MINISTRIO DA SADE Hospital Regional Santiago Norte

MANUAL DO LABORATRIOMANUAL DO PROTOCOLO TCNICAS REALIZADAS NO LABORATRIO DE ANLISES CLNICAS DO HOSPITAL REGIONAL SANTIAGO NORTE

Elaborado por: CECLIO MENDES PIRES

NDICE 1 Regras Bsicas Da Lavagem Dos Materiais Do Laboratrio 2 Principais Tcnicas Usadas Em Hematologia Matrias e amostras para cada tcnica Grupo sanguneo em lminas e em tubos Hemograma completo Leucograma Frmula leucocitria colorao de Wright Gota espessa teste rpido e no esfregao v gota espessa Reticulcitos Pesquisa clulas falciformes Velocidade sedimentao globular VSG Coagulograma completa Coombs Indirecto

3 Principais Tcnicas Usadas Em Bioqumica 3.a Serologia VDRL WIDAL PCR Factor Reumatide (FR) TASO 3.b Determinaes bioqumicas Glicemia Ureia Triglicerdeos cido rico Colesterol total e fraces HDL, LDL GOT/ASAT, GPT/ALAT e GGT as transaminases. Bilirubina Total e Directa Protenas totais Creatinina Fosfatase alcalina Alfa amilase Ionograma Cloro, Potssio, Sdio Ferro Srico 3.c testes rpidos HIV Determine v Bioline AgHBs Hepatite B 4 Principais Tcnicas Usadas Na Anlise Da Urina Fita reactiva Sedimento urinrio

Teste Gravindex Pigmentos biliares

5 Principais Tcnicas Usadas Na Anlise Parasitolgica Tcnica de Willis concentrao em soluo salina. 6 Principais Tcnicas Usadas Na Anlises Bacteriolgica o o o o Baciloscopia BK Exsudato vaginal Colorao de Gram Anlise do LCR

7 Protocolo de preparao dos principais reagentes

1 REGRAS BSICAS DE LAVAGEM DOS MATERIAIS Uma boa lavagem dos materiais que se utilizam diariamente no laboratrio de vital importncia para a obteno dos melhores e fidedignos resultados das anlises que se executam diariamente. Por isso, para ter os materiais ptimas condies de assepsia convm seguir o seguinte: obrigatrio o uso de batas e luvas: No reservatrio despejar todos os resduos (o sangue e outros produtos biolgicos para um frasco de resduos biolgicos e depois lavar com gua corrente: Lavar todos os materiais pea por pea (nunca vrios ao mesmo tempo) com gua, detergente e lixvia, usando o escovilho, e retirar todos os nmeros: Deixar todos os materiais imersos dentro do recipiente com gua e lixvia durante 30 45 minutos. Passando o tempo enxaguar 4 vezes os matrias com gua limpa para uma completa remoo da espuma: Deixar mais 15 minutos dentro da gua destilada morna: Passando o tempo, retirar os materiais e separar nos suportes em matrias de vidros e plsticos e deixar secar a temperatura ambiente: Ligar a estufa a 180 C, e depois de seco, colocar o suporte ou cestos com os materiais de vidros na estufa com a temperatura de 180 C durante 30 minutos. Baixar a temperatura da estufa para 50 C e introduzir o outro suporte, ou cestos com os materiais de plsticos durante 30 minutos. Retirar os materiais esterilizados e arrumar (no misturar com as que ainda no esto esterilizados). 2 PRINCIPAIS TCNICAS USADAS EM HEMATOLOGIA Matrias e amostras para cada tcnica Em hematologia a maioria das tcnicas usa-se o sangue total colhido quer em tubos tampa azul com EDTA (hemograma, grupo sanguneo, gota espessa, leucograma, etc.), ou o tubo tampa laranja com citrato trisdio (VSG, tempo protombina, etc.) ESTABILIDADE DAS AMOSTRAS As amostras devem ser processada o quanto antes. As recolhidas com EDTA-K3 podem permanecer em boas condies se estiver no frio durante 24 horas. O VSG deve ser processado antes das 3 4 horas. Os soros ou plasma se no se vai processar nas primeiras horas, podemos congelar e descongel-las no momento e dia em que ir se processar.

DETERMINAES Hematcrito Hemoglobina Leucograma/hemograma Reticulcitos Plaquetas Grupo sanguneo

TIPO DE AMOSTRA

Sangue recolhido em EDTA-K3 (2gotas de EDTA-K3 por cada 5 ml de sangue)

Velocidade

sedimentao

globularVSG Sangue recolhido com citrato (0,5 ml de citrato trisdico 0,105M por cada 2 ml de sangue)

Tempo protrombina Tempo tromboplastia parcial

Sangue recolhido com citrato (0,5 ml de citrato trisdico 0,105M por cada 4,5 ml de sangue) Centrifugar e separar o plasma

Gota espessa e esfregao sanguneo

Uma gota de sangue recolhida sem anticoagulante (no acto da colheita) ou com EDTA-K3.

Determinaes bioqumicas

Sangue recolhido sem anticoagulante Deixar coagular (T. ambiente ou Banho-maria) Centrifugar e separar o soro

Grupo sanguneo em lminas

Amostra: sangue total em tubos com EDTA, ou picada digital. Materiais: 2 lminas, reagentes Anti-A, Anti-B, Anti-AB e Anti-D; um misturador. Colocar quadro gotas de sangue em separado nas duas lminas e colocar em cada gota um dos reagentes; Misturar bem e ler aps 2 minutos vendo se (h - positivo ou no negativo) aglutinao.

Figura 1 Distribuio das amostras/tipo reagente na determinao GS. Grupo sanguneo em tubos A determinao do grupo sanguneo em tubos a forma mais segura da fenotipagem do grupo sanguneo. Esta engloba a prova celular que determina os antigenos presentes e a prova srica que determina os anticorpos. 1 Preparar uma suspenso de Clulas de fentipo conhecido, isto , A, B e O, para a prova srica. Em 3 tubos colocar 1 gota de sangue conhecida e encher com o soro fisiolgico at a marca e misturar delicadamente e centrifugar a 3000 rpm, durante 5 minutos, decantar o sobrenadante; Encher de novo com soro fisiolgico e centrifugar e executar os mesmos procedimentos durante 3 X. PROVA CELULAR Preparar num tubo uma suspenso de clulas (1 gota sangue + 9 gotas de soro fisiolgico). Para cada amostra preparar 4 tubos enumerados em A, B, AB e D por cada amostra. Adicionar a cada tubo os respectivos reagentes Antis. Adicionar a estas 1 gota da suspenso preparada em cima. Misturar e centrifugar a 1000 rpm, 1minutos e ler a consoante a graduao: 4 + -1boto; 2+ ---- disperso: aglutinao fraco.

PROVA SRICA Da suspenso preparada a partir do fentipo conhecido (A; B; O) Preparar 3 tubos por cada amostra, enumerando as em A, B e O;

Pegar no tubo da amostra a fenotipar contendo plasma ou soro, colocar 1 gota em cada tubo e em seguida juntar a estas 1 gota de suspenso conhecida nos respectivos tubos; Misturar e centrifugar a 1000 rpm, 1minutos e ler a aglutinao, consoante a graduao: 4 + -- 1boto; 2+ ---- disperso: aglutinao fraco.

Hemograma completo Num contador automtico, aps ter feito a colheita de sangue total para um tubo com anticoagulante (EDTA); Ligar o aparelho at que esteja pronto, mistura-se o sangue, introduza-se todos os dados da amostra e passa-se o sangue; Imprima-se os resultados e ver se ficou bem distribudo. Aquelas que a frmula no ficar bem distribudo, coram o esfregao e faz-se manualmente. Leucograma a contagem total (quantitativo) e diferencial (qualitativo) dos glbulos brancos. Num tubo de vidro ou plstico junta-se 400 microlitro de reagente de TURK + 20 microlitro de sangue total (retirar o excesso de sangue da pipeta antes de misturar); Homogeneza-se e aps 2 minutos monta-se a Cmara de NEUBAUER; Deixar sedimentar e observar com a objectiva de 40 X e fazer a contagem do total dos leuccitos presentes. Se fizermos a contagem num campo s, expressa-se os resultados em WBC = n. contados * 200 para 1 campo; WBC = n. contados * 100 para 2 campos; WBC = n. contados * 50 para 4 campos. Frmula leucocitria colorao de Wright Fazer o esfregao a partir do sangue sem contacto com anticoagulantes (de preferncia); Secar o esfregao, enumerar e colocar no suporte de colorao; Cobrir o esfregao com a soluo de Wright, aps 1 minutos diluir com gua tamponada; Deixar mais 14 minutos e passando o tempo, lavar com gua corrente; Limpar o fundo de modo a retirar o resto de corante e secar ao ar; Observar ao microscpio 100X e contar 100 clulas e distribuir em N + L + M + E + B + NB. Gota espessa teste rpido Utilizado na pesquisa dos parasitas que causam a malria: Plasmodium falciparum, malarie, ovale, vivax.

Num mini cuvete adiciona-se 4 gotas do tampo, e na fita do teste na parte apropriada uma gota de sangue, colhida com a mini-pipeta prpria do kit; Adiciona-se na zona de teste e imerge-se no tampo de modo a correr por capilaridade; Aps 15 minutos ler os resultados, em positivo 2 traos (C + T), e 1 trao negativos (s C). O trao do C controle tem de aparecer, caso contrrio h que repetir o teste porque este no vlido. Gota espessa no esfregao v gota espessa Desinfecta-se o dedo ou o antebrao com lcool 70%; com uma lanceta (pica-se o dedo) despreza-se a primeira gota e colocar a outra sobre 2 lminas (uma lmina para o esfregao e outra para gota espessa); Ou com uma seringa retirar o sangue do antebrao e distribuir da mesma forma; Fazer um movimento circular para a gota espessa de momo a espalhar o sangue. Secar os 2 e corar com Giemsa diludo. Fixar o esfregao com metanol 1 minuto depois cobrir com giemsa durante 20 minutos; Lavar retirar o corante e secar, observar com a objectiva de 100X. Conta-se 100 eritrcitos e ver quantos que esto parasitados, e destas expressar o nvel da parasitmia. Reticulcitos Importante prova nos estudos das anemias hemolticas. Caso das anemias falciformes, talassmias e outras hemoglobinopatias. Num tubo de vidro ou plstico juntar 5 gotas de sangue total + 5 gotas da soluo de cresil brilhante; Misturar e incubar durante 15 minutos a 37 C numa estufa; Passando o tempo retira-se e faz o esfregao, secar e observar em objectiva de 100X. Conta-se X eritrcitos e destas quantos que tinham o ncleo. Pesquisa clulas falciformes Utilizada para a pesquisa das anemias de clulas falciformes ou drepanocitose. Pode-se montar de manh, ler no final do dia, 12 horas ou 24 horas depois. Numa lmina colocar no centro uma gota de sangue, juntar a esta 1 gota do metabissulfito de sdio 2%; Misturar e cobrir com uma lamela, e incubar numa cmara hmida ( uma caixa com papel absorvente e molh-la de forma a ficar hmida); Fechar a cmara e ler o resultado aps 12, ou 24 horas. Velocidade sedimentao globular VSG

A sedimentao das hemceas depende de factores plasmticos fundamentalmente de fibrinognio e outras protenas (PCR, alfa 1 antitripsina, haptoglobina, ceruplasmina, etc.) e outros factores como a forma das hemceas e o seu volume. uma determinao pouco especfica visto que altera em um grande nmero de situaes patolgicas e fisiolgicas (gravidez). Esta til fundamentalmente para prever a progresso ou regresso de uma doena e a resposta ao tratamento. Agita-se suavemente a amostra, invertendo o tubo vrias vezes e com cuidado; Introduza-se o tubo Westergren e puxar o sangue para cima at a marca de 0 (Zero); Colocar o tubo sobre o suporte na posio completamente vertical; Marcar o tempo e ler aps 1 h ou 60 minutos. Ver no tubo graduado at onde alcanam as hemceas sedimentadas, e expressar o resultado em: X mm/1h. Coagulograma completa So conjuntos de provas que demonstram a capacidade das plaquetas de aderirem ao endotlio vascular e formar o trombo plaquetrio que cessem uma hemorragias de um vaso de pequeno calibre. Consiste portanto, em efectuar uma pequena ferida e medir o tempo que leva a sangrar. Estas incluem: Tempo Hemorragia No lbulo de uma das orelhas livre de qualquer objectos (piercing, brincos etc.), com algodo e lcool 70% desinfectar suavemente; Deixar evaporar completamente o lcool; Com uma agulha, lanceta estril, fazer uma inciso (picar) rpida, e cronometrar o tempo; Deixar sair o sangue livremente e com o papel de filtro a cada 30 segundos limpar as gotas de sangue at a ltima gota; Quando cessar a hemorragia, registar o tempo percorrido. Tempo Coagulao Faz-se recorrendo a puno venosa. Prepara-se 2 tubos; Com um seringa e agulha estril, retirar 1 ml de sangue e distribuir pelos 2 tubos; Incubar no banho-maria a 37 C e marcar o tempo; Ver os tubos de 30 em 30 segundos; Registar o tempo em que ambos os tubos se coagularem completamente. Caso os 2 coagularem em tempo diferente faz-se o registo dos diferentes tempos e calcula-se a mdia. Tempo Protombina Tempo Tromboplastia Parcial

Fibrinognio

Coombs Indirecto um teste utilizado na pesquisa e identificao de anticorpos irregulares (IgG); variantes de D fraco (Du O -); na realizao de provas de compatibilidade. AMOSTRA: soro com menos de 48 horas (4 C). PAINEL Faz-se o painel de um grupo O + (positivo), que so 3 gotas de sangue e juntar o soro fisiolgico at a marca, misturar e centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos; Descartar o sobrenadante e encher de novo com o soro fisiolgico e centrifugar nas mesmas condies; Fazer a lavagem 4X. SUSPENSO do O+ Pegar no painel e num tubo deitar 1 gota do painel e 9 gotas do soro fisiolgico e misturar. Num outro tubo deitar 2 gotas do soro do doente a testar; Juntar a esta uma gota de suspenso do O+ e misturar; Incubar 15 minutos a temperatura de 37 C (banho-maria ou estufa); Passando o tempo retira-se e lava-se 4 X com o soro fisiolgico e na ltima lavagem desprezar todo o soro fisiolgico com cuidado; Juntar ao boto 2 gotas de AHG (Anti Human Globin). Misturar e centrifugar 20 segundos a 1000 rpm; Passando o tempo, misturar e com uma pipeta colocar algumas gotas numa Lmina e examinar ao microscpio ler a aglutinao em Positivo ou Negativo. 3 PRINCIPAIS TCNICAS USADAS EM BIOQUMICA Em bioqumica tanto a serologia, determinaes qumicas ou testes rpidos podese usar soro ou plasma dependendo das provas que iremos realizar. 3.a Serologia VDRL

um teste serolgico utilizado para a pesquisa de anticorpos anti treponmicos (T. pallidum), bactria causadora da sfilis. Numa placa branca ou transparente, adiciona-se 1 gota (50l) de soro ou plasma e a esta juntar 1 gota do reagente (BIOTEC RPR kit Carbon Antigen); Misturar e agitar por movimentos rotativos durante 8 minutos e ver se h ou no aglutinao. Para os casos positivos fazer a titulao com o soro fisiolgico. Coloca-se 1 gota (50l) de soro fisiolgico a cada poo (6); com uma pipeta adicionar no 1 poo 1 gota (50l) do soro/plasma, misturar e passar de um para o poo 2 1 gota (50l) e assim sucessivamente a todos os 6. Adicionar 1 gota (50l) do reagente, misturar e ver at onde positivo. Se no for nenhum: diz-se VDRL positivo com ttulo negativo; caso contrrio dar o ultimo ttulo positivo.

WIDAL

um teste serolgico utilizado para a pesquisa de anticorpos anti Salmonella typhi e paratyphi. Reagentes: o Humatex Febrile Antigen ST H, HA, HB e HC e paratyphi O, AO, OB e OC. Numa placa de cristal prpria coloca-se 20l de soro (plasma no) em cada 1 dos 8 poos e espalhar. Numa fila colocar os reagentes do thyphi (Hs) e na outra fila o dos parathyphi (Os). Misturar e ler a aglutinao antes de 1 minuto. Para os casos positivos fazer a diluio com o soro fisiolgico (20l de soro + 20l de soro fisiolgico em cada poo igual a d VDRL) s para a espcie positiva. Se no for nenhum: diz-se WIDAL positivo com ttulo negativo; caso contrrio dar o ultimo ttulo positivo.

PCR a pesquisa da Protena srica reactiva que reage com o anti humana CRP do reagente. um teste sensvel e indicador de um processo inflamatrio, febre reumtica, ou alguma fase aguda da artrite reumtica. E a sua determinao pode ser usada no controle teraputico. Pode-se usar soro ou plasma. Numa placa preta junta-se uma gota de soro/plasma + 1 gota do reagente. Misturar e ler a aglutinao aps 2 minutos. Informar os resultados em Positivos ou negativos. Nos casos positivos fazer a diluio (ver diluente) e dar o ttulo consoante a diluio. Factor Reumatide (FR) Pode-se usar soro ou plasma. Numa placa preta junta-se uma gota de soro/plasma + 1 gota do reagente. Misturar e ler a aglutinao aps 2 minutos. Informar os resultados em Positivos ou negativos. Nos casos positivos fazer a diluio (ver diluente) e dar o ttulo consoante a diluio. TASO / ASO

um kit utilizado para a determinao quantitativa e qualitativa da Antiestreptolisina O no soro no diludo. Valores aumentados/Positivos do TASO pode estar associado a febre reumatide e glomerulonefritis. Valor superior a 200 IU/ml poder indicar uma infeco aguda estreptoccica. Pode-se usar soro ou plasma. Numa placa preta junta-se uma gota de soro/plasma + 1 gota do reagente. Misturar e ler a aglutinao aps 2 minutos. Informar os resultados em Positivos ou negativos. Nos casos positivos fazer a diluio (ver diluente) e dar o ttulo consoante a diluio. 3.b DETERMINAES BIOQUMICAS (in. HUMANLIZER) GLICMIA

til no diagnstico, controle das Hiper e hipoglicmias. Pode-se usar tanto o soro como o plasma livre de hemlise e a absorvncia lida a 490 550 nm. A glicose oxidase cataliza a oxidao da glucose a cido glucnico. A intensidade da cor directamente proporcional a concentrao de glucose no sangue. Preparar os tubos em: Branco + Padro + Amostras Adicionar a todos 1 ml do reagente Ao tubo padro adiciona-se 10l do padro e a mesma quantidade de soro ou plasma e aos tubos de amostra.

Misturar e incubar 10 minutos a 37 C, ou 30 minutos a temperatura ambiente; Ler a absorvncia 1 o Branco para Zerar o aparelho, 2 o Padro e 3 as Amostras. A Concentrao obtm-se dividindo a absorvncia da amostra pelo do padro multiplicando por 100 (que a concentrao do padro). Valores referncia:

UREIA

til no diagnstico, controle das insuficincias renais. Preparar os tubos em: Branco + Padro + Amostras Adicionar a todos 1 ml do reagente 1 RGT1. Ao tubo padro adiciona-se 10l do padro e a mesma quantidade de soro ou plasma e aos tubos de amostra. Misturar e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, passando o tempo adiciona-se 1 ml do RGT 2 a todos os tubos, misturar e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos, passando o tempo ler a absorvncia a 530 nm, 1 do branco, 2 padro e depois as amostras. A Concentrao obtm-se dividindo a absorvncia da amostra pelo do padro multiplicando por 80 (que a concentrao do padro). Valores referncia:

TRIGLICERDEOS

til no diagnstico, controle das Preparar os tubos em: Branco + Padro + Amostras Adicionar a todos 1 ml do reagente Ao tubo padro adiciona-se 10l do padro e a mesma quantidade de soro ou plasma e aos tubos de amostra. Misturar e incubar 10 minutos a 37 C, ou 30 minutos a temperatura ambiente; Passando o tempo ler a absorvncia a 530 nm, 1 do branco, 2 padro e depois as amostras. A Concentrao obtm-se dividindo a absorvncia da amostra pelo do padro multiplicando por 200 (que a concentrao do padro). Valores referncia:

CIDO RICO

til no diagnstico, controle da doena da Gota. Preparar os tubos em: Branco + Padro + Amostras Adicionar a todos 1 ml do reagente Ao tubo padro adiciona-se 20l do padro e a mesma quantidade de soro ou plasma e aos tubos de amostra. Misturar e incubar 10 minutos a 37 C, ou 30 minutos a temperatura ambiente; Passando o tempo ler a absorvncia a 530 nm, 1 do branco, 2 padro e depois as amostras. A Concentrao obtm-se dividindo a absorvncia da amostra pelo do padro multiplicando por 8 (que a concentrao do padro). Valores referncia:

COLESTEROL TOTAL

til no diagnstico, controle das Preparar os tubos em: Branco + Padro + Amostras Adicionar a todos 1 ml do reagente Ao tubo padro adiciona-se 10l do padro e a mesma quantidade de soro ou plasma e aos tubos de amostra. Misturar e incubar 10 minutos a 37 C, ou 30 minutos a temperatura ambiente; Passando o tempo ler a absorvncia a 530 nm, 1 do branco, 2 padro e depois as amostras. A Concentrao obtm-se dividindo a absorvncia da amostra pelo do padro multiplicando por 200 (que a concentrao do padro). Valores referncia: FRACES HDL, LDL GOT/ASAT, GPT/ALAT e GGT as transaminases. BILIRUBINA TOTAL E DIRECTA PROTENAS TOTAIS

til no diagnstico, controle das Preparar os tubos em: Branco + Padro + Amostras

Adicionar a todos 1 ml do reagente Ao tubo padro adiciona-se 20l do padro e a mesma quantidade de soro ou plasma e aos tubos de amostra. Misturar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente; Passando o tempo ler a absorvncia a 530 nm, 1 do branco, 2 padro e depois as amostras ler antes dos 30 minutos. A Concentrao obtm-se dividindo a absorvncia da amostra pelo do padro multiplicando por 7 (que a concentrao do padro). Valores referncia: Crianas recm nascidos: 4,6 7,0 g/dl, Adultos e crianas de 3 anos 6,6 8,7 g/dl. CREATININA FOSFATASE ALCALINA ALFA AMILASE IONOGRAMA CLORO, POTSSIO, SDIO FERRO SRICO

3.c testes rpidos HIV. Normalmente usa-se os 2 testes: uma altamente sensvel Determine, e um outro altamente especfico Bioline. O DETERMINE informa-nos se a pessoa tem ou no o vrus, isto , diz-nos se ou no positivo, enquanto que o BIOLINE faz-nos a serotipagem do vrus. DETERMINE Identificar a tira do teste com o cdigo ou o nmero da amostra; Retirar a cobertura com cuidado para no tocar na parte reactiva; Com uma micropipeta, pipetar 50l do soro ou plasma e aplicar na parte indicada conforme a figura: Aps 15 minutos ler os resultados, em positivo 2 traos (C + T), e 1 trao negativos (s C). O trao do C controle tem de aparecer, caso contrrio h que repetir o teste porque este no vlido. HIV DETERMINE V BIOLINE til no diagnstico, controle das infeces pelo vrus da imunodeficincia humana

BIOLINE Para os casos positivos a que identificar de que serotipo se trate. Retirar um kit teste identificar e colocar na zona teste 10l do soro ou plasma e juntar a esta 4 gotas do tampo, ver figura. Aps 15 minutos ler os resultados, em positivo 2 traos (C + T1 ou C + T2, ou C + T1-2 infeco misto), e 1 trao negativos (s C). O trao do C controle tem de aparecer, caso contrrio h que repetir o teste porque este no vlido.

AgHBs HEPATITE B

4 Principais Tcnicas Usadas Na Anlise Da Urina Fita reactiva Sedimento urinrio Teste Gravindex Pigmentos biliares

5 PRINCIPAIS TCNICAS USADAS NA ANLISE PARASITOLGICA TCNICA DE WILLIS CONCENTRAO EM SOLUO SALINA um mtodo que se baseia na flutuao dos ovos dos parasitas. Divide-se em duas partes: EXAME DIRECTO que consiste em adicionar a uma lmina uma gota de lugol e adicionar um pouco de fezes; Mistura-se e cobre com a lamela e observa-se ao microscpio com objectiva de 400X.

EXAME CONCENTRADO dissolve-se cerca de 5g de fezes a um tubo contendo soluo saturada de cloreto sdio (sal comum); Homogeneizar e completar o tubo com a soluo saturada de NaCl at formar um menisco convexo na boca do frasco. Coloca-se por cima uma lamela sobre as bordas para que fique em contacto com o lquido ao menos por 10 minutos; Passando o tempo, retira-se a lamela e coloca-se sobre uma lmina sem escorrer o lquido, observa-se ao microscpio. 6 PRINCIPAIS TCNICAS USADAS NA ANLISES BACTERIOLGICA o BACILOSCOPIA BK o mtodo de eleio para o diagnstico e controle da tuberculose. Possui uma especificidade muito elevada (100%), enquanto a sua sensibilidade de 50 80%. SEGURANA Devido a facilidade com que a tuberculose transmitida, h que tomar precaues para minimizar o risco de contgio dentro do laboratrio. No processamento das amostras: lavar sempre as mos, usar batas, usar mscaras adequadas, no comer nem beber, manter uma corrente de ar para arear as partculas infecciosas. RECOLHA AMOSTRAS De manh antes de lavar a boca, tossir para dentro do frasco estril. Ter o cuidado que se est a pr o escarro e no a saliva. So 3 amostras. A 1 no momento da consulta; as seguintes no dia seguintes. As amostras que no so processadas podem ser guardadas a temperatura ambiente at uma semana em locais seco, fresco e protegido da luz ou no frio. Ou ento podemos fazer o esfregao e fixar a chama ou metanol e guardar. PROCEDIMENTO Pegar numa lmina limpa (prpria para o BK); enumerar e identificar bem com um lpis; junto a uma chama (bico de Bunsen) abre o recipiente da amostra e com uma esptula estril toma-se um pouco da parte purulenta da amostra e estende-se sobre a lmina num movimento circular cobrindo uma rea oval; Aquece a esptula sobre o bico de Bunsen para eliminar o resto do material biolgico e o esfregao deixar secar ao ar livre. Uma vez seco, fixa-se sobre a chama, passando por cima umas 3 vezes. No local da colorao, colocar as lminas sobre um suporte e cobrir com fucsina por 5 minutos, aquecer com um ispodo de algodo com lcool, aquece-se por baixo at a emisso do vapor (fumo). Isto faz-se para que a fucsina penetre na parede celular da bactria; Lava-se as lminas com gua corrente com cuidado; retirar o excesso de gua e cobrir com a soluo lcool cido por 2 minutos; se no descorar bem, repete-se a

descolorao. O lcool cido descolora todos os microrganismos excepto os lcoois resistentes; Lava-se de novo com abundante gua e escorrer; Cobrir com o azul-de-metileno durante 2 minutos, lava-se com gua e retirar o excesso e deixar secar e limpar a parte posterior com algodo. Observar a preparao com a objectiva de imerso, ao menos 100 campos durante 5 minutos. O Bacilo de tuberculose som bastonetes delgados de cor roxo sobre um fundo azul (Gram negativos); podem ser rectos ou curvos; em grupos ou individuais. Os n. de bacilos encontrados reflectem o grau de infeco, assim com a gravidade da doena. Guardar sempre as lminas negativas e principalmente as positivas para uma possvel confirmao, para o caso de controlo de qualidade; As amostras devem ser incineradas, ou ento inteiradas.

o EXSUDADO VAGINAL Existe 2 tipos: o exsudado urogenital (do meato urinrio) e o normal (parede da vagina) que dividido em exsudado simples e o exsudado com cultivo. Deve ser feito sempre pela manh antes que a mulher tenha feito a sua higiene ntima. Colher bastante material e coloc-lo num tubo estril contendo o soro fisiolgico.EXSUDADO SIMPLES

Estas incluem uma anlise a fresco onde incluem o Exame Citolgico: clulas, leuccitos, eritrcitos; Exame Parasitolgico: Trichomonas, e outros parasitas; Exame Micolgico: leveduras e identificar; e o Exame de Gram: classificar em flora normal (Lactobacillus Gram positivos) ou mista e informar os organismos. Com a mulher em cima de uma marquesa, deitada prepara-se 2 lminas e um tubo de vidro com um pouco de soro fisiolgico = 1 ml; Com uma . Colecta-se na parede da vagina um pouco da amostra e faz-se primeiro o esfregao (2) e depois deitar o isopodo no tubo com o soro fisiolgico. Prepara-se o exame a fresco que consiste em colocar uma gota da amostra sobre uma lmina e cobrir com a lamela e observar. E o esfregao colorar com a colorao de Gram e observar com a objectiva de imerso.EXSUDADO COM CULTIVO

A esta o procedimento igual, a nica coisa que se acrescenta a colheita da amostra para o meio de cultivo. O processamento igual, a nica que se acrescenta a cultura e anlise da mesma. o COLORAO DE GRAM

A realizao de uma colorao especfica o primeiro passo para a uma correcta identificao de uma dada bactria. So teis para o estudo da morfologia, comportamento das bactrias em relao aos corantes; e outras caractersticas especiais da bactria. A realizao do Gram permite uma primeira aproximao a classificao das bactrias presentes numa amostra, segundo a morfologia (cocos, bastonetes,) e colorao (positivas retm o primeiro corante roxo) ou (negativas as que perdem o primeiro e adquirem o 2 corante rosa). Aps ter o material (colheita a fresco, colnias de cultura, etc.), faz-se um esfregao do material e deixar secar a temperatura ambiente ou chamuscar no Bico de Bunsen; Cobrir a preparao com metanol durante 1 minutos; eliminar o lcool e deixar secar; Cobrir com a violeta de cristal durante 1 minutos; Lavar com gua; Cobrir com o lugol durante 1 minutos, lavar com gua Descorar com lcool-acetona (rpido para no descorar todas as bactrias); Lavar com gua e cobrir com a safranina durante 1 minutos; Lavar com gua, escorrer o excesso e deixar secar Observar ao microscpio. o ANLISE DO LCR

7 PROTOCOLO DE PREPARAO DOS PRINCIPAIS REAGENTES BACTERIOLOGIA Colorao em Baciloscopia (BAAR) ZIELH NEELSON FUCSINA Soluo A: 3 gr fucsina + 100 ml Etanol absoluto 6 gr fucsina + 200 ml Etanol absoluto Soluo B: 10 gr Fenol + 200 ml H2O destilada 45 gr Fenol + 900 ml H2O destilada Misturar 100 ml da Soluo A + 900 ml da Soluo B.

LCOOL CIDO 30 ml de HCL + 970 de Etanol Absoluto, ou 60 + 1940 ml. AZUL METILENO 0,3 gr + 100 ml de H2O Destilada, ou 3 gr + 1000 ml de H2O Destilada. COLORAO DE GRAM VIOLETA CRISTAL Soluo A: violeta cristal 2 gr + 200 ml de Etanol Absoluto Soluo B: Oxalato amnio 0,8 ou 16 gr + 80 ou 1600 ml de H2O Destilada. Misturar a soluo A e B. LUGOL Ioduro Potssio (KI) 2 gr + 1 gr de Iodo + 100 ml de H2O Destilada. LCOOL ACETONA (Descolorao) Em Partes Iguais: 500 ml metanol + 500ml Acetona. SAFRANINA Soluo A: 2,5 gr ou 25 gr Safranina + 100 ml ou 1000 ml de Etanol Absoluto Soluo B: 10 ml ou 100 ml de soluo A + 90 ou 900 ml de H2O Destilada.

REAGENTE DE PANDY (LIQUIDO CEFALO-RAQUIDIANO) 15gramas do Fenol 250 ml de H2O Destilada. Prepara-se dissolvendo o fenol em 250 ml de H2O Destilada e depois completar o volume at 500 ml com H2O Destilada. HEMATOLOGIA COLORAO DE WRIGHT Para 1 litro de reagente prepara-se: 3 Gramas de wright em p (N. 11) 30 ml de Glicerina (N. 4) 970 ml de lcool metlico (metanol).

Dissolver o corante no almofariz. Juntar a glicerina, e agitar. Usar aps 24 horas. LEUCOGRAMA REAGENTE DE TURK 3 ml de cido actico glacial + 300 ml de H2O Destilada e juntar a esta 3 a 5 gotas de violeta genciana ou azul metileno q.b.. TEMPO DE PROTROMBINA 0,11 moles Citrato trisdico dihidratado 3,24 gramas + 100 ml de H2O Destilada ou Citrato sdio anidro 2,82 grama + 100 ml de H2O Destilada. TESTE FALCIFORME 2 Gramas de metabissulfito de sdio + 100 ml de H2O Destilada. Dissolve-se o metabissulfito de sdio em H2O Destilada e conserva-se no frio durante 1 ms.