les cellules souches hÉmatopoÏÉtiques humaines normales : rÉgulation et mÉthodes dexploration...
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LES CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES HUMAINES
NORMALES : RÉGULATION ET MÉTHODES D’EXPLORATION
S. Fichelson, 17 Juin 2004 – 5èmes journées du GFM - Rouen
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SOMMAIRE
- Définition des cellules souches
- Transdifférenciation : polémiques
- Ontogénèse
- Méthodes d’exploration
- Régulation
- Expansion
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Les Cellules Souches
Intestin Peau CerveauTissu
HématopoïétiqueMuscle
EctodermeMésodermeEndoderme
Foie
TOTIPOTENTES
PLURIPOTENTES
MULTIPOTENTES
PROGÉNITEURS
¢ MATURES
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« TRANSDIFFÉRENCIATION » DES CELLULES SOUCHES
Nombreuses études in vivo et in vitro chez la souris
Transdifférenciation = phénomène rare + contexte de régénération post-lésionnelle
Mise en évidence du phénomène de transdifférenciation (1999-2003):
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Controverses surle concept de transdifférenciation
Fusion cellulaire ?Reprogrammation ?
Homing ectopique?Populations hétérogènes de ¢ souches ?
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Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle
through myeloid intermediatesFD Camargo, R Green, Y Capetenaki, KA Jackson & MA Goodel. Nat Med Dec 2003, 9: 1520-27
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Semaines degestation
Début de la circulation sanguine
Colonisation du Foie par les précurseurs CD34+
3 5 117 9
SacVitellin
HématopoïèseIntravasculaire(aorte, artère vitelline)
Foie
Thymus
Moelle Osseuse
Ontogénèse de l’hématopoïèse chez l’homme
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Fibroblastes Myofibroblastes
Cytokines
Macrophages
Protéoglycannes
Adipocytes
Chimiokines
CSH
Endothélium
Matrice Extra-Cellulaire (Fibronectines, laminines,
collagènes, TSP)
La « niche » hématopoïétique
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Moelle osseuse
Thymus
Tis
su p
érip
hériq
ue
Cellules souches
Progéniteur Myélo-érythroïde
CFU-GEMM
Progéniteurlymphoïde
Pro-B
Pro-NK
Pro-T
Pré-B Lymphocyte BPlasmocyte
NK
Cellule dendritique
Pré-T
T auxiliaire
T cytotoxique
Compartiment des cellules souches
Compartiment des progéniteurs
Compartiment de maturation Précurseurs et cellules matures
sang
Cellules dendritiques
CFU-GM
CFU-M Pro-Monocyte Monocyte
Macrophage
CFU-G neutrophile neutrophile
éosinophileCFU-Eo éosinophile
basophileCFU-Baso basophileMastocyte
BFU-MK
BFU-E
Mégacaryocyte Plaquettes
Érythroblaste Érythrocyte
Myé
locy
tes
Gra
nulo
cyte
s
ProgéniteurLympho-myéloïde
Représentation schématique des différents compartiments du système hématopoïétique
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Caractéristiques fonctionnelles
Caractéristiques phénotypiques
MÉTHODES D’EXPLORATION DES CSH
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Différenciation MaturationDifférenciation
MARQUEURS IMMUNULOGIQUES
MARQUEURS FONCTIONNELS
CSH
CD34+ ou -
CD38-
Lin-
Thy-1-
QuiescenteRésistante au 5-FU
Rhod 123 faible
ProgéniteurImmature
CD34+
CD38-
Lin-
Thy-1+
QuiescenteRésistante au 5-FU
Rhod 123 faible
ProgéniteurMature
CD34+
CD38+
Lin±
Thy-1±
En cycleSensible au 5-FU
Rhod 123 fort
PrécurseurDifférencié
CD34-
CD38+
Lin+
Thy-1-
En cycleSensible au 5-FU
Rhod 123 fort
I- Caractéristiques phénotypiques des cellules hématopoïétiques humaines
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Séquence d’expression des marqueurs
Cellules MaturesPrécurseursProgéniteurs
Lignée Myéloïde
Lignée Lymphoïde
Megacaryocyte/Plaquettes
Monocyte
Erythrocyte
Eosinophile
Granulocyte
Cellules souches
CD34 HLA-DR, CD38…
Ag lin (CD13, CD41, GpA,
CD71, CD61…)
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II - Tests fonctionnels pour l’étude de l’hématopoïèse
CSH humaines?
CS
H
SRC
Cultures à long terme
Pro
géni
teur
s
LTC-ICMy, Ly
Tests clonogéniques
CFC
Cel
lule
s en
cou
rsde
mat
urat
ion
Caractéristiques phénotypiques
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1- Tests in vivo de transplantation xénogénique
SCID-RC(SRC)
3 - 4 mois
NOD-SCID
Irradiation sub-létale
(+ anti-CD122)
5 - 12 sem
2 sem
En pratique : identification des cellules souches humaines
Milieusemi-solide+ cytokines
2- Tests in vitro de culture
LTC-IC
Milieu+ sérum+ stroma
CFC
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Fréquence des progéniteurs hématopoïétiques humains dans le sang de cordon ombilical
¢ mononucléées ¢ CD34+CD38-
SRC SRC 1 / 5x101 / 5x1055 1 / 6001 / 600
LTC-ICLTC-IC 1 / 2x101 / 2x1044 1 / 201 / 20
CFCCFC 1 / 250 1 / 3
Progéniteurs présents au sein desProgéniteurs présents au sein des
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REGULATION DES CSH
Auto-renouvellement
Détermination
Différenciation
Facteurs extrinsèques
Facteurs intrinsèques
et / ou
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Représentation schématique du rôle des facteurs de transcriptionhématopoïétiques aux différents stades de la différenciation
HoxB4Bmi1
C/EBP
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Représentation schématique des principales étapes ciblesdes facteurs extrinsèques
ShhWntJagged/Delta
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Comment expandre les CSH ?
X
X
QuiescenceAuto-renouvellement
DifférenciationApoptose
DélaiInhibition
StimulationMise en cycle
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Approches expérimentales pour l’expansion des CSH humaines
- CYTOKINES :FLT3-L + TPO + SCF (Kobari et al; Piacibello et al)
± IL-6 + sIL-6R (Ueda et al)
- AUTRES FACTEURS SOLUBLES:Shh (via BMP4) (Bhardwaj et al)
FGF-1 (de Haan et al)
Wnt-5A (Murdoch et al); Wnt-3A (Willert et al)
- CELLULES FEEDER (co-cultures + cellules stromales) :(Connealy et al; Miller & Eaves; .... Dexter)
- FACTEURS DE TRANSCRIPTION :
Homéoprotéines : HOXB4 (HOXC4, B3, A9, A10, ...),bHLH : Tal-1/SCL, polycomb : Bmi-1, ...
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Voie Wnt/Catenine/GSK3 dans les cellules souches
(Dishevelled)
(Glycogen synthase kinase-3)
6-bromoindirubin-3’-oxime (BIO)
X
Différenciation
Auto-renouvellement
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HOXB4
Contrôle
Progéniteurs clonogénique
s
d 12 CFU-S Cellulesmatures
CRU
Sauvageau et al., 1995
Effets de sa surexpression sur l’hématopoïèse murine
HOXB4 :
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Les homéoprotéines agissent sousforme de complexes transcriptionnels
1310998811 22
MEIS1
PBX1Coopération
Paralogues Hox
HOXPBX1
TGAT NNATFixation à l'ADN (Chang et al 1996; Shen et al 1997)
HoxB4 + Knock-down de PBX1 CSH « ultra-compétitives » (x 20 par rapport aux cellules surexprimant HoxB4 seul) (J. Krosl et al, 2003)
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Effets de HoxB4 dans les CSH humaines(Buske et al. Blood, août 2002; Schiedlmeier et al. Blood, mars 2003)
Expression ectopique par transduction rétrovirale
(= expression constitutive du transgène)
Augmentation du nombre des cellules greffant
dans les souris NOD-SCID (SRC) et des CRU (x 3-4)
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Comment expandre les CSH humaines
Sans utiliser de cytokines exogènes* perte de potentiel (?)
Sans transfert de gènes * mutagenèse insertionnelle
* leucémogénène à long terme ?
* dérégulation de l’hématopoïèse terminale ?
Transduction de la protéine HOXB4
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Propriété des homéodomaines
Transport intercellulaire atypique : sécrétion spontanée et internalisation indépendante de récepteur
(formation de micelles inverses)
La 3ème hélice de l’homéodomaine :
- permet la liaison à l’ADN
- nécessaire et suffisante pour l’internalisation
de la protéine
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Résumé de notre travail
• La PROTEINE HOXB4 est capable de pénétrer passivement dans des cellules hématopoïétiques
• Ce système permet une expansion des cellules hématopoïétiques
humaines primitives, sans manipulation de leur génome, par passage
passif (et réversible) de la protéine
Nouvelle approche pour des protocoles d’expansion ex vivo des
CSH humaines
Dans un système de co-culture de CSH humaines avec des cellules stromales sécrétant HOXB4
Amsellem et al, Nat Med, nov 2003