 %
bolnikov z ET in pri 5 do 11 % bolnikov s PM (10, 15, 20).
Oblikovali smo hipotezi:
- reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija) omogoča določanje
mutacij MPL W515L in MPL W515K v receptorju za trombopoetin
- mutaciji MPL W515L in MPL W515K se pojavljata pri približno 1-9 % bolnikov z
ET.
Namen našega dela je:
- vpeljava metode določitve mutacij MPL W515L in MPL W515K v receptorju za
trombopoetin, z načinom verižne reakcije s polimerazo v realnem času (uporaba
reagenčnega kompleta MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija)). Način bomo
preizkusili na pozitivnih, negativnih kontrolnih vzorcih DNA reagenčnega kompleta in
na vzorcih DNA, dobljenih iz granulocitov bolnikov z ET.
- določiti delež bolnikov z ET, ki imajo mutacijo MPL W515L/K in rezultate
primerjati s podatki iz literature.
K delu bomo pristopili tako, da bomo izolirali granulocite z gradientnim centrifugiranjem
preko fikola iz periferne krvi 77 bolnikov z ET. Iz le-teh bomo izolirali celokupno DNA z
reagenčnim kompletom QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) in ji spektrofotometrično
izmerili koncentracijo ter čistočo. Prisotnost mutacij MPL W515L/K bomo nato določili s
kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qPCR). Genotip mutacij bomo
določili z alelno diskriminacijo. Pričakujemo, da bomo hipotezi dokazali in potrdili.
Uvedba metode določitve mutacij MPL W515L in MPL W515K z reagenčnim kompletom
MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija) bo pripomogla k postavitvi diagnoze bolnikov
z ET in PM, v skladu s smernicami kriterijev diagnostičnih meril Svetovne zdravstvene
organizacije.
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
14
3 PREISKOVANCI IN METODE
3.1 PREISKOVANCI V raziskavo smo vključili 77 bolnikov z esencialno trombocitemijo, od tega 59 (77 %)
žensk in 18 (23 %) moških. Vsi bolniki so bili negativni za prisotnost mutacije JAK2
V617F. Starost bolnikov ob prvem odvzemu oz. ob napotni diagnozi je bila od 18 do 89
let. Mediana starosti bolnikov je znašala 48 let.
Vzorci periferne krvi bolnikov so bili odvzeti v ambulanti Kliničnega oddelka za
hematologijo, UKC Ljubljana. Meritve smo opravili na vzorcih DNA, shranjenih pri
temperaturi 20 °C v Specializiranem hematološkem laboratoriju kliničnega oddelka za
hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana.
Diagnoza je bila postavljena s strani zdravnika hematologa na osnovi kriterijev SZO 2008
(2).
DNA je bila izolirana iz granulocitov vzorcev periferne krvi. Granulocite smo pridobili z
liziranjem eritrocitov po odstranitvi mononuklearnih celic po gradientnem centrifugiranju
vzorcev periferne krvi preko fikola. DNA pa smo izolirali z reagenčnim kompletom
QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN).
Izvedeni postopki so bili v skladu z načeli Helsinške deklaracije o biomedicinskih
raziskavah na človeku (1975).
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
15
3.2 METODE
3.2.1 Izolacija granulocitov iz vzorcev venske krvi z gradientnim centrifugiranjem preko fikola Izolirani granulociti so izhodni material za izolacijo DNA, ki jo uporabljamo za
molekularno genetske preiskave pri MPN. Fikol se uporablja za izolacijo posameznih vrst
krvnih celic (granulociti, mononuklearne celice) iz periferne krvi ali kostnega mozga.
Različne krvne celice imajo različno specifično gostoto in se tako ločijo v gradientu s
fikolom, ki nastane med centrifugiranjem.
Reagenti, pribor in aparature:
Ficoll – PaqueTM PLUS (GE Healthcare Bio-Science AB) - brezbarvna, bistra
tekočina za gradientno ločevanje celic, hranimo jo v temnem prostoru;
1 × fosfatni pufer s soljo (PBS) - uporablja se za redčenje vzorcev periferne krvi in
kostnega mozga, za spiranje celic ter raztapljanje celic na koncu izolacije.
Pripravimo ga iz 10 × pufra PBS (GIBCO-Invitrogen), ki je fiziološka raztopina s
solmi (NaCl, KCl, Na2HPO4 × 7H2O, KH2PO4), a brez dodatka CaCl2 ter MgCl2;
pH: 7,2 ± 0,05;
(Priprava PBS: Za pripravo PBS z merilnim valjem odmerimo 100 mL 10 × pufra
PBS ter ga prenesemo v 1000 mL bučko in z redestilirano vodo, ki ne vsebuje
encimov DNaz in RNaz, redčimo do oznake);
raztopina za lizo eritrocitov – je pufer, ki povzroči lizo eritrocitov in nam tako
omogoča izolacijo čistih levkocitov. Najprej pripravimo 10 × matično raztopino za
lizo eritrocitov, ki vsebuje soli (82,6g NH4Cl, 10,0g KHCO3, 0,37g EDTA)
raztopljene v 1000mL redestilirane vode in prefiltrirane skozi vakuumsko-
filtracijski sistem.
(Priprava raztopine za lizo eritrocitov: Za pripravo raztopine za lizo eritrocitov z
valjem odmerimo 100 mL 10 × matične raztopine za lizo eritrocitov in jo
prenesemo v 1000 mL bučko ter z redestilirano vodo, ki ne vsebuje encimov DNaz
in RNaz, redčimo do oznake);
pipete in nastavki za pipete (10–100 µL, 100–1000 µL Eppendorf);
10 mL epruveta Vacuntainer z antikoagulantom K2/K3 EDTA;
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
16
15 mL plastične, sterilne epruvete Falcon (Greiner bio-one CELLSTAR PP-test
tube);
sterilna 50 mL centrifugirka (Falcon);
1,5 mL mikrocentrifugirke (Safe-lock tubes; Eppendorf Biopur);
sterilna brizga in igla za injiciranje fikola;
stojalo za epruvete;
komora, ki omogoča sterilno delo (Iskra Bio LFVP 12);
hematološki analizator Beckman Coulter LH 750 Analyzer;
centrifuga Labofuge 400 ( Heraeus);
orbitalni mešalnik
Postopek:
Odvzeli smo 10 mL venske krvi v epruveto Vacuntainer z antikoagulantom EDTA.
Vensko kri smo redčili s fosfatnim pufrom s soljo (PBS) v razmerju 1 : 1, ogretim na sobno
temperaturo. V 15 mL plastične epruvete smo z iglo in brizgalko nabrizgali 3 mL fikola.
Razredčeno vensko kri smo počasi in previdno pipetirali ob steni epruvete na plast fikola,
tako da je meja med fikolom in razredčeno vensko krvjo ostala popolnoma ostra. Nato smo
vzorce centrifugirali 22 minut pri 2200 obr./min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus) pri
sobni temperaturi.
Po centrifugiranju so bile lepo vidne vse štiri plasti celic: eritrociti in granulociti, fikol,
mononuklearne celice in plazma. Eritrociti in granulociti so se zaradi večje specifične
gostote usedli na dno epruvete pod plast fikola. Plast fikola je ostala bistra, nad njo pa se je
nabrala plast mononuklearnih celic. Nad plastjo mononuklearnih celic v supernatantu so se
nabrali PBS, plazma in maščoba (Slika 4).
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
17
Slika 4: Ločitev posameznih frakcij celic z gradientnim centrifugiranjem preko fikola
Po centrifugiranju smo odstranili supernatant, plast mononuklearnih celic in fikola.
Granulocite smo s pipeto prenesli v sterilno 50 mL centrifugirko in dolili 45 mL raztopine
za lizo eritrocitov, premešali z obračanjem in inkubirali na sobni temperaturi 10 min. Nato
smo vzorce centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus). Po
centrifugiranju smo supernatant previdno odlili, skupek celic razbili z mešanjem na
orbitalnem mešalniku in dodali 25 mL raztopine za lizo eritrocitov. Ponovno smo
premešali z obračanjem in inkubirali na sobni temperaturi 10 min ter po inkubiranju vzorce
centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus).
Supernatant smo odlili in granulocite s pipeto prenesli v manjšo 15 mL sterilno epruveto.
V epruveto smo dolili 14 mL 1 x fosfatnega pufra s soljo (PBS), premešali z obračanjem
in centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus). Nato smo
odlili supernatant, celice raztopili v preostali tekočini in dolili 12 mL 1 x fosfatnega pufra s
soljo (PBS). Premešali z obračanjem in centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga
Labofuge 400, Heraeus).
Po končanem spiranju granulocitov s fosfatnim pufrom s soljo smo odlili supernatant in
odpipetirali še vso preostalo tekočino nad celicami. Nato smo uravnali koncentracijo celic
na 5 × 106 celic v 200 µl raztopine PBS. Število celic smo prešteli s pomočjo
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
18
hematološkega analizatorja (Beckman Coulter LH 750 Analyzer). Te celice smo nato
prenesli v 1,5 mL sterilno mikrocentrifugirko, ki ni vsebovala encimov RNaz in DNaz.
Vzorec izoliranih granulocitov smo shranili v zamrzovalnik (-20 ºC).
3.2.2 Izolacija celokupne DNA iz granulocitov Reagenčni komplet QIAamp DNA Mini Kit (kat. št. 51304, QIAGEN) je namenjen
izolaciji celotne DNA iz različnih bioloških vzorcev, kot so polna kri, plazma, serum,
kostni mozeg in celice, vključno granulociti in mononuklearne celice. Reagenčni komplet
se lahko uporablja na svežih ali zamrznjenih vzorcih krvi, ki so jim dodani različni
antikoagulanti (EDTA, citrat, heparin).
Reagenti, pribor in aparature:
1 × fosfatni pufer s soljo (PBS)
QIAamp DNA Mini Kit (kat. št. 51304, QIAGEN), ki vsebuje:
- pufer AL – pufer za lizo celic;
- pufer ATL;
- pufer AW1, ki se mu pred začetkom uporabe doda 25mL absolutnega etanola;
- pufer AW2, ki se mu pred začetkom uporabe doda 30mL absolutnega etanola;
- pufer AE;
- proteinaza K;
- filtrirne epruvetke z volumnom 700 µL;
- zbiralne epruvetke z volumnom 2 mL (sterilne, brez prisotnih encimov RNaz in
DNaz);
pipete in nastavki za pipete (10100 µL, 1001000 µL Eppendorf);
1,5 mL mikrocentrifugirke (Eppendorf Safe-lock tubes; Eppendorf Biopur);
stojalo za mikrocentrifugirke;
komora, ki omogoča sterilno delo (Iskra Pio LFVP 12);
centrifuga Biofuge Pico (Heraeus);
orbitalni mešalnik;
termoblok TDB-120 (Biosan).
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
19
Postopek: Pred začetkom izolacije smo segreli termoblok TDB-120 (Biosan) na 56 ºC. Vzorce s 5 x
106 celic resuspendiranih v 200 µL pufra PBS smo segreli na sobno temperaturo. K 200 µL
vzorca celic smo dodali 20 µL proteinaze K in 200 µL pufra AL. Zaprte mikrocentrifugirke
smo dobro (15–20 s) premešali z vorteksiranjem in nato še kratko centrifugirali (˝spin
down˝) v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus). Nato smo vzorce vstavili v termoblok in jih
inkubirali 10 min pri 56 ºC.
Po končani inkubaciji smo k vzorcu celic dodali 200 µL absolutnega etanola. Dobro (15 –
20 s) premešali z vorteksiranjem in kratko centrifugirali (˝spin down˝) v centrifugi Biofuge
Pico (Heraeus). Medtem smo si v stojalu za mikrocentrifugirke sestavili zbiralne epruvete s
kolonami in nanje prenesli celotno raztopino iz mikrocentrifugirk. Nato smo centrifugirali
1 min na 9000 obr/min v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus).
Po končanem centrifugiranju smo zavrgli zbiralno epruveto in znova sestavili kolono z
novo zbiralno epruveto. K vzorcu celic smo dodali 500 µL pufra AW1 in centrifugirali 1
min na 9000 obr/min v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus).
Ponovno smo zavrgli zbiralno epruveto in sestavili novo zbiralno epruveto s kolono.
Dodali smo 500 µL pufra AW2 in centrifugirali 3 min na 13000 obr/min v centrifugi
Biofuge Pico (Heraeus).
Kolone smo nato vstavili v 1,5 mL mikrocentrifugirke, ki so bile RNaz in DNaz proste.
Dodali smo 200 µL pufra AE ter inkubirali 5 min na sobni temperaturi. Nato smo
centrifugirali 1 min na 9000 obr/min v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus). Po končanem
centrifugiranju smo kolone zavrgli, v mikrocentrifugirki nam je ostal le še eluat DNA.
Mikrocentrifugirke z DNA smo shranili v zamrzovalniku (-20 °C).
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
20
3.2.3 Merjenje koncentracije in čistoče vzorcev DNA
Vzorcem z izolirano DNA smo pred nadaljnjo analizo najprej izmerili koncentracijo DNA
ter preverili njeno čistočo, saj smo za reakcijo potrebovali 25ng vzorčne DNA. To smo
določili s pomočjo spektrofotometra Parkin Elmer (program Lambda 20 Bio), z merjenjem
absorbance pri treh valovnih dolžinah 260 nm (A260), 280 nm (A280) in 320 nm (A320).
S spektrofotometrično metodo mora biti izmerjena absorbanca (A260) večja od 0,15. Če je
A260 = 1, pomeni, da smo imeli v vzorcu 50 µg/mL DNA. Ta povezava velja samo pri
nevtralnem pH.
Čistočo vzorcev smo preverjali z določanjem razmerja absorbance pri valovni dolžini 260
in 280 nm in odštetjem tega razmerja od absorbance pri valovni dolžini 320 nm.
Predpostavljamo, da je čistoča DNA ustrezna, če je razmerje A260/A280 = 1,7-2,0. V
primeru, da je razmerje A260/A280 manjše od 1,7, so v vzorcu lahko prisotni proteini in/ali
aromatske spojine (npr. fenol). Razmerje A260/A280 > 2,0 nakazuje, da je v vzorcu lahko
prisotna RNA.
Reagenti, pribor in aparature:
raztopine za spiranje spektrofotometra:
- 70 % etanol,
- 0,1 M in 1 M NaOH,
- redestilirana voda,
- DNaza in RNaza prosta deionizirana voda,
2 mL epruvetke (Eppendorf, BioPure);
spektrofotometer Parkin Elmer (program Lambda 20 Bio).
Postopek:
V sterilno 2 mL epruvetko (Eppendorf, BioPure) smo odpipetirali 45 μL deionizirane vode
in dodali 5 μL vzorčne DNA ter dobro premešali. Nato smo zagnali program Lambda 20
Bio in z ukazom Wp določili aplikacijo DNA ter pričeli z merjenjem absorbanc.
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
21
3.2.4 Kvantitativna določitev mutacij MPL W515L in MPL W515K z verižno reakcijo s polimerazo v realnem času
Za določitev izražanja mutacij MPL W515L in MPL W515K smo uporabili kvantitativno
verižno reakcijo s polimerazo v realnem času z uporabo hidrolizirajočih sond. V reakciji
smo uporabili smerni in protismerni oligonukleotidni začetnik ter par sond označenih s 5'
reporterskim barvilom. Pri alelni diskriminaciji reakcijska mešanica vsebuje za vsak alel
specifično fluorescenčno označeno sondo (v našem primeru je bil mutiran alel označen z
reporterskim barvilom FAMTM, nemutiran pa z VIC®), kar omogoča spremljanje
pomnoževanja posameznega alela (17).
Reagenti, pribor in aparature:
univerzalna reakcijska mešanica TaqMan® Universal PCR Master Mix 2X (Applied
Biosystems);
reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen), ki je sestavljen iz:
- IPSOGEN PPM–MPL W515L 10X (kat. št. PF-000552) je mešanica
specifičnih smernih in protismernih oligonukleotidov za gen MPL ter
specifičnih sond za mutacijo (W515L) FAMTM in divji tip VIC®;
- IPSOGEN PPM–MPL W515K 10X (kat. št. PF-000553) je mešanica
specifičnih smernih in protismernih oligonukleotidov za gen MPL ter
specifičnih sond za mutacijo (W515K) FAMTM in divji tip VIC®;
- PC-W515L (pozitivna kontrola) (kat. št. PF-000547);
- PC-W515K (pozitivna kontrola) (kat. št. PF-000548);
- NC-MPL (negativna kontrola) (kat. št. PF-000549);
- COS-MPL W515L (Cut–Off Sample oz. razmejitveni vzorec) = 1,5 %
W515L/WT (kat. št. PF-000550);
- COS-MPL W515K (Cut–Off Sample oz. razmejitveni vzorec) = 1,5 %
W515K/WT (kat. št. PF-000551);
redestilirana voda (brez encimov DNaz in RNaz);
sterilne pipete in nastavki za pipete (10100 µL, 0,510 µL Eppendorf);
avtomatska pipeta (Multipipette® stream, Eppendorf);
komora, ki omogoča sterilno delo (Holten LaminAir);
orbitalni mešalnik Multi-Spin MSC-6000 (Biosan)
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
22
mikrotitrska ploščica ABI PRISMTM 96-well Optical Reaction Plate;
ciklični pomnoževalnik ABI PRISM 7000 SDS (Applied Biosystems).
Postopek:
Reakcijo smo izvedli po navodilu priloženem kompletu MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen
Cancer Profiler, december 2008). Vzorce in reagente smo najprej prenesli iz
zamrzovalnika in jih odtalili na sobni temperaturi. Nato smo jih premešali z orbitalnim
mešalnikom in kratko centrifugirali (˝short spin˝). Vzorce in reagente smo ves čas hranili
na hladnem, raztopini IPSOGEN PPM W515L/K pa smo še dodatno zaščitili pred svetlobo
z aluminijasto folijo, ker sta vsebovali fluorescenčni barvili.
Najprej smo v dve 1,5 mL mikrocentrifugirki pripravili za ustrezno število reakcij
reakcijski mešanici za MPL W515L in MPL W515K in pri tem zaradi izgub pri pipetiranju
prišteli še 2 dodatni reakciji. Pripravljeni reakcijski mešanici smo z aluminijasto folijo
zaščitili pred svetlobo, rahlo premešali in kratko centrifugirali (˝short spin˝). Vsaka
reakcija je vsebovala v dvojniku pozitivno in negativno kontrolo, razmejitveni vzorec (Cut-
Off Sample), slepo kontrolo (DNaza in RNaza prosta voda) in do 20 preiskovanih vzorcev.
Preglednica III: Sestava reakcijske mešanice za MPL W515L in MPL W515K
REAGENT
Volumen za 1 vzorec
TaqMan Universal PCR Master Mix 2x 12,5 µL
IPSOGEN PPM-MPL W515L ali MPL
W515K 10x 2,5 µL
RNaza, DNaza prosta voda 5 µL
Celotna reakcijska zmes 20 µL
Nato smo si pripravili mikrotitrsko ploščico in v posamezne vdolbinice z avtomatsko
pipeto napipetirali 20 µL ustrezne reakcijske mešanice (Slika 5). V vsako vdolbinico, kjer
je že bila reakcijska mešanica, smo dodali 5 µL vzorca, tako da je bil končni volumen
reakcijske mešanice 25 µL. Po nanosu vseh vzorcev smo mikrotitrsko ploščico pokrili s
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
23
prozorno samolepilno folijo (MicroAmpTM Optical Adhesive Film, Applied Biosystems) in
jo centrifugirali 1 min pri 2000 obr./min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus).
Slika 5 : Shema nanosa reakcijskih mešanic in vzorcev na mikrotitrsko ploščico
(Legenda: +K MPL W515L/K= pozitivna kontrola, NC= negativna kontrola, COS=
razmejitveni vzorec (Cut-Off Sample), H2O (RNaz in DNaz prosta voda). Z oranžno barvo
so označeni prostorčki, kjer smo določali prisotnost mutacije W515L, z rumeno barvo pa
so označeni prostorčki, kjer smo določali prisotnost mutacije W515K.
Mikrotitrsko ploščico smo prenesli v ciklični pomnoževalnik ABI PRISM 7000 SDS in
zagnali program absolutne kvantifikacije.
Preglednica IV: Pogoji qPCR
qPCR program Temperatura Čas Št. ponovitev 50 2 min 1x 95 10 min 1x 92 15 s 60 1 min
50x
Po končani reakciji je sledila še alelna diskriminacija (ang.: Allelic Discrimination, Post-
Read; sledili smo navodilom za uporabo aparata ABI PRISM 7000 SDS, User Guide,
Applied Biosystems 2001). Aparat je pri 60 ºC izvedel 1 cikel in zaznal jakost fluorescence
posameznega barvila.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A +K MPL W515L
+K MPL W515L
NC NC COS COS +K MPL W515K
+K MPL W515K
NC NC COS COS
B H2O H2O Vz.1 Vz.1 Vz.2 Vz.2 H2O H2O Vz.1 Vz.1 Vz.2 Vz.2 C Vz.3 Vz.3 Vz.4 Vz.4 Vz.5 Vz.5 Vz.3 Vz.3 Vz.4 Vz.4 Vz.5 Vz.5 D Vz.6 Vz.6 Vz.7 Vz.7 Vz.8 Vz.8 Vz.6 Vz.6 Vz.7 Vz.7 Vz.8 Vz.8 E Vz.9 Vz.9 Vz.10 Vz.10 Vz.11 Vz.11 Vz.9 Vz.9 Vz.10 Vz.10 Vz.11 Vz.11 F Vz.12 Vz.12 Vz.13 Vz.13 Vz.14 Vz.14 Vz.12 Vz.12 Vz.13 Vz.13 Vz.14 Vz.14 G Vz.15 Vz.15 Vz.16 Vz.16 Vz.17 Vz.17 Vz.15 Vz.15 Vz.16 Vz.16 Vz.17 Vz.17 H Vz.18 Vz.18 Vz.19 Vz.19 Vz.20 Vz.20 Vz.18 Vz.18 Vz.19 Vz.19 Vz.20 Vz.20
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
24
Preglednica V: Alelna diskriminacija- program Post read
Temperatura Čas Št. ponovitev
60 ºC 1 min 1x
3.3 STATISTIČNA OBDELAVA VZORCEV Statistično obdelavo vzorcev smo izvedli s pomočjo statističnega programa SPSS (Statsoft Inc, ZDA). Kot parametre opisne statistike smo določili povprečno vrednost, standardno deviacijo in
koeficient variacije.
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
25
4 REZULTATI IN RAZPRAVA Pri večini bolnikov s policitemijo rubro vera (PRV) in pri približno polovici bolnikov z ET
in PM lahko dokažemo pridobljeno somatsko mutacijo JAK2 V617F. Nadaljnje raziskave
so pokazale, da v približno 1-9 % bolnikov z ET in v 5-11 % bolnikov s PM ugotovimo
somatske mutacije v genu za trombopoetinski receptor MPL. Slednje se pri drugih MPN
pojavijo redko. Določitev mutacije JAK2 V617F in mutacij v genu MPL sta pomembni
dodatni preiskavi pri postavitvi diagnoze mieloproliferativnih novotvorb (2).
Glede na pomen določanja mutacij v MPL smo se odločili preiskavo vpeljati v redno delo
Specializiranega hematološkega laboratorija in določiti odstotek pojavljanja mutacij
W515L in W515K pri populaciji 77 bolnikov z ET. Prisotnost pridobljenih mutacij MPL
W515L/K smo določili s pomočjo reagenčnega kompleta MPL MutaScreenTM Kit
(Ipsogen) na aparatu ABI PRISM 7000 SDS.
Po navodilu priloženem kompletu MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen Cancer Profiler,
december 2008), smo za reakcijo potrebovali 25 ng vzorčne DNA s čistočo A260/A280 =1,7-
2,0. Zato smo najprej izmerili koncentracijo in čistočo vzorcev DNA s pomočjo
spektrofotometra Parkin Elmer (program Lambda 20 Bio).
MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen) je raziskovalno orodje namenjeno natančni detekciji
mutacij MPL W515L in MPL W515K ter določanju deleža mutiranega alela v genomski
DNA. Metoda je osnovana na verižni reakciji s polimerazo v realnem času s hidrolizo
fluorescenčno označenih oligonukleotidnih sond. Princip določanja genotipa pa je alelna
diskriminacija.
Izvedli smo štiri analizne preizkuse, kjer smo istočasno določali tako mutacijo MPL
W515L, kot tudi mutacijo MPL W515K. Pri vsakem analiznem preizkusu smo najprej
izvedli qPCR, da smo pridobili zadostno količino produkta PCR. Pridobili smo podatke o
vrednosti Cq, ki je sorazmerna številu kopij DNA segmenta v začetku reakcije. Z
določanjem vrednosti Cq in analize teh podatkov smo pridobili povprečno vrednost,
standardni odklon in koeficient variacije vrednosti Cq za posamezen genotip. Pri rednem
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
26
delu nam te vrednosti lahko služijo kot kontrola natančnosti določanja prisotnosti mutacij
MPL W515L/K v različnih preizkusih.
Po končanem qPCR smo izvedli še alelno diskriminacijo, kjer smo izmerili intenziteto
fluorescence posameznega barvila. Preizkuse smo opravili v dvojniku. Iz dobljenih
vrednosti intenzitete fluorescence reporterskih barvil za mutiran (barvilo FAMTM ) in
nemutiran (barvilo VIC®) alel smo za vsak vzorec najprej izračunali povprečno vrednost
mutiranega in nemutiranega alela, nato razmerje med povprečno vrednostjo mutiranega in
nemutiranega alela (povprečje FAMTM /povprečje VIC® oz. povprečje alel Y/povprečje
alel X) in to razmerje primerjali z razmerjem mutiranega in nemutiranega alela
razmejitvenega vzorca ((vzorec povprečje alel Y/povprečje alel X)/ (razmejitveni vzorec
povprečje alel Y/povprečje alel X)). Če je bilo to razmerje ≥ 1 je bil vzorec pozitiven za
mutaciji MPL W515L/K, če je bilo razmerje < 1 pa je bil vzorec WT za mutaciji MPL
W515L/K. Razmejitveni vzorec vsebuje 1,5 % mutiranega alela W5151L ali W515K.
Pomeni tudi občutljivost detekcije našega analitskega sistema.
4.1 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOČE DNA IZOLIRANE IZ GRANULOCITOV PERIFERNE KRVI
Podatki o čistoči DNA kažejo na to, da reagenčni komplet QIAamp DNA Mini Kit
(Qiagen) omogoča izolacijo DNA ustrezne čistoče (A260/A280=1,7-2,0) in zadovoljive
koncentracije. V našem primeru sta le dva vzorca (J2170 in J2123) odstopala od
predpisanega intervala ustrezne čistoče, vendar smo ju kljub temu vključili v raziskavo in
ugotovili, da neustrezna čistoča ni vplivala na rezultat qPCR in alelne diskriminacije (glej
rezultate v preglednici VIII in preglednici IX). Povprečna koncentracija izolirane DNA je
znašala 90,88±51,72 ng/μL. Povprečno razmerje (A260/A280) je znašalo 1,8±0,1, razpon od
1,6 do 2,0.
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
27
Preglednica VI: Rezultati merjenja koncentracije in čistoče (A260/A280) DNA izolirane iz granulocitov periferne krvi s kompletom QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)
Vzorec Koncentracija
(ng/μL) A260/A280 Vzorec Koncentracija
ng/μL) A260/A280
J2170 25,42 1,6 J1093 168,64 1,8 J2123 38,41 1,6 J1076 97,34 1,8 J2113 120,55 1,7 J1075 61,26 1,7 J2054 64,05 1,8 J1059 85,64 1,8 J2041 57,08 1,8 J1049 165,88 1,8 J1980 51,96 1,7 J1025 106,49 1,7 J1962 20,70 2,0 J1024 92,68 1,8 J1849 134,18 1,9 J1011 58,21 1,7 J1831 70,48 1,9 J982 70,66 1,8 J1795 183,02 1,8 J900 107,10 1,8 J1751 14,57 1,7 J896 111,72 1,9 J1693 24,51 2,0 J881 96,95 1,8 J1661 29,43 1,9 J867 73,55 1,8 J1629 58,92 1,9 J863 157,49 1,8 J1626 51,77 1,8 J855 125,29 1,9 J1583 217,81 1,8 J796 111,49 1,9 J1565 42,77 1,8 J707 87,23 1,8 J1557 70,25 1,9 J694 30,40 1,7 J1510 27,99 1,7 J643 96,86 1,9 J1509 48,88 1,9 J603 45,76 2,0 J1467 23,27 1,8 J589 64,72 2,0 J1466 36,74 1,8 J583 66,21 1,8 J1358 41,92 1,7 J541 77,80 1,9 J1319 244,01 1,8 J518 143,57 1,9 J1311 18,76 2,0 J498 80,41 1,8 J1293 171,96 1,8 J473 78,46 1,8 J1285 82,99 1,7 J452 127,10 1,8 J1281 81,76 1,8 J451 125,31 1,7 J1272 118,13 1,9 J411 87,55 1,7 J1255 77,13 1,7 J402 148,68 1,8 J1254 51,53 1,7 J392 145,55 1,8 J1235 194,20 1,8 J380 70,66 1,8 J1234 57,73 1,8 J325 99,46 1,8 J1230 229,18 1,8 J293 90,56 1,8 J1224 82,23 1,8 J291 27,40 1,8 J1133 112,58 1,9 J279 55,52 2,0 J1117 79,84 1,8 J277 79,25 1,8 J1113 114,04 1,8 J249 175,14 1,9 J1103 133,48 1,8
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
28
4.2 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO V REALNEM ČASU
4.2.1 Vrednosti Cq pozitivnih, negativnih kontrolnih in razmejitvenih vzorcev priloženih h kompletu MPL MutaScreenTM Kit
Preizkus smo za pozitivni, negativni kontrolni ter razmejitveni vzorec (Cut-Off Sample)
naredili v dvojniku. Pozitivni, negativni kontrolni ter razmejitveni vzorec so sestavni del
reagenčnega kompleta MPL MutaScreenTM Kit. Določili smo povprečno vrednost,
standardno deviacijo in koeficient variacije Cq za pozitivni, negativni kontrolni ter
razmejitveni vzorec, kar prikazuje preglednica VII.
Vrednosti standardne deviacije in koeficienta variacije za pozitivni in negativni kontroli ter
razmejitveni vzorec, pridobljene v 4 analiznih preizkusih kažejo na dobro ponovljivost
vrednosti Cq. Priporočljivo bi bilo te vrednosti nadgraditi z nadaljnjimi preizkusi v rednem
delu v laboratoriju, z namenom pridobiti še natančnejše podatke. Že sedaj lahko te
vrednosti služijo za oceno natančnosti analiz za določitev prisotnosti mutacij MPL
W515L/K.
-
29
Preglednica VII: Vrednosti Cq pozitivnih, negativnih kontrolnih in razmejitvenih vzorcev za mutaciji MPL W515K in MPL W515L, pridobljene v štirih reakcijah
Pozitivni kontrolni vz. Negativni kontrolni vz. Razmejitveni vz. MPL W515K MPL W515L MPL W515K MPL W515L MPL W515K MPL W515L
Cq FAM Cq VIC Cq FAM Cq VIC Cq FAM Cq VIC Cq FAM Cq VIC Cq FAM Cq VIC Cq FAM Cq VIC Exp. 1 24,64 0 24,33 0 0 25,23 0 26,45 38,82 26,16 36,64 26,51 Exp. 1 24,73 0 24,31 0 0 26,03 0 26,13 38,24 26,83 35,67 26,64 Exp. 2 24,56 0 24,38 0 0 26,10 0 26,52 40,76 26,17 35,31 26,80 Exp. 2 24,48 0 24,29 0 0 25,98 0 26,46 39,25 26,29 35,83 26,73 Exp. 3 24,79 0 25,02 0 0 25,91 0 26,11 39,64 26,20 36,67 26,55 Exp. 3 24,79 0 25,02 0 0 26,31 0 26,07 40,16 26,56 37,30 26,66 Exp. 4 24,93 0 24,35 0 0 26,04 0 26,06 39,91 26,08 35,47 26,46 Exp. 4 25,01 0 24,31 0 0 25,84 0 26,26 41,13 26,21 34,55 26,48
Povprečje Cq 24,74±0,18
0 24,50±0,32
0 0 25,93±0,31 0 26,26±0,19 39,74±0,97 26,31±0,25 35,93±0,89 26,60±0,12
Koef. variacije (%) 0,73 0 1,31 0 0 1,20 0 0,72 2,44 0,95 2,48 0,45
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
30
4.2.2 Določanje vrednosti Cq vzorcev bolnikov z ET
Vsak vzorec smo analizirali v dvojniku. V preglednici VIII so zbrane vrednosti Cq za 76
vzorcev bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515K. Za te vzorce smo
izračunali povprečno vrednost, standardno deviacijo in koeficient variacije vrednosti Cq.
Povprečna vrednost Cq vzorcev bolnikov z odsotno mutacijo W515K je znašala
28,01±0,97. Povprečno vrednost in standardno deviacijo smo izračunali iz vseh vrednosti
Cq VIC. Izločili smo le enega ubežnika, vzorec z oznako J589, ki je bil nad mejo ±3
standardne deviacije srednje vrednosti Cq. Koeficient variacije je znašal 3,46 %.
Preglednica IX prikazuje vrednosti Cq vzorcev 73 bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne
mutacije MPL W515L. Tudi za te vzorce smo izračunali povprečno vrednost, standardno
deviacijo in koeficient variacije vrednosti Cq VIC. Povprečna vrednost Cq vzorcev
bolnikov z odsotno mutacijo W515L je znašala 28,73±1,10. Koeficient variacije je znašal
3,82 %. Izločili smo ubežnike z oznako J589, J583 in eno paralelko vzorca J2041, ki so bili
nad mejo ±3 standardne deviacije srednje vrednosti Cq.
Pri bolnikih z ET, ki niso imeli prisotni mutaciji MPL W515L/K so vrednosti standardne deviacije in koeficienta variacije zelo podobne in kažejo na dobro ponovljivost analiznega
postopka (Preglednica VIII in IX).
Pri bolnikih s prisotno mutacijo MPL W515L smo opazili večji koeficient variacije, kar
kaže na različna deleža mutiranega in nemutiranega alela v posameznih vzorcih
(Preglednica X).
Preglednica VIII: Vrednosti Cq bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515K
Vzorec Ponovitev Cq VIC Cq
FAM Vzorec Ponovitev Cq VIC Cq
FAM J2170 1 27,64 0 J1467 1 27,12 0
2 27,68 0 2 26,93 0 J2123 1 27,99 0 J1466 1 28,12 0
2 27,70 0 2 28,13 0 J2113 1 26,14 0 J1358 1 27,39 0
2 26,37 0 2 27,67 0 J2054 1 27,88 0 J1319 1 28,26 0
2 27,66 0 2 28,20 0
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
31
J2041 1 25,48 0 J1311 1 29,49 0 2 25,51 0 2 29,29 0
J1980 1 27,78 0 J1293 1 29,12 0 2 27,82 0 2 29,09 0
J1962 1 27,17 0 J1285 1 28,22 0 2 27,15 0 2 28,20 0
J1849 1 28,67 0 J1281 1 28,11 0 2 28,57 0 2 27,86 0
J1831 1 27,12 0 J1272 1 28,62 0 2 27,41 0 2 28,62 0
J1795 1 29,31 0 J1255 1 27,80 0 2 28,90 0 2 27,71 0
J1751 1 29,19 0 J1254 1 27,71 0 2 29,23 0 2 27,86 0
J1693 1 28,67 0 J1235 1 29,24 0 2 28,31 0 2 28,86 0
J1661 1 28,06 0 J1234 1 26,26 0 2 27,76 0 2 26,34 0
J1629 1 27,45 0 J1230 1 28,80 0 2 27,34 0 2 29,01 0
J1626 1 27,77 0 J1224 1 28,33 0 2 27,33 0 2 28,33 0
J1583 1 29,81 0 J1133 1 27,53 0 2 29,67 0 2 27,28 0
J1565 1 27,06 0 J1117 1 28,52 0 2 27,08 0 2 28,47 0
J1557 1 26,58 0 J1113 1 27,76 0 2 26,51 0 2 27,66 0
J1093 1 28,37 0 J1103 1 30,02 0 2 28,16 0 2 29,36 0
J1076 1 27,44 0 J603 1 27,53 0 2 27,77 0 2 27,58 0
J1075 1 28,22 0 J589 1 24,63* 0 2 27,99 0 2 24,45* 0
J1059 1 27,26 0 J583 1 25,42 0 2 27,22 0 2 25,43 0
J1049 1 28,47 0 J541 1 28,26 0 2 28,92 0 2 28,07 0
J1025 1 27,05 0 J518 1 28,06 0 2 27,06 0 2 28,19 0
J1024 1 30,32 0 J498 1 27,90 0 2 30,28 0 2 27,82 0
J1011 1 27,38 0 J473 1 27,31 0 2 27,19 0 2 27,48 0
J982 1 26,47 0 J452 1 28,09 0 2 26,40 0 2 27,82 0
J900 1 28,72 0 J451 1 27,58 0 2 28,39 0 2 27,53 0
J896 1 27,96 0 J411 1 28,91 0 2 28,30 0 2 28,71 0
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
32
J881 1 27,76 0 J402 1 28,76 0 2 27,54 0 2 28,65 0
J867 1 27,97 0 J392 1 29,00 0 2 27,97 0 2 28,81 0
J863 1 28,01 0 J380 1 27,09 0 2 27,97 0 2 26,83 0
J855 1 29,03 0 J325 1 28,08 0 2 29,18 0 2 27,64 0
J796 1 28,00 0 J293 1 29,46 0 2 27,96 0 2 29,73 0
J707 1 27,48 0 J291 1 28,32 0 2 27,40 0 2 28,50 0
J694 1 28,94 0 J279 1 28,20 0 2 28,73 0 2 28,10 0
J643 1 29,54 0 J277 1 28,22 0 2 29,70 0 2 28,42 0 J1510 1 26,26 0 J249 1 30,04 0
2 26,14 0 2 29,66 0 Z * so označene meritve, ki zaradi velikih odstopanj pri nadaljnjem izračunu niso bile upoštevane.
Preglednica IX: Cq vrednosti bolnikov, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515L
Vzorec Ponovitev Cq VIC Cq
FAM Vzorec Ponovitev Cq
VIC Cq
FAM J2170 1 28,18 0 J1358 1 28,21 0
2 28,18 0 2 28,10 0 J2123 1 28,22 0 J1319 1 28,51 0
2 28,48 0 2 28,98 0 J2113 1 26,80 0 J1311 1 30,17 0
2 26,88 0 2 30,15 0 J2054 1 29,02 0 J1293 1 29,79 0
2 28,91 0 2 30,12 0 J2041 1 26,12 0 J1285 1 29,09 0
2 25,90* 0 2 28,83 0 J1962 1 27,89 0 J1281 1 28,53 0
2 28,01 0 2 28,47 0 J1849 1 29,19 0 J1272 1 29,39 0
2 29,04 0 2 29,23 0 J1831 1 27,44 0 J1255 1 28,84 0
2 27,50 0 2 28,71 0 J1795 1 30,10 0 J1254 1 28,30 0
2 29,85 0 2 28,40 0 J1693 1 30,19 0 J1235 1 29,68 0
2 30,20 0 2 29,81 0 J1661 1 29,01 0 J1234 1 27,04 0
2 28,85 0 2 26,89 0 J1629 1 28,26 0 J1230 1 29,77 0
2 28,73 0 2 29,63 0 J1626 1 29,26 0 J1224 1 29,11 0
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
33
2 29,16 0 2 28,70 0 J1565 1 27,94 0 J1133 1 28,10 0
2 28,23 0 2 27,89 0 J1557 1 27,97 0 J1117 1 29,60 0
2 27,35 0 2 29,35 0 J1510 1 27,00 0 J1113 1 28,42 0
2 27,19 0 2 28,60 0 J1509 1 30,02 0 J1103 1 30,70 0
2 29,92 0 2 30,56 0 J1467 1 28,40 0 J1093 1 29,44 0
2 27,46 0 2 29,31 0 J1075 1 30,36 0 J1076 1 28,51 0
2 29,77 0 2 28,58 0 J1059 1 28,30 0 J589 1 25,12* 0
2 27,82 0 2 25,02* 0 J1049 1 29,13 0 J583 1 25,92* 0
2 29,59 0 2 25,81* 0 J1025 1 27,51 0 J541 1 29,06 0
2 27,31 0 2 28,91 0 J1024 1 30,14 0 J518 1 28,56 0
2 31,06 0 2 28,52 0 J1011 1 27,92 0 J498 1 28,50 0
2 27,50 0 2 28,49 0 J982 1 27,05 0 J473 1 28,21 0
2 26,88 0 2 28,05 0 J900 1 28,94 0 J452 1 29,05 0
2 28,93 0 2 28,74 0 J896 1 29,53 0 J451 1 28,19 0
2 29,26 0 2 28,37 0 J881 1 28,69 0 J411 1 30,04 0
2 28,82 0 2 29,74 0 J867 1 29,00 0 J402 1 29,65 0
2 28,48 0 2 29,66 0 J863 1 28,47 0 J392 1 29,42 0
2 28,47 0 2 29,49 0 J855 1 29,32 0 J380 1 27,51 0
2 29,69 0 2 27,52 0 J796 1 28,85 0 J325 1 29,13 0
2 28,47 0 2 28,48 0 J707 1 27,74 0 J293 1 30,25 0
2 27,75 0 2 30,45 0 J694 1 29,65 0 J291 1 29,13 0
2 29,40 0 2 29,09 0 J643 1 30,74 0 J279 1 29,16 0
2 30,05 0 2 28,80 0 J603 1 27,90 0 J277 1 28,83 0
2 27,98 0 2 29,31 0 J1466 1 29,87 0 J249 1 30,78 0
2 29,28 0 2 30,46 0 Z * so označene meritve, ki zaradi velikih odstopanj pri nadaljnjem izračunu niso upoštevane.
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
34
Preglednica X: Vrednosti Cq vzorcev 4 bolnikov, ki so imeli prisotni mutaciji MPL
W515L/K
MPL W515L MPL W515K vzorec FAM VIC
vzorec FAM VIC
J1980 33,83 29,81 J1509 30,76 29,47 J1980 33,63 29,07 J1509 30,38 29,43 J1751 25,05 32,65 J1751 25,02 32,14 J1583 25,38 34,49 J1583 25,86 34,86
Povprečje Cq 28,13±4,35 32,17±2,37 30,57±0,27 29,45±0,03
Koef. variacije
(%) 15,46 7,37 0,88 0,10
4.3 REZULTATI ALELNE DISKRIMINACIJE
Iz dobljenih vrednosti intenzitete fluorescence za barvili FAMTM in VIC® smo za vsak
vzorec najprej izračunali povprečno vrednost mutiranega in nemutiranega alela, nato
razmerje med povprečno vrednostjo mutiranega in nemutiranega alela (povprečje FAMTM
/povprečje VIC® oz. povprečje alel Y/povprečje alel X) in to razmerje primerjali z
razmerjem mutiranega in nemutiranega alela razmejitvenega vzorca ((vzorec povprečje
alel Y/povprečje alel X)/ (razmejitveni vzorec povprečje alel Y/povprečje alel X)). Če je
bilo to razmerje ≥1 je bil vzorec pozitiven za mutaciji MPL W515L/K, če je bilo razmerje
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
35
zaznali na meji občutljivosti preiskave, v našem primeru 1,5 %. Izsledke je zato potrebno
vedno vrednotiti skupaj s klinično sliko in drugimi preiskavami.
S kompletom MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen) smo prisotnost mutacije MPL W515L
ugotovili pri 3 (4 %) bolnikih z ET (Preglednica XIV). Prisotnost mutacije MPL W515K
pa pri 1 ( 2 %) bolniku z ET (Preglednica XV). Obe mutaciji se skupno pojavljata pri
približno 5 % bolnikov z ET, ki smo jih vključili v raziskavo. Ugotovili smo, da se
vrednosti ujemajo z objavljenimi podatki iz literature in da je mutacija MPL W515L
pogostejša. Smatramo, da je preiskava primerna za redno uporabo v laboratoriju.
V prilogi se nahajata preglednici XVI in XVII, kjer so zbrani rezultati alelne diskriminacije
(intenziteta fluorescence za barvili FAMTM in VIC® ) vzorcev bolnikov z ET, ki niso imeli
prisotni mutaciji MPL W515L/K.
Preglednica XI: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela razmejitvenega vzorca za
mutacijo MPL W515K in mutacijo MPL W515L, pridobljenih v 4 analiznih poskusih
Alel X Alel Y Povprečje alel X Povprečje
alel Y Povprečje alel Y/ povprečje alel X
Razmejitveni vzorec W515K Exp. 1 1,965 1,009 Exp. 1 1,812 0,989
1,889 0,999 0,529
Exp. 2 2,164 1,353 Exp. 2 1,974 1,316
2,069 1,335 0,645
Exp. 3 1,974 1,035 Exp. 3 1,826 1,015
1,900 1,025 0,539
Exp. 4 2,051 1,289 Exp. 4 1,879 1,151
1,965 1,220 0,621
Povprečje 1,956±0,083 1,145±0,160 Koef. variacije (%) 4,243 13,973
Razmejitveni vzorec W515L Exp. 1 1,976 1,338 Exp. 1 1,972 1,242
1,974 1,290 0,653
Exp. 2 2,029 1,073 Exp. 2 2,029 1,048
2,029 1,061 0,523
Exp. 3 2,379 1,384 Exp. 3 2,384 1,401
2,382 1,393 0,585
Exp. 4 2,062 1,187 Exp. 4 2,043 1,241
2,053 1,214 0,591
Povprečje 2,109±0,184 1,239±0,140 Koef. variacije (%) 8,724 11,299
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
36
Preglednica XII: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela pozitivne kontrole za
mutacijo MPL W515L in mutacijo MPL W515K, pridobljenih v 4 analiznih poskusih
Alel X Alel Y povprečje alel X povprečje
alel Y alel Y/ alel X (alel Y/ alel X)/
(COS alel Y/alel X) +K W515L
Ekp. 1 0,585 4,047 Ekp. 1 0,609 3,978
0,597 4,013 6,721 10,285
Ekp. 2 0,480 3,541 Ekp. 2 0,499 3,653
0,490 3,597 7,348 14,059
Ekp. 3 0,783 4,651 Ekp. 3 0,795 4,660
0,789 4,656 5,901 10,091
Ekp. 4 0,675 3,737 Ekp. 4 0,672 3,750
0,674 3,744 5,558 9,397
Povprečje 0,637±0,126 4,002±0,468 10,958±2,102 Koef. variacije (%) 19,780 11,694 19,182
+K W515K Exp. 1 0,256 4,105 Exp. 1 0,245 4,188
0,251 4,147 16,553 31,291
Exp. 2 0,520 4,059 Exp. 2 0,507 4,102
0,514 4,081 7,946 12,320
Exp. 3 0,321 4,288 Exp. 3 0,300 4,283
0,311 4,286 13,802 25,584
Exp. 4 0,605 3,737 Exp. 4 0,561 3,720
0,583 3,729 6,395 10,301
Povprečje 0,414±0,159 4,060±0,237 19,874±10,193 Koef. variacije (%) 38,406 5,837 51,288
Preglednica XIII: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela negativne kontrole za
mutacijo MPL W515L in mutacijo MPL W515K, pridobljenih v 4 analiznih poskusih
Alel X Alel Y povprečje alel X povprečje
alel Y
Povprečje alel Y/
povprečje alel X
(alel Y/ alel X)/ (COS alel Y/alel X)
W515L Exp. 1 2,019 0,786 Exp. 1 2,050 0,778
2,035 0,782 0,384 0,588
Exp. 2 2,026 0,682 Exp. 2 2,053 0,687
2,040 0,685 0,336 0,642
Exp. 3 2,393 0,831 Exp. 3 2,378 0,828
2,386 0,830 0,348 0,595
Exp. 4 2,463 0,942 Exp. 4 2,577 0,968
2,520 0,955 0,379 0,641
Povprečje 2,245±0,246 0,813±0,112 0,616±0,029 Koef. variacije 10,958 13,776 4,708
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
37
W515K Exp. 1 2,038 0,581 Exp. 1 2,039 0,591
2,039 0,586 0,287 0,499
Exp. 2 2,227 0,616 Exp. 2 2,211 0,604
2,219 0,610 0,275 0,421
Exp. 3 2,128 0,613 Exp. 3 2,061 0,607
2,095 0,610 0,291 0,557
Exp. 4 2,171 0,538 Exp. 4 2,149 0,579
2,160 0,559 0,259 0,442
Povprečje 2,128±0,078 0,591±0,024 0,480±0,061 Koef. variacije (%) 3,665 4,061 12,708
Preglednica XIV: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela vzorcev bolnikov z ET in
prisotno mutacijo MPL W515L
vzorec Alel X Alel Y Povprečje alel X Povprečje
alel Y
Povprečje alel Y/ povprečje
alel X
(alel Y/ alel X)/ (COS alel Y/alel X)
1,884 1,652 J1980 1,939 1,652
1,912
1,652
0,864
1,461
1,374 4,136 J1751 1,329 3,899
1,352
4,018
2,973
5,026
1,213 3,802 J1583 1,230 3,906
1,222
3,854
3,155
5,334
Preglednica XV: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela vzorcev bolnikov z ET in
prisotno mutacijo MPL W515K
Vzorec Alel X Alel Y Povprečje alel X Povprečje
alel Y
Povprečje alel Y/ povprečje
alel X
(alel Y/ alel X)/ (COS alel Y/alel X)
1,549 2,655 J1509 1,584 2,811
1,567 2,733 1,745 3,298
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
38
5 ZAKLJUČKI
Na podlagi izsledkov naše raziskave lahko zaključimo:
da način osamitve DNA iz granulocitov z reagenčnim kompletom QIAamp DNA
Mini Kit (Qiagen) omogoča ustrezno količino in kakovost DNA za določitev
mutacij MPL W515L in MPL W515K pri bolnikih z ET.
da je reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen) primeren za redno
določitev prisotnosti somatskih mutacij MPL W515L in MPL W515K v vzorcih
DNA izoliranih iz granulocitov.
da se mutaciji MPL W515L in MPL W515K pojavljata v 5 % bolnikov z esencialno
trombocitemijo
da je mutacija MPL W515L pogostejša od mutacije MPL W515K
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
39
6 LITERATURA
1. Andoljšek D: Interna medicina; Poglavje 12: Bolezni krvi in krvotvornih organov;
Kronične mieloproliferativne bolezni. 3. izdaja, Littera Picta d.o.o., Ljubljana 2005: 1240–
1249.
2. Varidman, JW, Thiele J, Arber DA e tal.: The 2008 revision of the World Health
Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale
and important changes. Blood, 2009; 114: 937-951
3. Černelč P: Smernice za ugotavljanje in zdravljenje bolnikov z esencialno
trombocitemijo. Zdravstveni vestnik 2008; 77: I-15-7
4. Fabris F, Randi ML: Essential thrombocythemia: past and present. Intern Emerg Med
2009; 4: 381-388
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?Db=gene&Cmd=retrieve&dopt=full_report&list
_uids=4352 (03.08.2010)
6. http://www.nature.com/leu/journal/v24/n6/full/leu201069a.html (10.09.2010)
7. Tefferi A, Gilliland DG: Oncogenes in Myeloproliferative Disorders.Cell Cycle 2007; 6:
550-566
8. Levine RL, Heaney M: New Advances in the Pathogenesis and Therapy of Essential
Thrombocythemia. Hematology 2008; 7: 76-82
9. Beer PA, Campbell JP, Scott ML et. al: MPL mutations in myeloproliferative disorders:
analysis of the PT-1 cohort. Blood 2008; 112: 141-149
10. Skoda RC: Thrombocytosis. Hematology 2009; 159-167
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
40
11. Kralovics R: Genetic complexity of myeloproliferative neoplasms. Leukemia 2008; 22:
1841-1848
12. Kawamata N, Ogawa S, Yamamoto G, et al. Genetic profiling of myeloproliferative
disorders by singlenucleotide polymorphism oligonucleotide microarray. Exp Hematol.
2008;36:1471-1479.
13. Moliterno AR, Williams DM, Gutierrez-Alamillo LI, Salvatori R, Ingersoll RG, Spivak
JL. Mpl Baltimore: athrombopoietin receptor polymorphism associated with
thrombocytosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:11444-11447.
14. Levine RL, Warnig G: Role of JAK-STAT signalinh in the pathogenesis of
myeloproliferative disorders. Hematology 2006; 233-239
15. Vannucchi AM, Guglielmelli P, Tefferi A: Advances in Understanding and
Management of Myeloproliferative Neoplasms. CA A Cancer J Clin 2009; 59: 171-191
16. Bio.Rad Laboratories, Inc.: Real-Time PCR Application Guide, 2006
17. MPL MutaScreenTM Kit for the detection of MPL W515L & W515K mutations.
Introduction for use, Ipsogen Cancer Profiler, Version 01, December 2008
18. User Guide , ABI PRISM 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems 2001
19. Ding J, Komatsu H, Iida S et. al: The ASN505 mutation of the c-MPL gene, which
causes familial essential thrombocythemia, induces autonomous homodimerization of
the c-Mpl protein due to strong amino acid polarity. Blood 2009; 114: 3325-3328
20. Delhommeau F, Jeziorowska D, Marzac C, Casadevall N: Molecular aspects of
myeloproliferative neoplasms. Int J Hematol 2010; 91: 165-173
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
41
21. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, et al.: The MIQE
guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR
experiments. Clin Chem 2009; 55: 611–22.
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
42
7 PRILOGE Preglednica XVI: Rezultati alelne diskriminacije za vzorce bolnikov z ET, ki niso imeli
prisotne mutacije MPL W515L
Vzorec Alel X Alel Y Povprečje alel X
Povprečje alel Y
Povprečje alel Y/ povprečje
alel X (alel Y/ alel X)/
(COS alel Y/alel X)
J2170 1,910 0,704 1,942 0,702 0,361 0,611 1,974 0,700
J2123 1,977 0,718 1,968 0,714 0,363 0,613 1,959 0,710
J2113 1,714 0,696 1,728 0,710 0,411 0,703 1,741 0,724
J2054 1,872 0,744 1,901 0,742 0,390 0,660 1,929 0,740
J2041 2,003 0,753 2,011 0,748 0,372 0,629 2,019 0,743
J1962 1,970 0,747 2,007 0,769 0,383 0,647 2,044 0,790
J1849 1,738 0,692 1,756 0,689 0,392 0,751 1,774 0,686
J1831 1,838 0,695 1,843 0,696 0,378 0,723 1,848 0,697
J1795 1,700 0,706 1,694 0,700 0,413 0,707 1,688 0,694
J1693 1,872 0,759 1,897 0,750 0,395 0,668 1,922 0,740
J1661 1,937 0,778 1,956 0,785 0,401 0,678 1,974 0,791
J1629 2,033 0,811 1,992 0,802 0,402 0,680 1,950 0,792
J1626 1,921 0,760 1,937 0,758 0,391 0,662 1,952 0,756
J1565 1,943 0,752 1,942 0,746 0,384 0,649 1,941 0,740
J1557 1,892 0,769 1,892 0,776 0,410 0,693 1,892 0,782
J1510 1,902 0,807 1,925 0,783 0,407 0,688 1,947 0,759
J1509 1,834 0,709 1,829 0,716 0,391 0,661 1,824 0,722
J1467 1,771 0,799 1,808 0,796 0,440 0,745 1,844 0,793
J1466 1,786 0,809 1,805 0,790 0,438 0,740 1,824 0,771
J1358 1,903 0,735 1,890 0,750 0,397 0,671
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
43
1,876 0,765 J1319 1,880 0,742 1,874 0,742 0,396 0,606
1,867 0,741 J1311 1,715 0,762 1,723 0,748 0,434 0,830
1,731 0,733 J1293 1,871 0,730 1,891 0,748 0,395 0,605
1,911 0,765 J1285 1,756 0,785 1,802 0,782 0,434 0,664
1,848 0,778 J1281 1,872 0,755 1,879 0,763 0,406 0,621
1,886 0,770 J1272 1,893 0,778 1,900 0,781 0,411 0,629
1,907 0,783 J1255 1,842 0,764 1,852 0,775 0,418 0,640
1,862 0,786 J1254 1,905 0,768 1,932 0,770 0,399 0,610
1,959 0,772 J1235 1,936 0,773 1,907 0,769 0,403 0,617
1,877 0,765 J1234 1,875 0,809 1,875 0,793 0,423 0,647
1,875 0,776 J1230 1,887 0,783 1,918 0,778 0,405 0,620
1,948 0,772 J1224 1,960 0,782 1,959 0,788 0,402 0,615
1,957 0,793 J1133 1,833 0,802 1,847 0,815 0,441 0,675
1,861 0,828 J1117 1,825 0,784 1,852 0,795 0,429 0,657
1,879 0,806 J1113 1,955 0,811 1,935 0,807 0,417 0,647
1,915 0,803 J1103 1,755 0,804 1,775 0,803 0,452 0,692
1,795 0,801 J1093 1,849 0,804 1,874 0,794 0,424 0,648
1,898 0,783 J1076 1,910 0,785 1,918 0,791 0,412 0,631
1,926 0,796 J1075 1,733 0,860 1,726 0,837 0,485 0,742
1,718 0,814 J1059 1,780 0,792 1,782 0,781 0,438 0,670
1,784 0,769 J1049 1,817 0,772 1,827 0,772 0,422 0,646
1,837 0,771 J1025 1,925 0,653 1,909 0,652 0,341 0,653
1,892 0,650 J1024 1,859 0,653 1,880 0,659 0,350 0,670
1,901 0,664 J1011 1,795 0,721 1,835 0,709 0,386 0,739
1,874 0,697 J982 1,939 0,684 1,934 0,679 0,351 0,671
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
44
1,929 0,673 J900 1,937 0,685 1,930 0,678 0,351 0,672
1,923 0,670 J896 2,003 0,823 1,853 0,767 0,414 0,707
1,703 0,710 J881 1,932 0,888 1,977 0,869 0,439 0,751
2,022 0,849 J867 1,810 0,704 1,847 0,706 0,382 0,732
1,883 0,708 J863 1,920 0,695 1,950 0,701 0,359 0,687
1,980 0,706 J855 1,941 0,689 1,935 0,689 0,356 0,681
1,929 0,689 J796 1,872 0,729 1,881 0,720 0,383 0,733
1,889 0,711 J707 1,965 0,697 1,962 0,708 0,361 0,690
1,958 0,718 J694 1,855 0,721 1,860 0,727 0,391 0,748
1,865 0,733 J643 1,841 0,689 1,854 0,692 0,373 0,714
1,867 0,694 J603 1,956 0,701 1,955 0,714 0,365 0,677
1,953 0,727 J589 1,821 0,794 1,849 0,779 0,421 0,806
1,876 0,763 J583 1,891 0,720 1,911 0,708 0,370 0,708
1,931 0,695 J541 1,666 0,747 1,690 0,741 0,438 0,749
1,714 0,734 J518 1,873 0,699 1,883 0,705 0,375 0,717
1,892 0,711 J498 1,793 0,704 1,789 0,707 0,395 0,636
1,784 0,709 J473 1,795 0,790 1,802 0,755 0,419 0,717
1,809 0,720 J452 1,774 0,735 1,782 0,728 0,408 0,698
1,790 0,720 J451 1,817 0,715 1,812 0,719 0,397 0,678
1,806 0,722 J411 1,767 0,718 1,780 0,708 0,398 0,680
1,793 0,698 J402 1,749 0,725 1,767 0,710 0,402 0,687
1,784 0,695 J392 1,814 0,708 1,820 0,717 0,394 0,674
1,825 0,726 J380 2,239 0,831 2,056 0,783 0,381 0,651
1,873 0,735 J325 2,103 0,801 2,141 0,824 0,385 0,658
2,178 0,847 J293 2,161 0,814 2,153 0,820 0,381 0,651
-
Diplomska naloga Leonida Kovačič
45
2,145 0,825 J291 2,225 0,817 2,201 0,811 0,369 0,630
2,176 0,805 J279 2,044 0,830 2,076 0,834 0,402 0,687
2,108 0,838 J277 2,140 0,787 2,139 0,791 0,370 0,632
2,138 0,795 J249 2,099 0,779 2,106 0,777 0,369 0,631
2,113 0,775
Preglednica XVII: Rezultati alelne diskriminacije za vzorce bolnikov z ET, ki niso imeli
prisotne mutacije MPL W515K
Vzorec Alel X Alel Y Povprečje alel X Povprečje
alel Y
Povprečje alel Y/ povprečje
alel X (alel Y/ alel X)/
(COS alel Y/alel X)
J2170 1,888 0,580 1,907 0,592 0,310 0,586 1,926 0,603
J2123 1,788 0,596 1,831 0,626 0,342 0,646 1,873 0,655
J2113 2,350 0,663 2,269 0,671 0,296 0,476 2,188 0,678
J2054 1,920 0,603 1,932 0,598 0,310 0,585 1