Albrecht v. Graefes Arch. klin. exp. Ophthal. 199, 121--131 (1976) �9 by Springer-Verlag 1976

Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an kurzzeitkonservierten Hornh/iuten*

Wolfgang K. Wal le r , Sadak i Yoko ta und Wolfgang Leydheeke r

Augenklinik der Universitgt Wiirzburg (Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c .W. Leydheeker)

Eingegangen am 26. November 1975

L igh t and E lec t ron Microscopic Studies on Shor t -Term Prese rved Corneae

Summary. t%abbit corneae were stored at a temperature of +4~ in the following media: 1. 5% Dextran T40, 2. McCoy's Medium 5a (modified), 3. Dextran T 40d-Mc Coy's 5a Medium + gentamicin sulphate (250 ~g/ml). The endothelia of the eorneae were examined by light and electron microscopy after preservation for a varied number of days. The structure of the endothelia, stored for 1, 6, 12, 18 days, was compared to fresh corneal endothelial cells. The results indicate that corneae preserved in Dextran 5 % T 40 -4- McCoy's 5a Medium d- gentamicin sulphate might be equivalent to fresh corneal tissue in keratoplasties.

Zusammen/assung. Kaninchenhornh~ute wurden mit einem Sklerarand vom Bulbus abpr~pariert und in verschiedenen Medien bei -~4~ konserviert: in 5% Dextran T 40, in McCoy's 5a Medium (modified), in 5% Dextran T 40 d-McCoy's 5a Medium, in Dextran 5% T 40 + McCoy's 5a Medium-4-Gentamycinsulfat (250 ~xg/m]). Das Hornhautendothel wurde nach 1, 6, 12 und 18 Tagen licht- und elektronenmikroskopisch un%ersucht und verg]ichen mit dem Endothel frischer Kaninchenhornh/~nte und mit dem I-Iornhautendothel yon Bulbi, die in feuchter Kammer bei A-4~ gelagert waren.

Die Untersuchungen zeigten, dal3 noeh eine 6-tiigige Lagerung der t{ornhiiute in 5% Dextran T 40 d-McCoy's 5a Medium mit Refobaein | gute Voraussetzungen fiir eine erfolg- reiche Keratoplastik bietet.

Enuk le ie r t e Bulbi kSnnen bei d-4~ in feuchte r K a m m e r n ich t 1/~nger als 48 h ge lager t werden, wenn d ie t I o r n h a u t noch zur T r a n s p l a n t a t i o n ve rwende t werden soil (Bito und Sa]vador, 1970).

Capella, K a u f m a n und Robb ins (1965) en twicke l ten desha lb eine Tiefgefrier- me thode der t t o rnhau t , d ie auch an der Wi i rzburger Augenk l in ik zu den l%outine- ver fahren gehSrt (Waller , 1973). Dabe i werden Hornh/~ute inne rha lb 6 h nach der E n u k l e a t i o n mi t Dimethy l su l fox id (DMSO), Saccharose und Se ruma lbumin in fl i issigem St ickstoff bei - -196~ gelagert .

Da jedoch diese Methode eine Spezia le inr ich tung erforder t , das I t o rnha u t - gewebe a u g e r d e m of tmals i n n e r h a l b de r e rs ten Woche t r ansp l an t i e r t wird, ent- wickel ten mehre re Au to ren eine Kurzze i tkonse rv ie rung der t t o rnha u t .

Stocker, Levenson und Georgiade (1963) l age r t en erfolgreich Kan inchenhorn - h/~ute fiber zwei Wochen in K a n i n c h e n s e r u m bei d-4~ I m a i z u m i (1968) sehlug ebenfal ls eine Lagerung in Serum vor. K u w a h a r a u. Mitarb . (1965) ve rwende ten eine Salzl6sung mi t Glucose, G lykosaminog lykanen und Ascorbins/~ure. Mizukgwa (1967) w/~hlte e in N/s mi t TC 199, Glykosaminoglykanen, Adenos in und

* Mit Unferstiitzung der Stiftung Volkswagenwerk (AZ: 111516).

122 W.K. Waller et al.

Adenin . Mit d iesen be iden Methoden konn te m a n erfolgreieh fiber eine Woche t t o rnh~u te lagern. Sakimoto , Valent i , I t o i und K a u f m a n (1974) en twicke l ten eine K a m m e r , in de r Hornh/~ute bei ~ 4 ~ in modi f iz ie r te r Krebs -Ringer l6sung mi t D e x t r a n bis zu zwei Woehen konse rv ie r t werden konnten . MeCarey und Kauf - m a n (1974) ff ihr ten eine Konse rv i e rungsme thode t i n m i t Medium 199 und 5% D e x t r a n (M-K-Medium). Noch nach 14 Tagen Lagerung in d iesem Medium konn t e n effolgreiche K e r a t o p l a s t i k e n durehgeff ihr t werden (Bigar, MeCarey und Kaufman , 1975 ; S tark , Maumenee und Kenyon , 1975 ; Aquave l la , Van H o r n und I t agge r ty , 1975).

Van Horn , Schultz und DeBru in (1975) l age r t en Katzenhornh&ute in M-K- Medium (5% Dex t ran , TC 199) und in modi f i z i e r t em M-K-Medium (TC 199, 1% Chondroi t insulfa t ) . A n der Wi i rzburger Augenk l in ik wurden verschiedene Metho- den der Kurzze i tkonse rv ie rung der H o r n h a u t un tersucht , um ein Verfahren zu f inden, Hornhau tgewebe mindes tens eine Woche lagern zu k6nnen. A u g e r d e m k a n n das zweite Auge, das bei e iner T r a n s p l a n t a t i o n im Opera t ionssaa l n ich t ve rwende t wurde, n ich t mehr t iefgefforen werden, da meis t d ie 6-h-Grenze nach der E n u k l e a t i o n f iberschr i t ten ist. S t eh t nun eine Kurzze i tkonse rv ie rnngsmethode zur Verf i igung b rauch t dieses zwei te Auge n ieh t verwoffen zu werden.

Mater ia l und Methode Nach der Enukleation der Bulbi yon New Zealand Albinokaninchen (m~nnlich, 2--3 kg)

win'de die Hornhaut mit einem 2 mm breiten Sklerarand vom Bulbus abpr~pariert (aul]er bei Lagerung in feuchter Kammer).

Lagerungsbedingungen 1. Lagerung der Bulbi in feuchter Kammer bei -~4~ 2. Konservierung der Hornhiiute mit SMerarand in a) 5 % Dextran T 40 (Carl Roth, Karlsruhe, BRD). b) McCoy's 5a Medium (modified) (Gibco, Sehottland). c) 5% Dextran T 40--McCoy's 5a Medium. d) 5 % Dextran T 40 • McCoy's 5 a Medium -~ Gentamyeinsulfat (250 ~zg/ml) (E. Merck,

Darmstadt, BRD). Die Osmolaritgt yon Medium d. betrug 285 mOsm, der pH 7.4. Die Hornhgute wurden

nach 1, 6, 12 und 18 Tagen lieht- und elektronenmikroskopiseh untersueht.

Stru]cturuntersuchungen Alle Hornh~ute wurden in 2,5%igem Glutaraldehyd, gel6st in 0.1 M Phosphatpuffer

(pH 7.4, 480 mOsm), fiir 8 h fixiert; anschliefiend 2real 10 rain in 0,1 M Phosphatpuffer-~ 0,2 M Saecharose (420 mOsm) und fiber Nacht in einer dritten Portion aufbewahrt. Nach- fixiert wurde 2 h mit 2%iger Osmiums~ure nach Caulfield (1957) bei ~-4~ und 1 h im 0,5%igen Uranylacetat, gel5st in Veronalacetatpuffer (pH 5,0) im Dunkeln und bei Zimmer- temperatur.

Die Hornh~ute wurden in der aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und in Epon 812 (Luft, 1961) eingebettet. Das Pr~parateblSckchen wurde an der Trimmeinrichtung TM 60 yon Reichert getrimmt. Ultradfinnschnitte des Hornhautendothels wurden mit dem Diamant- messer yon DuPont am Ultramikrotom Om U 3 yon Reichert gesehnitten. Die Sehnitte wurden auf ein Kupfernetz aufgezogen und mit Uranylaeetat (Watson, 1958) und Bleicitrat (Reynolds, 1963) doppelkontrastiert. Die Prgparate wurden mit dem EM 9-S yon Zeiss unter- sueht.

Semidfinnschnitte wurden mit dem Glasmesser am Ultramikrotom geschnitten, auf einen Objekttri~ger aufgezogen und mit l%igem Toluidin-Blau in l%igem Natriumcarbonat (Mercer und Birbeck, 1966) angefgrbt.

Ultrastruktur kurzzeitkonservierter Hornh~tute 123

Ergebnisse Lichtmikroskopie . Das E n d o t h e l de r fr ischen H o r n h a u t is t g le ichma$ig

gef/trbt, Zellschi~den s ind n icht e rkennbar . (Abb. 1 a). Nach 6t~giger Lagerung des Bulbus in feuchter K a m m e r bei + 4 ~ ist das H o r n h a u t e n d o t h e l geschwollen und

Abb. 1 a--f . Semidfinnschnitte wurden mit 1%igem Toluidin-Blau angef~rbt. • 150. (a) frische Kaninchenhornhaut. Gleichmal]ige Anf~rbung. (b) Endothel einer Hornhaut, die 6 Tage in feuchter Kammer bei +4~ gelagert wurde. Schwellung und ungleichmal~ige Anf~rbbarkeit. Partielle Zerst6rung des basalen Cytololasmas. (c) Endothel nach 6t~giger Lagerung in 5% Dextran T 40 bei +4~ Inhomogene Anfarbbarkeit. (d) Lagerung in McCoy's 5a Medium 6 Tage bei +4~ Spaltbildungen und Vakuolenbi]dung im Cytoplasma. (e) Endothel nach 6ti~giger Lagerung bei +4~ in McCoy's 5a Medium+Dextran 5% T 40. Spalten in der cytoplasmatischen Matrix sind zu sehen. (f) Endothel nach 6 Tage-Lagerung bei -~4~ in McCoy's 5 a Medium + 5 % Dextran T 40 + Refobacin | (250 ~g/ml). Inhomogene Anfarb-

barkeit des Cytoplasma mit wenigen Spalten in der Matrix

124 W.K. Waller et al.

Abb. 2. Endothel einer frisehen Kaninehenhornhaut. Die gesamte Zellstruktur ist erhalten, unter der Zelloberfl~che ist das ,,terminal web" zu sehen (T). Es sind eine ~r oeeludens (Doppelpfeil) und eine lViaeula adhaerens (Pfeil) zu erkennen. Die seitliehen Zellgrenzen sind vielfaeh ineinandergefaltet. (D) Descemet-Membran. (N) Kern. (ER) Endoplasmatisehes

I%eticulum. >< 27400

inhomogen angefgrbt. Die basalen Zellanteile sind zerstSrt (Abb. l b). Nach Lagerung der t to rnhaut in 5% Dextran T 40 6 Tage zeigt das Endothel eine ungleichmgSige Anfgrbung (Abb. 1 c). Wurde die Hornhaut 6 Tage in MeCoy's 5a Medium gelagert zeigt das Endothel Spalten im Cytoplasma und Vakuolen, ist jedoch nieht gesehwollen (Abb. 1 d). Nach 6tggiger Lagerung der Hornhaut in Dextran 5% T 40 -]- McCoy's 5a Medium sind die Cytoplasmaspalten ebenfalls zu sehen, jedoch weniger zahlreieh als in Abb. 1 d (Abb. 1 e). Nach Zugabe yon Gentamyeinsulfat (250 ~zg/ml) ist das Hornhautendothel nach 6t~giger Lagerung inhomogen angef&rbt, im Cytoplasma sind nur wenige Spalten erkennbar (Abb. If).

Elektronenmikroskopie. Frisehes Hornhautendothel. Die Zelloberfl~che ist glatt. Darunter ist ein typisehes ,,terminal web" zu sehen. Das rauhe endo- plasmatisehe I%etieulum ist im Cytoplasma verteilt und manehmal in Lamellen- form angeordnet. Die Mitochondrien haben keine typisehen Cristae in ihrer Matrix. Kleine Vesikel, wal~rseheinlieh Ausdruck einer pinoeytotisehen T/~tigkeit, sind im ,,terminal web" lokalisiert. I m apikalen Teil der Zelle ist eine Maeula oecludens zu sehen, aul?erdem erkennt man eine Maeula adhaerens. Die seitliehen Zellgrenzen sind vielfach ineinandergefaltet (Abb. 2, 3).

Lagerung der Bulbi in feuchter Kammer bei •4~ einen Tag. I m Vergleich zu frisehen Hornhautendothelzellen kann kein auff/illiger morphologiseher Unter-

Abb. 3. Endo~hel einer frischen Kaninehenhornhaut. Erhaltene Zellstruktur mit intakten Zellorganellen. (N) Kern. (M) Mitochondrien. • 37500

Abb. 4. ttornhautendo~hel nach 6t~giger Lagerung des Bulbus in feuchter Kammer bei q~4C. Die Zelloberflgche is~ irregulgr, das ,,terminal web" verschwunden. Es entstehen grol~e Vakuolen (V) im Cytoplasma, die Cis~ernen des endoplasmatischen l~eticulums (*) sind dilatiert. Kern (N) und Kemhiille intakt. (o) lVfitoehondrien, deren Cristae und Matrix zerst6rt

sind. • 24600

i26 W.K. Waller et al.

Abb. 5. Itornhautendothel nach 6t~giger Lagerung in 5% Dextran T 40 bei d-4~ Es ent- stehen Vakuolen (V) bei intakten Zellorganellen, Kern (N) und Kernhiille oh~le sichtbaren

morphologisehen Sehaden. • 24~000

sehied beobaehtet werden. Die meisten Zellorganellen erseheinen intakt, jedoeh sind die Cisternen des endoplasmatisehen get ieulums erweitert. Der Interzellular- raum ist nieht verbreitert. Naeh einer 6tggigen Lagerung in fenehter Kammer bei @4~ ist die Zelloberflgehe irregular, das ,,terminal web" ist nieht mehr zu sehen. Es entstehen Vakuolen versehiedener Gr6Be im Cytoplasma. Die meisten Mito- ehondrien sind zerst6rt, die Cristae und die Matrix sind versehwunden, jedoeh bleibt die Doppelmembran erhalten. Das endoplasmatisehe Retieulum ist extrem dilatiert, seine Cisternen sind mit den Vakuolen verbunden. Die membrangebun- denen I~ibosomen sind nieht betroffen. Die Kernhiille ist nieht gesehgdigt, der Kern zeigt die gleiehe Struktur wie bei Irisehen Endothelzellen (Abb. 4).

Lagerung in Dextran 5% T 40. Naeh 6tggiger Lagerung bei -~4~ ist die Zelloberflgehe uneben und das ,,terminal web" versehwunden. Es ist eine geringe Vakuolenbildung erkennbar. Die iibrigen Zellorganellen erseheinen intakt (Abb. 5). Lagerung in MeCoy's 5a Medium (modified). Naeh 6 Tagen bei -~4~ sind bemerkenswerte Jmderungen zu sehen. Die Zelloberflgehe ist uneben, es entstehen grol3e Spalten in der ey~oplasmatisehen Matrix, die innen keine Membran be- sitzen. Die Vakuolen zeigen versehiedene Gr6ge, einige von ihnen enthalten ein nieht identifizierbares Material. Das endoplasmatisehe get ieulum ist nieht dila- tiert, einige Mitoehondrien sind aufgebroehen, jedoeh nieht gesehwollen. Der Interzellularraum ist verbreitert, Kern und Kernhiille sind intakt (Abb. 6).

Abb. 6. Hornhautendothel n~ch 6t~giger Lagerung in MeCoy's 5a ~edium (modified) bei ~-4~ Es sind Vakuolen (V) und Sp~lten (S) im Cy~oplasma zu sehen, die Cisternen des endoplasmatischen I~e~iculums (*) sind erweitert. Einige Mitochondrien (M) sind au~gebrochen,

~ber nicht gesehwollen. • 25125

Abb. 7. Hornh~utendo~he] n~ch 6 Tage-Lagerung in McCoy's 5a Medium~-5% Dextran T40 bei ~-4~ Die Zelloberfl~che ist uneben, darunter ents~ehen kleine Vakuolen. Die

meisten ~r (M) sind intakt, ebenso Kern (N) und KernhS]le. • 12450

128 W.K. Waller et al.

Abb. 8. Hornhautendothel nach 6t~giger Lagerung in MeCoy's 5~ Medium + 5% Dextran T 40 -~ Gentamaycinsulf~t bei @4~ Alle Ze]lorganellen sind intakt, unter der Zelloberfli~che erscheinen kleine Vakuolen. Kern (N) und Kernhfille ohne Schwellung oder Schrumpfung.

• 8750

Lagerung in 5% Dextran T 40-~ McCoy's 5a Medium. Die Zelloberflgche ist irregulgr, das ,,terminal web" wird undeutlich. Es entstehen kleine Vakuolen im Cy~oplasma. Die Cisternen des endoplasmatischen Reticulums sind nicht er- weitert, die meisten Mitochondrien sind intakt, die Kernhiille zeigt keine Schgdi- gung. Ein Schrumpfen oder eine Vergr6gerung des Kernes ist nicht zu beobachten (Abb. 7).

Lagerung in Dextran 5% +McCoy ' s 5a Medium+Gentamyc insu l fa t bei ~-4~ Alle Zellorganellen sind intakt, man erkennt die typische Form der Mito- ehondrien, das rauhe endoplasmatische Retieulum, augerdem intakte Kern- und Kernhiillenstrukturen. Jedoch erscheinen unter der Zelloberfls kleinste Vaku- olen, zahlreieher als in frisehen Endothelzellen (Abb. 8, 9).

Diskussion

Nach heutiger Auffassung ist die Transparenz der Hornhaut abh~ngig yon einem morphologisch und funktionell intakten Endothe] (Mishima und Kudo, 1967; Trenberth und Mishima, 1968). Es wird vermutet , dab ein bikarbonat- abh/~ngiger ~ktiver Transport in dieser Zellsehicht existiert (ttodson, 1971; Fischbarg, 1972; Dikstein und Mauriee, 1972 ; Yokota und Waller, 1975). Aus die- sere Grunde werden die ultrastrukturellen Vers n~r dieser Zellschicht mitgteilt.

Ultrastruktur kurzzeitkonservierter Hornhgute 129

Abb. 9. Lagerungsbedingungen wie in Abb. 8. (ER) endoplasmatisches Reticulum. (N) Kern. x 19500 Zonula occludens (Pfeil)

Tabelle 1. Morphologische Kriterien

Un- Vakuolen- Spalt- Schwellung Cyto- Ver- ebenheit bildung bildu~g Eta, plasma- breiterung der im Mito- zerfall des Inter- Zellober- Cyto- chondrien, partiell cellular- fl~che plasma Golgi- (basal) spaltes

komplex

Konservierungsmethode

Bulbus bei + 4 ~ C in feuchter Kammer

Hornhaut bei + 4 ~ C in 5 % Dextran

Hornhaut bei • + ~o C in McCoy 5A + 5% Dextran

Hornhaut bei :k + 4 ~ C in 5 % Dextran + McCoy 5A + Refobacin

+ + + + + + O + + + + + + + +

+ + + + + • + + +

+ + • O • 0

+ + • O ~: O

+ - t - + ~ sehr stark, -+-+ = stark. + = maBig, ~ = sehr wenig, 0 = fehlt.

130 W.K. Waller et M.

Unter verschiedenen Lagerungsbedingungen finden sieh folgende charakte- ristischen morphologischen Vergnderungen (Tabelle 1):

1: Unebenheit der Zelloberfli~che, 2. Vakuolenbildung im Cytoplasma, 3. SpMtbildung im Cytoplasma, 4. Dilatation des endoplasmatischen t~eticulums und Schwellung der Mito-

chondrien, 5. Partielle Zerst6rung der Descemet-nahen cytoplasmatischen Matrix, 6. Verbreiterung des Interzellularspaltes.

Nach 6t~giger Lagerung der Hornhaut in 5% Dextran T 40 bei ~-4~ wird die Zelloberfl~ehe uneben und das ,,terminal web" verschwindet, jedoch zeigt die Descemet-nahe cytoplasmatische Matrix keine Aufhellungen. Man kann vermuten, dab der cytoplasmatische Schaden verhindert wird dutch die Lagerung in einem hypertonen Medium wie Dextran 5 % T 40, da diese Ver~nderungen deutlich bei einer Konservierung in einem isotonischen Medium (McCoy% 5a Medium) zu linden sind. Nut bei dieser Methode sind im hier vorgelegten Material Spaltbil- dungen im Cytoplasma zu erkennen neben Erweiterungen des endoplasmatisehen Reticulums und Sehwellung der Mitoehondrien. McCarey und Kaufman (1974) beobachteten diese Spaltbildung bei Lagerung im M-K-Medium und ffihrten diese Ver~nderungen auf die osmotische Kraf t des Dextrans zuriick. Auch Saki- moto, VMenti, I toi und Kaufman (1974) konnten diese Spaltbildungen im Cyto- plasma nahe dem endoplasmatischen Reticulum sehen, ohne eine Erkl~rung fiir diesen Befund zu geben. In unserem Material waren bei Lagerung in 5 % Dex t r in T 40 lediglich Vakuolen im Cytoplasma zu beobachten bei intakten Zellorganellen. 5~ach 6t~giger Lagerung in McCoy's 5a Medium mit 5% Dextran T 40 waren zwar kleine Vakuolen im Cytoplasma zu beobachten, die Cisternen des endo- plasmatischen Reticulums waren jedoch nicht dilatiert und die meisten Mito- chondrien intakt. Auch nach Zugabe yon Gentamycinsulfat (250 ~g/ml) t ra ten keine zus~tzlichen Zellsch~den auf.

Ausgehend yon diesen licht- und elektronenmikroskopischen Befunden bietet die Kurzzeitkonservierung der I-Iornhaut in McCoy's 5a Medium mit 5% Dextran T 40 und Refobacin | auch noch naeh 6t~giger Lagerung bei -~4~ gute Voraussetzungen fiir eine erfolgreiche perforierende Keratoplastik.

Die Autoren danken Erl. C. Doleschal ffir wertvolle tectmische Mitarbeit.

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Dr. Wolfgang K. Waller Dr. Sadaki Yokota Prof. Dr. Dr. h. c. Wolfgang Leydhecker Josef-Schneider-Str. 1t Kopfklinikum D-8700 Wfirzburg Bundesrepublik Deutschland