lineare: non lineare: generazione di seconda...

Dipolo indotto da E Lineare:

Non lineare:

Generazione di seconda armonica:

Raman (vibrazionale)

Una molecola non è ferma:

Consideriamo una frequenza (di vibrazione) ω' :

Dipolo indotto Generalizzazione: ω' ωkn (frequenza di risonanza del sistema)

From Cyrus Farokh Hirjibehedin Ph.D. Thesis

Example

Ripasso Conosciamo le soluzioni dell’equazione di Schrödinger di base:

Rappresentazione nello spazio degli autostati di H0:

Considero una perturbazione:

Riscrivo l’equazione di Schrödinger completa dipendente dal tempo nello spazio degli autostati di H0:

(3.2.1)

Teoria delle perturbazioni dipendente dal tempo:

Ordine 1:

Caso particolare: perturbazione sinusoidale su un autostato

Regola d’oro di Fermi

(3.3.1)

(3.3.2)

(3.3.3)

(3.3.4)

Alcune non-linearità: ordine 2

Consideriamo uno spettro non banale per f(t); per mantenere le cose semplici:

Il doppio integrale sarà quindi dato da una somma di termini del tipo:

Sostituendo il risultato dell’integrale nell’espressione per , considerando solo I termini derivanti dall’espressione nel riquadro , e con considerazioni simili a quelle che portano alla regola d’oro di Fermi (e considerando solo termini non trascurabili…) un contributo al secondo ordine alla probabilità di transizione dal livello n al livello j è legato a:

Assorbimento a 2 fotoni: ω1=ω2=ω

g

n

ω

ω

(3.15.1)

Spettroscopia ottica Spettroscopia a due fotoni

Le frequenze di risonanza e le regole di selezione sono diverse. La probabilità di transizione dipende dal “momento di transizione”

Sono attualmente allo studio marcatori specifici per le tecniche a due fotoni, che sono generalmente molecole più complesse con strutture di risonanza diradicaliche, o strutture dendrimeriche

Spettroscopia ottica

La probabilità di transizione (e quindi il segnale) è più basso a potenze ordinarie, ma ci sono diversi vantaggi Le risonanze sono ad energie più basse di quelle usualmente usate (circa la metà, di solito nell’infrarosso), e quindi c’è minor probabilità di danneggiare il campione

Spettroscopia a due fotoni

Spettroscopia ottica

Le regole di selezione sulla simmetria tra stati iniziali e finali sono diverse di quelle ad un fotone ⇒ è possibile avere informazioni su stati eccitati inaccessibili alla spettroscopia ad un fotone La probabilità di transizione (e quindi l’eventuale segnale di fluorescenza) è quadratica nell’intensità di radiazione incidente⇒ varia molto rapidamente per variazioni spaziali dell’intensità del fascio, creando una selettività locale molto utile nella microscopia di a fluorescenza, come vedremo più avanti. Per tutti questi motivi, le tecniche legate all’assorbimento a due fotoni stanno prendendo piede nell’analisi di sistemi biologici

Spettroscopia a due fotoni

2 photon vs. 1-photon excitation

Alcune non-linearità: ordine 2

Consideriamo uno spettro non banale per f(t); per mantenere le cose semplici:

Il doppio integrale sarà quindi dato da una somma di termini del tipo:

Raman ωnk+ ωkj = ωnk− ωjk= ωnj ω2 = ωL (-) ω1 = ωS (+)

γ

(3.16.1)

Raman non risonante

Per W(x) ~ e Ei x, la probabilità per il Raman diventa circa proporzionale a:

(Questa semplificazione si trova in alcuni testi; ha una certa validità per sistemi con pochi livelli molto ben separati, e lontano dalla risonanza)

20,

24SL EEe

(3.16.1)

(3.17.1)

Is/Ias=[(ν0-νvib)/ (ν0+νvib)]3exp(hνvib/kT)

F

Fluorescence

F

Thermally activated fluorescence

Misure Raman: Set-up

Spettrometro

Risoluzione: dispersione grating; distanza fra pixel; apertura fenditura

Rumore

• Elettronico • Schottky (sqrt(N)) • Raggi cosmici

• Possibili fonti: baseline, background

• No rumore: offset

La spettroscopia Raman

• Prerisonanza selezione modi cromoforo

• Misure in soluzione acquosa

Rayleigh

Stokes Anti-Stokes

Inte

nsit

y

Energy

νvib

Difficoltà: Bassa sezione d’urto rilevante segnale di fondo

laser Ar-Kr

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20

Ass

orba

nza

250 300 350 400 450 500 550 600 650 Lunghezza d'onda (nm)

EYQ1 in DEA, pH = 8.3 BFPF in DEA, pH = 8.3

La spettroscopia Raman

• Prerisonanza selezione modi cromoforo

• Misure in soluzione acquosa

Rayleigh

Stokes Anti-Stokes

Inte

nsit

y

Energy

νvib

Difficoltà: Bassa sezione d’urto rilevante segnale di fondo 800 1000 1200 1400 1600 1800

Raman shift (cm-1)

psGFP 250 μM in DEA, pH = 7.95 DEA 20 mM, pH = 7.95 laser (Ludox)

Vibrational spectroscopy

Vibrational spectra: fingerprint of a molecule 1. Presence and/or localization of molecules 2. Conformational changes of a molecule

Ene

rgy

S0

S1 Example of “normal mode” for a BFPF chromophore (691 cm-1 )

stretching symmetrical asymmetrical

scissor twisting

rocking wagging

Vibrational spectroscopy Localized modes

Spettroscopia vibrazionale

ω

Frequenze tipiche di modi intra-molecolari La frequenza dei modi vibrazionali si misura in cm-1 f=cν(cm-1)= 1/λ inverso della lunghezza d’onda EM a freq corrispondente

hν[meV] = 0.124/ λ[cm]=0.124 f [cm-1]

Freq f (cm-1) T(fsec) hν (meV)

C-H,O-H,N-H 3000-3700 10 400

C C, C N 2100-2300 15 250

C=O,C=C,C=N 1500-1600 20 200

C-O,C-C,C-N 1000-1400 30 130

Bending, twisting,…

500-1100 50 60-140

Modi “fingerprint” delocalizzati

<600 >70 <70

La spaziatura dei livelli vibrazionali è tipicamente 1-2 ordini di grandezza inferiore a quella delle transizioni elettroniche ottiche o UV

KT(300K)=25meV ⇒ Solo i modi a frequenza molto bassa (quelli più “delocalizzati) possono essere trattati “classicamente” a temperatura ambiente!


La soluzione del problema elettronico (con DFT o altre tecniche) definisce l’insieme delle PES (per stato fondamentale ed eccitati)

R

E

Il moto nucleare in approssimazione adiabatica è guidato dalle PES, che agiscono come energie potenziali, i cui gradienti rispetto alle coordinate nucleari sono le forze

Fin ({R}) = −∇Ri

E n ({R})

E0

E1

E2

Spettroscopia vibrazionale Approx armonica, Stati vibrazionali

Vibrational levels

E i(R) = E i(R0) +∂E i

∂RI

I∑

0

(RI − RI0) +

12

∂ 2E i

∂RI∂RJ

IJ∑

0

(RI − RI0)(RJ − RJ

0) + ...

Sviluppo fino al termine quadratico intorno ai minimi delle PES

Passaggio in coordinate normali {Q} (diagonalizzazione della matrice dinamica)

E i(Q) =12

ω I2

I∑ QI

2

⇒Il sistema viene descritto come un insieme di oscillatori armonici semplici indipendenti

χ i(Q) = φ1i(Q1) ⋅ φ2

i (Q2) ⋅ ...⇒Per ogni stato elettronico (i) la funzione d’onda nucleare totale si disaccopia nelle componenti dovute ai singoli modi

Ogni singolo modo può essere trattato quantisticamente

QI ,ωI

Eυ i , I

i,I = ω I12

+ ν i,I

χ i = φυ i , I

i,I

I∏ = ν i,I

I∏

Funz d’onda nucleare totale:

ν=1 ν=2

Spettroscopia vibrazionale Calcolo di spettri vibrazionali con DFT

Ottimizzazione della struttura Soluzione delle equazioni di Kohn-Sham e ricerca dei minimi delle PES ⇒ Geometria del minimo locale R0

Calcolo della matrice dinamica (=Hessiano della PES nel minimo) Calcolo diretto delle derivate seconde oppure calcolo numerico con il metodo dei piccoli spostamenti dal minimo

Diagonalizzazione ⇒ Autovalori (frequenze di vibrazione) e autostati (modi di vibrazione) Risultato finale: per ogni modo normale, frequenza, pattern di spostamenti (autostato di vibrazione)

∂ 2E i

∂RI∂RJ

0


I livelli vibrazionali non sono più equispaziati I modi vibrazionali a diverse frequenze interagiscono tra loro e hanno una larghezza e vita media finita

Anarmonicità e accoppiamento vibronico

E i(Q) =12

ω I2

I∑ QI

2 +13!

∂ 3E i

∂QI∂QJ∂QK

0

QIQJQKI ,J ,K∑

All’ordine cubico

QI ,ωI

R

E INOLTRE, in vicinanza di intersezioni coniche, dove le PES si avvicinano tra loro, l’approssimazione adiabaitica fallisce, e possono verificarsi accoppiamenti elettronici-vibrazionali (vibronici) e conseguenti salti tra le PES

1 1

Electronic transitions

1

L’elemento di matrice di dipolo vale: Fattori di Franck Condon


Le spaziature tra I picchi dello spettro di fluorescenza misurano la frequenza dei modi vibrazionali dello stato fondamentale ∆E= hνi

Q

Ei

Ef

Spettro a basse temperature della GFP S65T (picco A soppresso) La struttura vibrazionale dello spettro di assorbimento si vede chiaramente Le spaziature tra i picchi corrispondono alle frequenze dei modi vibrazionali dello stato eccitato: ∆E= hνf

I0-0

hνf

hνi

Non tutti i modi vibrazionali contribuiscono alla struttura del picco di ass/emiss: È necessario che le PES dello stato fondamentale ed eccitato siano spostate l’una rispetto all’altra e/o abbiano frequenze sensibilmente diverse, altrimenti i vibrazionali non fondamentali non vengono eccitati dalla transizione elettronica (modi vibrazionali correlati con l’eccitazione) Le frequenze dei modi siano non troppo piccole (altrimenti i picchi vibrazionali non si distinguono) e non troppo grandi (altrimenti i picchi vibrazionali sono troppo spaziati e non si vedono)⇒ Alta selettività su specifici modi caratteristicamente correlati con l’eccitazione elettronica

Esempio:

∆λ~15nm ∆E~77meV hνf~620cm-1

∆λ~17nm ∆E~87meV hνi~700cm-1


R

Ei

Ef

I0-0

hνf

ma anche la transizione principale tra vibrazionali “fondamentali” delle PES di stato fondamentale ed eccitato Ef,0→ Ei,0 ha energia inferiore a quella inversa Ei,0→ Ef,0 (Stokes shift del picco principale). Questo è dovuto al rilassamento “solvente” (o ambiente chimico circostante) che si riaggiusta in seguito all’eccitazione spostando la PES

hνi

Origine dello Stokes shift

Lo spettro di fluorescenza presenta una struttura analoga (speculare), con energia media di transizione inferiore a quella di assorbimento (Stokes shift “medio”)

Ei,0

Ef,0

Spettroscopia vibrazionale Effetto della temperatura

A temperatura ambiente, però la struttura vibrazionale di solito non è distinguibile a causa dell’allargamento termico dei picchi vibrazionali L’innalzamento della temperatura produce uno spostamento effettivo dei picchi, modificando di solito anche lo Stokes shift

GFP-wt (solo assorbimento)

GFP S65T

Rimangono tuttavia di solito visibili i picchi dovuti a strutture conformazionali diverse, come gli stati A e B nella GFP-wt, oppure picchi dovuti a transizioni diverse della stessa struttura, che sono separati da differenze di energie maggiori


La misura delle frequenze vibrazionali dallo spettro di assorbimento/emissione ottica è una misura indiretta delle proprietà vibrazionali, difficoltosa (va fatta a bassa temperatura) e dà informazioni su pochi modi Esiste però la possibilità di fare misure dirette delle frequenze vibrazionali di un sistema


µFI = ν f ν i µ0(R0) + ν fI

∑ QI ν i∂µ0

∂QI R0

+ ...

Misura diretta degli spettri vibrazionali

Spettroscopia IR = spettroscopia in assorbimento con radiazione IR tale da non eccitare lo stato elettronico (di solito hν ~ 0.05-0.5eV, λ ~ 2000-20000nm)

Sorgente IR accordabile

λ

I0

Campione Rivelatore

I

QI

IR absorption

0 µ(R0) 0

Stati vibrazionali dello stato fondamentale ⇒il termine di ordine 0 è nullo

⇒ ν f ν i = δij

ν f QI ν i =

2ω I

ν i +1δ f ,i+1 + ν iδ f ,i−1( )⇒il termine di ordine 1 è diverso da zero solo per transizioni di singolo livello vibrazionale, cioè per assorbimenti di energia pari a hν! In realtà le transizioni a partire dai vibrazionali eccitati hanno energia leggermente minore, per via dell’anarmonicità, il che introduce rumore. Rumore può essere introdotto anche dall’emissione stimolata da stati vibrazionali eccitati, ma di solito è trascurabile

hν

IR spectroscopy • Absorption spectroscopy; usual range ~300--3000 cm-1 (λ ~ 30--3µm)

• Dispersion usually obtained by Fourier Transform Interferometer

• Best results with water (and CO2) free environment

• Often, differential spectra to highlight changes.

Milano - Rho, 18/11/2010

FTIR


µFI = ν fI

∑ QI ν i∂µ0

∂QI R0

Selezione delle frequenze vibrazionali: picchi di assorbimento a ω=ωI

Modulazione dei picchi: l’intensità del picco dipende dalla variazione del dipolo elettrico lungo la coordinata normale

I modi con intensità non nulla si dicono IR-attivi

formaldeide

Esempio: spettro IR della formaldeide n. Totale di modi = (4x3-6)=6

Spettroscopia vibrazionale Spettro IR del cromoforo di GFP

stretching double bonds stretching single bonds

bending, scissor delocalized bending-ring def

I modi del cromoforo GFP si possono assegnare con calcoli (DFT): Si calcolano frequenze e autostati dei modi vibrazionali Si confrontano frequenze/ampiezze con quelle sperimentali⇒si assegna il modo L’assegnazione del modo ci dice che tipo di vibrazione ha la molecola

Ad es, i due modi a più alta frequenza (esclusi i modi dell’idrogeno) corrispondono a stretching localizzato di C=O e C=C e la loro frequenza è sensibile all’ambiente chimico circostante (ad es, formazione di legami a idrogeno con O di C=O)

I modi a frequenza <1000cm-1 sono delocalizzati e fortemente caratteristici della molecola e della sua conformazione


n. nodi del cromoforo: ~70 di cui circa 30 che coinvolgono l’idrogeno e ~ 40 che coinvolgono anche gli atomi “pesanti”

Nello spettro IR si vedono quasi tutti sono stati assegnati tramite calcoli ⇒ l’assegnazione consente di seguire la variazione di specifici modi per effetto della variazione dell’environment e quindi trarre informazioni strutturali dalla misura dello spettro vibrazionale

Ma la spettroscopia IR è poco selettiva! In una proteina ci sono 3N-6 modi con N~10000!! Risulta impossibile distinguere e classificare i singoli modi tramite semplice spettroscopia IR

Spettroscopia vibrazionale Spettroscopia IR dei polipeptidi

Per risolvere il problema ci si concentra su due particolari gruppi di modi presenti in tutte le proteine: i modi Amide I e Amide II

La frequenza di questi modi è finemente dipendente dalla presenza di legami a idrogeno su C=O e N-H e dal loro tipo specifico ⇒ è possibile distinguere il segnale in frequenza derivante da grummi amminici o carbossilici

privi di legame a idrogeno Legati con acqua In α eliche In β foglietti paralleli o antiparalleli In random coil


Amide I C=O Amide I N-H Amide II

α-helix 1650 || 1652 ⊥

3290-3300 1516 II 1546 ⊥

β-sheet parallelo

1685 || 1632 ⊥

3280-3300 1530

β-sheet antiparallelo

1645 || 1630 ⊥

1530 II 1550 ⊥

Random coil 1656 1535 Non legati 1680-1700 ~3400 ~1520

Il modo AmideI vengono indeboliti (frequenze diminuite) dai legami a idrogeno in maniera struttura specifica Il modo AmideII viene generalmente rafforzato (frequenza aumentata) dai legami a idrogeno, sempre in maniera struttura specifica Nelle eliche e nei foglietti si verifica il fenomeno del dicroismo (frequenze e intensità differenziate a seconda del’orientazione della polarizzazione della luce incidente rispetto all’asse dell’elica o al piano del foglietto) ⇒ Si possono ricavare informazioni sulla presenza, abbondanza e orientazione di strutture secondarie


In ogni caso i dati non forniscono misure dirette della struttura: sono necessari modelli per interpretare gli spostamenti e le intensità delle bande, oppure specifiche tecniche che introducono conoscenza a priori sul sistema Difference IR: Si determina la natura di una variazione strutturale del sistema dalla variazione del suo spettro IR (differenza dello spettro IR dei due stati)

Spettri IR differenziali

GFP

Ad esempio: gli spettri differenza (stato A - stato B) delle GFP mostrano dei picchi sia nelle bande Amide, sia tra i modi caratteristici del cromoforo, che indicano la deptrotonazione (comparsa del picco 1149, legato al legame singolo C-O del fenolo) NB: di solito si fanno gli spettri diff-IR usando acqua deuterata come solvente perché le bande di assorbimento dell’acqua normale si sovrappongono e creano rumore

Raman (vibrazionale)

Una molecola non è ferma:

Consideriamo una frequenza (di vibrazione) ω' :

Dipolo indotto Generalizzazione: ω' ωkn (frequenza di risonanza del sistema)

( ) ( )00

RRR R

−∂∂

↔′ αωα


La polarizzabilità è la funzione di risposta che misura la variazione di dipolo al campo elettrico considerato come perturbazione, e può essere calcolata nell’ambito della teoria delle perturbazioni in risposta lineare Si usano le seguenti approssimazioni/assunzioni Approssimaziona adiabatica Approssimazione armonica Frequenza del fascio incidente sufficientemente piccola da NON eccitare lo stato elettronico

Livelli elettronici Livelli vibrazionali

Anche se stati elettronici iniziali e finali sono gli stessi, la polarizzabillità, come altre funzioni di risposta, coinvolge una somma su stati intermedi, elettronici e vibrazionali NB: αβ sono indici cartesiani, la polarizzabilità è un tensore

I = 0 ν i

I = 0 ν f

R = r ν n

Spettroscopia Raman


Oltre che dalla frequenza ω la polarizzabilità dipende anche dalla configurazione nucleare R; usando l’approssimazione armonica e passando in coordinate normali si può scrivere lo sviluppo:

Il primo termine sopravvive solo quando anche gli stati vibrazionali iniziale e finale sono gli stessi (a causa della loro ortonormalità) La conservazione dell’energia implica che le frequenze della radiazione incidente e diffusa siano le stesse, dal momento che stato finale e iniziale del sistema dopo il passaggio della radiazione sono gli stessi Diffusione elastica della luce (Rayleigh)

QI

Ee,i hν hν

Diffusione ELASTICA

α0 è la polarizzabilità statica, e sarebbe l’unico contributo se la radiazione incidente non inducesse lo spostamento degli atomi

NB: la somma coinvolge stati elettronici eccitati


Ee,i

Raman Anti-Stokes hνI

hν hν’’

hνI

La diffusione Raman può essere vista come un’interazione inelastica di un fotone con il mezzo: il fotone cede o assorbe energia al sistema generando o assorbendo un singolo “fonone” (quanto di vibrazione della molecola)

Diffusione inelastica Raman

Considerando che in approssimazione armonica vale

il secondo termine risulta non nullo solo se lo stato vibrazionale finale differisce dall’iniziale per un singolo livello vibrazionale ⇒ si deve avere hν-hν’=±hνI

Raman Stokes

L’ampiezza di diffusione coinvolge la derivata della polarizzabilità rispetto allo spostamento lungo la coordinata normale Questa contiene la somma sugli stati elettronici eccitati.


Tipico spettro Raman

Lo spettro della radiazione diffusa presenta un picco a frequenza ω=ω’, ∆ω=ω’-ω=0 (Rayleigh) e picchi a frequenze ω’-ω= ωI (i.e. un picco per ogni modo)

Le intensità dei picchi dipendono dal (quadrato della) derivata della polarizzabilità rispetto alla coordinata normale: vengono selezionati i modi per effetto dei quali più facilmente il sistema si polarizza (Raman-attivi)

Generalmente I modi Stokes sono più forti degli anti-Stokes perché i livelli vibrazionali inferiori sono più popolati

La polarizzabilità è un tensore e quindi l’intensità della radiazione diffusa dipende dall’angolo di raccolta della radiazione


IR L’intensità del picco a ωI dipende da (∂µ/∂QI) Raman L’intensità del picco a ωI dipende da (∂α/∂QI) ⇒Le due tecniche danno risultati diversi, e spesso “complementari”: dipendentemente dalla simmetria della molecola, di solito i modi IR attivi non sono Raman attivi e viceversa

Nel caso del cromoforo GFP in soluzione, solo circa 1/3 del totale dei modi sono Raman attivi In particolare nella zona 500-900cm-1 ci sono i modi delocalizzati caratteristici della molecola

Selettività dei processi Raman Spettri vibrazionali del cromoforo GFP neutro

IR

Raman


In generale, anche se la tecnica Raman è più selettiva rispetto all’IR, in una proteina rimangono pur sempre qualche migliaio di modi diversi Raman-attivi che in linea di principio contribuiscono tutti quanti allo spettro Tuttavia, in certi casi è possibile rendere la tecnica più specificamente selettiva Nella formula della polarizzabilità la frequenza della radiazione incidente compare al denominatore

Negli esperimenti Raman usuali ω è nell’infrarosso (condizioni “fuori risonanza”) e quindi si può trascurare nel calcolo, risultando in un valore della polarizzabilità praticamente indipendente dalla frequenza Se l’esperimento viene fatto con ω nel vicino infrarosso/visibile, e l’ampiezza di scattering dipenderà in modo più complesso dalla frequenza; questo complica i calcoli e quindi anche il confronto esperimento-teoria

( )

0~ EEr −<ω


In condizioni di “risonanza”, cioè quando l’energia della radiazione incidente è uguale o molto vicina all’energia della transizione elettronica hν~E1-E0, solo un termine della somma sugli stati eccitati (r=1) contribuisce alla polarizzabilità

Ee,i Resonance Raman scattering

Raman risonante

In queste condizioni si può ulteriormente assumere che la dipendenza principale di α da Q provenga dalla variazione della PES (si trascura la variazione di µ); usando anche il fatto che si parte dal minimo della PES dello stato fondamentale si ha infine

I'∝ (ω −ω I )4

ω I

∂E1

∂QI

2

⇒


Ee,i Resonance Raman scattering

Interpretazione “euristica”: Poiché l’energia hν è sufficiente ad eccitare elettronicamente il sistema, la transizione non è più “virtuale”, ma reale

I'∝ (ω −ω I )4

ω I

∂E1

∂QI

0

2

Successivamente il sistema torna sullo stato elettronico fondamentale, con le velocità acquisite; l’ampiezza di vibrazione a frequenza ωI sarà proporzionale a queste velocità, e quindi a ⇒ Saranno maggiormente amplificati i modi con maggiore valore di

Sullo stato eccitato, il sistema si trova fuori equilibrio e acquista una velocità che in prima approssimazione è proporzionale alle forze che sente; riferito a un singolo modo normale, la forza è precisamente il gradiente della PES di stato eccitato rispetto alla coordinata Q calcolata nel minimo della PES fondamentale,

∂E1 /∂QI

∂E1 /∂QI


La DFT è in grado di calcolare molto bene gli spettri Raman

⇒rende possibile l’identificazione e assegnazione delle bande vibrazionali a specifici modi di vibrazione

Ma come si usano queste informazioni?

Come si possono utilizzare i dati vibrazionali per acquisire informazioni strutturali?


La frequenza dei modi vibrazionali localizzati su specifici legami (ad es C=O, C=C, C=N) è linearmente correlata con la lunghezza del legame ⇒ La misura Raman da un’informazione diretta sulla struttura del cromoforo

La frequenza di C=O (IR attivo) e il C=C (Raman attivo) sono correlati con lo stato di protonazione del cromoforo (distinguono anioni da neutri), mentre C=N è correlato con il “colore” ⇒ ulteriori informazioni sulla proprietà strutturali/ottiche

Correlazione frequenze-struttura


Glu222 Ser205

Excitation Energy (eV)

quinonoid

benzenoid

Chr

omop

hore

geo

met

ry (B

LA)

mod

e fre

quen

cy (c

m-1

)

C=O

C=C

La relazione lineare tra le frequenze dei modi C=C (C=O) e la struttura esiste anche all’interno delle proteine, e implica una correlazione tra frequenze e “colore”: ωC=O e ωC=C sono linearmente correlate alla BLA La BLA è correlata all’energia di eccitazione ⇒ Frequenze ed energie di eccitazione sono correlate!


Neutral-like (benzenoid)

anionic-like (quinonoid)

La correlazione lineare tra frequenza del modo C=C ed energia di assorbimento è stata esperimentalmente misurata, e c’è accordo con la teoria ⇒ Dalla misura delle frequenza del modo C=C si può risalire alle proprietà elettroniche e a quelle strutturali (interazioni tra cromoforo e amminoacidi nel sito attivo)

teoria

esperimento


Relazione lineare tra frequenze dei modi localizzati (~1500-1800cm-1) e lunghezze dei legami corrispondenti Frequenze (e quindi lunghezze di legame) finemente dipendenti dall’environment chimico ⇒ gli spettri Raman (o IR) potrebbero essere usati, al pari degli spettri NMR, per porre vincoli sulla struttura ⇒Determinazione indiretta della struttura! Di recente sta prendendo piede la spettroscopia IR 2D, dove, similmente a quello che si fa con l’NMR, si misurano mappe di correlazione tra coppie di modi, che sono molto più selettive e informative degli spettri unidimensionali

Problema: questa tecnica è facilmente utilizzabile solo per i modi localizzati

Mappa 2D dei modi amide per diverse strutture secondarie

Conformational changes in fluorescent proteins studied by Raman

Raman scattering: from excitations to

conformational properties

ON OFF

switching

switching

514

kT 416

N

N O

H O N N

O O

Fluorescent proteins

Results: synthetic cromo-phores and folded proteins

Conclusions

BFPF EYQ1

IN ON OFF

switching

switching

photoactivation

† bleaching

Photophysics of Fluorescent Proteins

0.13

0.12

0.11

0.10

0.09

0.08

0.07

0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0.00

600 550 500 450 400 350 300

T=0' (totally relaxed)

T=15', 20 mW @ 514 nm

T=1', 40 mW @ 416 nm

T=+60' relaxation after react

Wavelength (nm)

Abs

orba

nce

EYQ1 pH 8.5

X

Photochromic Fluorescent Proteins

Photochromic Fluorescent Proteins

K. A. Lukyanov et al., Nat Rev Mol Cell Biol 6, 885 (2005)

Selective photolabeling

R. A. G. Cinelli et al., Appl. Phys. Lett. 79, 3353 (2001)

Optical memories

Dedecker, P. et al., JACS 129, 16132 (2007)

Sub-diffraction imaging

(STED, RESOLFT)

NEUTRAL ANION

Reversible photophysics/chemistry

CIS TRANS

Photochromism Mechanisms

BFPF EYQ1

250 300 350 400 450 500 550 6000,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

Asso

rban

za

Lunghezza d'onda (nm)

psGFP in DEA, pH = 8.3 psGFP, pH = 8.3,

dopo 60 min irraggiamento

400 410 4200,0000,0020,0040,0060,0080,010

240 270 300 330 360 390 420 450

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

Asso

rban

za

Lunghezza d'onda (nm)

BFPF in DEA, pH = 8.3 BFPF in DEA,

dopo 1 h irraggiamento

EYQ1 EYQ1

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Inten

sity

(a.u

.)

cBFPFExperiments

Theory

Energy (cm-1)

Raman on Chromophores: cBFPF

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Inten

sity

(a.u

.)

cBFPFExperiments

Theory

Energy (cm-1)


350nm

(a)

(b)

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Inten

sity

(a.u

.)

cBFPF

cBFPFExperiments

tBFPF

(LB-B3LYP pre-resonance)

Theory

Energy (cm-1)

tBFPF

(c)

(d)

(GB-B3LYB pre-resonance)


1000 1500

1000 1500

1000 1500

1000 1500

(b)

Inten

sity

(a.u

.)

cCFP

cCFPExperiments

tCFP

(d)


Theory

Energy (cm-1)

tCFP

Inten

sity

(a.u

.)

cGFP

cGFPExperiments

tGFP

(a)

(c)


Theory

Energy (cm-1)

tGFP(GB-B3LYB pre-resonance) (GB-B3LYB pre-resonance)

Raman on Chromophores: cGFP and cCFP

Raman on Chromophores: Conclusions

•Similar results on chromophores of BFPF, GFP and CFP

•Synthetic chromophores are

photochromic

•Identification of peaks in the Raman spectra of native and photoconverted

forms

•Photoconverted form is a trans isomer

Raman on Proteins: Preresonance Conditions

250 300 350 400 450 500 550 600 650

laser Ar-Kr A

bsor

banc

e

Wavelength (nm)

EYQ1 in DEA, pH = 8.3 BFPF in DEA, pH = 8.3

Ar laser

Ar-Kr laser

1000 1200 1400 16001000 1200 1400 1600

Inte

nsity

(a. u

.)

Raman shift (cm-1)

Inte

nsity

(a. u

.)

Raman shift (cm-1)

BFPF ~0.2mM pH=8.3

* * * # %

CH 3 N N

O

CH 3

cBFPF

*

cGFP ~1mM in H2O pH=9.9

Protein: EYQ1 0.3mM pH=8

CH 3 O

N N

O

CH 3

1200 1600Raman shift (cm-1)

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Inten

sity

(arb

. uni

ts)

Raman shift (cm-1)

CH 3 N N

O

CH 3

cBFPF (Chromo-

phore)

(Protein) BFPF ~0.2mM pH=8.3

* * * # %

Raman on Proteins: BFPF

1200 1600Raman shift (cm-1)

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Inten

sity

(arb

. uni

ts)

Raman shift (cm-1)

CH 3 N N

O

CH 3

CH 3 N

N O CH

3

cBFPF

tBFPF

(Chromo-phore)

(Protein)

BFPF Photoconverted

BFPF ~0.2mM pH=8.3

* * * # %

Raman on Proteins: BFPF

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Inten

sity

(arb

. uni

ts)

Raman shift (cm-1)

CH 3

O N

N

O

CH 3

*

cGFP ~1mM in H2O @ pH=9.9

Protein: EqGFP ~0.3mM pH=8

Raman on Proteins: EYQ1

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Inten

sity

(arb

. uni

ts)

Raman shift (cm-1)

H O

CH 3 N

N O CH

3

CH 3

O N

N

O

CH 3

*

cGFP ~1mM in H2O @ pH=9.9 tGFP ~2.5mM in acetonitrile

Protein: EYQ1 ~0.3mM pH=8 Photoconverted form (@ 514nm ~50mW ~30min)


1200 1500 1600Raman shift (cm-1)

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Inten

sity

(arb

. uni

ts)

Raman shift (cm-1)

H O CH 3 N

N

O

CH 3

H O

CH 3 N

N O CH 3 cGFP

tGFP

(Chromophore)

(Protein)

Chromophore in acetonitrile

Photoconverted protein @ pH=8

EYQ1 ~0.1mM pH=4.7


1200 1500 1600Raman shift (cm-1)

(Chromophore)

(Protein)


trans

cis

BFPF: cis trans

•Synthesized chromophores are photochromic

•Raman spectra of native and photoconverted forms cis-trans transition

•Raman spectroscopy addresses the chromophore states in photoswitchable fluorescent proteins

514 kT

416

X N

N O

H O

A B N N

O O

N N

O H O

pK=6.86

pH=8 EYQ1:

Conclusions


Quindi: il modo a ~700(730)cm-1 può essere usato come fingerprint per la rivelazione della transizione cis-trans, anche eventualmente in proteina, a patto di poter misurare accuratamente gli spettri Raman in quella zona Incidentalmente (ma non troppo) lo stesso modo a ~700cm-1 è quello che si estrae dai picchi vibrazionali dello spettro di fluorescenza

∆λ~17nm ∆E~87meV hν~700cm-1

Questo modo quindi risulta essere strettamente correlato con l’eccitazione elettronica, cioè gli spostamenti atomici collegati ad esso sono “attivati” dall’eccitazione elettronica. Infatti, non a caso, l’isomerizzazione cis-trans avviene in seguito ad eccitazione elettronica

Spettroscopia vibrazionale Tipo di tecnica Proprietà

elettroniche Proprietà strutturali Risoluzione

Proprietà vibrazionali e dinamiche

Raggi X Diffrazione

Mappa di densità elettronica

Posizioni degli atomi pesanti; ~Å

Neutroni Diffrazione Posizioni atomiche; ~Å

NMR Misura dello spostamento chimico

Posizioni atomiche, ottenute adattando modelli ai vincoli ricavati dai dati sperimentali; pochi Å

Strutture alternative dovute alle fluttuazioni termiche o piccole transizioni strutturali

Microscopia (crio-)elettronica

Mappa di densità elettronica

Posizione dei Cαo dei P; ~10Å

Strutture alternative dovute a transizioni strutturali

Spettroscopia ottica-UV Assorbimento o Fluorescenza

Spettro dei livelli energetici elettronici

Indicazioni indirette, derivanti dal confronto con la teoria

Indicazioni su variazioni strutturali, dal confronto con la teoria A bassa temperatura, frequenze dei modi vibrazionali correlati con l’eccitazione

Spettroscopia IR Assorbimento


Spettro vibrazionale dello stato fondamentale

Spettroscopia Raman Diffusione inelastica di radiazione EM


Spettro vibrazionale dello stato fondamentale Indicazioni su variazioni strutturali dal confronto con la teoria


Teoria-modelli

r-X neutroni CrioEM NMR Spettr ottica-

UV

IR Raman Struttura

Variazioni strutturali Dinamica

Livelli elettronici

Struttura vibrazionale

Sinergie tra tecniche


SERS cromoforo

Surface Enhanced Resonance Raman (SERS)

SERS proteina

La luce incidente eccita plasmoni di superficie, della sferetta, la cui frequenza si aggira intorno a 500 cm-1, a seconda delle dimensioni Questi creano un campo elettromagnetico locale che è anche più di 3 ordini di grandezza maggiore di quello esterno, e che interagisce con le vibrazioni della molecola Questo risulta in un sensibile aumento del campo effettivo, e quindi del segnale Raman, per frequenze vicine a questi valori ⇒ Amplificazione del segnale proprio nella regione di interesse

Le bande a bassa frequenza (300-700 cm-1), che sono anche le più caratterizzanti di una struttura, hanno solitamente intensità Raman molto bassa È possibile amplificarle selettivamente con una tecnica che prevede che le molecole (cromofori o proteine) siano legati (o adsorbiti) a sferette metalliche in sospensione acquosa

Raman cromoforo

Risonanze plasmoniche La tecnica: dal Raman al SERS

J.Fe

ldm

ann

et a

l, N

ano

Lett

. 200

7,7

(9) 2

753-

2757

W. Rechberger et al. Opt. Comm. 220 (2003)

30 100 nm

SER(R)S

SEM images of deposited silver sol

100nm

20nm

1µm

200nm

SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy): Surface plasmon enhance electric field; chemical effects

Singola molecola in hot spot

S. Nie, S. R. Emory, Science 275, 1102 (1997)

SERS

Oltre al fattore elettrico, l’aumento del segnale Raman è portato anche, in minor parte, da un “fattore chimico”, in cui si considera una transizione mediata dall’accoppiamento con il gas elettronico nel vicino metallo: oltre allo scambio di fotoni, si considera nel singolo processo di diffusione anche un possibile scambio di elettroni.

( ) ( )( ) o

3

o

o Er2εωεεωεωP

+−

∝

. r

d

Au or Ag nanoparticle

ε(ω) – frequency complex dielectric constant

SERS EFFECT: METALLIC NANOPARTICLES

If Re[ε(ω)] = -2εo {real part of ε(ω)} and the imaginary part of ε(ω) is small, the dipole moment (hence the local electric field) will be significantly enhanced.

( )

+−

+=γωω

εωεi

fo 2

Higher enhancement close to tips or between nanoparticles in aggregrates

( )3

drr ωP~

+∝

frequency dependent dipole moment of a spherical nanoparticle

Eo – incident electric field from laser beam

“perfect” metals (free electrons)

Behaviour of “induced” electric field:

lineare: non lineare: generazione di seconda...

Documents