TESIS

PEMBERIAN MINUMAN EKSTRAK TEH HIJAU SUHU HANGAT DAN SUHU DINGIN MENURUNKAN KADAR MALONDIALDEHIDA (MDA) SERUM PADA TIKUS DENGAN DIET TINGGI KARBOHIDRAT DAN

TINGGI LEMAK

LILIK LIANA

PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR 2 0 11

PEMBERIAN MINUMAN EKSTRAK TEH HIJAU

SUHU HANGAT DAN SUHU DINGIN MENURUNKAN KADAR MALONDIALDEHIDA (MDA) SERUM PADA TIKUS DENGAN DIET TINGGI KARBOHIDRAT DAN

TINGGI LEMAK

Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister

Pada Program Magister, Program Studi Ilmu Biomedik,

Program Pascasarjana Universitas Udayana

LILIK LIANA NIM. 0890761013

PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK

PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR 2 0 11

Lembar Pengesahan

TESIS INI TELAH DISETUJUI

TANGGAL 15 JUNI 2011

Pembimbing I, Pembimbing II,

Prof. Dr. dr. N. Adiputra, MOH Prof. dr. N. Agus Bagiada, SpBIOK NIP: 194712111976021001 NIP: 195601251986011

Mengetahui,

Ketua Program Studi Ilmu Biomedik Direktur Program Pascasarjana Program Pascasarjana Universitas Udayana Universitas Udayana

Prof.Dr.dr.Wimpie Pangkahila,SpAnd,FAACS Prof.Dr.dr.AA Raka Sudewi, Sp.S(K)

NIP: 1946121319710710 NIP: 19590215985102001

Tesis Ini Telah Diuji dan Dinilai Oleh Panitia Penguji pada Program

Pascasarjana Universitas Udayana Pada Tanggal 15 Juni 2011

Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana

No.: 0990/UN14.4/HK/2011

Tanggal 23 Mei 2011

Ketua: Prof. Dr. Dr. N. Adiputra, MOH

Anggota:

1. Prof. dr. N. Agus Bagiada, SpBIOK

2. Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, SpAnd, FAACS

3. Prof. Dr. dr. J. Alex Pangkahila, MSc, SpAnd

4. Prof. dr. I Gusti Made Aman, SpFK

UCAPAN TERIMA KASIH

Pertama-tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur kepada

Tuhan Yang Maha Esa karena atas karunia-Nya tesis yg berjudul: “Pemberian

Minuman Ekstrak Teh Hijau Suhu Hangat dan Suhu Dingin Menurunkan

Kadar Malondialdehida (MDA) Serum Pada Tikus Dengan Diet Tinggi

Karbohidrat dan Tinggi Lemak” dapat diselesaikan.

Tulisan ini disusun untuk memenuhi persyaratan tugas akhir studi yang

dijalani penulis untuk memperoleh gelar magister pada Program Magister Program

Studi Ilmu Kedokteran Ilmu Biomedik, Kekhususan Anti Aging Medicine,

Program Pascasarjana Universitas Udayana.

Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan rasa hormat,

penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, Sp.And, FAACS selaku ketua

Program Studi Ilmu Kedokteran Biomedik Kekhususan Anti Aging

Medicine Universitas Udayana dan sebagai penguji telah banyak

memberikan ide, masukan, bimbingan dan semangat selama proses

penyusunan tesis ini.

2. Prof. Dr. dr. N Adiputra, MOH, pembimbing I yang dengan penuh

perhatian telah memberikan dorongan, semangat, bimbingan, dan saran

selama penulis mengikuti Program Magister, khususnya dalam

penyelesaian tesis ini.

3. Prof. dr. N Agus Bagiada, Sp. BIOK selaku pembimbing II yang telah

banyak memberikan saran dari sudut biomolekuler dan memberi

masukan yang sangat bermanfaat untuk menyempurnakan penyusunan

karya ilmiah ini.

4. Prof. Dr. dr. J Alex Pangkahila, M. Sc., Sp.And. selaku penguji yang

telah memberikan banyak dukungan, semangat, dan bimbingan serta

saran ilmiah kepada penulis selama penyusunan tesis ini.

5. Prof. dr. I Gusti Made Aman, Sp. FK selaku penguji dan kepala

Laboratory Animal Unit Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran

Universitas Udayana telah memberikan dukungan yang besar,

bimbingan dan banyak saran ilmiah kepada penulis selama penyusunan

tesis ini.

6. Para staf administrasi program Pascasarjana Universitas Udayana yang

telah membantu penyelesaian tesis ini.

7. Laboratorium Biokimia dan Patologi Klinik Fakultas Keodkteran

Airlangga Surabaya yang telah banyak membantu menjaga tikus

peneliti selama proses penyusunan tesis ini,

8. Para dosen pengajar dan rekan-rekan yang tidak dapat disebutkan satu

persatu, yang selalu memberikan doa dan dorongan serta semangat bagi

penulis.

9. Keluarga tercinta yaitu suami (Ir. Satya Sugihwardoyo) dan kedua anak

penulis (Madeline Maydavania dan Stanley Sugihwardoyo) serta kedua

orang tua atas doa, dukungan, dan pengertiannya selama penulis

menempuh pendidikan.

Diakhir kata penulis berharap dengan selesainya kerya ilmiah ini dapat

memberikan manfaat kepada banyak pihak, yaitu kepada bagi penulis

pribadi, bagi program pendidikan Program Magister Program Studi Ilmu

Biomedik, Program Pascasarjana Universitas Udayana, serta bagi pihak-

pihak lain yang berkepentingan. Semoga Tuhan Yang Maha Esa selalu

melimpahkan karunia-Nya kepada semua pihak yang telah berperan

terhadap kelancaran tesis ini.

Denpasar, Juni 2011

Penulis,

Lilik Liana

ABSTRAK

PEMBERIAN MINUMAN EKSTRAK TEH HIJAU SUHU HANGAT DAN SUHU DINGIN MENURUNKAN KADAR MALONDIALDEHIDA (MDA) SERUM PADA TIKUS DENGAN DIET TINGGI KARBOHIDRAT DAN

TINGGI LEMAK

Salah satu penyebab penuaan ialah penumpukan kerusakan oksidatif oleh radikal bebas dalam tubuh. Dalam kondisi fisiologis radikal bebas selalu terbentuk namun radikal bebas dapat meningkat dalam keadaan hiperglikemia dan hiperlipidemia. Malondialdehida (MDA) adalah petanda kerusakan oksidatif sebab terbentuk dari reaksi peroksidasi lipid oleh radikal bebas. Teh hijau mengandung senyawa bersifat antioksidan. Berbagai studi menunjukkan perbedaan kapasitas antioksidan teh hijau pada suhu teh yang berbeda dimana teh suhu panas mempunyai kapasitas antioksidan lebih tinggi daripada suhu dingin, namun kemampuan antioksidan teh hijau dengan suhu berbeda pada studi belum diketahui. Tujuan penelitian ini menunjukan peran teh dalam menurunkan MDA, dimana minuman ekstrak teh hijau suhu hangat (37°C) menurunkan kadar MDA serum lebih banyak daripada suhu dingin (20°C) pada tikus dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak. Rancangan penelitian ini adalah experimental dengan pretest-posttest control group design. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya. Tikus (Norwegicus rattus) jantan galur Wistar yang sesuai dengan kriteria eligibilitas sebanyak 16 ekor, dipilih secara randomisasi sederhana dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok kontrol dan perlakuan. Tikus kelompok kontrol dan perlakuan diberi diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak selama 14 hari pertama, kemudian diambil 1 mL darah dari ekor untuk diperiksa kadar MDA serum dengan MDA ELISA assay kit (OxiselectTM, Cell Biolabs, Inc., USA) sebagai data pretest. Selanjutnya tikus kelompok kontrol diberi minuman ekstrak teh hijau suhu dingin (20°C) sedangkan kelompok perlakuan diberi minuman ekstrak teh hijau suhu hangat (37°C). Ekstrak teh hijau dan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak diberikan selama 14 hari kedua, kemudian darah diambil untuk diperiksa kadar MDA sebagai data posttest. Data dinyatakan sebagai rerata ± standar deviasi. Data dianalisis dengan uji t memakai program SPSS 17.0 for Windows (p<0,05). Rerata kadar MDA pretest kelompok kontrol 101,17 ± 6,94 pmol/mg, sedangkan kelompok perlakuan 103,83 ± 6,27 pmol/mg. Rerata kadar MDA posttest kelompok kontrol 70,83 ± 5,78 pmol/mg sedangkan kelompok perlakuan 66,00 ± 3,41 pmol/mg. Kadar MDA pretest kelompok perlakuan tidak berbeda bermakna dengan kontrol (p=0,501). Kadar MDA posttest kelompok perlakuan dan kontrol tidak berbeda bermakna (p=0,108). Kadar MDA posttest lebih rendah daripada pretest baik pada perlakuan (p=0,0001) maupun kontrol (p=0,0001) dan berbeda bermakna. Minuman ekstrak teh hijau suhu hangat dan suhu dingin dapat menurunkan kadar MDA dan menghambat radikal bebas. Suhu minuman ekstrak teh hijau baik hangat maupun dingin tidak mempengaruhi kapasitas antioksidan teh hijau. Masih diperlukan studi lebih mendalam tentang kapasitas antioksidan pada berbagai suhu minuman teh secara in vivo dengan rentang suhu yang lebih besar. Kata kunci: teh hijau suhu hangat, teh hijau suhu dingin, malondialdehida

ABSTRACT

WARM AND COLD GREEN TEA EXTRACT DECREASE SERUM

MALONDIALDEHYDE (MDA) LEVEL OF RATS WITH HIGH CARBOHYDRATE AND FAT DIET

One of causes of aging is the accumulation of oxidative damage due to free radicals in the body. Free radical is always produced in physiological condition but it can increase in either hyperglycemia or hyperlipidemia state. Malondialdehyde (MDA) is the free radicals marker because it is formed from lipid peroxidation reaction by free radicals. Green tea consists of antioxidative compounds. Previous studies showed that green tea’s antioxidant capacity varies at different beverage temperatures. Hot tea has higher antioxidant capacity than cold tea, but this is still unknown regarding antioxidant capacity studies. This research’s goal is to find out the role of tea in decrease MDA level where a warmer green tea extract (37°C) can decrease MDA serum levels more than cold green tea extract (20°C) can on rats with high carbohydrate and high fat diet.

This research’s design was experimental with pre-test and post-test control group design and it was done in Biochemistry and Clinical Pathology Laboratory of Medical Faculty of Airlangga University Indonesia. Sixteen male rats (Norwegicus rattus) with the Wistar strain that meets the eligibility criteria were chosen by simple randomization and divided into two groups, which are control and treatment groups. Rats of both groups were fed with high carbohydrate and fat diet for the first 14 days, then 1 mL of blood from the tail was extracted and collected in order to determine serum MDA level with the MDA ELISA assay kit (OxiselectTM, Cell Biolabs, Inc., USA) as pre-test data. Green tea extract and high carbohydrate and fat diet were given again for the next 14 days. Control rats had been fed by cold green tea extract beverage (20°C) whereas the treatment group had warm green tea extract beverage (37°C). Tail blood was collected after the treatment period as post-test data. Data were performed as mean ± standard deviation. Data analysis was using SPSS 17.0 for Windows (p<0,05). Pre-test MDA level mean of control group was 101,17 ± 6,94 pmol/mg, whereas the treatment group was 103,83 ± 6,27 pmol/mg. Post-test MDA level of control group was 70,83 ± 5,78 pmol/mg whereas treatment group was 66,00 ± 3,41 pmol/mg. Pre-test MDA level of treatment and control groups did not differ significantly (p=0,501). Post-test MDA level of treatment and control group also did not differ significantly (p=0,108). Post-test MDA level of treatment and control groups were significantly lower than pretest (p=0.0001; p=0.0001). Warm and cold green tea extract beverage decrease MDA level and inhibits free radical. Further research is needed to investigate in vivo antioxidant capacity of green tea beverage with a wider range temperature. Keywords: warm green tea, cold green tea, malondialdehyde

DAFTAR ISI

Halaman

SAMPUL DALAM ......................................................................................... i

PRASYARAT GELAR ................................................................................... ii

LEMBAR PERSETUJUAN ............................................................................ iii

PENETAPAN PANITIA PENGUJI ................................................................ iv

UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................... v

ABSTRAK ...................................................................................................... vii

ABSTRACT ................................................................................................... ix

DAFTAR ISI ................................................................................................... x

DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xv

DAFTAR SINGKATAN .................................................................................. xvi

BAB I PENDAHULUAN ............................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 4

1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 5

1.3.1 Tujuan umum ........................................................................................ 5

1.3.2 Tujuan khusus ....................................................................................... 5

1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................... 5

BAB II KAJIAN PUSTAKA.......................................................................... 7

2.1 Penuaan ..... ............................................................................................... 7

2.2 Radikal Bebas ........................................................................................... 9

2.3 Malondialdehida ....................................................................................... 13

2.4 Radikal Bebas, Hiperglikemia, dan Hiperlipidemia ............................... 14

2.5 Teh Hijau ................................................................................................ 18

2.5.1 Struktur kimia dan komposisi teh ........................................................ 18

2.5.2 Peran teh hijau pada kesehatan ............................................................ 19

2.5.3 Kapasitas antioksidan teh ..................................................................... 21

2.5.4 Suhu minuman teh ................................................................................ 22

BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS

PENELITIAN ........... ..................................................................................... 24

3.1 Kerangka Berpikir.................................................................................... 24

3.2 Konsep .............. ........................................................................................ 26

3.3 Hipotesis Penelitian .................................................................................. 26

BAB IV METODE PENELITIAN ................................................................ 27

4.1 Rancangan Penelitian ............................................................................... 27

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ................................................................... 28

4.2.1 Lokasi penelitian ................................................................................... 28

4.2.2 Waktu penelitian ................................................................................... 28

4.3 Ruang Lingkup Penelitian ....................................................................... 28

4.4 Penentuan Sumber Data .......................................................................... 28

4.4.1 Populasi ................. ............................................................................... 28

4.4.2 Sampel................ .................................................................................... 29

4.4.3 Teknik pengambilan sampel ................................................................. 29

4.4.4 Besar sampel .......................................................................................... 29

4.4.5 Kriteria eligibilitas................................................................................. 30

4.4.5.1 Kriteria inklusi ..................................................................................... 30

4.4.5.2Kriteria drop out .................................................................................... 30

4.5 Variabel Penelitian ................................................................................... 31

4.5.1 Jenis variabel ......................................................................................... 31

4.5.2 Definisi operasional variabel ................................................................. 31

4.6 Bahan Penelitian ....................................................................................... 32

4.7 Instrumen Penelitian ................................................................................ 32

4.8 Prosedur Penelitian .................................................................................. 32

4.9 Analisis Data ............................................................................................. 34

BAB V HASIL PENELITIAN ....................................................................... 36

5.1 Data Kelompok Kontrol dan Perlakuan.................................................. 36

5.2 Perbandingan Data Kelompok Kontrol dan Perlakuan ......................... 37

BAB VI PEMBAHASAN ............................................................................... 40

6.1 Efek Ekstrak Teh Hijau pada Radikal Bebas ......................................... 40

6.2 Pengaruh Suhu Minuman Ekstrak Teh Hijau ........................................ 42

6.3 Efek yang Sama Minuman Ekstrak Teh Hijau Suhu Hangat dan

Dingin ...................................................................................................... 43

6.4 Peran Teh Hijau dalam Anti-Aging Medicine.......................................... 44

BAB VII SIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 46

7.1 Simpulan................... ................................................................................. 46

7.2 Saran.......................................................................................................... 46

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 47

LAMPIRAN ................................................................................................... 50

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Radikal bebas, oksidan nonradikal, spesies thiol reaktif nonradikal ........................................................................................................ 12

Tabel 5.1 Kadar MDA kelompok kontrol dan perlakuan ................................... 36

Tabel 5.2 Perbandingan kadar MDA pretest kelompok kontrol dan perlakuan ......................................................................................................... 37

Tabel 5.3 Perbandingan kadar MDA pretest-posttest kelompok perlakuan........ 37

Tabel 5.4 Perbandingan kadar MDA pretest-posttest kelompok kontrol............ 38

Tabel 5.5 Perbandingan kadar MDA posttest kelompok kontrol dan perlakuan ......................................................................................................... 39

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Senyawa aldehida hasil peroksidasi lipid ....................................... 13

Gambar 2.2 Produk sekunder dan ALEs dari proses peroksidasi lipid ............... 17

Gambar 2.3 Struktur kimia flavonoid utama yang terkandung di teh hijau, hitam, oolong ............................................................................... 19

Gambar 3.1 Skema konsep ............................................................................... 26

Gambar 4.1 Skema rancangan penelitian .......................................................... 27

Gambar 4.2 Alur penelitian .............................................................................. 35

Gambar 5.1 Kadar MDA pretest-posttest kelompok kontrol dan perlakuan....... 36

Gambar 5.2 Kadar MDA pretest-posttest kelompok perlakuan (suhu hangat) ... 38

Gambar 5.3 Kadar MDA pretest-posttest kelompok kontrol (suhu dingin) ........ 38

Gambar 5.4 Perbandingan kadar MDA posttest kelompok kontrol dan perlakuan ................................................................................ 39

DAFTAR SINGKATAN

AGEs = Advancedglycosilation end-products

ALEs = Advanced lipid peroxidation end-products

DNA = Deoxy ribonucleic acid

eNOS = Endothelial nitric oxide synthase

HNE = hidroksinonenal

ICAM-1 = Intercellular adhesive molecule-1

iNOS = Inducible nitric oxide synthase

MDA = Malondialdehida

NO = Nitric oxide

RNS = Reactive nitrogen species

ROS = Reactive oxygen species

SOD = Superoxide dismutase

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penuaan adalah proses yang terjadi dalam kehidupan manusia. Namun kita

berharap dapat melewati penuaan dalam kondisi sehat dan tanpa keluhan penyakit.

Sebenarnya penuaan dapat dicegah dan dihambat sehingga meskipun usia

bertambah tetapi kualitas hidup tetap baik. Dengan konsep antiaging medicine, kita

dapat mengatasi masalah-masalah penuaan.

Pada proses penuaan terjadi penurunan fungsi fisiologis tubuh. Kemampuan

mempertahankan homeostasis menurun seiring pertambahan usia sehingga

meningkatkan risiko terkena penyakit dan terjadi kematian. Penuaan terjadi oleh

karena ada faktor internal dan eksternal. Faktor internal meliputi penumpukan

radikal bebas, hormon yang berkurang, glikosilasi, metilasi, apoptosis, imunitas

yang menurun, dan genetik. Faktor eksternal meliputi gaya hidup yang tidak sehat,

kebiasaan yang salah, polusi lingkungan, stres dan kemiskinan (Pangkahila, 2007).

Faktor-faktor di atas berasal dari berbagai teori penuaan yang diajukan oleh para

ahli. Teori radikal bebas adalah salah satu teori yang berkembang luas dan

digunakan untuk menjelaskan proses penuaan.

Dengan mengingat faktor-faktor yang berpengaruh dalam proses penuaan,

dapatlah ditentukan faktor mana yang perlu dihindari atau diatasi sehingga proses

penuaan dapat dicegah atau dihambat. Beberapa upaya yang dapat dilakukan untuk

menghambat proses penuaan antara lain adalah menjaga kesehatan tubuh dan jiwa

dengan pola hidup sehat seperti makanan sehat (Pangkahila, 2007).

Radikal bebas adalah senyawa dengan elektron tak berpasangan. Radikal

bebas dapat bereaksi dengan DNA, nukleotida, protein, dan lipid. Reaksi radikal

bebas dengan lipid pada membran sel menghasilkan peroksida lipid. Senyawa

peroksida lipid terdiri dari malondialdehida (MDA), hidroksinonenal (HNE), dan

isoprostan. Reaksi radikal bebas dengan protein menghasilkan cross-link sehingga

terjadi disfungsi protein. Reaksi radikal bebas dengan DNA dan nukleotida

menyebabkan mutasi gen. Kerusakan oksidatif membran sel, disfungsi protein, dan

mutasi gen mengakibatkan kematian sel. Kerusakan oksidatif terakumulasi seiring

dengan pertambahan usia. Akumulasi ini yang menyebabkan penuaan (Dröge,

2002).

Radikal bebas dapat meningkat dengan pola makan tinggi karbohidrat dan

tinggi lemak. Makanan tinggi karbohidrat memberikan dampak hiperglikemia.

Reaksi glikosilasi oleh karena hiperglikemia menghasilkan pembentukan advanced

glycosilation end-products (AGEs). Ikatan AGEs dengan reseptor AGEs pada

membran sel memicu pembentukan radikal bebas. Makanan tinggi lemak

memberikan dampak hiperlipidemia. Hiperlipidemia mengakibatkan penumpukan

lemak intraseluler sehingga terjadi lipotoksisitas pada sel. Lipotoksisitas memicu

pembentukan radikal bebas (Khan, 2005). Peningkatan radikal bebas ditandai

dengan peningkatan MDA sebab MDA adalah hasil reaksi peroksidasi lipid.

Manusia berupaya untuk menghambat radikal bebas sehingga penuaan

dapat dihambat. Di alam telah tersedia bahan-bahan yang dapat dikonsumsi

manusia untuk menghambat radikal bebas. Salah satu bahan alami penghambat

radikal bebas adalah teh. Teh mengandung flavonoid yang memiliki sifat

antioksidan sehingga dapat menghambat radikal bebas. Teh terdiri dari berbagai

jenis yaitu teh hitam, teh hijau, dan teh oolong. Teh hijau termasuk jenis yang

banyak dikonsumsi di Asia. Teh hijau memiliki kapasitas antioksidan lebih tinggi

daripada teh hitam (McKay dan Blumberg, 2002).

Teh yang dulu dikonsumsi dengan air panas, saat ini dikonsumsi dalam

kondisi dingin. Penyajian minuman teh ternyata berpengaruh pada potensi

antioksidan teh. Minuman teh panas memiliki kapasitas antioksidan lebih tinggi

daripada es teh (McKay dan Blumberg, 2002). Uji konsentrasi zat-zat antioksidan

dalam teh menunjukkan bahwa konsentrasi flavonoid total, polifenol total,

catechins, theaflavins, thearubigens lebih tinggi pada minuman teh panas daripada

teh dingin (Hakim dkk, 2001). Studi tentang hubungan kanker kulit (squamous cell

carcinoma) dengan suhu minuman teh, melaporkan bahwa kasus kanker kulit lebih

sedikit pada orang yang minum teh panas daripada teh dingin. Hal ini disebabkan

kebiasaan penyajian minuman teh. Teh dingin disajikan dengan volume air yang

banyak dan kantong teh sedikit, sehingga kadarnya 0,86-1,44 g daun teh/240 mL,

sedangkan teh panas disajikan dengan volume air lebih sedikit sehingga kadarnya

2,26 g/240 mL. Pada teh dingin, senyawa flavonoid, theaflavin, thearubigens

membentuk kompleks tak larut dengan kafein, sehingga membentuk endapan.

Endapan ini tidak bisa terminum sehingga kadar senyawa antioksidan teh yang

diminum lebih sedikit (Hakim dkk., 2000). Namun studi hubungan antara suhu

minuman teh dan kanker esofagus melaporkan bahwa suhu minuman teh panas,

lebih dari 70°C, meningkatkan risiko oesophageal squamous cell carcinoma.

Kanker terjadi sebab pengaruh thermal injury pada mukosa esophagus sehingga

bila minum teh dianjurkan dalam kondisi hangat (Whiteman, 2009). Hasil studi di

atas masih terbatas uji in vitro kapasitas antioksidan dan korelasi suhu teh dengan

penyakit kanker, sedangkan pengaruh suhu minuman teh terhadap radikal bebas

tubuh masih belum diketahui. Penelitian ini dirancang untuk membuktikan

pengaruh suhu hangat dan suhu dingin minuman teh hijau terhadap kadar MDA

tikus yang diberi diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak sehingga terjadi

hiperglikemia dan hiperlipidemia. Kondisi hiperglikemia dan hiperlipidemia dapat

memicu pembentukan radikal bebas.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian di atas maka disusun rumusan masalah seperti berikut:

1. Apakah pemberian minuman ekstrak teh hijau suhu hangat menurunkan

kadar malondialdehida (MDA) serum pada tikus dengan diet tinggi

karbohidrat dan tinggi lemak ?

2. Apakah pemberian minuman ekstrak teh hijau suhu dingin menurunkan

kadar malondialdehida (MDA) serum pada tikus dengan diet tinggi

karbohidrat dan tinggi lemak ?

3. Apakah pemberian minuman ekstrak teh hijau suhu hangat menurunkan

kadar malondialdehida (MDA) serum lebih banyak pada tikus dengan diet

tinggi karbohidrat dan tinggi lemak daripada suhu dingin?

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan umum

Untuk mengetahui peranan suhu ekstrak the hijau terhadap kerusakan

oksidatif oleh radikal bebas pada tikus dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi

lemak.

1.3.2 Tujuan khusus

1. Untuk mengetahui bahwa pemberian minuman ekstrak teh hijau suhu

hangat (37°C) menurunkan kadar malondialdehida (MDA) serum pada

tikus dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak.

2. Untuk mengetahui bahwa pemberian minuman ekstrak teh hijau suhu

dingin (20°C) menurunkan kadar malondialdehida (MDA) serum pada

tikus dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak.

3. Untuk mengetahui bahwa pemberian minuman ekstrak teh hijau suhu

hangat (37°C) lebih menurunkan kadar malondialdehida (MDA) serum

pada tikus dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak daripada suhu

dingin (20°C).

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat ilmiah:

Memberi pengetahuan tentang pengaruh suhu minuman ekstrak teh hijau

terhadap kondisi biologis, terutama terhadap radikal bebas.

Manfaat aplikasi:

Memberi pengetahuan tentang cara penyajian teh ekstrak hijau agar lebih

bermanfaat bagi kesehatan.

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

2.1 Penuaan

Kemampuan mempertahankan homeostasis menurun seiring pertambahan

usia sehingga meningkatkan risiko terkena penyakit dan terjadi kematian. Proses

penuaan alami mempunyai 4 karakteristik yaitu progresif, endogen, irreversible,

dan terjadi penurunan. Proses penuaan bersifat progresif karena penyebab penuaan

telah ada sejak organisme masih muda. Penuaan melibatkan proses yang bersifat

endogen sehingga terjadi proses penuaan intrinsik. Faktor eksogen juga dapat

mengakibatkan penuaan baik secara langsung atau melalui interaksi dengan faktor

endogen. Faktor endogen ini yang menjelaskan tentang mengapa tiap individu

mempunyai usia yang berbeda meskipun dalam lingkungan yang sama. Proses

penuaan adalah proses yang tidak dapat kembali ke awal (irreversible). Pada proses

penuaan terjadi penurunan fungsi fisiologis tubuh. Radikal bebas adalah senyawa

penyebab penuaan yang sesuai dengan karakteristik tersebut di atas. Radikal bebas

diproduksi tubuh (endogen) sejak muda sampai tua. Radikal bebas mengakibatkan

kerusakan sel yang irreversible sehingga terjadi penurunan fungsi dan pada

akhirnya terjadi kematian sel (Hulbert dkk., 2007).

Berdasarkan teori wear and tear, penggunaan tubuh secara terus-menerus

apalagi bila berlebihan dapat mengakibatkan kerusakan. Penggunaan mitokondria

dalam proses respirasi aerobik menghasilkan superoksida, dimana superoksida

adalah

senyawa radikal bebas. Penggunaan mitokondria secara berlebihan menghasilkan

lebih banyak radikal bebas sehingga terjadi kerusakan oksidatif. Akumulasi

kerusakan oksidatif mengakibatkan penuaan (Hulbert dkk., 2007).

Setelah mencapai usia dewasa, secara alami seluruh komponen tubuh tidak

dapat berkembang lagi. Sebaliknya terjadi penurunan akibat proses penuaan. Pada

umumnya menjadi tua dianggap hal yang lumrah sehingga semua masalah yang

muncul dianggap memang seharusnya dialami. Padahal terdapat banyak faktor

yang berpengaruh terhadap proses penuaan. Faktor-faktor ini dapat dibagi menjadi

faktor internal dan faktor eksternal. Beberapa faktor internal adalah radikal bebas,

hormon yang berkurang, dan genetik. Faktor eksternal yang utama adalah pola

hidup yang tidak sehat, polusi lingkungan dan stres. Faktor-faktor ini dapat

dicegah, diperlambat bahkan mungkin dihambat sehingga kualitas hidup dapat

dipertahankan. Lebih jauh lagi usia harapan hidup dapat lebih panjang dengan

kualitas hidup yang baik (Pangkahila, 2007).

Usia harapan hidup yang lebih panjang disertai kualitas hidup yang optimal

inilah konsep baru dari ilmu kedokteran anti penuaan atau Anti Aging Medicine

(AAM). AAM ini didefinisikan sebagai bagian ilmu kedokteran yang didasarkan

pada penggunaan ilmu pengetahuan dan teknologi kedokteran terkini untuk

melakukan deteksi dini, pencegahan, pengobatan, dan perbaikan ke keadaan

semula berbagai disfungsi, kelainan, dan penyakit yang berkaitan dengan penuaan,

yang bertujuan untuk memperpanjang hidup dalam keadaan sehat. Dengan definisi

AAM tersebut, tampak bahwa terdapat paradigma yang baru. Yakni di antaranya

manusia bukanlah orang terhukum yang terperangkap dalam takdir genetik dan

penuaan dapat dianggap sama dengan penyakit yang dapat dicegah, diobati bahkan

dikembalikan ke keadaan semula (Pangkahila, 2007).

Dengan mengingat faktor-faktor yang berpengaruh dalam proses penuaan,

dapatlah ditentukan faktor mana yang perlu dihindari atau diatasi sehingga proses

penuaan dapat dicegah atau dihambat. Bermodalkan kesadaran tentang pentingnya

menjaga kesehatan dan menghindari berbagai faktor penyebab proses penuaan

dilengkapi dengan pengobatan, masyarakat memiliki kesempatan untuk hidup lebih

sehat dan berusia lebih panjang dengan kualitas hidup yang baik (Pangkahila,

2007).

Beberapa upaya yang dapat dilakukan untuk menghambat proses penuaan

antara lain adalah menjaga kesehatan tubuh dan jiwa dengan pola hidup sehat

meliputi berolahraga teratur, makanan sehat dan cukup, atasi stres; jangan merasa

sehat dan normal hanya karena tidak ada keluhan serius; melakukan pemeriksaan

kesehatan berkala yang diperlukan dan disesuaikan dengan kondisi; menggunakan

obat dan suplemen yang diperlukan sesuai petunjuk ahli untuk mengembalikan

fungsi berbagai organ tubuh yang menurun. Namun, terdapat pula hambatan atau

kesulitan melakukan upaya menghambat proses penuaan, antara lain karena

lingkungan tidak sehat, pengetahuan rendah dan budaya yang tidak benar

(Pangkahila, 2007).

2.2 Radikal Bebas

Radikal bebas adalah atom atau molekul dengan elektron tidak

berpasangan.Bentuk ini adalah atom/molekul yang tidak stabil. Ketidakstabilan

memicu reaksi dengan atom/molekul lain agar terjadi pasangan elektron sehingga

menjadi bentuk stabil. Reaksi ini dapat mengubah formasi/struktur senyawa yang

berinteraksi dengan radikal bebas (Dröge, 2002).

Radikal bebas terdiri dari reactive oxygen species (ROS) dan reactive

nitrogen species (RNS).Bentuk utama ROS adalah anion superoksida (O2-·). Proses

pembentukan O2-· dimediasi oleh reaksi enzimatik yaitu dengan enzim NADPH

oksidase dan xanthin oksidase atau nonenzimatik melalui reaksi senyawa reaktif

redoks. Hidrogen peroksida (H2O2) dapat dihasilkan melalui enzimatik yaitu enzim

superoxide dismutase (SOD) mengubah superoksida menjadi H2O2 atau melalui

nonenzimatik yaitu superoksida menjadi H2O2 dan singlet oksigen (1O2). Dengan

tersedianya ion Fe atau Cu, H2O2 diubah menjadi radikal hidroksil yang sangat

reaktif (·OH) melalui reaksi Fenton dan Haber Weiss (Dröge, 2002).

Denham Harman, 1956, dalam free radical theory of aging,

mengemukakan bahwa radikal bebas yang dihasilkan selama proses

respirasi aerobik mengakibatkan akumulasi kerusakan oksidatif yang

menghasilkan penuaan dan kematian (Dröge, 2002). Radikal bebas yang dihasilkan

sel berasal dari sumber endogen dan eksogen. Ada 4 macam sumber endogen dan 3

macam sumber eksogen radikal bebas (Dröge, 2002; Hulbert dkk, 2007).

Sumber endogen radikal bebas yaitu (Dröge, 2002; Hulbert dkk, 2007):

1. Konsekuensi dari respirasi aerobik normal, mitokondria mengkonsumsi

O2, mereduksinya dengan beberapa tahap sehingga dihasilkan H2O.

Produk yang dihasilkan selama proses tersebut adalah O2-·, H2O2 , dan

·OH.

2. Sel – sel fagositik menghancurkan bakteri atau sel terinfeksi virus

dengan ledakan oksidatif yaitu nitric oxide (NO), O2- , H2O2 , dan OCl-

3. Peroksisom, yaitu organel yang mendegradasi asam lemak dan molekul

lainnya menghasilkan H2O2. Dalam kondisi tertentu beberapa peroksida

lolos dari degradasi, sehingga masuk ke kompartemen sel lainnya dan

merusak DNA, protein, dan lipid.

4. Enzim sitokrom P450 adalah enzim untuk pertahanan terhadap bahan –

bahan toksik dari makanan. Induksi enzim ini mencegah efek toksik

bahan asing tetapi juga menghasilkan produk oksidan yang merusak

DNA.

Sumber eksogen radikal bebas yaitu (Dröge, 2002; Hulbert dkk, 2007):

1. Oksida nitrogen (NOx) dari asap rokok mengakibatkan oksidasi

makromolekul dan menurunkan kadar antioksidan.

2. Besi dan tembaga memicu pembentukan radikal bebas dari reaksi

Fenton. Diet tinggi besi dan tembaga biasanya dari daging, menjadi

faktor resiko penyakit kardiovaskular dan kanker pada orang normal.

3. Diet normal terdiri dari tumbuhan dengan senyawa fenolik seperti

klorogenik dan asam kafeik, dapat menghasilkan oksidan melalui reaksi

redoks.

Tabel 2.1 Radikal bebas, oksidan nonradikal, spesies thiol reaktif nonradikal (Jones,2008)

Radikal bebas Anion superoksida Nitric oxide Radikal hidroksil ·CCl3

Oksidan nonradikal Hidrogen peroksida (H2O2) Hydroperoxyfatty acids Aldehida Quinone Peroksinitrit Disulfida

Thiol reaktif nonradikal Aldehida terkonjugasi (misal, akrolein) 4-hydroxynoneal, malondialdehida (MDA) Quinone Epoksida Zn2+, Hg2+, ion-ion logam

Menurut teori penuaan oleh radikal bebas, menyatakan bahwa radikal bebas

menyebabkan kerusakan oksidatif pada DNA, protein, dan lipid membran sehingga

terjadi kematian.Reaksi radikal bebas dengan asam lemak tak jenuh ganda

menghasilkan peroksida lipid.Oksidasi lipid merusak struktur dan fungsi membran

sel sebab komponen terbesar membran sel adalah lipid (Jones, 2008).

Sel mengalami stres akibat kerusakan oksidatif. Stres oksidatif

didefinisikan sebagai ketidakseimbangan prooksidan dan antioksidan yang

menghasilkan kerusakan makromolekul dan gangguan sinyal redoks dan

pengendalian fungsi sel. Penuaan terjadi karena peningkatan akumulasi kerusakan

oksidatif dan penurunan kemampuan perbaikan dan kompensasi (antioksidan,

enzyme repair system) (Jones, 2008).

Gambar 2.1 Senyawa aldehida hasil peroksidasi lipid (Salvayredkk., 2008)

2.3 Malondialdehida

Malondialdehida (MDA) adalah senyawa organik dengan rumus kimia

CH2(CHO)2. Dalam proses metabolism normal, MDA terbentuk karena proses

oksidatif. MDA menjadi salah satu penanda stres oksidatif. Malondialdehida

terutama ada dalam bentuk enol:

CH2(CHO)2 → HOCH=CH-CHO

Dalam pelarut organik, berada dalam bentuk isomer cis, sedangkan dalam air

berada pada bentuk isomer trans (Nairdkk., 2008).

Malondialdehida adalah senyawa yang sangat reaktif yang tidak bisa

dianalisis dalam bentuk asalnya. MDA terbentuk dari reaksi degradasi

polyunsaturated lipid oleh ROS. MDA adalah senyawa aldehida reaktif yang dapat

merusak sel dan membentuk ikatan kovalen dengan protein menjadi advanced lipid

peroxidation end-products (ALEs), yang serupa dengan advanced glycosylation

end-products (AGE) yaitu hasil oksidasi glikoprotein. MDA bereaksi dengan

deoksiadenosin dan deoksiguanosin pada DNA, membentuk DNA adducts,

sehingga bersifat mutagenik (Nair dkk, 2008).

Radikal bebas memiliki waktu paruh yang sangat pendek sehinggasulit

diukur dalam laboratorium.MDA menjadi parameter untuk mengukur ROS secara

tidak langsung. MDA plasma, urin, dan jaringan dapat diukur dengan cara

konvensional yaitu tes thiobarbituric acid-reactive subtance (TBARS). Namun

spesifisitas metode TBARS kurang baik (Halliwell dan Whiteman, 2004).MDA

bebas dan MDA terikat protein dapat bereaksi pada metode TBARS. Hasil pe

roksidasi lipid yang lain yaitu 4-hydroxyalkenals dapat berinteraksi dengan TBA

sehingga dapat memberikan false positive. Metode ELISA memiliki spesifisitas

lebih baik karena hanya mendeteksi MDA bebas.

2.4 Radikal Bebas, Hiperglikemia dan Hiperlipidemia

Ada berbagai teori yang menjadi pengembangan teori penuaan radikal

bebas oleh Harman (Tosatodkk., 2007). Peran glukosa pada proses penuaan

dijelaskan melaluiglycation theory of aging. Berdasarkan studi pada diabetes,

bahwa kondisi hiperglikemia meningkatkan proses penuaan. Radikal bebas

mempunyai hubungan dengan kondisi hiperglikemia dalam proses penuaan.

Interaksi radikal bebas, glikasi, dan reaksi Maillard, dijelaskan melalui free

radical-glycation/Maillard reaction theory of aging.

Reaksi Maillard adalah proses nonenzimatik antara gula tereduksi dengan

asam amino yang menghasilkan karamelisasi. Pemanasan asam amino glisin

dengan glukosa menghasilkan kompleks warna coklat. Reaksi Maillard terdiri dari

inisiasi, propagasi, dan terminasi, sehingga terbentuk advanced glycosylation end

products (AGEs). Glikosilasi adalah reaksi kimia antara glukosa dan protein yang

bersifat nonenzimatik.Glikasi dan reaksi Maillard mengubah senyawa-senyawa

komponen sel. Perubahan komponen sel menghasilkan kerusakan sel yang

akhirnya mengakibatkan kematian atau penyakit (Kahn, 2005).

Glukosa dapat berperan sebagai prooksidan, yang menghasilkan radikal

bebas.Kondisi hiperglikemia memicu reaksi pembentukan advanced glycosilation

end-products (AGEs). AGEs berikatan dengan reseptor AGEs yang ada di berbagai

sel. Ikatan ini menginduksi sinyal transduksi di intraseluler sehingga memicu

pembentukan ROS.Adanya peningkatan glukosa di intrasel mengakibatkan

glukotoksisitas sehingga terbentuk ROS (Kahn, 2005).

Sukrosa terdiri dari molekul fruktosa dan glukosa.Fruktosa mempunyai

peran dalam pembentukan radikal bebas dan inflamasi. Diet tinggi sukrosa 650 g /

kg diet selama 2 minggu meningkatkan kadar TBARS (MDA) plasma, urin, dan

jantung tikus. Kadar TBARS (MDA) lebih tinggi pada tikus jantan daripada tikus

betina.Hormon estrogen memiliki kapasitas antioksidan sebab dapat mengurangi

stres oksidatif. Diet tinggi sukrosa juga meningkatkan kadar trigliserida plasma dan

menurunkan enzim antioksidan superoxide dismutase (SOD) (Busserolles dkk,

2002). Fruktosa memicu reaksi inflamasi melalui peningkatan intercellular

adhesive molecule-1 (ICAM-1).Fruktosa juga menurunkan enzim endothelial nitric

oxide synthase (eNOS) sehingga produksi nitric oxide (NO) berkurang.Bila diet

mengandung fruktosa hingga 20% total energi, terjadi peningkatan ICAM-1

(Cirillo dkk, 2009). Proses inflamasi dapat mengaktifkan pembentukan radikal

bebas. Sel-sel fagositik meningkatkan radikal bebas melalui enzim

myeloperoksidase dan peningkatan NADPH oksidase.

Proses oksidasi pada lipid berperan pada penuaan. Peroksidasi lipid dan

glikosilasi karbohidrat menghasilkan senyawa karbonil reaktif. Senyawa karbonil

adalah precursor dari advanced lipid peroxidation end products (ALEs) dan

advanced glycosylation end products (AGEs). Senyawa karbonil membentuk

cross-link dengan protein jaringan (carbonyl stress). Reaksi ini terakumulasi pada

penuaan dan penyakit kronis.Stres karbonil menginduksi disfungsi protein dan

kerusakan jaringan, yang menyebabkan inflamasi (keradangan) dan apoptosis

(kematian sel terprogram) (Salvayre dkk, 2008).

Produk peroksidasi lipid meliputi senyawa karbonil reaktif dan produk yang

lebih stabil yaitu keton dan alkane.Oksidasi polyunsaturated fatty acids (PUFAs)

menghasilkan senyawa karbonil reaktif.Senyawa karbonil seperti aldehida dan

dikarbonil, terdiri dari hidroksialkenal, akrolein, malondialdehida (MDA), glioksal,

dan metilglioksal.Laju peroksidasi lipid sangat rendah pada kondisi fisiologis,

tetapi meningkat pada penuaan.Peningkatan ini seiring juga dengan penurunan

antioksidan pada penuaan (Salvayre dkk, 2008).

Gambar 2.2 Produk sekunder dan ALEs dari proses peroksidasi lipid (Salvayre dkk, 2008)

Studi tentang diet tinggi lemak dan kadar MDA pada tikus menunjukkan

bahwa pemberian lemak 10%, dengan menggunakan lemak babi, pada diet selama

14 hari mengakibatkan hiperlipidemia dan peningkatan kadar MDA. Kadar

kolesterol plasma lebih dari 240 mg/dL (rerata 261,48 mg/dL). Pemberian infus teh

hijau 0,605 g/kg BB/hari pada tikus hiperlipidemia dapat menurunkan kadar MDA

(Sunarsih dan Prasetystuti, 2007).

2.5 Teh Hijau (Camellia sinensis)

2.5.1 Struktur kimia dan komposisi teh

Teh terbuat dari daun tanaman Camellia sinensis. Teh dikonsumsi di

seluruh dunia dengan konsumsi per kapita ~120 mL/hari. Teh hitam dikonsumsi di

Eropa, Amerika utara, dan Afrika utara.Teh hijau dikonsumsi di Asia.Teh oolong

banyak dikonsumsi di Cina dan Taiwan.Daun teh hijau setelah dipetik kemudian

diuap untuk menginaktivasi oksidase polifenol, baru kemudian dikeringkan.Sekitar

20-22% teh yang dikonsumsi di dunia adalah teh hijau (McKay dan Blumberg,

2002).

Teh mengandung polifenolik termasuk flavonoid. Flavonoid adalah derivat

fenol yang disintesis dalam jumlah 0,5-1,5%. Flavonoid utama yang terkandung

dalam teh hijau adalah catechin (flavan-2-ols) seperti epicatechin (EC),

epicatechin-3-gallate (ECG), epigallocatechin (EGC), dan epigallocatechin-3-

gallate (EGCG) (McKay dan Blumberg, 2002).

Gambar 2.3 Struktur kimia flavonoid utama yang terkandung di teh hijau, hitam, dan oolong (McKay dan Blumberg, 2002)

2.5.2 Peran teh hijau pada kesehatan

Konsumsi teh mempunyai hubungan dengan risiko rendahnya kematian dari

penyakit jantung koroner dan stroke. Efek protektif teh terhadap penyakit

kardiovaskuler melalui mekanisme penghambatan oksidasi LDL (Low Density

Lipoprotein) oleh polifenol teh. Oksidasi LDL berperan dalam proses

aterosklerosis. Aktivitas hipokolesterolemik teh berfungsi juga sebagai

perlindungan dari penyakit jantung. Pada studi dengan hewan coba yang diberi diet

tinggi lemak dan kolesterol, teh hijau, teh hitam, dan polifenol teh mencegah

peningkatan lipid serum dan hati, mengurangi kolesterol total serum dan indeks

aterogenik, dan meningkatkan ekskresi lipid total dan kolesterol di feses (Yang dan

Landau, 2000). Polifenol teh dapat menurunkan peroksidasi lipid dan mengurangi

hiperlipidemia sehingga menghambat proses aterosklerosis pada mencit diabetic

LDL-receptor KO (Salvayre dkk, 2008).

Teh dapat menghambat kanker kulit, paru, esophagus, lambung, hati, usus

halus, pancreas, kolon, prostat, kandung kencing, dan kelenjar payudara.Efek

preventif teh terhadap kanker tampak lebih kuat pada studi – studi Asia dimana

dominan minum teh hijau dibandingkan pada Eropa yang dominan minum teh

hitam.Komponen efektif teh adalah catechin, theaflavin, dan caffeine.Kandungan

catechin dalam teh hitam lebih rendah daripada teh hijau.Mekanisme

penghambatan karsinogenesis terjadi melalui aktivitas antioksidan teh (Yang dan

Landau, 2000). Studi pada mencit tentang efek teh hijau dalam menghambat tumor

kulit akibat paparan sinar ultraviolet, melaporkan bahwa ekstrak teh hijau 1,25%

(1,25 g daun teh / 100 ml air) dan 2,5% (2,5 g daun teh / 100 ml air) dapat

menghambat pembentukan tumor (Wang dkk, 1992).

Teh bermanfaat untuk mencegah obesitas dan perlemakan hati. Teh

menstimulasi termogenesis jaringan lemak.Teh mengurangi absorbsi makanan dan

meningkatkan pemakaian energi.Studi efek teh hijau pada high fat-induced obesity,

gejala sindroma metabolik, dan perlemakan hati mencit, menunjukkan bahwa teh

hijau mengurangi berat badan, persentase lemak tubuh, dan berat lemak

visceral.Penurunan berat badan berhubungan dengan peningkatan lipid fecal. Teh

hijau mengurangi resistensi insulin, kolesterol plasma, dan kadar protein monocyte

chemoattractant. Teh hijau mengurangi berat hati, trigliserida hati, alanine

aminotransferase plasma, akumulasi lipid dalam hepatosit, gula darah.Konsumsi

teh hijau dalam jangka panjang menghambat obesitas serta memperbaiki gejala

yang berhubungan dengan sindroma metabolik dan perlemakan hati.Efek teh ini

berhubungan dengan penurunan absorpsi lipid dan reaksi inflamasi (Bose dkk,

2008).

2.5.3 Kapasitas antioksidan teh

Flavonoid teh dapat mengikat ion logam seperti besi dan tembaga untuk

mencegah peran ion tersebut dalam reaksi radikal bebas Fenton dan Haber –

Weiss.Studi dengan Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) menunjukkan

bahwa teh hijau dan hitam memiliki aktivitas antioksidan terhadap radikal peroksil

lebih tinggi daripada sayuran.Studi dengan Ferri Reducing Ability of Plasma

(FRAP) menunjukkan bahwa kapasitas antioksidan total teh hijau lebih tinggi

daripada teh hitam.Studi tersebut di atas dilakukan secara in vitro sehingga masih

belum bisa menunjukkan faktor bioavailabilitas dan metabolisme dari kapasitas

antioksidan flavonoid.Studi ex vivo dapat menunjukkan lebih baik tentang peran

fisiologis teh (McKay dan Blumberg, 2002).

Uji klinis dengan teh dosis tunggal memperbaiki kapasitas antioksidan

plasma orang dewasa sehat dalam 30 – 60 menit sesudah minum teh. Kapasitas

antioksidan plasma dengan pemeriksaan FRAP meningkat sesudah orang minum

250 ml rebusan teh hijau yang dibuat dari 20 g daun teh kering / 500 ml air atau 2 g

teh hijau atau teh hitam bentuk padat (ekuivalen dengan 3 cangkir teh). Nilai Total

Radical Antioxidant Parameter (TRAP) meningkat sesudah subyek minum 400 mg

ekstrak teh hijau yang terdiri dari EGCG. Secara umum, kapasitas antioksidan

plasma meningkat dalam 1 – 2 jam sesudah minum teh (McKay dan Blumberg,

2002)

Konsumsi teh secara rutin dengan ekstrak teh selama 1 – 4 mingggu

menurunkan biomarker status oksidatif. Studi di Cina pada 40 pria perokok dan di

Amerika Serikat pada 27 pria dan wanita perokok dan bukan perokok melaporkan

bahwa konsumsi teh hijau 6 cangkir per hari selama 7 hari mengurangi kerusakan

oksidatif DNA, peroksidasi lipid, dan pembentukan radikal bebas. Konsumsi diet

tinggi asam linoleat dan ekstrak teh (ekuivalen dengan 10 cangkir teh hijau) selama

4 minggu oleh 20 wanita sehat berusia 23 – 50 tahun terbukti menurunkan kadar

malondialdehida (MDA) plasma, dimana MDA adalah indikator peroksidasi lipid

(McKay dan Blumberg, 2002).

Peran polifenol teh sebagai antioksidan yaitu dengan scavenging ROS, RNS

dan chelating redox-active transition metal ions. Namun ada efek polifenol secara

tak langsung yaitu menghambat redox-sensitive transcription factors (nuclear

factor-κB=NF-κB, dan activator protein-1=AP-1), menghambat enzim prooksidan

(inducible nitric oxide synthase=iNOS, lipooksigenase, siklooksigenase, xanthin

oksidase), dan menginduksi enzim antioksidan (superoxide dismutase=SOD,

glutathione S-transferase) (Frei, 2003).

2.5.4 Suhu minuman teh

Ada peran suhu minuman teh terhadap kapasitas antioksidan teh.Kadar

tertinggi flavonoid terdapat pada rebusan teh panas (541-692 μg/mL), kadarnya

berkurang pada pembuatan instan, dan kadar terendah pada es teh dan teh siap

minum (McKay dan Blumberg, 2002).

Penelitian tentang hubungan kanker kulit (squamous cell carcinoma)

dengan suhu minuman teh, melaporkan bahwa kejadian kanker kulit lebih rendah

pada orang yang minum teh panas daripada teh dingin. Pada minuman teh dingin,

flavonoid, theaflavin, dan thearubigin membentuk kompleks tak larut dengan

kafein yang disebut tea cream.Tea cream mengalami presipitasi (endapan)

sehingga tidak terminum. Endapan tersebut berada di dasar cangkir sehingga kadar

flavonoid yang diminum lebih sedikit.Selain itu ada faktor kebiasaan dalam

membuat teh panas dan dingin. Teh dingin dibuat dengan volume air yang banyak

sehingga kadarnya hanya 0,86-1,44 g daun teh / 240 mL. Teh panas dibuat dengan

volume sedikit sehingga kadarnya mencapai 2,26 g / 240 mL (Hakim dkk, 2000).

Namun studi hubungan antara suhu minuman teh dan kanker esophagus

melaporkan bahwa suhu minuman teh panas, lebih dari 70°C, meningkatkan risiko

esophageal squamous cell carcinoma. Kanker terjadi sebab pengaruh thermal

injury pada mukosa esofagus sehingga bila minum teh dianjurkan dalam kondisi

hangat.Minum teh yang sangat panas dalam jangka lama menyebabkan kerusakan

kronis mukosa esofagus (Whiteman, 2009).

BAB III

KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Berpikir

Berdasarkan teori radikal bebas bahwa penuaan adalah proses akumulasi

dari kerusakan oksidatif oleh radikal bebas. Pembentukan radikal bebas berasal

dari sumber eksternal dan internal. Sumber internal radikal bebas adalah proses

fisiologis dalam tubuh. Sumber eksternal radikal bebas bisa berasal dari pola diet

tinggi karbohidrat dan tinggi lemak. Kondisi hiperglikemia dan hiperlipidemia

menghasilkan senyawa radikal bebas yaitu reactive oxygen species (ROS). Kondisi

hiperglikemia memicu pembentukan AGEs sedangkan hiperlipidemia memicu

pembentukan ALEs. Baik AGEs maupun ALEs dapat memberikan sinyal

transduksi pada sel untuk menghasilkan ROS. ROS bereaksi dengan berbagai

komponen sel yaitu DNA, lipid, dan protein. Peroksidasi lipid adalah reaksi antara

ROS dengan lipid yang mengubah struktur kimia dan fungsi komponen lipid sel.

Perubahan ini dapat merusak sel yang akhirnya mengarah pada kematian sel. Salah

satu hasil peroksidasi lipid adalah malondialdehida (MDA). MDA adalah senyawa

yang relatif stabil sehingga mudah diukur. Malondialdehida adalah senyawa yang

sangat reaktif yang tidak bisa dianalisis dalam bentuk asalnya. MDA terbentuk dari

reaksi degradasi polyunsaturated lipid oleh ROS.

Radikal bebas terdiri dari reactive oxygen species (ROS) dan reactive nitrogen

species (RNS). Bentuk utama ROS adalah anion superoksida (O2-·). Proses

pembentukan O2-· dimediasi oleh reaksi enzimatik yaitu dengan enzim

NADPH oksidase dan xanthin oksidase atau nonenzimatik melalui reaksi senyawa

reaktif redoks. Hidrogen peroksida (H2O2) dapat dihasilkan melalui enzimatik yaitu

enzim superoxide dismutase (SOD) mengubah superoksida menjadi H2O2 atau

melalui nonenzimatik yaitu superoksida menjadi H2O2 dan singlet oksigen (1O2).

Dengan tersedianya ion Fe atau Cu, H2O2 diubah menjadi radikal hidroksil yang

sangat reaktif (·OH) melalui reaksi Fenton dan Haber Weiss.

Kemampuan antioksidan tubuh semakin menurun seiring dengan proses

penuaan. Tubuh membutuhkan senyawa antioksidan eksternal untuk menetralisir

peningkatan radikal bebas. Teh hijau mengandung flavonoid yang bersifat

antioksidan sehingga menghambat pembentukan ROS. Flavonoid utama yang

terkandung dalam teh hijau adalah catechin (flavan-2-ols) yaitu epicatechin (EC),

epicatechin-3-gallate (ECG), epigallocatechin (EGC), dan epigallocatechin-3-

gallate (EGCG). Penurunan ROS dapat mengurangi pembentukan peroksida lipid

sehingga kadar MDA berkurang. Penurunan ROS dapat menghambat kerusakan

dan kematian sel. Diharapkan ekstrak teh hijau dapat menghambat penuaan melalui

perannya sebagai antioksidan. Penelitian sebelumnya membuktikan minuman teh

hijau dengan suhu panas mempunyai kadar flavonoid lebih tinggi daripada suhu

dingin, sehingga penelitian ini mengharapkan minuman ekstrak teh hijau suhu

hangat dapat lebih menurunkan radikal bebas daripada suhu dingin.

3.2 Konsep

Gambar 3.1 Kerangka konsep

3.3 Hipotesis Penelitian

1. Pemberian minuman ekstrak teh hijau suhu hangat menurunkan MDA serum

tikus dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak.

2. Pemberian minuman ekstrak teh hijau suhu dingin menurunkan MDA serum

tikus dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak.

Teh hijau Faktor eksternal: Gaya hidup Diet Polusi lingkungan

Faktor internal: Respirasi normal Inflamasi (Sel fagositik) Glikosilasi Sistem antioksidan ↓

Tikus dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak

MDA

= Aktivasi

= Inhibisi

3. Pemberian minuman ekstrak teh hijau suhu hangat menurunkan MDA serum

lebih besar pada tikus dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak daripada

suhu dingin.

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian yang digunakan adalah experimental pretest-posttest

control group design (Pocock, 2008).

P1 R O1 O2

P S Kelompok P2

O3 O4

Gambar 4.1 Skema rancangan penelitian

Keterangan:

P = Populasi

S = Sampel

R = Randomisasi

O1 = Pemeriksaan pretest pada kelompok kontrol

O2 = Pemeriksaan posttest pada kelompok perlakuan

P1 = Perlakuan I (minuman ekstrak teh hijau suhu dingin)

O3 = Pemeriksaan pretest pada kelompok perlakuan

O4 = Pemeriksaan posttest pada kelompok perlakuan

P2 = Perlakuan II (minuman ekstrak teh hijau suhu hangat)

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

4.2.1 Lokasi penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Patologi

Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya.

4.2.2 Waktu penelitian

Penelitian dilakukan selama 31 hari. Adaptasi tikus dilakukan selama 3

hari. Persiapan tikus dilakukan selama 14 hari pertama dan perlakuan tikus selama

14 hari kedua.

4.3 Ruang Lingkup Penelitian

Ruang lingkup penelitian ini adalah anti aging medicine khususnya yang

berkaitan dengan bidang nutrisi dan biokimia. Bidang nutrisi yang menjadi fokus

penelitian adalah teh hijau. Bidang biokimia yang menjadi fokus penelitian adalah

radikal bebas.

4.4 Penentuan Sumber Data

4.4.1 Populasi

Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah tikus (Norwegicus rattus)

galur Wistar.

4.4.2 Sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian adalah tikus jantan yang

memenuhi kriteria eligibilitas.

4.4.3 Teknik pengambilan sampel

Jumlah kelompok yang digunakan sebanyak 2 kelompok, yaitu kelompok

kontrol dan perlakuan. Sampel yang memenuhi kriteria eligibilitas dipilih secara

randomisasi sederhana untuk dimasukkan dalam kelompok kontrol dan perlakuan.

4.4.4 Besar sampel

Untuk besar sampel digunakan rumus besar sampel Pocock (2008):

2 σ2 n = f(α,β)

( μ2- μ1)2

Keterangan:

n = jumlah subyek tiap kelompok

α = type I error = 0,05

β = type II error= 0,20

f(α,β) = 7,9

σ = simpangan baku kadar MDA serum kontrol = 5 pmol/mg (Verbunt

dkk., 1996)

μ1= kadar MDA serum rerata kontrol = 20 pmol/mg (Verbunt dkk., 1996)

μ2 = kadar MDA serum yang menghasilkan perbedaan klinis yang

diinginkan = 28 pmol/mg

2 x 52 n = 7,9 = 6,1718

( 28 – 20)2

Untuk mengantisipasi drop out, digunakan rumus:

n’ = n / (1-f)

f = perkiraan proporsi drop out = 20% = 0,2

n’ = 6,1718 / (1- 0,2) = 7,7147

Besar sampel minimal yang dibutuhkan adalah 6 tikus tiap kelompok. Jadi

penelitian ini menggunakan besar sampel 8 tikus tiap kelompok untuk antisipasi

drop out.

4.4.5 Kriteria eligibilitas

4.4.5.1 Kriteria inklusi

1. Tikus (Norwegicus rattus) jantan galur Wistar.

2. Berat badan 200 gram, umur 6 bulan.

3. Kondisi sehat, yang ditandai dengan tidak ada kerontokan bulu; tidak ada

luka; tidak ada keradangan dan atau pus pada mata, telinga, badan, dan

ekor.

4.4.5.2 Kriteria drop out

1. Sakit selama perlakuan.

2. Mati selama penelitian.

4.5 Variabel Penelitian

4.5.1 Jenis variabel

1. Variabel bebas adalah minuman teh hijau suhu hangat dan dingin.

2. Variabel tergantung adalah kadar MDA serum.

3. Variabel kendali adalah jenis kelamin, kandang, galur, berat badan tikus.

4.5.2 Definisi operasional variabel

1. Teh hijau adalah ekstrak teh hijau 2,5% (2,5 gram daun teh hijau / 100 ml air)

sebanyak 1 ml yang diberikan setiap hari selama 14 hari melalui sonde. Ekstrak

teh hijau berasal dari Pusat Penelitian Teh dan Kina ,Gambung-Bandung

Selatan, Jawa Barat. Ekstrak teh hijau yang dimaksud adalah teh sudah diolah

sehingga memiliki kadar catechin tang tinggi..

2. Suhu minuman teh hijau adalah suhu minuman teh hijau yang diukur dengan

termometer, dimana suhu 37°C disebut suhu hangat, dan suhu 20°C disebut

suhu dingin. Minuman ekstrak teh hijau hangat dibuat dengan melarutkan

ekstrak teh hijau dalam rebusan air bersuhu 100°C kemudian didiamkan hingga

bersuhu 37°C, lalu ditempatkan dalam termostat. Minuman teh hijau dingin

dibuat dengan melarutkan ekstrak teh hijau dalam rebusan air bersuhu 100°C

kemudian didiamkan dalam lemari es hingga bersuhu 20°C, lalu ditempatkan

dalam termostat.

3. Kadar MDA serum adalah kadar MDA serum tikus yang diambil dari sampel

darah ekor sebanyak 1 ml, dalam kondisi dianestesi ether sebelum pengambilan

sampel darah, kemudian diperiksa secara kuantitatif dengan MDA assay kit

(OxiselectTM, Cell Biolabs, Inc., USA) yang menggunakan metode ELISA.

4. Diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak adalah makanan tikus yang

mengandung sukrosa 650 g/kg diet (Busserolles dkk., 2002) dan lemak 100 g/kg

diet (Sunarsih dan Prasetystuti, 2007), dengan 4700 kalori (Hartoyo dan Astuti,

2002), yang diberikan secara ad libitum.

5. Kondisi kandang adalah kondisi kandang tikus dengan siklus 12 jam terang dan

12 jam gelap, suhu 25±2°C, kelembaban 50±10%.

4.6 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan adalah tikus, ekstrak teh hijau, diet tikus, ether, MDA

assay kit ELISA (OxiselectTM, Cell Biolabs, Inc., USA).

4.7 Instrumen Penelitian

Instrumen yang digunakan adalah kandang tikus, termometer, thermostat,

hygrometer, syringe 1 ml, syringe 10 ml, jarum 30G, vaccutainer tube, microreader

ELISA.

4.8 Prosedur Penelitian

1. Tikus yang sesuai dengan kriteria eligibilitas ditempatkan di kandang untuk

adaptasi selama 3 hari, dan makanan serta minuman diberikan ad libitum.

2. Tikus dipilih dengan randomisasi sederhana sebanyak 8 ekor tikus tiap

kelompok, diberi diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak secara ad libitum

selama 14 hari. Pada hari ke-18 tikus dianestesi dengan ether, dengan cara ether

diteteskan pada kapas, lalu tikus ditempatkan bersama kapas ether dan ditutup

dengan tempat transparan. Darah tikus diambil sebanyak 1 mL dari ekor dengan

jarum 30G dan syringe 3mL. Darah dimasukkan vaccutainer tube dan MDA

serum diperiksa dengan MDA assay kit (OxiselectTM, Cell Biolabs, Inc., USA)

yang menggunakan metode ELISA sebagai data pretest (persiapan).

3. Tikus kelompok kontrol mendapat diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak

dengan minuman teh hijau bersuhu dingin (20°C). Tikus kelompok perlakuan

mendapat diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak dengan minuman teh hijau

bersuhu hangat (37°C). Diet diberikan secara ad libitum. Ekstrak teh hijau

sebanyak 1 ml diberikan secara sonde. Perlakuan dilakukan selama 14 hari.

Minuman ekstrak teh hijau hangat dibuat dengan melarutkan ekstrak teh hijau

dalam rebusan air bersuhu 100°C kemudian didiamkan hingga bersuhu 37°C,

lalu ditempatkan dalam termostat. Minuman teh hijau dingin dibuat dengan

melarutkan ekstrak teh hijau dalam rebusan air bersuhu 100°C kemudian

didiamkan dalam lemari es hingga bersuhu 20°C, lalu ditempatkan dalam

termostat.

4. Pada akhir perlakuan (hari ke-32) tikus dianestesi dengan ether, dengan cara

ether diteteskan pada kapas, lalu tikus ditempatkan bersama kapas ether dan

ditutup dengan tempat transparan. Darah diambil sebanyak1 mL dari ekor

dengan jarum 30G dan syringe 3 mL. Darah dimasukkan vaccutainer tube dan

MDA serum diperiksa dengan MDA assay kit (OxiselectTM, Cell Biolabs, Inc.,

USA) yang menggunakan metode ELISA sebagai data posttest (perlakuan).

5. Data dianalisis dengan analisis deskriptif (rerata ± standar deviasi), uji Shapiro-

Wilk untuk normalitas data, uji t bebas untuk komparasi data kadar MDA serum

tikus kelompok kontrol dan perlakuan, dan uji t berpasangan untuk komparasi

data pretest-posttest. Analisis statistik menggunakan program SPSS 17.0 for

Windows dengan nilai signifikan p < 0,05.

4.9 Analisis Data

1. Analisis deskriptif:

Data kadar MDA serum dinyatakan dengan rerata ± standar deviasi.

2. Analisis normalitas:

Normalitas data kadar MDA serum pretest diuji dengan Shapiro-Wilk (SPSS

17.0 for Windows) dengan nilai signifikan p < 0,05. Bila nilai p > 0,05, artinya

tidak ada perbedaan, maka data berdistribusi normal, sehingga dilanjutkan

dengan uji t untuk komparasi.

3. Analisis homogenitas:

Homogenitas data diuji dengan uji Levene dan nilai signifikan p < 0,05, bila

nilai p>0,05, artinya tidak ada perbedaan, maka data homogen.

4. Analisis komparasi:

Rerata kadar MDA antara pretest dan posttest diuji dengan uji t berpasangan.

Rerata kadar MDA kelompok kontrol dan perlakuan diuji dengan uji t bebas.

Analisis menggunakan SPSS 17.0 for Windows dengan nilai signifikan bila

p<0,05.

Tikus sesuai kriteria eligibilitas

Adaptasi tikus selama 3 hari

Randomisasi sederhana

Kelompok kontrol Kelompok perlakuan 8 tikus 8 tikus

Diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak selama 14 hari

Pemeriksaan kadar MDA serum (data pretest)

Kontrol Perlakuan

Diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak Diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak Minuman ekstrak teh hijau bersuhu dingin Minumanekstrak teh hijau bersuhu hangat selama 14 hari selama 14 hari

Pemeriksaan kadar MDA serum

(data posttest)

Analisis statistik data

Gambar 4.2 Alur penelitian BAB V

HASIL PENELITIAN

5.1 Analisis Deskriptif

Data Kelompok Kontrol dan Perlakuan

Tabel 5.1 Kadar MDA kelompok kontrol dan perlakuan

Pemeriksaan Kelompok

Kontrol (suhu dingin)

(pmol/mg)

Perlakuan (suhu hangat)

(pmol/mg)

Pretest (persiapan) 101,17 ± 6,94 103,83 ± 6,27

Posttest (perlakuan) 70,83 ± 5,78 66,00 ± 3,41

5.2 Analisis normalitas

Oleh karena n < 50, digunakan analisis normalitas data Shapiro-Wilk,

sehingga diperoleh data yang mempunyai distribusi normal (p = 0,480) (Lampiran

1).

Gambar 5.1 Kadar MDA pretest-posttest kelompok kontrol dan perlakuan

5.3 Analisa komparasi

Perbandingan data kelompok control dan perlakuan

Perbandingan kadar MDA pretest kelompok kontrol dan perlakuan

menunjukkan tidak berbeda bermakna (p=0,501), sehingga dapat dianggap kondisi

awal kedua kelompok tidak berbeda (Lampiran 2).

Tabel 5.2 Perbandingan kadar MDA pretest kelompok kontrol dan perlakuan

Kelompok Rerata ± SD p

Kontrol (suhu dingin) 101,17 ± 6,94 0,501

Perlakuan (suhu hangat) 103,83 ± 6,27

Kadar MDA kelompok kontrol dan perlakuan setelah pemberian teh lebih rendah

daripada sebelum pemberian teh. Kadar MDA pretest-posttest kelompok perlakuan

(suhu hangat) menunjukkan perbedaan bermakna (p=0,0001). Perbandingan kadar

MDA pretest-posttest pada kelompok kontrol (suhu dingin) menunjukkan

perbedaan bermakna (p=0,0001) (Lampiran 4).

Tabel 5.3 Perbandingan kadar MDA pretest-posttest kelompok perlakuan (suhu

hangat)

Pemeriksaan Rerata ± SD p

Pretest 103,83 ± 6,27 0,0001

Posttest 66,00 ± 3,41

Gambar 5.2 Kadar MDA pretest-posttest kelompok perlakuan (suhu hangat)

Tabel 5.4 Perbandingan kadar MDA pretest-posttest kelompok control (suhu

dingin)

Pemeriksaan Rerata ± SD p

Pretest 101,17 ± 6,94 0,0001

Posttest 70,83 ± 5,78

Gambar 5.3 Kadar MDA pretest-posttest kelompok kontrol (suhu dingin)

Kadar MDA posttest antara kelompok kontrol dan perlakuan menunjukkan

perbedaan tidak bermakna (p=0,108) (Lampiran 3).

Tabel 5.5 Perbandingan kadar MDA posttest kelompok kontrol dan perlakuan

Kelompok Rerata ± SD p

Kontrol (suhu dingin) 70,83 ± 5,78 0,108

Perlakuan (suhu hangat) 66,00 ± 3,41

Gambar 5.4 Perbandingan kadar MDA posttest kelompok kontrol dan perlakuan

70,83 ± 5,78 66,00 ± 3,41

BAB VI

PEMBAHASAN

6.1 Efek Ekstrak Teh Hijau pada Radikal Bebas

Menurut teori penuaan oleh radikal bebas, menyatakan bahwa radikal bebas

menyebabkan kerusakan oksidatif pada DNA, protein, dan lipid membrane

sehingga terjadi kematian sel. Reaksi radikal bebas dengan asam lemak tak jenuh

ganda menghasilkan peroksida lipid, dimana salah satu senyawa yang terbentuk

adalah malondialdehida (MDA). Penuaan terjadi karena peningkatan akumulasi

kerusakan oksidatif dan penurunan kemampuan perbaikan dan kompensasi

(antioksidan, enzyme repair system) (Jones, 2008).

Teh hijau mempunyai kandungan flavonoid yang sangat tinggi aktivitas

antioksidannya. Teh hijau terdiri dari katekin, dimana yang menjadi senyawa

katekin utama adalah epigallocatechin-3-gallate (EGCG), epigallocatechin (EGC),

epicatechin-3-gallate (ECG), dan epicatechin (EC). Secangkir teh hijau, yaitu

rebusan 2,5 g daun teh dalam 250 mL air panas, terdiri dari 620-880 mg water-

extractable materials, dimana sepertiganya adalah katekin. Senyawa katekin

terbanyak adalah ECGC yaitu sekitar 50-75% (Yang dkk., 2009).

Katekin teh dapat bereaksi dengan spesies reaktif oksigen, seperti radikal

superoksida, singlet oxygen, radikal hidroksil, radikal peroksil, nitric oxide,

nitrogen dioksida, dan peroksinitrit. Katekin mendonorkan atom hidrogen

sehingga

pembentukan radikal bebas dapat berkurang. Katekin dapat berperan sebagai

kelator ion logam, dimana ion-ion logam ini menginisiasi pembentukan radikal

bebas, sehingga radikal bebas dapat dihambat. Mekanisme yang lain yaitu katekin

meningkatkan enzim antioksidan seperti superoxide dismutase, asam askorbat, α-

tocopherol, dan glutation tereduksi sehingga protein karbonil dan malondialdehida

(MDA) berkurang (Yang dkk., 2009).

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian minuman ekstrak teh

hijau baik suhu hangat maupun suhu dingin dapat menurunkan kerusakan oksidatif

oleh radikal bebas seperti MDA. Kadar MDA kelompok kontrol dan perlakuan

lebih rendah sesudah diberi ekstrak teh hijau sehingga dapat disimpulkan

pemberian teh hijau hangat ataupun dingin dapat menurunkan radikal bebas. Hal

ini bermanfaat dalam bidang anti-aging medicine, dimana penghambatan radikal

bebas dapat menghambat dan kerusakan sel dan penuaan. Pada penuaan

kemampuan antioksidan tubuh mengalami penurunan, sehingga diperlukan

senyawa antioksidan eksternal untuk menetralisir oksidan tubuh.

Kondisi awal (pretest) menunjukkan perbedaan yang tidak bermakna antara

kelompok teh hangat dan teh dingin, sehingga dapat diasumsikan kondisi awal

perlakuan relatif sama. Selama pemberian diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak,

3 ekor tikus mati, yaitu 2 ekor tikus kontrol dan 1 ekor tikus perlakuan.

Kemungkinan penyebab kematian adalah kondisi hiperglikemia dan hiperlipidemia

sehingga terjadi gangguan metabolik. Baik kondisi hiperglikemia maupun

hiperlipidemia, dapat meningkatkan radikal bebas sehingga terjadi kegagalan

fungsi organ (Kahn, 2005).

6.2 Pengaruh Suhu Minuman Ekstrak Teh Hijau

Dari hasil penelitian didapatkan kadar MDA kelompok perlakuan (teh

hangat) dan kontrol (teh dingin) tidak berbeda bermakna. Studi in vitro tentang

suhu minuman teh juga melaporkan bahwa kadar tertinggi flavonoid terdapat pada

rebusan teh panas daripada es teh (McKay dan Blumberg, 2002).Senyawa

flavonoid mempunyai aktivitas antioksidan yang dapat menurunkan kadar MDA.

Adanya teori tentang tea cream yang terbentuk dan mengendap di gelas

pada minuman teh dingin (Hakim dkk., 2000), tampaknya tidak sesuai dengan hasil

penelitian ini, sebab hasilnya tidak berbeda bermakna. Tampaknya ekstrak teh

hijau suhu hangat (37°C) mempunyai kapasitas antioksidan yang hampir sama

dengan ekstrak teh hijau suhu dingin (20°C). Minuman ekstrak teh hijau suhu

dingin juga memiliki efektivitas yang sama dalam menurunkan kadar MDA.

Memang masih diperlukan studi lebih lanjut tentang kapasitas antioksidan ekstrak

teh hangat dan dingin baik secara in vitro maupun in vivo. Penelitian Su

dkk.,(2007), menunjukkan bahwa perbedaan suhu menghasilkan perbedaan

aktivitas antioksidan dan kadar katekin. Aktivitas antioksidan dan kadar katekin

lebih tinggi pada suhu 100°C daripada 90°C.

Suhu minuman teh yang sering digunakan dalam berbagai penelitian

sebelumnya adalah suhu panas (lebih dari 70°C), sebab yang digunakan adalah

rebusan teh panas. Suhu minuman teh lebih dari 70°C memiliki risiko peningkatan

kanker esofagus sebab efek thermal injury (Whiteman, 2009). Adanya thermal

injury memicu pembentukan radikal bebas. Suhu minuman teh panas dapat

meningkatkan radikal bebas. Penelitian ini menunjukkan bahwa dengan suhu

hangat (37°C) dapat menurunkan kadar MDA sehingga dapat disimpulkan teh suhu

hangat dapat menurunkan radikal bebas. Perbedaan suhu minuman teh hijau ini

perlu diteliti lebih mendalam dengan menggunakan variasi suhu yang lebih banyak.

Meskipun suhu berpengaruh terhadap kapasitas antioksidan teh hijau, masih

ada faktor lain yang mempengaruhi. Katekin dalam teh hijau memiliki stabilitas

yang bergantung pada pH saluran pencernaan, dimana lambung dalam kondisi

asam sedangkan usus halus dalam kondisi netral atau basa. Katekin stabil pada

kondisi asam (pH<4), dan tidak stabil serta terdegradasi dalam beberapa menit

pada kondisi basa (pH>8). Katekin mengalami oksidasi dalam lingkungan netral

atau basa. Katekin juga terikat protein di lumen usus halus sehingga absorpsinya

menurun (Spencer, 2003).

6.3 Efek yang Sama Minuman Ekstrak Teh Hijau Suhu Hangat dan Dingin

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa efek penurunan kadar MDA oleh

teh hijau sama antara suhu hangat dan suhu dingin. Perbedaan suhu ini tidak

berbeda bermakna. Ada berbagai kemungkinan yang mendasari hal tersebut, yaitu:

1. Kapasitas antioksidan ekstrak teh hijau masih sama dengan rentang suhu antara

20°C sampai 37°C, sehingga penurunan kadar MDA masih relatif sama.

2. Rentang suhu masih terlalu dekat, dan rentang suhu perlu diperbesar agar

memperoleh hasil yang berbeda bermakna, yaitu suhu hangat ditingkatkan lagi

sedangkan suhu dingin diturunkan lagi.

3. Teh hijau yang digunakan dalam penelitian ini adalah bentuk ekstrak yang

sudah mengandung katekin, sehingga dalam suhu minuman yang berbeda

masih menunjukkan kapasitas antioksidan yang sama. Pada penelitian

sebelumnya yang digunakan bentuk ekstrak atau masih berupa daun kering teh

yang direbus. Pada daun teh yang direbus masih terdapat berbagai senyawa

seperti kafein yang bukan bersifat antioksidan. Pada minuman teh dingin,

flavonoid, theaflavin, dan thearubigin membentuk kompleks tak larut dengan

kafein yang disebut tea cream. Tea cream mengendap sehingga tidak terminum

dan kapasitas antioksidan berkurang. Oleh karena itu, terdapat perbedaan hasil

penurunan radikal bebas.

6.4 Peran Teh Hijau dalam Anti-Aging Medicine

Radikal bebas dihasilkan terus-menerus selama proses penuaan. Radikal

bebas adalah faktor penyebab penuaan yang sebenarnya dapat dihambat. Radikal

bebas dapat dihambat oleh senyawa-senyawa antioksidan. Tubuh sebenarnya

mempunyai sistem antioksidan untuk menghambat radikal bebas, namun pada

proses penuaan kapasitas antioksidan internal ini menurun. Dalam kondisi

demikian tubuh membutuhkan senyawa antioksidan eksternal untuk menghambat

akumulasi radikal bebas tubuh.

Teh hijau mempunyai kandungan zat yang bersifat antioksidan. Minuman

teh hijau yang disajikan dengan suhu hangat maupun dingin memiliki kemampuan

untuk menghambat radikal bebas. Dalam penelitian ini digunakan kadar MDA

sebagai petanda radikal bebas. Konsumsi teh hijau secara rutin dapat menghambat

penuaan, sehingga diharapkan kualitas hidup dapat lebih baik. Hal ini sesuai

dengan konsep Anti-Aging Medicine, dimana penuaan adalah hal yang dapat

dihambat sehingga individu tetap memiliki kualitas hidup yang baik meskipun usia

bertambah.

Aspek nutrisi daripada teh hijau ini merupakan bagian dari anti aging

medicine dimana teh hijau memiliki nilai protektif dan berperan dalam

meningkatkan kualitas hidup (quality of life) dan meningkatkan kinerja dari hidup (

quality of work life).

BAB VII

SIMPULAN DAN SARAN

7.1 SIMPULAN

1. Minuman ekstrak teh hijau suhu hangat menurunkan kadar MDA serum tikus

dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak.

2. Minuman ekstrak teh hijau suhu dingin menurunkan kadar MDA serum tikus

dengan diet tinggi karbohidrat dan tinggi lemak.

3. Minuman ekstrak teh hijau suhu hangat dan suhu dingin mempunyai kapasitas

yang sama dalam menurunkan kadar MDA serum pada tikus dengan diet

tinggi karbohidrat dan tinggi lemak.

7.2 SARAN

1. Penelitian tentang minuman ekstrak teh hijau dengan berbagai variasi suhu,

dimana suhu hangat ditingkatkan sedangkan suhu dingin diturunkan.

2. Penelitian lebih mendalam tentang kapasitas antioksidan minuman teh hijau

suhu hangat dan suhu dingin pada studi in vitro dan in vivo.

3. Penelitian tentang minuman ekstrak teh hijau dengan suhu yang lebih tinggi.

DAFTAR PUSTAKA Basu, A., Sanchez, K., Leyva, M., J., Wu, M., Betts, N. M., Aston, C. E., Lyons, T.

J. 2010.Green Tea Supplementation Affects Body Weight, Lipids, and Lipid Peroxidation in Obese Subjects with Metabolic Syndrome. Journal of American College of Nutrition, 29(1):31-40.

Bose, M., Lambert, J. D., Ju, J., Reuhl, K. R., Shapses, S. A., Yang, C. S. 2008.

The Major Green Tea Polyphenol, (-)-Epigallocatachin-3-Gallate, Inhibits Obesity, Metabolic Syndrome, and Fatty Liver Disease in High-Fat-Fed-Mice. J. Nutr., 138:1677-1683.

Busserolles, J., Mazur, A., Gueux, E., Rock, E., Rayssiguier, Y. 2002. Metabolic

Syndrome in the Rats: Females are Protected Against the Prooxidant Effect of A High Sucrose Diet. ExpBiol Med, 227:837-842.

Cirillo, P., Sautin, Y. Y., Kanellis, J., Kang, D. H., Gesualdo, L., Nakagawa, T.,

Johnson, R. J. 2009.Systemic Inflammation, Metabolic Syndrome, and Progressive Renal Disease.Nephrol Dial Transplant, 24:1384-1387.

Crespy, V., Williamson, G. 2004.A Review of The Health Effects of Green Tea

Cathecins in In Vivo Animal Models. J. Nutr., 134:3431S-3440S. Dröge, W. 2002.Free Radical in the Physiological Control of Cell

Function.Physiol Rev., 82:47-95. Frei, B, Higdon, J. V. 2003. Antioxidant Activity of Tea Polyphenols in vivo:

Evidence from Animal Studies. J Nutr, 133:3275S-3284S. Hakim, I. A., Harris, R. B., Weisgerber, U. M. 2000.Tea Intake and Squamous Cell

Carcinoma of the Skin: Influence of Type of Tea Beverages. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 9:727-731.

Hakim, I. A., Hartz, V., Harris, R. B., Balentine, D., Weisgerber, U. M., Graver, E.,

Whitacre, R., Alberts, D. 2001.Reproducibility and Relative Validity of a Questionnaire to Assess Intake of Black Tea Polyphenols in Epidemiological Studies. Cancer Epidemiol Biomarker Prev, 10:667-678.

Halliwell, B., Whiteman, M. 2004. Measuring Reactive Species and Oxidative

Damage in vivo and in Cell Culture: How Should You Do It and What Do The Results Mean ? British Journal of Pharmacology, 142:231-255.

Hartoyo, A., Astuti, M. 2002. Aktivitas Antioksidatif dan Hipokolesterolemik

Ekstrak The Hijau dan Teh Wangi pada Tikus yang Diberi Ransum Kaya Asam Lemak Tidak Jenuh Ganda. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, 8(1):78-85.

Hulbert, A. J., Pamplona, R., Buffenstein, R., Buttemer, W. A. 2007. Life and

Death: Metabolic Rate, Membrane Composition, and Life Span of Animals.Physiol Rev, 87:1175-1213.

Jones, D. P. 2008. Radical-free Biology of Oxidative Stress. Am J Physiol Cell

Physiol, 295:C849-868. Kahn, C. R. 2005. Joslin’s Diabetes Mellitus.14th edition.Philadelphia : Lippincott

Williams and Wilkins, pp. 331-338. Madhavi, K., Saraswathi, V. S. 2011. In Vivo Toxicological Evaluation of

Chlorpyrifos Pesticide on Female Albino Mice: Therapeutic Effects of Curcuma Longa. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 2(2):439-447.

McKay, D. L., Blumberg, J. B. 2002. The Role of Tea in Human Health: An

Update. Journal of American College of Nutrition, 21(1):1-13. Nair, V., O'Neil, C. L., Wang, P. G.2008.“Malondialdehyde” Encyclopedia of

Reagents for Organic Synthesis. New York : John Wiley & Sons. Nielsen, F., Mikkelsen, B. B., Nielsen, J.B., Andersen, H. R., Grandjean, P. 1997.

Plasma Malondialdehyde as Biomarker for Oxidative Stress: Reference Interval and Effects of Life Style Factors. Clinical Chemistry, 43(7):1209-1214.

Pangkahila, W. 2007. Anti-Aging Medicine: Memperlambat Penuaan,

Meningkatkan Kualitas Hidup. Jakarta: Kompas Media Nusantara. hal:8-23.

Pocock, S. 1983. Clinical Trials: A Practical Approach. Wiley-Blackwell. Salvayre, A. N., Coatrieux, C., Ingueneau, C., Salvayre, R. 2008. Advanced lipid

Peroxidation End Products in Oxidative Damage to Proteins.Potential role in Disease and Therapeutic Prospects for the Inhibitors. British Journal of Pharmacology, 153:6-20.

Schindler, C. 2007. The Metabolic Syndrome as An Endocrine Disease: Is There

An Effective Pharmacotherapeutic Strategy Optimally Targeting The Pathogenesis ? Therapeutic Advances in Cardiovascular Disease, 1(1):7-26.

Spencer, J. P. E. 2003. Metabolism of Tea Flavonoids in the Gastrointestinal Tract.

J. Nutr., 133:3255S-3261S. Su, X., Duan, J., Jiang, Y., Duan, X., Chen, F. 2007.Polyphenolic Profile and

Antioxidant Activities of Oolong TeaInfusion under Various Steeping Conditions.Int. J. Mol. Sci.,8:1196-1205.

Sunarsih, E. S., Prasetystuti. 2007. Pengaruh Pemberian Juice Lidah Buaya (Aloe

vera L.) Terhadap Kadar Lipid Peroksida (MDA) Pada Tikus Putih Jantan Hiperlipidemia.http://mot.farmasi.ugm.ac.id/files/12Endang_lidah%2520buaya%2520fix.pdf.

Tosato, M., Zamboni, V., Ferrini, A., Cesari, M. 2007.The Aging Process and Potential Intervention to Extend Life Expectancy. Clinical Intervention in Aging, 2(3):401-412.

Verbunt, R. J. A. M., Egas, J. M., der Laarse, A. V. 1996. Risk of Overestimation of

Free Malondialdehyde in Perfused Rat Hearts due to Homogenization Artifacts. Cardiovascular Research, 31:603-606.

Wang, Y., Beydoun, M. A. 2007. The Obesity Epidemic in The United State-

Gender, Age, Sosioeconomic, Racial/Ethnic, and Geographic Characteristics: A Systematic Review and Meta-Regression Analysis. Epidemiol Rev, 29:6-28.

Wang, Z. Y., Huang, M. T. Ferraro, T., Wong, C. Q., Lou, Y. R., Reuhl, K.,

Iatropoulos, M., Yang, C. S., Conney, A. H. 1992.Inhibitory Effect of Green Tea in The Drinking Water on Tumorigenesis by Ultraviolet Light and 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate in The Skin of SKH-1 Mice. Cancer Research, 52:1162-1170.

Whiteman, D. C. 2009. Hot Tea and Increased Risk of Oesophageal Cancer. BMJ

338:b610. Yang, C. S., Lambert, J. D., Sang, S. 2009. Antioxidative and Anticarcinogenic

Activities of Tea Polyphenols. Arch Toxicol, 83(1):1-17. Yang, C. S., Landau, J. M. 2000.Effects of Tea Consumption on Nutrition and

Health.J.Nutr., 130:2409-2412.

LAMPIRAN 1

Descriptive Statistics

N Minimum Maximum Mean Std. Deviation

pretest control 6 94.00 112.00 101.1667 6.94022 pretest perlakuan 6 97.00 113.00 103.8333 6.27429 posttest kontrol 6 65.00 78.00 70.8333 5.77639 posttest perlakuan 6 62.00 70.00 66.0000 3.40588 Valid N (listwise) 6

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

pretest .151 12 .200* .939 12 .480

a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

LAMPIRAN 2

Group Statistics

kelompok N Mean Std. Deviation Std. Error Mean

pretest kontrol 6 101.1667 6.94022 2.83333

perlakuan 6 103.8333 6.27429 2.56147

Independent Samples Test

Levene's Test

for Equality of

Variances t-test for Equality of Means

95% Confidence Interval

of the Difference

F Sig. t df Sig. (2-tailed) Mean Difference Std. Error Difference Lower Upper

pretest Equal variances

assumed

.035 .856 -.698 10 .501 -2.66667 3.81954 -11.17713 5.84380

Independent Samples Test

Levene's Test

for Equality of

Variances t-test for Equality of Means

95% Confidence Interval

of the Difference

F Sig. t df Sig. (2-tailed) Mean Difference Std. Error Difference Lower Upper

pretest Equal variances

assumed

.035 .856 -.698 10 .501 -2.66667 3.81954 -11.17713 5.84380

Equal variances

not assumed -.698 9.900 .501 -2.66667 3.81954 -11.18881 5.85547

LAMPIRAN 3

Group Statistics

kelompok N Mean Std. Deviation Std. Error Mean

posttest kontrol 6 70.8333 5.77639 2.35820

perlakuan 6 66.0000 3.40588 1.39044

Independent Samples Test

Levene's Test for

Equality of

Variances t-test for Equality of Means

95% Confidence

Interval of the

Difference

F Sig. t df Sig. (2-tailed) Mean Difference Std. Error Difference Lower Upper

posttest Equal variances

assumed

3.288 .100 1.766 10 .108 4.83333 2.73760 -1.26642 10.93308

Equal variances

not assumed 1.766 8.102 .115 4.83333 2.73760 -1.46582 11.13249

LAMPIRAN 4

Paired Samples Statistics

Mean N Std. Deviation Std. Error Mean

Pair 1 pretest kontrol 101.1667 6 6.94022 2.83333

posttest kontrol 70.8333 6 5.77639 2.35820 Pair 2 pretest perlakuan 103.8333 6 6.27429 2.56147

posttest perlakuan 66.0000 6 3.40588 1.39044

Paired Samples Test

Paired Differences

t df

95% Confidence Interval of

the Difference

Mean Std. Deviation Std. Error Mean Lower Upper

Pair 1 pretest kontrol - posttest kontrol

30.33333 2.87518 1.17379 27.31602 33.35065 25.842

Pair 2 pretest perlakuan - posttest perlakuan

37.83333 6.11283 2.49555 31.41831 44.24835 15.160

LAMPIRAN 5 LAMPIRAN 6

Pengambilan sampling darah

Pemberian ekstrak teh hijau per sonde

MDA ELISA Kit

MAKANAN STANDAR TIKUS ( CP593, PT. CHAROEN POKPHAND

INDONESIA)

BAHAN: jagung, dedak, tepung ikan, bungkil kedelai, bungkil kelapa, tepung

daging dan tulang, pecahan gandum,

bungkil kacang tanah, canola, tepung daun, vitamin, kalsium, fosfat,

trace mineral.

ANALISIS:

Kadar air 13%

Protein 13-15%

Lemak 3%

Serat 8%

Abu 6%

Kalsium 0,8%

Fosfor 0,6%

DIET TIKUS TINGGI KARBOHIDRAT DAN TINGGI LEMAK

(HartoyodanAstuti, 2002)

Bahan g/kg Pati jagung 285 Kasein 140 Sukrosa 650 Minyak kedelai 131 CMC 50 Mineral mix 35 Vitamin mix 10 L-cys 1,8 Kolesterol 4 Lemak babi 100 Total kalori 4700 kalori

Revised Protocol

Product Manual

OxiSelect™ MDA Adduct ELISA Kit Catalog Number

STA-332 96 assays

STA-332-5 5 x 96 assays

FOR RESEARCH USE ONLY Not for use in diagnostic procedures

Introduction Lipid peroxidation is a well-defined mechanism of cellular damage in animals and plants. Lipid peroxides are unstable indicators of oxidative stress in cells that decompose to form more complex and reactive compounds such as Malondialdehyde (MDA) and 4-hydroxynonenal (4-HNE), natural bi- products of lipid peroxidation. Oxidative modification of lipids can be induced in vitro by a wide array of pro-oxidant agents and occurs in vivo during aging and in certain disease conditions. Measuring the end products of lipid peroxidation is one of the most widely accepted assays for oxidative damage. These aldehydic secondary products of lipid peroxidation are generally accepted markers of oxidative stress. Both MDA and HNE have been shown to be capable of binding to proteins and forming stable adducts, also termed advanced lipid peroxidation end products. These modifications of proteins by MDA or HNE can cause both structural and functional changes of oxidized proteins. Cell Biolabs' MDA Adduct ELISA Kit is an enzyme immunoassay developed for rapid detection and quantitation of MDA-protein adducts. The quantity of MDA adduct in protein samples is determined by comparing its absorbance with that of a known MDA-BSA standard curve. The kit has detection sensitivity limit of 2 pmol/mg MDA adduct. Each kit provides sufficient reagents to perform up to 96 assays, including standard curve and unknown protein samples. Assay Principle BSA standards or protein samples (10 g/mL) are adsorbed onto a 96-well plate for 2 hrs at 37ºC. The MDA-protein adducts present in the sample or standard are probed with an anti-MDA antibody, followed by an HRP conjugated secondary antibody. The MDA protein adducts content in an unknown sample is determined by comparing with a standard curve that is prepared from predetermined MDA-BSA standards.

Related Products

1. STA-316: OxiSelect™ N-epsilon-(Carboxymethyl) Lysine (CML) ELISA Kit 2. STA-317: OxiSelect™ Advanced Glycation End Products (AGE) ELISA

3. STA-320: OxiSelect™ Oxidative DNA Damage ELISA Kit (8-OHdG Quantitation) 4. STA-325: OxiSelect™ Oxidative RNA Damage ELISA Kit (8-OHG Quantitation)

5. STA-330: OxiSelect™ TBARS Assay Kit (MDA Quantitation) 6. STA-331: OxiSelect™ MDA Immunoblot Kit 7. STA-333: MDA-BSA Control

8. STA-334: OxiSelect™ HNE Adduct ELISA Kit 9. STA-335: HNE-BSA Control

10. STA-337: OxiSelect™ 8-iso-Prostaglandin F2a Activity Assay Kit 11. STA-344: OxiSelect™ Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit

2

12. STA-347: OxiSelect™ In Vitro ROS/RNS Assay Kit (Green Fluorescence)

Kit Components

Box 1 (shipped at room temperature)

1. 96-well Protein Binding Plate (Part No. 231001): One strip well 96-well plate.

2. Anti-MDA Antibody (1000X) (Part No. 233201): One 20 µL vial of anti-MDA Rabbit IgG. 3. Secondary Antibody, HRP Conjugate (1000X) (Part No. 231003): One 20 µL vial. 4. Assay

Diluent (Part No. 310804): One 50 mL bottle. 5. 10X Wash Buffer (Part No. 310806): One 100 mL bottle.

6. Substrate Solution (Part No. 310807): One 12 mL amber bottle. 7. Stop Solution (Part. No. 310808): One 12 mL bottle.

8. Reduced BSA Standard (Part No. 233202): One 500 µL vial of 1 mg/mL reduced BSA in PBS.

Box 2 (shipped on blue ice packs) 1. MDA-BSA Standard (Part No. 233203): One 20 µL vial of 1 mg/mL MDA-BSA in PBS at 2.4

µmol MDA/mg proteins. The amount of MDA adduct is predetermined by a TBARS assay kit (Cat# STA-330).

Materials Not Supplied 1. Protein samples such as purified protein, plasma, serum, cell lysate 2. 3. 4. 5. 6.

1X PBS 10 µL to 1000 µL adjustable single channel micropipettes with disposable tips 50 µL to 300 µL adjustable multichannel micropipette with disposable tips Multichannel micropipette reservoir Microplate reader capable of reading at 450 nm (620 nm as optional reference wave length)

Storage Upon receipt, aliquot and store the Reduced BSA and MDA-BSA Standards at -20ºC to avoid multiple freeze/thaw cycles. Store all other kit components at 4ºC until their expiration dates.

Preparation of Reagents • 1X Wash Buffer: Dilute the 10X Wash Buffer Concentrate to 1X with deionized water. Stir to

homogeneity. • Anti-MDA Antibody and Secondary Antibody: Immediately before use dilute the Anti-MDA

antibody 1:1000 and Secondary Antibody 1:1000 with Assay Diluent. Do not store diluted solutions.

3

Preparation of Standard Curve 1. Freshly prepare 10 g/mL of Reduced BSA by diluting the 1 mg/mL BSA standard in 1X PBS.

Example: Add 50 L to 4.95 mL of 1X PBS. 2. Freshly prepare 0.5 g/mL of MDA-BSA by diluting the 1 mg/mL MDA-BSA standard in 10

g/mL of Reduced BSA. Example: Add 2 L to 4.0 mL of 10 g/mL Reduced BSA. 3. Prepare a series of MDA-BSA standards according to Table 1. Standard Tubes

1 2345678

0.5 g/mL MDA-BSA

(L) 1000

500 of tube #1 500 of tube #2 500 of tube #3 500 of tube #4 500 of tube #5 500 of tube #6

0

10 g/mL Reduced BSA

(L) 0

500 500 500 500 500 500 500

MDA Adduct (pmol/mg)

120 60 30 15 7.5 3.75

1.875 0

Table 1. Preparation of MDA-BSA Standard Curve

Assay Protocol 1. Dilute unknown protein sample to 10 g/mL in 1X PBS. Each protein sample and MDA-BSA

Standard should be assayed in duplicate or triplicate. 2. Add 100 µL of the 10 g/mL protein samples or Reduced/MDA-BSA standards to the 96-well

Protein Binding Plate. Incubate at 37ºC for at least 2 hours or 4ºC overnight. Note: Lysate sample should not be prepared in lysis buffer containing Triton X-100, NP-40, or Igepal CA-630 because these detergents interfere with protein coating of the plate unless the detergent concentration in the 10 g/mL protein samples is no more than 0.001%. We recommend lysis by homogenization or sonication.

3. Wash wells 2 times with 250 µL 1X PBS per well. After the last wash, empty wells and tap microwell strips on absorbent pad or paper towel to remove excess wash solution.

4. Add 200 µL of Assay Diluent per well and incubate for 1-2 hours at room temperature on an orbital shaker.

5. Wash 3 times with 250 µL of 1X Wash Buffer with thorough aspiration between each wash. After the last wash, empty wells and tap microwell strips on absorbent pad or paper towel to remove excess 1X Wash Buffer.

6. Add 100 µL of the diluted anti-MDA antibody to all wells and incubate for 1 hour at room temperature on an orbital shaker. Wash the strip wells 3 times according to step 5 above.

4

7. Add 100 µL of the diluted Secondary Antibody-HRP conjugate to all wells and incubate for 1 hour at room temperature on an orbital shaker. Wash the strip wells 5 times according to step 5 above.

8. Warm Substrate Solution to room temperature. Add 100L of Substrate Solution to each well,

including the blank wells. Incubate at room temperature on an orbital shaker. Actual

incubation time may vary from 2-30 minutes.

Note: Watch plate carefully; if color changes rapidly, the reaction may need to be stopped

sooner to prevent saturation.

9. Stop the enzyme reaction by adding 100 µL of Stop Solution to each well. Results should be read immediately (color will fade over time).

10. Read absorbance of each well on a microplate reader using 450 nm as the primary wave length. Use the Reduced BSA Standard as an absorbance blank.

Example of Results The following figures demonstrate typical MDA Adduct ELISA results. One should use the data below for reference only. This data should not be used to interpret actual results.

2

1.8 1.6 1.4 1.2

1

0.8 0.6 0.4 0.2

0 0 20 40 60 80 100 120 140

MDA Adduct (pmol/mg)

Figure 1: MDA-BSA ELISA Standard Curve

5

OD

450

nm

References 1. Hoff HF, O'Neil J. (1993) J Lipid Res. 34: 1209-17. 2. Armstrong, D. and Browne, R. (1994). Free Radicals in Diagnostic Medicine. 366: 43-58. 3. Armstrong, D., et al. (1998). Free Radicals and

Antioxidant Protocols. 108: 315-324. 4. Boyum, A. (1966). J. of Clinical Investigation. 21: Supplement 97. 5. Braun, D. and Fromherz, P. (1997). Applied Physics A.

6. Gidez, L., et al. (1982). J. of Lipid Research. 23: 1206-1223. 7. Lef'evre G., et al. (1998). Annals de Biologie Clinique. 56(3): 305-319. 8. Ohkawa, H., et al. (1979). Anal.

Biochem. 95: 351-358. 9. Yagi, K. (1998). Free Radicals and Antioxidant Protocols. 108: 101-106.

Recent Product Citations

1. Schinzari, F. et al. (2010). Generalized Impairment of Vasodilator Reactivity during

Hyperinsulinemia in Patients with Obesity-related Metabolic Syndrome. Am. J. Physiol Endocrinol Metab. 299:E947-E952.

2. Labbé, A. et al. (2010). Resveratrol Improves Insulin Resistance Hyperglycemia and

Hepatosteatosis But Not Hypertriglyceridemia, Inflammation, and Life Span in a Mouse Model for Werner Syndrome. J. Gerontol. A Biol Sci Med. Sci. 10.1093/gerona/glq184.

W

arranty These products are warranted to perform as described in their labeling and in Cell Biolabs literature when used in accordance with their instructions. THERE ARE NO WARRANTIES THAT EXTEND BEYOND THIS EXPRESSED WARRANTY AND CELL BIOLABS DISCLAIMS ANY IMPLIED WARRANTY OF MERCHANTABILITY OR WARRANTY OF FITNESS FOR PARTICULAR PURPOSE. CELL BIOLABS' sole obligation and purchaser's exclusive remedy for breach of this warranty shall be, at the option of CELL BIOLABS, to repair or replace the products. In no event shall CELL BIOLABS be liable for any proximate, incidental or consequential damages in connection with the products.

Contact Information

Cell Biolabs, Inc. 7758 Arjons Drive San Diego, CA 92126 Worldwide: +1 858-271-6500 USA Toll-Free: 1-888-CBL-0505 E-mail: tech@cellbiolabs.com www.cellbiolabs.com

2007-2010: Cell Biolabs, Inc. - All rights reserved. No part of these works may be reproduced in any form without permissions in writing.

6