lỜi cẢm Ơn - trường thpt nguyễn...
TRANSCRIPT
SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI
TRƯỜNG THPT CHUYÊN NGUYỄN HUỆ - HÀ ĐÔNG
**************
ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT
DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC
(NĂM HỌC 2014 - 2015).
Tên đề tài:
GÓP PHẦN BẢO VỆ SỨC KHỎE CON NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT QUA VIỆC
XỬ LÝ ĐỘC TỐ MICROCYSTINS TRONG NGUỒN NƯỚC
BẰNG BIỆN PHÁP SINH HỌC
Lĩnh vực: Sinh học môi trường.
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
- TS Nguyễn Thị Hoài Hà
- Đơn vị công tác: Viện Vi sinh và
Công nghệ Sinh học - ĐHQG Hà Nội.
- ThS. Trịnh Việt Văn
- Đơn vị công tác: Trường THPT
Chuyên Nguyễn Huệ.
TÁC GIẢ:
1. Nguyễn Hữu Hải Trung, Lớp: 11 Sinh,
Trường: THPT Chuyên Nguyễn Huệ.
2.Huỳnh Đức Anh, Lớp: 11 Sinh, Trường: THPT
Chuyên Nguyễn Huệ.
Hà Nội, tháng 1 năm 2015
1
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................5
PHẦN I: LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI..................................................................................6
1. Lý do chọn đề tài:...................................................................................................6
2. Mục tiêu của đề tài:................................................................................................7
3. Điểm mới và tính sáng tạo của đề tài:....................................................................7
4. Lợi ích của đề tài....................................................................................................7
PHẦN II. TỔNG QUAN..............................................................................................8
2.1. Tổng quan............................................................................................................8
2.1.1. Tình hình tảo độc M. aeruginosa trên thế giới và ở Việt Nam:...................8
2.1.2. Hồ Hoàn Kiếm:............................................................................................8
2.1.3. Các hồ và thủy vực khác:.............................................................................9
2.1.4. Các công trình nghiên cứu về MCs trước đây:............................................9
PHẦN III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............11
3.1. NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT..........................................................................11
3.1.1. Vi tảo lam Microcystis aeruginosa và độc tố microcystins.......................11
3.1.2. Vi khuẩn dị dưỡng Pseudomonas và khả năng phân hủy độc tố MCs
..............................................................................................................................16
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................19
3.2.1. Phân lập vi khuẩn dị dưỡng từ nước hồ nở hoa.........................................19
3.2.3. Phân tích giải trình tự 16S rADN...............................................................21
3.2.4. Nghiên cứu xây dựng mô hình phân hủy độc tố microcystins...................21
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................23
4.1. Sàng lọc vi tảo lam thuộc chi Microcystis aeruginosa trong mẫu tự nhiên...........23
4.2. Phân loại VKDD Pseudomonas SP8.................................................................26
4.2.1. Đặc điểm hình thái học:.............................................................................26
4.2.2. Phân tích giải trình tự 16S rADN:..............................................................27
2
4.2.3. Thu sinh khối VKDD P. fluorescens SP8:.................................................29
4.3. Mô hình xử lý độc tố microcystins trong phòng thí nghiệm.............................30
4.3.1. Xử lý trực tiếp (vi khuẩn dạng tự do).........................................................30
4.3.2. Xử lý bằng bể có gắn màng sinh học.........................................................31
4.4. Thử nghiệm chế phẩm VKDD P. fluorescens SP8 và đánh giá khả năng
phân hủy độc tố trong điều kiện nhân tạo................................................................34
4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phân hủy microcystins.............................34
4.4.2. Ảnh hưởng của số lượng tế bào VKDD:...................................................36
4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ microcystin.........................................................37
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................39
1. Kết luận:...............................................................................................................39
2. Kiến nghị..............................................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................41
3
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Các chữ viết tắt Tên đầy đủ
ADN Acid Deoxyribo Nucleotide
ARN Acid Ribonucleotide
C Carbon
MCs Microcystins
N Nitrogen
PBS Phosphate Buffer Saline
P Phosphorus
PCR Polymerase chain reaction
SEM Scanning electron micrograph
TE Tris Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
TNT Trinitrotoluene
VKDD Vi khuẩn dị dưỡng
WHO World Health Organization
4
LỜI CẢM ƠN
Nhóm đề tài: GÓP PHẦN BẢO VỆ SỨC KHỎE CON NGƯỜI VÀ
ĐỘNG VẬT QUA VIỆC XỬ LÝ ĐỘC TỐ MICROCYSTINS TRONG
NGUỒN NƯỚC BẰNG BIỆN PHÁP SINH HỌC xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới BGH trường THPT CHUYÊN NGUYỄN HUỆ đã tạo điều kiện thuận lợi
giúp đỡ chúng em trong thời gian thực hiện đề tài.
Nhóm chúng em xin cảm ơn cố vấn khoa học TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, ThS.
Phạm Thị Bích Đào, cử nhân Nguyễn Đình Tuấn, Đại học Quốc gia Hà Nội và
thầy giáo - ThS. Trịnh Việt Văn, trường THPT Chuyên Nguyễn Huệ đã hướng
dẫn tận tình, tạo điều kiện để nhóm tác giả hoàn thành tốt đề tài.
Chúng em cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo, các anh chị sinh
viên thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã
đưa ra những lời khuyên cũng như giúp nhóm thực hiện tốt đề tài.
Cuối cùng nhóm tác giả xin gửi lòng biết ơn đến Cha, Mẹ, Anh, Chị cùng gia
đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên nhóm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
NHÓM TÁC GIẢ
Nguyễn Hữu Hải Trung
Huỳnh Đức Anh
5
PHẦN I: LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
1. Lý do chọn đề tài:
- Qua các phương tiện thông tin đại chúng, chúng em được biết trong nước
cung cấp cho thành phố Hà Nội từ nguồn nước sông Đà có nhiễm vi tảo lam
Microcystis aeruginosa, loài tảo tiết độc tố Microcystins (MCs) có ảnh hưởng
đến sức khỏe của con người và các sinh vật thủy sinh. Bên cạnh đó, các hồ lớn
như hồ Ba bể, hồ Dầu Tiếng... cũng đang trong tình trạng tương tự.
- Từ những quan sát thực tế trong chuyến tham quan hồ Hoàn Kiếm, một địa
danh nổi tiếng ở thủ đô Hà Nội, chúng em nhận thấy hồ đang chịu tác động lớn
từ việc phát triển nhanh của vi tảo lam này do tình trạng ô nhiễm nặng nề bởi rác
thải hữu cơ, gây hiện tượng “phú dưỡng” trong hồ.
- Trong chuyến đi điều tra thực tế tại các hồ nuôi trồng thủy sản ở ngoại
thành Hà Nội, chúng em cũng thấy sự nhiễm vi tảo lam gây độc tại các hồ này.
- Sự nở hoa của vi tảo lam M. aeruginosa làm tăng lượng độc tố MCs, độc tố
này, đặc biệt là MCs-LR, có ảnh hưởng nghiêm trọng đến các sinh vật sống
trong hồ, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người sử dụng nguồn nước nhiễm MCs.
- Từ các nguồn thông tin như báo đài và internet, chúng em được biết có
nhiều vi sinh vật có khả năng sử dụng độc tố MCs của vi tảo lam M. aeruginosa
làm nguồn cơ chất cho sinh trưởng, đảm bảo cơ chế tự làm sạch của thủy vực
trong tự nhiên. Đặc biệt là vi khuẩn Pseudomonas fluorescens, chủng vi khuẩn dị
dưỡng có sẵn trong hồ Hòa Kiếm được quan tâm nghiên cứu.
- Dựa vào các dẫn liệu trên, chúng em tiến hành nghiên cứu mối quan hệ
giữa vi tảo lam M. aeruginosa và vi khuẩn dị dưỡng P. fluorescens ở hồ Hoàn
Kiếm. Kết quả của nghiên cứu này sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng xử
lý độc tố MCs trong những nguồn nước bị nhiễm độc tố MCs ở các hồ, ao nuôi
trồng... Do đó, chúng em thực hiện đề tài:
“Góp phần làm bảo vệ sức khỏe con người và động vật qua việc xử lý độc
tố microcystins trong nguồn nước bằng biện pháp sinh học. ”
6
2. Mục tiêu của đề tài:
- Xác định và nâng cao hiệu quả xử lý độc tố MCs trong môi trường nước hồ
Hoàn Kiếm của vi khuẩn P. fluorescens;
- Tạo chế phẩm sinh học có thể sử dụng để xử lý MCs ở hồ Hoàn Kiếm và áp
dụng với nguồn nước khác, bao gồm nguồn nước cung cấp cho sinh hoạt và nước
trong các ao, hồ nuôi thủy sản.
- Tìm hướng xử lý độc tố MCs trong nguồn nước sinh hoạt cung cấp cho
thành phố Hà Nội và các ao, hồ nuôi thủy sản bằng phương pháp sinh học.
3. Điểm mới và tính sáng tạo của đề tài:
- Đây là đề tài đầu tiên sử dụng đối tượng là vi khuẩn P. fluorescens trong
việc xử lý độc tố MCs do M. aeroginosa gây ra trong nước hồ Hoàn Kiếm cũng
như các nguồn nước khác bị nhiễm MCs.
- Đề xuất tạo màng sinh học từ P. fluorescens để xử lý độc tố MCs, vừa tăng
hiệu quả xử lý độc tố, vừa kiểm soát được số lượng vi khuẩn P. fluorescens,
không để chúng tăng số lượng quá mức.
- Lần đầu tiên đề xuất biện pháp làm sạch nguồn nước sinh hoạt thông qua
việc áp dụng việc sử dụng vi khuẩn P. fluorescens vào việc xử lý độc tố tảo lam -
MCs.
- Từ công trình nghiên cứu có thể áp dụng trên các khu vực có điều kiện
tương tự, như các hồ, ao nuôi có nhiễm MCs.
4. Lợi ích của đề tài
- Bảo vệ môi trường và cảnh quan các hồ, thủy vực ở Hà Nội bị nhiễm M.
aeuroginosa, qua đó bảo vệ các loài động vật thủy sinh được nuôi trong các ao,
hồ có nhiễm MCs.
- Áp dụng xử lý với mọi khu vực bị nhiễm MCs bởi M. aeruginosa .
7
PHẦN II. TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan
2.1.1. Tình hình tảo độc M. aeruginosa trên thế giới và ở Việt Nam:
- Điều kiện môi trường thuận lợi đã làm cho vi tảo lam phát triển mạnh trong các
thủy vực nước ngọt, gây ra mối nguy hại trực tiếp tới các thủy sinh vật, đồng thời
gián tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe và cuộc sống con người.
- Trên thế giới, vi tảo lam M. aeruginosa xuất hiện phổ biến ở các thủy vực giàu
dinh dưỡng ở Australia, đặc biệt vào mùa hè (Mc.Barron và May, 1966). Những
năm 60 của thế kỷ XX, tảo độc cũng phổ biến ở vùng Địa Trung Hải và vùng có
khí hậu ôn đới ở cả 2 bán cầu (Carmichael và Falconer, 1993). Tại Nam Phi, hàu
hết động vật nuôi bị chết do vi tảo lam M. aeruginosa tại các thủy vực phì
dưỡng... [2].
- Ở Việt Nam, tình trạng nhiễm tảo độc M. aeruginosa ở các thủy vực cũng rất
phổ biến. M. aeruginosa có trong tất cả các mẫu nước khảo sát lấy từ hồ Trị An,
Đức An, Biển Hồ, Hoàn Kiếm, Cửa Ngăn, Hồ Mưng, Như Ý, Đập Đá với mật độ
từ 0,11×105 - 2,793×105 tế bào/L [2].
2.1.2. Hồ Hoàn Kiếm:
- Tại các cuộc hội thảo khoa học về hồ Hoàn Kiếm, nhiều ý kiến của các nhà
khoa học đều khẳng định môi trường nước hồ Hoàn Kiếm đang bị ô nhiễm nặng,
chất lượng nước hồ ngày một suy giảm, trong số 51 loài vi tảo thì có gần 90% là
vi tảo lam độc hại. [2]
- Đáng chú ý, sự xuất hiện thường xuyên và dày đặc của vi tảo lam M.
aeruginosa đã tạo nên sự đặc trưng của hồ Hoàn Kiếm. Vi tảo lam này sinh độc
tố MCs, là các peptid mạch vòng gây ảnh hưởng đến sinh vật thủy sinh và có
nguy cơ gây ung thư gan ở người nếu sử dụng nguồn nước bị nhiễm MCs thường
xuyên.
8
2.1.3. Các hồ và thủy vực khác:
- Điều kiện môi trường thuận lợi đã làm cho vi tảo lam phát triển mạnh trong các
thủy vực nước ngọt, gây ra mối nguy hại trực tiếp tới các thủy sinh vật, đồng thời
gián tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe và cuộc sống con người.
- Trong số 36 mẫu nước thu từ các ao nuôi và hồ thuộc địa bàn Hà Nội từ tháng
4/2014 thì tất cả các mẫu đều có chứa M. aeruginosa với mật độ trung bình là
0,12×105 tế bào/lít.
2.1.4. Các công trình nghiên cứu về MCs trước đây:
MCs là các hợp chất có tính chất vật lý và hóa học bền vững đối với các yếu
tố pH, nhiệt độ và sự chiếu xạ. Hợp chất này có thể tồn tại một vài giờ trong
nước đun sôi và khá bền vững trong nhiều năm tại điều kiện không khí khô ở
nhiệt độ phòng.
MCs có thể bị oxy hóa bằng ôzon và một số tác nhân oxy hóa mạnh khác,
hoặc bị phân hủy bằng tia cực tím cường độ cao hoặc bị phân hủy chậm trong
điều kiện đủ ánh sáng mặt trời, đặc biệt khi có mặt các sắc tố hòa tan trong nước.
Đây có thể là lý do hiện nay đã có nhiều phương pháp xử lý độc tố như: phương
pháp vật lý (ví dụ lắng và lọc), phương pháp hóa học (ví dụ như kết tủa, keo tụ
và clo hóa) và ứng dụng bức xạ điện từ (ví dụ như tia cực tím)...
Tuy nhiên, MCs là các nội độc tố trong tế bào vi khuẩn lam khỏe mạnh, sẽ
được thải vào môi trường khi các tế bào bị ly giải hoặc chết đi. Bên cạnh đó hiệu
quả xử lý của các phương pháp đó cũng không cao và việc sử dụng các phương
pháp làm giết chết tế bào đồng loạt như trên sẽ làm tế bào bị phân hủy với số
lượng lớn gây ô nhiễm môi trường, do đó các phương pháp ở trên hiện nay
không còn được khuyến cáo sử dụng [7].
Các độc tố đi vào hệ thống xử lý nước như các hợp chất hòa tan trong nước
thô và trong các tế bào vi khuẩn lam. Vì vậy, hệ thống xử lý nước phải loại bỏ
các tế bào vi khuẩn lam sống mà không làm ly giải tế bào cũng như loại bỏ độc
tố của chúng từ nước thô. Như vậy, phương pháp sử dụng quần thể các vi sinh
9
vật bản địa để phân hủy độc tố MCS với ưu điểm hiệu quả và bền vững đang là
phương pháp nghiên cứu mới đầy hứa hẹn cho việc loại bỏ độc tố MCs mà
không ảnh hưởng môi trường.
Bằng cách sử dụng độc tố MCs như là nguồn N và C cho sinh trưởng, đã có
nhiều báo cáo công bố về việc tìm ra được các chủng vi khuẩn có khả năng phân
hủy độc tố MCs, như các chủng thuộc chi Sphingomonas, Pseudomonas,
Sphingosinicella, Sphingopyxis, Paucibacter và Burkholderia. Trong đó thì các
chủng thuộc chi Pseudomonas và Sphingomonas đã được chứng minh là chứa
phức hệ đa enzyme có khả năng mở vòng độc tố MCs, do đó chúng có tiềm năng
ứng dụng lớn trong việc phân hủy độc tố MCs [17].
10
PHẦN III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT
3.1.1. Vi tảo lam Microcystis aeruginosa và độc tố microcystins
3.1.1.1. Vi tảo lam Microcystis
Thuộc bộ Chroococcales với các đặc điểm là các tế bào nhỏ, màu xanh lam
sống thành tập đoàn gồm hàng nghìn tế bào kích thước 2-3µm và ở mỗi tế bào
đều có chứa không bào khí giúp chúng nổi trên mặt nước để có thể thu nhận ánh
sáng tốt trong quá trình quang hợp. Microcystis phân bố khắp mọi nơi, gây ra
hiện tượng “nở hoa” và sinh các độc tố MCs. Trong các loại vi tảo lam sinh độc
tố thì Microcystis xuất hiện thường xuyên và phổ biến nhất, chúng dễ “nở hoa”
khi môi trường có đầy đủ các yếu tố: dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, tốc độ gió
(gió nhẹ hoặc không có gió) và một số yếu tố khác, tổ hợp các yếu tố này dễ tồn
tại ở hồ thủy điện Hòa Bình, các hồ, ao nuôi cá cũng như điều kiện Hoàn Kiếm
vào thời điểm đầu mùa hè (tháng 3,4,5), nên đó là thời điểm hồ xảy ra “nở hoa”
tảo lam dữ dội nhất.
Microcystis “nở hoa” không chỉ sinh ra độc tố có hại mà ảnh hưởng từ hiện
tượng “nở hoa” cũng rất lớn như: làm giảm đa dạng loài (trong đó ở hồ Hoàn
Kiếm có nhiều loài vi tảo quý hiếm); tăng độ đục; tỷ lệ bồi lắng tăng gây giảm
tuổi thọ của hồ và làm giảm lượng oxy hòa tan trong nước hồ cũng như nguồn
nước bị nhiễm Microcystis.
11
Hình 3.1.1. Hình dạng tế bào Microcystisaeruginosa quan sát
dưới kính hiển vi (x40) [3]
Hình 3.1.2. Tế bào Microcystis dưới kính hiển vi điện tử [3]
3.1.1.2. Độc tố microcystins
Độc tố MCs thuộc nhóm độc tố gan (hepatotoxin), đã được phân lập từ nhiều
chi vi khuẩn lam, bao gồm Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Planktothrix,
Chroococcus và Nostoc. Trong đó phổ biến nhất là loài tảo lam Microcystis
aeruginosa do chúng có khả năng phân bố rộng và phát triển tốt triên nhiều kiểu
khí hậu khác nhau, do đó chúng trở thành mối đe dọa toàn cầu cho sức khỏe con
người [11]. Tên gọi microcystins xuất phát từ việc hợp chất này được tách ra lần
đầu tiên từ loài tảo lam M. aeruginosa .
Cấu trúc phân tử
Microcystins là peptide đơn vòng nhỏ với trọng lượng phân tử khoảng 1000
Daltons, bao gồm 7 amino acid trong cấu trúc. Cấu trúc hóa học là vòng (-D-
Ala1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D-Glu6-Mdha7) trong đó X và Z là các L-amino
acid, D-MeAsp là axit D-erytho-β-methylaspartic và Mdha là N-
methyldehydroalanin. Adda là axit (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-
trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic, đây là cấu trúc duy nhất chỉ có trong nhóm
12
các độc tố peptide dạng vòng của tảo lam và cực kỳ quan trọng trong việc biểu
hiện các hoạt tính sinh học của MCs [18].
Các độc tố MCs khác nhau tạo thành thường do sự thay đổi các gốc amino
acid ở các vị trí 2; 3; 4 và 7 như hình dưới. Trong khi ở các vị trí số 3 là D-
erythro-β-methylaspartic acid (D-MeAsp) và số 7 là N-methyldehydroalanine
(Mdha) sự thay đổi thường là có hay không sự methyl hóa, còn sự thay thế các
L-acid amin ở vị trí 2(X) và 4(Z) là sự thay đổi chính và thường tạo ra các biến
thể độc tố MCs phổ biến nhất như trong bảng dưới 3.1[12].
Hình 3.1.3. Cấu trúc phân tử độc tố MCs-LR [8]
1. D - Alanine
2. Leucine (X - có thể thay thế bởi các amino acid)
3. D - Methyl aspartic acid
4. Arginine (Z - có thể thay thế bởi các amino acid)
5. Adda
6. D - Glutamic acid
7. N- Methyl-dehydro-alanineVà dựa vào thành phần các amino acid cấu thành nên độc tố MCs thì chúng
được chia thành hai loại kỵ nước và không kỵ nước, các độc tố MCs kỵ nước là
13
dạng thường. Cho đến nay đã có hơn 90 biến thể khác nhau của MCs được biết
đến.
Bảng 3.1. Các amino acid cơ bản xuất hiện trong cấu trúc của microcystin
TênAmino acid vị
trí X
Amino acid vị trí
Z
Khối lượng phân
tử
Microcystins
LALeucine (L) Alanine (A) 910. 06
Microcystins
YRTyrosine (Y) Arginine (R) 1045. 19
Microcystins
RRArginine (R) Arginine (R) 1038. 2
Microcystins
LRLeucine (L) Arginine (R) 995. 17
Độc tính của microcystins :
Ở cấp độ phân tử các độc tố MCs đã được chứng minh là có khả năng ức chế
protein photphatase nhóm 1 và 2A (PP1 và PP2A). Protein photphatase là
enzyme xúc tác cho việc loại các gốc photphoryl của serine hoặc threonine, sự
ức chế các protein phosphate có thể dẫn tới sự phosphoryl hóa quá mức các vi
sợi, vi ống, sợi liên bào, dẫn đến làm phân hủy bộ khung tế bào và phá hủy cấu
trúc siêu vi gan. Sự co rút của các tế bào gan so với các tế bào liền kề và các mao
mạch dẫn đến chảy máu trong các mô gan. Điều này dẫn đến kết quả cuối cùng
là sự tổn thương cục bộ, mất chức năng của các cơ quan và xuất huyết [18; 19].
14
Hình 3.1.4. Quá trình ức chế photphatases P1 và 2A [19]
Sự tiếp xúc lâu dài với nồng độ MCs thấp trong nước uống là nhân tố gây ra
ung thư gan ở người. Các nghiên cứu cơ chế động học tế bào đã cho biết MCs
ảnh hưởng lớn đến cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân, điều này giúp giải
thích khả năng kích thích gây ung thư của chúng. Các độc tố này gây ảnh hưởng
xấu đến hai loại enzyme là serin - photphatase và threonin - photphatase liên
quan tới sự điều hòa phát triển các tế bào nhân thật (Eukaryote), điều khiển sự
hoạt động của tế bào động thực vật trong quá trình phân chia, sinh trưởng, trao
đổi chất, sao chép ADN và sự biểu hiện các tính trạng có liên quan. Điều đó cho
thấy microcystins có thể ảnh hưởng đến các chức năng của tế bào nhân thật ở
mức độ phân tử và từ đó có thể ảnh hưởng tới các động vật thủy sinh sống trong
môi trường có sự tiếp xúc với độc tố này [3].
Mặc dù chưa có báo cáo về trường hợp tử vong do uống phải MCs nhưng đã
có báo cáo về một loạt ảnh hưởng sức khỏe sau khi tiếp xúc với độc tố trong
nước uống hoặc tiếp xúc do bơi lội. Tổn thương gan là dấu hiệu phổ biến nhất
của con người khi tiếp xúc với MCs. Năm 1999, Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO)
đã nghiên cứu và xem xét toàn diện về lĩnh vực này.
15
Vào tháng 2 năm 1996, 116 trong 131 bệnh nhân ở Cauruaru-Brazil xảy ra
tình trạng rối loạn thị giác, buồn nôn, nôn mửa, yếu cơ và phải lọc máu thường
xuyên. 100 người trong số những người đó đã bị suy gan cấp tính và 52 người
cuối cùng đã chết do các triệu chứng mà giờ ta gọi là “Hội chứng Caruaru” .
Nguyên nhân của hội chứng này được xác định là do MCs từ các hồ chứa không
được xử lý lọc, khử trùng. MCs được tìm thấy trong máu và gan bệnh nhân .
Các nghiên cứu đã đưa ra giá trị LD50 đối với loại độc tố MCs phổ biến
MCs-LR là 50µg trên một kg cơ thể chuột, giá trị này đối với độc tố MCs-RR là
600µg. Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã đưa ra nồng độ chấp nhận được tối đa
của độc tố MCs-LR trong nước uống là 1µg/l [16].
3.1.2. Vi khuẩn dị dưỡng Pseudomonas và khả năng phân hủy độc tố MCs
3.1.2.1. Vi khuẩn dị dưỡng Pseudomonas
Là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que, không sinh bào tử và có khả năng
di động nhờ các tiên mao. Chúng có khả năng tiết các sắc tố ra ngoài môi trường
ví dụ như sắc tố huỳnh quang màu vàng-xanh pyoverdine, sắc tố lục pyocyanin,
sắc tố thioquinolobactin.
Hình 3.1.5. Hình dạng tế bào Pseudomonas [12]
Các loài thuộc chi Pseudomonas có sự phân bố rộng rãi ở đất, nước, trong
mô động vật và thực vật, vì vậy chi Pseudomonas có lịch sử nghiên cứu từ rất
sớm và cho đến nay chúng ta đã có rất nhiều thông tin về đặc điểm loài này cũng
16
như về hệ gen của chúng. Các loài thuộc chi Pseudomonas đã được tập trung
nghiên cứu nhiều bao gồm: nhóm gây bệnh ở người, ví dụ như P. aeruginosa là
trực khuẩn mủ xanh nổi tiếng; gây bệnh thực vật như P. syringae; nhóm vi khuẩn
đất như P. putida và nhóm thúc đẩy sinh trưởng ở thực vật, P. fluorescens [25].
Một số loài thuộc chi Pseudomonas là những sinh vật hiếu khí chịu khí,
trong điều kiện không có O2 chúng có thể sử dụng NO3- là chất nhận điện tử, vì
vậy chúng có thể sống ở dưới đáy ao hồ nơi có nồng độ O2 thấp và lượng chất
mùn hữu cơ cao. Nhiều loài trong đó cũng được chứng minh là có nhu cầu dinh
dưỡng đơn giản, chúng có thể sinh trưởng tốt trong môi trường muối khoáng có
bổ sung thêm đa dạng nguồn cacbon. Đã có nhiều nghiên cứu khai thác được khả
năng phân hủy hoàn toàn hoặc một phần của loài P. fluorescens đối với các chất
ô nhiễm như styrene, và polycyclic aromatic hydrocarbons [27].
3.1.2.2. Tính an toàn của P. fluorescens
a) Đối với người
Nhiều tài liệu khoa học trên thế giới đã khẳng định P. fluorescens là vi khuẩn
rất có giá trị trong công nghệ nông nghiệp. Chúng phân giải một số chất độc và
các chất ô nhiễm trong đó có styrene, polycyclic aromatic hydrocarbons và TNT.
Chúng cũng bảo vệ cây khỏi bị nhiễm trùng do các mầm bệnh bằng cách tiết ra
các chất để chuyển hóa thành thuốc kháng sinh và hydrogen cyanide để tiêu diệt
vi khuẩn và nấm khác. Chúng cũng tiêu diệt các mầm bệnh bằng cách loại trừ
cạnh tranh (do sự phát triển nhanh chóng của chúng). Nhiều nhà khoa học đã đưa
ra giả thuyết rằng P. fluorescens có thể là một lựa chọn tốt để dung làm thuốc trừ
sâu tổng hợp vì độc tính của chúng ức chế ấu trùng và nhộng của muỗi, hai mối
quan tâm chính trong kinh doanh nông nghiệp. [28]
Chúng cũng rất hữu ích cho con người. Các loại kháng sinh giúp bảo vệ rễ
cây cũng được sử dụng để điều trị nhiễm trùng ở người. Tác dụng của mupirocin
được sử dụng trong việc điều trị một căn bệnh nguy hiểm do Methicillin-
resistant Staphylococcus aureus gây ra,điều mà số ít kháng sinh có thể làm được.
17
Bên cạnh đó chúng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Chúng phân giải
protein và tạo hương vị chua. Điều mà tạo nên thương hiệu. của nhiều hãng sữa.
Chúng chỉ được biết đến là tác nhân của sự suy giảm miễn dịch như bệnh
nhân ung thư và những người có bệnh suy giảm miễn dịch như lupus. Tất cả chỉ
là một tỉ lệ nhỏ và cả trong sự hư hỏng thực phẩm. Chúng có thể phát triển thuận
lợi ở nhiệt độ 25-35oC và cũng có thể duy trì ở 4oC. Vậy vi khuẩn này cũng
thuộc trong số những tác nhân gây hỏng thức ăn trong tủ lạnh.
b) Đối với động vật thủy sinh (cá)
Các tài liệu chuyên ngành về vi khuẩn P. fluorescens cũng đã khẳng định sự
an toàn của vi khuẩn này đối với động vật thủy sinh (cá) [28]. Điều này có ý
nghĩa lớn trong việc ứng dụng khả năng phân hủy độc tố MCs của chủng SP8.
c) Con đường phân hủy MCs
Chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy độc tố MCs đầu tiên được công bố là
phân lập từ nước ở Murrumbidgee River, Australia bởi Jones và cộng sự, đó là
chủng Pseudomonas sp. đã được xác định là có khả năng phân hủy hoàn toàn
MCs-LR và MCs-RR trong 3 ngày.
Sau đó, tại Nhật Bản, các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu và đưa ra báo
cáo về khả năng phân hủy MCs của vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas. Năm
1996, Bourne và cộng sự đã phân loại lại chủng Psedomonas sp.
Jones và cộng sự cũng đã xác định được sự phân hủy MCs bởi phức hệ đa
enzyme và được chia ra thành 3 giai đoạn. Sau đó vào năm 2001 Bourne và cộng
sự đã mô tả cụ thể con đường phân hủy đó [6].
Phức hợp đa enzyme phân hủy MCs bao gồm 4 enzyme chính:
Microcystinase: một metalloprotease (MlrA)
Một serine peptidase 2 (MlrB)
Một metalloprotease 3 (MlrC)
MlrD - một protein vận chuyển
18
Hình 3.1.6. Con đường phân hủy MCs-LR của vi khuẩn dị dưỡng Pseudomonas
Các enzyme trên được mã hóa bởi đoạn trình tự gen kích thước 5,8 Kb, bao
gồm các đoạn gen mlrA, mlrB, mlrC vàmlrD. Trong đó enzyme MlrA được mã
hóa bởi gen mlrA, xúc tác cho việc thủy phân và mở vòng độc tố ở vị trí mạch
peptide Adda-Arg, việc mở vòng này làm giảm đến 160 lần độc tính của độc tố
MCs nên đây là enzyme có vai trò chủ đạo trong phức hệ đa enzyme. Sản phẩm
phân cắt của enzyme này đối với độc tố MCs-LR là hợp chất mạch thẳng (NH2-
Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu-MeAsp-Arg-OH). Enzyme MlrB mã hóa bởi gen mlrB
xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptide Ala-Leu của MCs-LR mạch thẳng để
tạo ra các tetrapeptide (NH2-Adda-Glu-Mdha-Ala-OH) và tripeptide (NH2-Leu-
MeAsp-Arg-OH). Sự phân cắt thành công khi enzyme MlrC mã hóa bởi gen
mlrC xúc tác thủy phân thành các peptide nhỏ hơn và các amino acid [6].
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Phân lập vi khuẩn dị dưỡng từ nước hồ nở hoa
Các mẫu nuôi được thực hiện trong phòng thí nghiệm: nước mẫu từ hồ Hoàn
Kiếm thu được trong vùng “nở hoa” của vi tảo lam Microcystis ngay lập tức
19
được lọc qua lưới 20µm, sau đó tiếp tục được lọc qua phin lọc. Tiến trình lọc
nhằm loại bỏ phần lớn động vật nguyên sinh.
Lấy 1ml nước hồ pha loãng ở các nồng độ pha loãng thích hợp. Nhỏ 1ml
dịch pha loãng trên môi trường dịch thể NA có bổ sung 10g/l microcystins. Sau
24 giờ nhỏ 100µl dịch cấy trang đều trên mặt thạch. Sau 20-24giờ, quan sát các
khuẩn lạc riêng rẽ. Tách khuẩn lạc, quá trình lặp lại nhiều lần cho đến khi thu
được các khuẩn lạc thuần khiết.
Nuôi giữ chủng VKDD này trên môi trường thạch nghiêng, bảo quản ở nhiệt
độ 4°C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Đếm số lượng tế bào (số khuẩn lạc trên đĩa thạch)
Tế bào vi sinh vật sống là tế bào có khả năng sinh trưởng để tạo thành một
quần thể. Trên bề mặt môi trường đặc, quần thể này tạo những đám có hình
dạng, màu sắc riêng biệt được gọi là khuẩn lạc. Từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa
thạch suy ra số tế bào sống có trong mẫu đã cấy trên mặt thạch.
Cách tiến hành: Để tách rời các tế bào, cần pha loãng mẫu kèm theo lắc
mạnh dịch đã pha loãng. Cấy trải dịch pha loãng trên đĩa thạch LB. Sau đó đem
nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC trong 24 - 48 giờ và đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa.
Chú ý cần phân biệt các khuẩn lạc lạ hình thành do tạp nhiễm và không tính
chúng.
Số lượng tế bào được tính theo công thức:
Số lượng tế bào được tính theo công thức:
S ố lư ợ ng t ế b à o=
a∗1k
∗1
v
a: số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa cấy có cùng độ pha loãng.
v: thể tích dịch pha loãng được cấy trên mặt đĩa thạch.
k: độ pha loãng của dịch cấy.
Ở đây đơn vị tính là CFU/ml hoặc CFU/g, nghĩa là số đơn vị hình thành
khuẩn lạc trong 1 ml đơn vị thể tích hoặc gam chế phẩm. .
20
3.2.3. Phân tích giải trình tự 16S rADN
Ở công đoạn này, chúng em đã liên hệ với phòng thí nghiệm “First base of
Singapore” để nhờ phân tích giải trình tự 16S rADN của vi khuẩn, từ đó có thể
xác định chính xác loài vi khuẩn được sử dụng là P. fluorescens.
Tách chiết ADN
Nhân đoạn gen bằng phản ứng PCR
Xác định trình tự gen bằng máy tự động(ABI Prism 3100 Avant)
Xây dựng cây phát sinh loài: của loài nghiên cứu với các loài tương ứng
được công bố trong ngân hàng genbank NCBI, bằng chương trình
ClustalW và Mega 5.10.
3.2.4. Nghiên cứu xây dựng mô hình phân hủy độc tố microcystins
Mục đích của thí nghiệm: Xác định tốc độ phân hủy độc tố MCs của các
VKDD trong chế phẩm trong bể chứa vi khuẩn dạng tự do và bể có gắn màng
sinh học.
3.2.4.1. Xử lý trực tiếp (vi khuẩn dạng tự do):
Nguồn nước sử dụng trong nghiên cứu: nước hồ Hoàn Kiếm
Bể nghiên cứu bằng nhựa kích thước: dài×rộng×cao = 60×20×20 cm. Lấy 20
lít nước hồ có nồng độ MCs là 20µg/l. Bổ sung dịch thể chế phẩm sinh học đã
được hoạt hóa để được nồng độ 108 FCU/ml.
Theo dõi hàm lượng MCs trong bể vào các thời gian: 0; 1; 3; 5 và 6 ngày thí
nghiệm. Nhiệt độ thí nghiệm: 30oC. Sử dụng chế độ sục khí tạo sự đồng đều
trong suốt thời gian thí nghiệm.
3.2.4.2. Xử lý bằng bể có gắn màng sinh học:
Sự hình thành màng sinh học trên vật liệu dính bám
Để lựa chọn vật liệu tốt cho xử lý bể gắn màng sinh học, các bề mặt phi sinh
vật được sử dụng từ vật liệu PS (polystyrene), PVC và thủy tinh (nhóm chọn PS
do vật liệu này dễ tạo màng hơn và an toàn hơn PVC) cho xác định sự hình thành
màng sinh học. Tấm nhựa PS được cắt thành các bản có kích thước 1 × 2 cm.
21
Bản nhựa PS được làm sạch bằng ethanol 70%, sau đó rửa lại bằng nước cất vô
trùng. Đặt các bản này vào đĩa Petri vô trùng và sấy ở 40°C cho đến khô. Dịch
nuôi VKDD bổ sung vào các các đĩa, nuôi cấy tĩnh ở 28-30oC, trong 24, 48 và 72
giờ. Sự hình thành màng sinh học trên các bản vật liệu được kiểm tra bằng cách
sử dụng dung dịch tinh thể tím 1%. Thu các tế bào nhuộm màu trên bề mặt các
bản vật liệu và đo quang phổ ở bước sóng 600nm. Cách tính như sau:
A=Am−Ac
Trong đó: Am là giá trị OD600 mẫu bản vật liệu thu được sau nhuộm.
Ac là giá trị OD600 của mẫu dịch VKDD trên đĩa Petri cùng thời điểm nuôi
cấy
Khả năng hình thành màng sinh học được phân lớp bằng cách sử dụng tiêu
chuẩn của Stepanovic, Cirkovic, Ranin và Svabic-Vlahovic (2004) [21] như sau:
A ≤ Ac - không hình thành màng sinh học
Ac < A ≤ (2×Ac) - hình thành màng sinh học yếu
(2×Ac) < A ≤ (4×Ac) - hình thành màng sinh học vừa phải
(4×Ac) < A - hình thành màng sinh học mạnh
Xử lý bằng bể có gắn màng sinh học
Nguồn nước sử dụng trong nghiên cứu: nước hồ Hoàn Kiếm. Bể nghiên cứu
bằng nhựa kích thước: dài×rộng×cao = 60×20×20 cm. Lấy 20 lít nước hồ có
nồng độ microcystins là 20µg/l.
Màng sinh học được cố định trên vật liệu dính bám loại sợi polystyrene (PS)
Theo dõi hàm lượng MCs trong bể theo thời gian: 0; 1; 3; 5 và 6 ngày thí
nghiệm. Nhiệt độ thí nghiệm 30oC. Sử dụng chế độ sục khí tạo sự đồng đều trong
suốt thời gian thí nghiệm.
22
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Sàng lọc vi tảo lam thuộc chi Microcystis aeruginosa trong mẫu tự nhiên
Trong nghiên cứu này chúng em dựa trên đặc điểm đặc trưng của M.
aeruginosa có không bào khí (gas vacuoles) nên chúng thường nổi trên bề mặt.
Do vậy, chúng em tiến hành thu thập mẫu từ tự nhiên, ly tâm ở 9 000 vòng/15
phút. Sau đó mẫu được quan sát trên kính Zeiss độ phóng đại 400 lần.
Kết quả thể hiện hình 4. 1. 1 và 4. 1. 2
Hình 4.1.1. Hình dạng tế bào chủng
Microcystis sp
Dạng tập đoàn, tế bào hình cầu màu
xanh lam với nhiều không bào khí,
đường kính tế bào 3 - 6μm, bao nhầy
dày không màu.
Hình 4.1.2.Hình dạng tế bào chủng
Microcystis sp
Tập đoàn với tế bào hình cầu, tế bào có
màu xanh nhạt, đường kính tế bào 3-
7μm, tập hợp thành từng tập đoàn nhỏ có
bao nhầy rõ rệt.
Ở hình 4.1.1 và 4.1.2 chúng em nhận thấy những đặc điểm hình thái của các
mẫu thu thập được có nhiều điểm tương đồng với lý thuyết mô tả về chúng, như
tế bào đều dạng hình cầu, tập đoàn với bao nhầy rõ rệt, tế bào hình cầu với
đường kính 2 - 5μm, với nhiều không bào khí bên trong, đường kính tế bào 3 -
7µm. Miêu tả trên của chúng em cũng phù hợp với những miêu tả của Watanabe.
Các mẫu chúng em ký hiệu lần lượt là MCs01 và MCs02.
Tiếp theo, để định danh mẫu thu được có phải M. aeruginosa không. Chúng
emtiến hành phân tích kết quả giải trình tự 16S rADN.
23
Nghiên cứu thu nhận sinh khối và quy trình đông khô sinh khối vi tảo
lam độc Microcystis aeruginosa từ hồ Hoàn Kiếm với lượng lớn:
Trong nghiên cứu này, chúng em nhằm mục đích, thu thập một lượng lớn
sinh khối từ tự nhiên, đồng nghĩa nó cung cấp lượng lớn hỗn hợp các MCs tự
nhiên có mặt trong sinh khối. Chúng em tiến hành các bước nghiên cứu sau:
Mẫu vi tảo lam được thu vào những ngày nắng, nóng của mùa hè trong năm
Hình 4.1.3. Thu thập mẫu tại Hồ Hoàn Kiếm
Quy trình đông khô:
Dựa trên quy trình đông khô sinh khối xây dựng (hình 4.1.4). Trong tháng 4
và tháng 5 thu được một lượng lớn 200 gam sinh khối khô vi tảo lam Microcystis
aeruginosa . Lượng sinh khối này chúng em sẽ dùng làm cơ chất cho tất cả các
nghiên cứu tiếp theo.
24
Thu mẫu bằng lưới No 75
Ly tâm (7000/20 phút)
Thu sinh khối vi tảo lam nổi (Microcystis aeruginosa chiếm >90%)
Kiểm tra hình thái ở vật kính (×40) của kính hiển vi phản pha Zeiss
Sơ bộ xác định vi tảo lam Microcystis aeruginosa
Rửa sinh khối (muối sinh lý 1‰)
Đông khô chân không sinh khối vi tảo lam ở -83oC tới khi khô
Bảo quản trong túi nilon
Hình 4.1.4. Quy trình đông khô sinh khối vi tảo lam độc M. aeruginosa
Hình 4.1.5. Sinh khối vi tảo lam M. aeruginosa đông khô
25
4.2. Phân loại VKDD Pseudomonas SP8
4.2.1. Đặc điểm hình thái học:
Trong nghiên cứu này, chúng em quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch,
có bổ sung MCs thô, nhuộm Gram. Mô tả hình dạng tế bào được quan sát dưới
kính hiển vi điện điện tử quét ở độ phóng đại 1500 lần. Chúng em nhận thấy
VKDD SP8 Gram-âm, có tiên mao, có khả năng tiết sắc tố ra ngoài môi trường
nuôi và phát quang dưới tia cực tím
Hình 4.2.1a. Hình thái khuẩn lạc
VKDD SP8 (24h nuôi cấy)Hình 4.2.1b. Tế bào VKDD SP8 quan sát dưới
kính hiển vi điện tử quét (SEM) (x15000)
Ở hình 4.2.1b chụp dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại
15000 lần cho thấy VKDD SP8 có tế bào hình trụ, kích thước khoảng 1-2 µm,
các tế bào nằm trong lớp màng nhày. Do vậy, khó quan sát được tiên mao.
Kết luận: Dựa trên các đặc điểm hình tháivà đồng thời dựa vào các khóa
phân loại khác chúng em sơ bộ phân loại VKDD SP8 thuộc chi Pseudomonas
được ký hiệu là Pseudomonas SP8. Kết quả này chưa đủ thông tin để định danh
chính xác chủng VKDD SP8 thuộc loài nào của chi Pseudomonas. Thí nghiệm
tiếp theo chúng em cùng các cán bộ hướng dẫn tiến hành phân tích giải trình tự
16S rADN.
4.2.2. Phân tích giải trình tự 16S rADN:
26
Nhờ sự giúp đỡ của phòng thí nghiệm “First base of Singapore” trong việc
phân tích ADN, chúng em đã thu được kết quả giải trình tự 16S rADN của
VKDD SP8.
VKDD Pseudomonas SP8 có mối
quan hệ gần gũi, có độ tương đồng
đến 99% với trình tự gen của loài
P. fluorescens KC773765.
Và 14 loài khác đã được đăng ký
trong ngân hàng gen quốc tế.Hình 4.2.2. Sản phẩm PCR của
VKDD Pseudomonas SP8
Khoảng cách tiến hóa được tính toán để thiết lập cơ sở dữ liệu bao gồm trình
tự của VKDD Pseudomonas SP8 và các trình tự khác của nhóm Pseudomonas,
thuộc phân lớp gamma của Proteobacteria. Cây phả hệ đã được xây dựng lại trên
cơ sở các số liệu ma trận về khoảng cách thu được như hình 3.4, neighbour
joining thước đo = 0,0005 Knor trong trình tự nucleotid. Các giá trị hiển thị tại
các nhánh cây là kết quả phân tích boostrap với độ lặp lại 1000 lần. Giá trị
bootstrap cao trên nhánh giữa VKDD và P. fluorescens KC773765 (96%) dùng
hỗ trợ đánh giá cao mối quan hệ gần gũi giữa chúng.
Kết luận: chúng em dựa vào các kết quả hình thái học và phân tích giải trình tự
rADN 16S và đồng dựa vào các khóa phân loại khác. Định danh VKDD SP8
thuộc loài P. fluorescens, với vị trí phân loại khoa học như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Pseudomonadales
Họ: Pseudomonadaceae
27
Chi: Pseudomonas
Loài: P. fluorescens
Trong quá trình tìm hiểu và tham khảo các nguồn tài liệu, các kết quả nghiên
cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Chúng em nhận thấy các loài
thuộc chi Pseudomonas thường biết đến là các loài gây bệnh cho con người,
động vật và thực vật như: Pseudomonas aeruginosa trực khuẩn gây mủ xanh ở
người. Pseudomonas syringae gây bệnh đốm dầu ở thực vật. Tuy nhiên, loài P.
fluorescens được chứng minh là không độc, loài này còn được biết đến với khả
năng kháng lại một số loài nấm gây bệnh ở lá và rễ cây và thúc đẩy sinh trưởng
thực vật. Ngoài ra, đã có nhiều nghiên cứu về P. fluorescens có khả năng phân
hủy các hợp chất mạch vòng thơm khó phân hủy như naphthalene [24] và phân
hủy độc tố MCs của vi tảo lam M. aeruginosa.
4.2.3. Thu sinh khối VKDD P. fluorescens SP8:
Chúng em tiến hành lên men thu sinh khối P. fluorescens SP8 trong thiết bị
lên men 10 lít.
VKDD P. fluorescens SP8được nuôi cấy lắc trong bình tam giác trongmôi
trường LB, sau 24 giờ ở pha sinh trưởng, giống được cấy vào thiết bị lên men 10
lít với tỷ lệ cấy giống khác nhau (2, 5, 7, 10 và 15%) được nuôi cấy trong điều
kiện thích hợp, thay đổi tốc độ khuấy trộn (50, 100, 150, 200 và 250 vòng/phút),
lượng khí cung cấp khác nhau (0,6; 0,8; 1; 1,2 và 1,4 lít khí/lít dịch/phút) và các
thời gian khác nhau (12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ). Kết quả thể hiện ở hình 4.2.3.
Chúng em nhận thấy VKDD P. fluorescens SP8, sinh trưởng tăng dần theo
các thời gian lên men, đạt cao nhất tại 36 giờ với OD là 1,89 và giảm dần ở các
giờ nuôi cấy tiếp theo, đến 72 giờ OD giảm chỉ còn 1,55 (hình 3.2.3). Tốc độ
khuấy có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của vi khuẩn P. fluorescens SP8, với
tốc độ khuấy 200 vòng/phút OD sinh trưởng đạt cao nhất 1,87.
28
2 5 7 10 150
0.20.40.60.8
11.21.41.61.8
2
Tỷ lệ giống (%)
OD
600n
m
0.6000000000000
01
0.8 1 1.2 1.40
0.5
1
1.5
2
2.5
Tốc độ sục khí (lít khí/lít dịch/phút)
OD
600n
m
Hình 4.2.3. Điều kiện lên men thích hợp của VKDD P. fluorescens SP8
trong thiết bị lên men 10 lít
Sinh trưởng cũng gia tăng cùng với lưu lượng khí đưa vào, OD sinh trưởng
đạt 1,92 tại lưu lượng khí đưa vào là 1 lít khi/lít dịch/phút và bắt đầu giảm khi
lưu lượng khí tăng tới 1,4 lít khi/lít dịch/phút còn 1,72. Như vậy, tốc độ khuấy
giúp cho môi trường được đảo trộn và khí phân tán đều vào môi trường tăng tiếp
xúc bề mặt của vi khuẩn và làm tăng khả năng hấp thụ oxy. Tỷ lệ cấy giống thích
hợp là 5-7% với OD đạt 1,81 đến 1,83.
Dịch lên men chúng em ly tâm thu sinh khối, đông khô tạo thành một “bánh”
dạng rắn chứa 2-4% nước. Sau đó nghiền, bột VKDD được trộn với chất mang là
cám đã khử trùng, đóng gói và bảo quản ở nhiệt độ 4oC và độ ẩm kiểm soát chặt
chẽ để có được nồng độ vi sinh vật mong muốn (108) và sử dụng cho các nghiên
cứu tiếp theo.
4.3. Mô hình xử lý độc tố microcystins trong phòng thí nghiệm
4.3.1. Xử lý trực tiếp (vi khuẩn dạng tự do)
Chế phẩm P. fluorescens SP8 được hoạt hóa trong môi trường 1/10 LB, nhiệt
độ 28-30oC, trong 36 giờ. Giống VKDD ban đầu được bổ sung (1×108 tế bào/m2)
vào bể dung tích 25 lít chứa 20 lít nước hồ Hoàn Kiếm với nồng độ microcystins
20µg/l. Sự phân hủy sinh học MCs ở nhiệt độ 30oC. Sau 2 ngày, thu mẫu một lần
và xác định nồng độ microcystins còn lại trong bể. Kết quả thu được hình 4.3.1.
29
Từ hình 4.3.1 cho thấy, VKDD P. fluorescens SP8 bổ sung vào bể ở dạng tự
do trong môi trường, tốc độ phân hủy sinh học của chúng trong 5 ngày làm giảm
lượng microcystins từ 20 µg/l xuống còn dưới 1 µg/l. Ở ngày thứ 3, hàm lượng
MCs trong mẫu nghiên cứu còn 6,54 µg/l.
Hình 4.3.1. Thời
gian phân hủy
sinh học MCs
của VKDD
P. fluorescens
SP8 ở dạng tự do0 1 3 5
-20
0
20
40
60
80
100
120
% Microcystin
Hàm lượng microcystin
Thời gian (ngày)
% M
icro
cyst
inHà
m lư
ợng
mic
rocy
stin
s (µ
g/l)
VKDD P. fluorescens SP8 là loài có chùm tiên mao, nên sự hình thành màng
có thể giúp cho vi khuẩn di chuyển tốt hơn đồng thời tạo nên các tương tác giữa
bề mặt và tế bào. Đồng thời việc hình thành màng giúp cho VKDD trao đổi dinh
dưỡng và chuyển hóa chất hiệu quả hơn trong môi trường thể tích lớn hoặc đáp
ứng với những tác động của môi trường sống như nguồn dinh dưỡng và oxy.
Trong nghiên cứu tiếp theo, ứng dụng màng sinh học trong xử lý nước nhiễm
độc tố MCs.
Khả năng phân hủy của VKDD P. fluorescens SP8 trong bể khi xử lý trực
tiếp có sự tương đồng với VKDD Sphingomonas S1 theo nghiên cứu của
Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng sự [3].
30
4.3.2. Xử lý bằng bể có gắn màng sinh học
Các chủng vi sinh vật trong tự nhiên ít khi tồn tại riêng rẽ mà thường hình
thành tập hợp quần xã vi sinh vật với một loạt các hoạt động chức năng sinh lý
và sinh hóa. Sự tạo thành màng sinh vật diễn ra tại bề mặt rắn tiếp xúc với môi
trường chất lỏng. Trong nghiên cứu xây dựng mô hình, nhóm nghiên cứu sử
dụng vật liệu PS cho cố định màng sinh học của VKDD.
Mô tả chi tiết bể xử lý:
Bể xử lý màng sinh học bao gồm máy sục khí, phin lọc khí kích thước màng
0,22 µm, một bể chứa nhựa có kích thước 60×20×20 cm. Khi hoạt động, màng
sinh học hình trụ/hộp chữ nhật đã được đặt tại trung tâm của bể chứa và một hệ
thống màng PS đặt theo chiều thẳng đứng xung quang bể, một đế tản khí bên
dưới (hình 4.3,2a, 4.3.2b). Màng sinh học trong đó các tế bào VKDD được cố
định, có chiều dài 20-30 cm và chiều cao 10 cm. Theo mặt cắt ngang, có nhiều
màng xếp song song khoảng cách 3 mm tạo diện tích bề mặt lớn cho thành màng
sinh học. Không khí được cung cấp liên tục qua đường ống dẫn khí đến đế tản
khí/quả sục khí ở dưới bể thông qua một phin lọc vô trùng có kích thước 0,22
µm.
Hình 4.3.2a. Mô hình bể xử lý gắn màng sinh học
31
Hình 4.3.2b. Mô hình thực tế
Chú thích:
1- Lỗ thông khí 2- Phin lọc khí 3- Máy sục khí
4- Đế tản khí/quả sủi 5- Màng sinh học PS trụ/hộp chữ nhật
6- Màng sinh học PS 7- Bể chứa nhựa
Cố định màng sinh học:
Chế phẩm P. fluorescens SP8 được hoạt hóa trong môi trường dịch thể 1/10
LB, lắc 200 vòng/phút, và 30°C. Sau 24 giờ, dịch nuôi cấy VKDD được đổ/phun
vào trong và lên xung quanh màng trong bể chứa, các tế bào bắt đầu hình thành
màng sinh học trên bề mặt của màng PS ở 30°C trong 24 giờ.
Sau khi màng sinh học được hình thành, màng được rửa bằng 10 lít nước hồ
để loại bỏ các tế bào bám dính lỏng lẻo và mở rộng ra môi trường nuôi cấy.
Nước hồ Hoàn Kiếm với nồng độ microcystins 20 µg/l được bổ sung vào bể xử
lý.
Bể xử lý đặt ở nhiệt độ 28-30oC cho quá trình phân hủy sinh học được diễn
ra. Không khí sạch được cung cấp liên tục thông qua phin lọc kích thước 0,22
µm vào trong thùng chứa VKDD.
Sự tuần hoàn không khí qua đế tản khí/quả sục khí. Sau 1 ngày, mẫu được
lấy ra và xác định hàm lượng MCs.
32
Kết quả thể hiện trên hình 4.3.4.
Ở hình 4.3.4 chúng em nhận thấy cùng nồng độ MCs 20 µg/l, điều kiện nhiệt
độ xử lý như nhau nhưng xử lý bằng màng sinh học VKDD P. fluorescens SP8
cho thấy hiệu quả cao hơn so với xử lý bằng VKDD dạng tự do.
Chỉ sau 3 ngày nồng độ MCs đã giảm xuống chỉ còn 5,2% tương ứng với
1,04 µg/l MCS. Đến ngày thứ 4 không thấy sự có mặt của MCs trong mẫu nước
nghiên cứu.
0 1 2 3 4-20
0
20
40
60
80
100
120
% Microcystin
Hàm lượng microcystin
Thời gian (ngày)
% M
icro
cyst
inHà
m lư
ợng
mic
rocy
stin
s (µ
g/l) Hình 4.3.4.
Thời gian
phân hủy sinh
học MCs bằng
màng sinh học
VKDD
P. fluorescens
SP8
Tốc độ xử lý của hệ thống màng sinh học nhanh hơn so với xử lý trực tiếp
bằng VKDD dạng tự do 1-2 ngày. So với việc sử dụng các VKDD trôi nổi trong
nước để xử lý nước thì việc xử lý nước bằng màng VKDD mang lại nhiều lợi ích
đáng kể. Một là, số lượng các VKDD trong màng cao hơn nhiều, tạo điều kiện
xử lý tối đa nguồn nước. Thứ 2, chúng ta bỏ qua được giai đoạn loại bỏ VKDD
khỏi môi trường sau khi xử lý nước.
4.4. Thử nghiệm chế phẩm VKDD P. fluorescens SP8 và đánh giá khả năng
phân hủy độc tố trong điều kiện nhân tạo
4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phân hủy microcystins
Tốc độ của quá trình phân hủy MCs bởi bất kỳ VKDD nào, bao gồm P.
fluorescens SP8 phụ thuộc chính vào nhiệt độ. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả
năng phân hủy của VKDD (1,0×108CFU/ml) để phân hủy microcystins với nồng
33
độ 20 µg/ml. Sự phân hủy sinh học các MCs bởi VKDD trong khoảng nhiệt độ
giữa 10 và 35°C. Sự phân hủy microcystins diễn ra ngay trong ngày đầu tiên ở
tất cả các nhiệt độ thí nghiệm (hình 4.4.1).
Tốc độ phân hủy cao nhất đạt được ở nhiệt độ 30°C, tuy nhiên tốc độ phân
hủy trong suốt pha suy giảm nhanh ban đầu là tương đối giống nhau giữa các
nhiệt độ 25, 30 và 35°C và trong khoảng 6,32 µg/108CFU/ngày.
0 1 3 5 7 10 15 200
20
40
60
80
100
Thời gian (ngày)
Đ/c 3010 C15 C20 C25 C
% m
icro
cyst
in
Hình 4.4.1. Sự phân hủy microcystins bởi VKDD P.
fluorescens SP8 ở nhiệt độ 10, 15, 20, 25, 30 và 35°C
Nồng độ
microcystins giảm
nhanh ở các nhiệt
độ từ 20 đến 35°C,
sự phân hủy hoàn
toàn xảy ra trong 5
ngày. Tại những
nhiệt độ này, dễ
dàng nhận thấy độ
dốc thẳng đứng
của đồ thị trong
tốc độ phân hủy
xuất hiện sau giai
đoạn suy giảm
nhanh ban đầu.
Tốc độ phân hủy thấp nhất ở 10°C và tăng nhanh theo nhiệt độ đến 35°C
tương ứng 1,08; 3,18; 4,76; 5,92; 6,32 và 4,19 µg/108CFU/ngày. Ở 10°C, sự
phân hủy sinh học xảy ra rất chậm và giống với VKDD Sphingomonas S1 phân
hủy MCs theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng sự, điều này thể
hiện sự tương đồng khi không thể phân hủy MCs ở 4°C [1,3].
Khả năng phân hủy các chất độc của VKDD ở nhiệt độ thấp có liên quan
tới sự phân hủy các độc chất trong mùa đông khi nhiệt độ nước thấp.
34
Kết quả cho thấy nhiệt độ tối ưu cho phân hủy sinh học của chế phẩm P.
fluorescens SP8 là 30°C, điều này phù hợp với nhiệt độ tự nhiên. Ở nhiệt độ tối
ưu cho sự sinh trưởng của VKDD, sự chuyển hóa của VKDD rất nhanh, tạo ra
nhiều enzyme cho quá trình phân hủy MCs. Ngược lại, ở nhiệt độ thấp hoặc cao
hơn nhiệt độ tối ưu, chuyển hóa VKDD và quá trình sản sinh ra các enzyme cho
sự phân hủy sinh học có thể chậm, đồng thời tốc độ phân hủy MCs cũng chậm
theo.
4.4.2. Ảnh hưởng của số lượng tế bào VKDD:
Quá trình phân hủy sinh học độc tố cũng phụ thuộc vào số lượng VKDD.
Số lượng tối ưu của VKDD P. fluorescens SP8 phân hủy 20 µg/ml microcystins
được đánh giá ở 30°C (là nhiệt độ tối ưu để phân hủy microcystins ). Số lượng tế
bào vi khuẩn tương đối của cả ba VKDD bổ sung vào là OD600 = 0,1 (6,5×106
CFU/ml); OD600 = 0,3 (2,1×107 CFU/ml); OD600 = 0,5 (4,0×107 CFU/ml); OD600
= 1 (1,0×108 CFU/ml); OD600 = 1,5 (1,32 ×108 CFU/ml).
Tốc độ phân hủy chậm với số lượng tế bào VKDD bổ sung thấp (6,5×106
và 2,1×107 CFU/ml). Sau 1 ngày nuôi cấy với số lượng 6,5×106 và 2,1×107
CFU/ml, nồng độ MCs còn lại tương ứng là 88,9% và 45,3%.
Tốc độ phân hủy tăng theo sự gia tăng của số lượng VKDD. Với số lượng
VKDD là 4,0×107; 1,0×108 và 1,32×108 CFU/ml, tốc độ phân hủy không có sự
khác nhau đáng kể với tốc độ phân hủy như nhau là 6,32 µg/108CFU/ngày.
35
Sự phân hủy hoàn
toàn các MCs của
VKDD P.
fluorescens SP8 chỉ
trong 3 ngày ở tất cả
các số lượng tế bào
bổ sung (hình 4.4.2).
Khi số lượng VKDD
bổ sung vào nuôi cấy
cao hơn là 4,2×107,
1,0×108 và 1,40×108
CFU/ml, nồng độ
MCs chỉ còn lại
trong khoảng 12,9-
25,1%.
0 1 2 30
20
40
60
80
100
Thời gian (ngày)
Đ/cOD = 0.1OD = 0.3OD = 0.5OD=1OD = 1.5
% m
icro
cyst
in
Hình 4.4.2. Ảnh hưởng của số lượng tế bào VKDD P.
fluorescens SP8 đến tốc độ phân hủy microcystin
4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ microcystin
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất MCs cũng đã được nghiên cứu. Tùy vào
từng loài VKDD khác nhau thì khả năng phân hủy MCs là khác nhau. Ở các thời
điểm khác nhau ở các thủy vực chứa Microcystis thì nồng độ độc tố MCs cũng
khác nhau, tùy thuộc vào mức độ nở hoa của tảo lam Microcystis ở từng giai
đoạn. Vì vậy, nghiên cứu khả năng phân hủy MCs của chúng sẽ giúp tính toán
được thời điểm bổ sung các vi khuẩn nhằm xử lý độc tố MCs vào thời điểm thích
hợp nhất. Trong nghiên cứu này cơ chất MCs được sử dụng với nồng độ 1, 10,
20 và 50 µg/l đây là dải nồng độ có thể tồn tại trong thủy vực hồ Hoàn Kiếm
theo các nghiên cứu trước của Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng sự, mật độ VKDD
đưa vào ban đầu là 1×108 CFU [1,3].
36
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ MCs khác nhau lên sự phân
hủy sinh học trong hình 4.4.3. Tốc độ phân hủy của chế phẩm P. fluorescens SP8
tăng lên khi các nồng độ MCs tăng.
Ở nồng độ microcystins thấp (1 và 10 µg/ml), MCs bị phân hủy toàn bộ
trong 1 ngày. Khi nồng độ độc tố microcystins tăng cao (20 và 50 µg/ml), sự
phân hủy diễn ra từ từ.
0 1 3 5 60
20
40
60
80
100
Thời gian (ngày)
Đ/c
MCs = 1 µg/ml
MCs = 10 µg/ml
MCs = 20 µg/ml
MCs = 50 µg/ml
% m
icro
cyst
in
Hình 4.4.3. Phân hủy
sinh học microcystins bởi
VKDD P. fluorescens
SP8 với nồng độ MCs
khác nhau (1, 10, 25 và
50 µg/ml)
VKDD có thể sử dụng microcystins như nguồn C và N cho sự sinh trưởng
của chúng, nên hàm lượng các MCs cao là có ích đối với sự sinh trưởng của
VKDD. Tuy nhiên, những tác động hạn chế được nhận thấy rõ ràng của các nồng
độ độc chất cao (> 50 µl/ml) và giới hạn nồng độ các MCs mà P. fluorescens
SP8 có thể phân hủy, cần được đánh giá sâu hơn nữa, do những ảnh hưởng lên
sự sinh trưởng và chuyển hóa của VKDD vẫn chưa xác định được.
37
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận:
- Đã chứng minh được khả năng xử lý độc tố MCs của vi khuẩn P.
fluorescens.
- Bước đầu xây dựng được quy trình sử dụng màng sinh học từ P.
fluorescens để xử lý độc tố MCs trong các môi trường có nhiễm độc tố ở hồ
Hoàn Kiếm.
- Đã so sánh đối chiếu hiệu quả sử dụng của hai phương pháp sử dụng trong
nghiên cứu.
- Đề tài đã phân tích được những ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đến sự
phân hủy độc tố MCs. Từ đó có thể tạo điều kiện tối ưu để tăng hiệu quả xử lý
độc tố.
- Đồng thời, đề tài cũng đã đưa ra hướng nghiên cứu, xử lý tiếp theo đối với
các hồ có tình trạng tương tự áp dụng phương pháp sử dụng trong việc xử lý độc
tố trong hồ Hoàn Kiếm.
- Bên cạnh đó, đề tài đã chứng minh được tính an toàn đối với động vật thủy
sinh của chế phẩm bằng thực nghiệm và với động vật, con người nói chung qua
tài liệu tham khảo. Từ đó có thể sử dụng trực tiếp phương pháp xử lý của đề tài
để áp dụng vào thực tế.
2. Kiến nghị
- Do điều kiện thời gian còn hạn chế nên đề tài mới chỉ dừng lại ở một loài vi
khuẩn P. fluorescens trong việc xử lý độc tố MCs có trong nước hồ Hoàn Kiếm.
Vì vậy, chúng em kiến nghị cần mở rộng nghiên cứu các đối tượng khác sử dụng
để xử lý độc tố MCS trong nước.
- Tiếp tục nghiên cứu về độ an toàn của chất thải tạo ra khi xử lý.
- Nghiên cứu về ảnh hưởng lâu dài về hệ sinh thái của môi trường sau khi
được xử lý độc tố.
38
- Đề tài có thể được mở rộng để xử lý các nguồn nước có nhiễm độc tố MCs
do M. aeruginosa gây ra, như nước sông Đà cung cấp cho dân cư thủ đô Hà Nội
hiện nay hay các thủy vực nuôi trồng thủy sản nước ngọt.
- Để xử lý làm sạch MCs có nhiễm trong nước sông Đà cấp cho thủ đô Hà
Nội và các vùng khác, chúng em mong muốn các ban ngành có ý kiến chỉ đạo
việc xây dựng một hồ chứa nước sông Đà để xử lý độc tố MCs trước khi cung
cấp cho các nhà máy nước để nước sinh hoạt đưa đến từng hộ dân không còn
nhiễm microcystins , đảm bảo sức khỏe cộng đồng và giảm nguy cơ gây ung thư
đối với người sử dụng.
39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dương Đức Tiến và cộng sự (2002), Bảo vệ nguồn gen vi tảo (microalgae)
đặc hữu quý hiếm ở hồ Hoàn Kiếm – Hà Nội, Báo cáo khoa học trong
chương trình tài trợ bảo vệ môi trường và gìn giữ di sản văn hoá - Công ty
Ford Motor.
2. Đặng Đình Kim, Dương Thị Thủy (2014), Vi khuẩn lam độc nước ngọt, NXB
Khoa học tự nhiên và Công nghệ.
3. Nguyễn Thị Hoài Hà (2008), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả
năng phân hủy độc tố của một số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn
Kiếm, Hà Nội, Viện Vi sinh và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà
Nội.
4. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2010); Giáo trình vi sinh vật học- Tập 1-Thế
giới vi sinh vật, Nhà xuất bản đại học quốc gia Hà Nội.
Tài liệu Tiếng Anh
5. Bourne D.G., Jones G.J., Blakeley R.L., Jones A., Negri A. P. and Riddles P.
(1996). “Enzymatic pathway for the bacterial degradation of the
cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin LR”,Appl. Environ.
Microbiol, 62(11): 4086.
6. Bourne D.G., Riddles P., Jones G.J., Smith W and Blakeley R.L (2001).
“Characterization of a gene cluster involved in bacterial degradation of the
cyanobacterial toxin microcystin LR”,Environ. Toxicol. 16(6): 523.
7. Crittenden J. C., Trussell R. R., Hand, D. W., Howe, K. J and Tchobanoglous
G. (2005). Water Treatment: Principles and Design, (2nd ed.). New Jersey:
John Wiley and Sons.
8. Ilona G., Joanna M. B.(2012). “The Natural Degradation of Microcystins
(Cyanobacterial Hepatotoxins) in Fresh Water –the Future of Modern
Treatment Systems and Water Quality Improvement”,Pol. J. Environ. Stud,
21(5): 1125-1139.
40
9. Jones G.J., Bourne D.G., Blakeley R.L and Doelle H. (1994),“Degradation of
the cyanobacterial hepatotoxin microcystin by aquatic bacteria”,Nat. Toxins,
2(4): 228.
10. Krieg N. R. and Holt J.G. (1984-1989). Bergey's manual of systematic
bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore and London.
11. Luděk B., Pavel B. and Blahoslav M. (2009),“Toxins produced in
cyanobacterial water blooms – toxicity and risks”, Interdisc Toxicol., 2(2):
36–41.
12. Michelle B., Rick G. W., Conor M. and Ifor R. B.(2000),“Temperature
regulation of protease in Pseudomonas fluorescens LS107d2 by an ECF
sigma factor and a transmembrane activator”,Microbiology, (146): 3149–
3155.
13. Namikoshi M., Yuan M., Sivonen K., Carmichael W.W., Rinehart K.L.,
Rouhiainen L., Sun F., Brittain S. and Otsuki A (1998),“Seven new
microcystins possessing two L-glutamic acid units, isolated from Anabaena
sp. strain 186”,Chem. Res. Toxicol,(11): 143–149.
14. Pearson L., Mihali T., Moffitt M., Kellmann R. and Neilan B. (2010),“On the
chemistry, toxicology and genetics of the cyanobacterial toxins, microcystin,
nodularin, saxitoxin and cylindrospermopsin”,Mar. Drugs. 8(5): 1650.
15. Robertson P. K. J., Lawton L. A., CornishB. J. P. A., and Jaspars M. (1998).
“Processes influencing the destruction of microcystin LR by TiO2
photocatalysis”,Journal of Photochemistry and Photobiology: A Chemistry,
(116): 215-219.
16. Sahin A.; Tencalla F. G.; Dietrich D. R.; Mez K. and Naegeli H.
(1995),“Enzymatic analysis of liver samples from rainbow trout for diagnosis
of blue-green algae-induced toxicosis”,Am. J. Vet. Res. (56): 1110–1115.
17. T. Somdee (2010), Biodegradation of cyanobacterial hepatotoxins [Dha7]
MCS-LR and MCS-LR by natural aquatic bacteria [Ph.D.thesis], Massey
University,Wellington, New Zealand.
41
18. Van A., M. E., Egmond H. P., Speijers G. J. A., & Bakker G. J. I. (2007).
“Toxins of cyanobacteria”,Molecular Nutrition and Food Research, 51(7):
60.
19. WHO (1998a), Guidelines for drinking water quality, World Health
Organisation, Geneva.
20. Xu Z. Y. and Chen W.L. (2013) “Preliminary study of degradation pathways
and isolation identification of PAHs-naphthalene phenanthrene degrading
bacteria”,Biological Science and Technology Department, Huazhong
Agricultural University.
Tài liệu qua website
21. http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas
22. http://hanoi.vietnamplus.vn/Home/Ho-Hoan-Kiem-Thap-Rua-den-Ngoc-
Son/200910/213.vnplus
23. http://www.iucnredlist.org/details/full/39621/0
24. http://www.lenntech.com/scientific-books/eutrophication/biology-freshwater-
pollution.htm#ixzz3051vcNe9
25. http://microbiologyglossary.wikispaces.com/Pseudomonas+fluorescens
26. https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Pseudomonas
27. http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Pseudomonas_fluorescens
28. http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_fluorescens
42
DEPARTMENT OF EDUCATION AND TRAINING HANOI
NGUYEN HUE SPECIALIZED HIGH SCHOOL-HADONG
**************
TOPIC FOR CONTEST OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
FOR HIGH SCHOOL STUDENTS
(ACADEMIC YEAR 2014-2015)
Topic:
Contributing to protect human health and animals
through the treatment of microcystins in water by biological method
Field: Environmental Biology
ADVISER
Dr.Nguyen Thi Hoai Ha
Institute of Microbiology and
Biotechnology, Vietnam National
University, Hanoi
M.Sc. Trinh Viet Van
Nguyen Hue Specialized High School
HIGH SCHOOL STUDENTS
Grade11Students, Nguyen Hue Specialized High
School
Nguyen Huu Hai Trung
Huynh Duc Anh
Hanoi, January, 2015
43
TABLE OF CONTENTS
PART 1. WHY CHOOSE THIS TOPICS....................................................................5
1.1. Reason...................................................................................................................5
1.2. Objectives.............................................................................................................5
1.3. The new and creative points of the topic..............................................................6
1.4. Benefits of the topic..............................................................................................6
PART 2. INTRODUCTION..........................................................................................7
2.1. Hoan Kiem Lake...................................................................................................7
2.2. Cyanobacteria - Microcystis aeruginosa and microcystins..................................7
2.2.1. Microcystis....................................................................................................7
2.2.2. Mcirocystins (MCs).......................................................................................8
2.3. Heterotrophic bacteria Pseudomonas and degrade MCs....................................10
2.3.1. Pseudomonas...............................................................................................10
2.3.2. MCs decomposition mechanism..................................................................10
2.4. Research on toxin MCs in the world and Vietnam.............................................11
PART III. MATERIAL AND METHODS.................................................................13
3.1. Research subjects................................................................................................13
3.2. Chemicals...........................................................................................................13
3.3. Media..................................................................................................................13
3.4. Machineryandexperiment apparatus...................................................................13
3.5. Methods..............................................................................................................13
3.5.1. Isolate heterotrophic bacteria from Hoan Kiem lake..................................13
3.5.2. Count bacteria..............................................................................................14
3.5.3. Sequencing 16S rDNA analysis...................................................................14
3.5.4. Study on building microcystin toxin decomposition model........................14
PART IV. RESULTS AND DISCUSSION.................................................................17
4.1. Screening cyanobacteria Microcystis aeruginosa in natural samples...............17
4.2. Taxonomy of heterotrophic bacteria Pseudomonas SP8....................................19
4.2.1. Morphological characteristics.....................................................................19
4.2.2. Phylogenetic 16S rDNA analysis................................................................19
44
4.2.3. Biomass Pseudomonas fluorescens SP8.....................................................22
4.3. Model to treat microcystin toxins in labotory.....................................................23
4.3.1. Treating directly (free bacteria)..................................................................23
4.3.2. Treating using attached biofilm...................................................................24
4.4. Test bioproduct heterotrophic bacteria Pseudomonas fluorescens SP8 and evaluate
toxins degrade ability in artificial conditions............................................................26
4.4.1. Effect of temperature on degradation of microcystin..................................26
4.4.2. Effect of the concentration of heterotrophic bacteria cells..........................27
4.4.3. Effect of microcystin concentration............................................................28
PART V. CONCLUSION AND PETITION...............................................................30
REFERENCES.............................................................................................................31
45
LIST OF ABBREVIATIONS
ADN Acid Deoxyribo Nucleotide
C Carbon
MCs Microcystins
N Nitrogen
P Phosphorus
PCR Polymerase chain reaction
SEM Scanning electron micrograph
TE Tris Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
46
ACKNOWLEDGMENT
Authors of topic Contributing to protect human health and animals through the
treatment of microcystins in water by biological method would like to express deep
gratitude to Administrator Department of Nguyen Hue Specialized High School for helping
us in the time of implementing the topic.
We would like to thanks scientific adviser Dr. Nguyen Thi Hoai Ha, M.Sc. Pham Thi
Bich Dao, Bachelor Nguyen Dinh Tuan, Vietnam National University, Hanoi and our
teacher-MSc. TrinhVietVan, Nguyen Hue Specialized High School has instructed and
facilitated us to fulfill this topic.
We also would like to thank the teachers, students of Institute of Microbiology and
Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi has given advices and helped us in
implementing this topic.
Finally,we would like to send our gratitude to Father, Mother, Brother, Sister and family
and friends who helped and encouragedus during the implementation of the topic.
The authorss
Nguyen Huu Hai Trung
Huynh Duc Anh
47
PART 1. PURPOSE OF THIS TOPICS
1.1. Purpose
Through mass media, we know that water supply for Hanoi city from Da river, which
has Microcystis aeruginosa, cyanobacteria produce toxins microcystins (MCs) that affect
human health and aquatic animals. Besides, other large lakes such as Ba Be, Dau Tieng, ...
are in a similar situation.
From the field trip in Hoan Kiem Lake, a famous landmark in the capital Hanoi, we
found that the lake is strongly influenced from the rapid development of microalgae because
it isheavily polluted by organic waste, causing the phenomenon of "eutrophication" in the
lake. Through field trip to aquaculture ponds in the outskirts of Hanoi, we also saw the
appearance of toxic cyanobacteria in these ponds.
M. aeruginosa blooms increased MCs concentration, especially MC-LR, severely affects
organisms living in lakes, adversely affecting human health if use water contaminated with
MCs.
Through newspapers, article, radio and internet, we know that there are many
microorganisms capable of using cyanobacteria toxin MCs of M. aeruginosa as carbon
sources for growth, ensure theself-cleaning mechanisms of natural water bodies. Especially
Pseudomonas fluorescens, a heterotrophic bacteria present in Hoan Kiem Lake is of
interested study.
Based on the resulting data above, we studied the relationship between cyanobacteria M.
aeruginosa and heterotrophic bacteria P. fluorescens in Hoan Kiem Lake. Results of this
study will be a prerequisite for studies of MCs toxins treatment in MCs contaminated water
in lakes, ponds, etc. Therefore, we implement the topic:
"Contributing to protect human health and animals through the treatment of
microcystins in water by biological method."
1.2. Objectives
Identify and improve treatment efficiency of MCs toxins in Hoan Kiem lake by
bacteria P. fluorescens
Produce bioproduct that can be used to treat MCs in Hoan Kiem Lake and applied
to other water bodies such as in aquaculture ponds.
48
Find way to treat toxins MCs in the ponds for aquaculture by biological methods.
1.3. The new and creative points of the topic
This is the first topic that using bacteria P. fluorescens in treating toxin MCs
produced by M. aeroginosa in Hoan Kiem Lake and other water sources
contaminated with MCs.
Proposal produce biofilms from P. fluorescens to treat toxin MCs, increased
both treating efficiency and controlling by the amount of bacteria P. fluorescens,
so they do not excess.
The first time proposed method to clean drinking water through the application
of bacteria P. fluorescens to treat cyanobacteria toxins - MCs.
From the research can be applied in areas with similar conditions, such as lakes,
ponds contaminated with MCs, especially to reduce the amount of MCs in
drinking water supply from the Da River to Hanoi in order to protect human
health.
1.4. Benefits of the topic
Foster knowledge for research team about classification, cyanobacteria toxin
extraction and taxonomy of heterotrophic bacteria, contributing to the knowledge of
Biotechnology in environmental protection.
Foster and improve scientific research for staffs participating in the topic about
building plan, applying technology.
Exchange and engaged in research with scientists. Raise awareness of environmental
protection.
Provide tools and solutions for agency management to apply and transfer to treat
water eutrophication.
49
PART 2. INTRODUCTION
2.1. Hoan Kiem Lake
Hoan Kiem Lake has an area of 10.6ha, the average width of 200m, 600m in length, and
1.5 - 2.0m in depth. Appearance of the lake is blue due to the endemic algae species. The
composition of phytoplankton in Hoan Kiem Lake is richness [15,20].
In current 10 years, the surveys shows that cyanobacteria thrive, they dominated in the
phytoplankton community, especially cyanobacteria species such as Microcystis aeruginosa,
M. wesenbergii, M. viridis, M. botrys, Anabaena aphanizomoides, A. smithii,
Cylindrospermopsis raborskii.
2.2. Cyanobacteria - Microcystis aeruginosa and microcystins
2.2.1. Microcystis
Among cyanobacteria that generate MCs, Microcystis is the most common genus in
water bodies. Different from other cyanobacteria genera, Microcystis is characterize by
colonies consisted of many similar cells, enclosed in a mucilage, naked eye can see colonies
as caviar suspending in water. Colonies are 40 - 250μm in size, and composed of many
spherical cells [18].
Figure 2.1. Thick scums Microcystis on
water surface [13]
Figure 2.2. Colonies of Microcystis (×40)
Microcystis cells suspend in water as plankton. Microcystis belong to the
cyanobacteria genus that is incapable of fixing nitrogen. When blooms it forms scums
floating on the water surface that are spread by wind, sustained over a certain area and
prevailed throughout the year. The cells of Microcystis are very simple and can change
50
during different stages of growth. The ultrastructure seem quite similar for all types of
morphology [13].
The gas vacuoles are a characteristic of genus Microcystis, the main function of the
vacuoles is to make cells emerge, adapt to environmental conditions changes in the water
column.
The favorable conditions for the growth and development of cyanobacteria
Microcystis that lead to blooms in water is a combination of factors: adequate lighting
conditions, suitable water temperature (15 - 30ºC ), pH from neutral to alkaline (pH 6-9),
stagnant water bodies, hypoxic water, high levels of nutrients, high concentration of N and
P, light winds or no wind. Water contains toxic Microcystisand dried biomass of Microcystis
often smells fishy.
2.2.2. Microcystins (MCs)
Microcystins (MCs) are cyclic peptides, containing 7 amino acid, the chemical structure
(Figure 2.3) is the ring (D-Ala1-X2-D-MeAsp3-Y4-Adda5-D-Glu6-Mdha7). In particular, X
and Z are L-amino acids (such as Leucine (L), arginine (R), Tyrosine (T), alanine (A) or
methionine (M)), D-MeAsp acid D-erytho- methylaspartic and β-N-methyldehydroalanin
Mdha, Adda denote 3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-4,6-dienoic acid-phenyldeca
[8,9].
Figure 2.3. Chemical structure of microcystin [9]
51
Change in structure is changes in location of all seven amino acids, but major change
is the replacement of L-amino acid corresponding in position 2 and 4, and the separation of
methyl in D-MeAsp and Mdha corresponding in position 3 and 7 [8,16]. The position is
replaced to produce different variants of MCs. There are more than 80 variations of MCs.
Molecular weight of MCs is from 900 to 1100 Daltons.
Table 2.1. Amino acids in microcystins’ structure [9]
MCs Amino acid-X Amino acid-Z Molecular weight
Microcystin LA Leucine (L) Alanine (A) 910.06
Microcystin YR Tyrosine (Y) Arginine (R) 1045.19
Microcystin RR Arginine (R) Arginine (R) 1038.2
Microcystin LR Leucine (L) Arginine (R) 995.17
Four major considered MCs are different in amino acids at position X and Z. MCs is
named after the letter abbreviation of the amino acid at position X and Z respectively. The
most popular MCs are MC - LR, MC - RR and MC -YR. In particular, MC - LR is the most
studied substances and have high toxicity.
Figure 2.4. Chemical structure of MC-LR [9]
Most MCs contain hydrophobic L-amino acid. The replacement of hydrophobic L-
amino acid in the X position by others hydrophobic L-amino acid (such as alanine,
phenylanine or tryptophan) maintain toxicity, but replacement by hydrophilic amino acids
(such as arginine) will significantly reduce toxicity. MCs have polarized component
52
(hydrophilic) in the position of the amino acid substitutions, such as MC-RR (arginine-
arginine) and MC-M(O)R (methionine sulfoxyde, arginine), have the lowest toxicity.
Changes in the rest may or may not affect toxicity [8,16,18].
2.3. Heterotrophic bacteria Pseudomonas and degrade MCs
2.3.1. Pseudomonas
Pseudomonas is Gram-negative, aerobic, rod-shaped, non-spore and mobility by the
flagellum. They have the ability to release pigments into environment, such as yellow-green
fluorescence pyoverdine, green pyocyanin, thioquinolobactin.
Figure 2.5. Pseudomonas
cell [14]
The species of the genus Pseudomonas is widely
distributed in soil, water, plant and animal tissues,
therefore Pseudomonas have been studied very early and
so far we have had a lot of information about the
characteristics this species, as well as their genomes.
Species of the genus Pseudomonas of focused research
include: human pathogens species, e.g. P. aeruginosa is
the famous blue pus bacillus; plant pathogen P. syringae;
soil bacteria such as P. putida and groups that promote
growth in plants, e.g.P. fluorescens [19,21,24].
Some species of the genus Pseudomonas are optional aerobic organisms, in the absence
of O2 they can use NO3- as electron acceptors, hence they can live in the bottom of the pond
where O2 concentration is low and amounts of organic humus is high. Many species are also
proven to have simple nutritional needs, they can grow well in mineral medium
supplemented with various carbon sources. There have been many studies exploited fully or
part ofbiodegrade ability of P. fluorescens for pollutants such as styrene, and polycyclic
aromatic hydrocarbons [24].
2.3.2. MCs decomposition mechanism
In 2001, Bourne and et al. described the specific MCs decomposition mechanism by
multi-enzyme complexes [7] consists of 4 major enzymes:
Microcystinase: a metalloprotease (MlrA)
A serine peptidase 2 (MlrB)
53
A metalloprotease 3 (MlrC)
MlrD - a transport protein
Figure 2.6. Degradation pathway of MC-LR [9]
2.4. Research on toxin MCs in the world and Vietnam
Studies of the existence of cyanobacteria toxin and toxin decomposition are
developing and has demonstrated that MC-LR exist in water for 2 weeks prior to be
degraded by native bacteria, however a small concentration of toxin is detected more than
one month later. Only when the process of biodegradation begins, the removal of MCs can
reach 90% in 2-20 days. It depends on water bodies, initial concentration of MCs and water
temperature [11]. Typically, bacteria degrade cyanobacteriain two ways: direct and indirect.
Indirect way is to degrade microalgae cells by producing extracellular substances that kill
cyanobacteria, while the direct way is to killcyanobacteria cells by direct effects on the cells
[12].
Solutions that many scientists around the world interested in treating toxic
cyanobacteria and their toxins are physical method (filtered by soil, charcoal) or by
biological methods (competition for survival) to limit the development of cyanobacteria.
Then the study about the stability of MCs under UV radiation has been carried out, it has
54
been shown that the toxin rapidly decomposed by UV at shorter wavelengths. These
methods are cost effective but efficiency is not high and is not widely available.
David G. Bourne when study the bacterium capable of degrade MCs had discovered
that it was a new species belong to the genus Sphingomonas (formerly Pseudomonas), it
contains enzyme complex that are capable of degrade MC-LR,commoncyclic peptide toxins
from cyanobacteria [6,7,10]. Sphingomonasis bacteria that use MC-LR as only carbon and
nitrogen source for growth. Cell extracts of this strain have enzyme activity, involving
microcystinase activity indegrading MC-LR, but not related to nodularin - another
toxicpentapeptide. Enzyme activity was shown continuously in condition of bacteria
growing on the environment containing peptone - yeast extract or yeast extract - glucose.
In the year 2007 -2012 team of Microalgae Biology Lab, Institute of Microbiology
and Biotechnology has made remarkable achievements in research to explore the possibility
of degrading toxins MCsof cyanobacteriaMicrocystis aeruginosa in Hoan Kiem Lake,
Hanoi. The authors had isolated, preserved heterotrophic bacteria strains that are capable of
degrade MCs in a short time [4].
The resulting data showed that studies of water blooms in water bodies have shown
signs of the relationship between bloomsand the outbreak of biomass of cyanobacteria
species and the risk due to the effects of toxins from cyanobacteria.
The outbreak of cyanobacteria in Hoan Kiem Lake also been identified in many
surveys, this is also the risk of negative impacts on water quality in the lake that change
ecological imbalance in the lake, and further is the risks arising from toxins affect the fauna
of the lake as fishes, turtles, etc.
55
PART III. MATERIAL AND METHODS
3.1. Research subjects
Cyanobacteria Microcystisa eruginosa.
Heterotrophic bacteria Pseudomonas sp. SP8 isolated from Hoan Kiem lake, Hanoi.
3.2. Chemicals
Chemical used for analysis and experiment that had high pure from Sigma, Merk,…
3.3. Media
Medium for heterontrophic bacteria :
LB Medium (g/l): NaCl-10; Peptone-10; Yeats extract-5,0; pH 7.
NA Medium (g/l): Pepton -10 ; Meat extract-1, NaCl-1,5; pH 7
3.4. Machinery and experiment apparatus
Use machineryandexperiment apparatus of Microalgae Biology Lab., the laboratory
of the Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi.
Physical and Nano Technology Department, Technology University, Vietnam
National University, Hanoi.
3.5. Methods
3.5.1. Isolate heterotrophic bacteria from Hoan Kiem lake
2. Water sample collected in Hoan Kiem lake at cyanobacteria bloom area. Then, the samples
were filted by 20µm net filter.
3. One militer was diluted with suitable concentration. Heterotrophic bacteria were isolated from
the water sample collected in Hoan Kiem lake by an enrichment culture approach using NA
medium containing 10µg/l microcystin-LR. At 24h in the liquid medium, take 100µl and the
obtained colonies were streaked onto a NA agar plate. After 20-24 hours, heterotrophic bacteria
were selected as pigment producing bacterial strains that formed a clear zone around the colonies
on agar plate. Then, the colonies were cultured in LB medium and preseve at 4°C.
3.5.2. Count bacteria
Microgramins are cells that have ability growth to formed microbial communities. On
agar plate, communities have form, colour that called colony. From colony on agar plate,
estimate live cells in the samples.
56
To seperate cells, the samples diluted and vortex. Then streaked onto agar plate. The
cultures were incubated at 28oC for 24-48h and count colonies. Note: colonies have strange
and not caculate.
Bacteria concentration was caculated follow:
Bacteria concentration=
a∗1k
∗1
v
a: Colonies average on agar plate (same dillution)
v: Dilution volumes contaminat on agar plate
k: Dilution concentration
Units are CFU/ml or CFU/g, its means unit colonies in 1 ml (volumes) or gram (weight).
3.5.3. Sequencing 16S rDNA analysis
In this study, we were helped from “First base of Singapore” for 16S rDNA sequence of
bacteria.
Extract DNA
Amplification PCR products
Sequencing
Contributing phylogentic tree: sequence alignments were performed with program
CLUSTAL W. Gaps and ambiguous bases were eliminated from calculation. A
phylogenetic tree was constructed by the neighbor-joining method with the program
MEGA 5.10
3.5.4. Study on building microcystin toxin decomposition model
The purpose of the experiment: Identify the decomposition rate of microcystin toxins by
heterotrophic bacteria in bioproducts in tanks contain free bacteria compare with biofilm.
3.5.4.1. Treating directly (freebacteria)
Water sourcesusedin thestudy: lake water
Experiment tank made of plastic with dimensions: length× width× height=60×20×20cm.
Add microcystin to20 liters of water to get concentration of20μg/l. Additional services
probiotics may have been activated to concentrations of 108CFU/ml.
57
Subscribe microcystin concentration in the tank at the time: 0; 1; 3; 5 and 6 days of the
experiment. Experimental temperature: 30°C. Use aeration create uniformity throughout the
experimental period.
3.5.4.2. Treating using biofilm
The formation of biofilms on materials tack
To choose the best material for treating with attached biofilm, non-living surfaces used
material from PS(polystyrene) to determine the formation of biofilms. PS sheets are cut into
sheets with size of 1×2cm. The PS was cleaned with ethanol 70%, then rinse with sterile
distilled water. Put these sheets into sterile Petri dishes and dried at 40°C. Cultured medium
of heterotrophic bacteriawas add to these dishes, static incubate at 28-30°C, in 24, 48 and 72
hours. The formation of biofilm on the material sheets is checked by using a solution of 1%
crystal violet. Collect stained cells on the surface of the material and measuringthe
spectrumat a wavelength of 600nm. The calculationis as follows::
A=Am−Ac
Where in: Am is OD600 value of material sheet samples obtained after staining.
Ac is the OD600 values of heterotrophic bacteria medium on Petri dishes at the
same culture time
The abilityto form biofilm was estimated using the criteria of Stepanovic, Cirkovic, Ranin và
Svabic-Vlahovic (2004) [17] as follows:
A ≤ Ac - no biofilm formation
Ac < A ≤ (2×Ac) - weak biofilm formation
(2×Ac) < A ≤ (4×Ac) - moderate biofilm formation
(4×Ac) < A – high level biofilm formation
Treating using attached biofilm
Water sources used in the study: lake water. Experiment plastic tank with dimensions:
length× width× height=60×20×20cm. Add microcystin to 20liters of water to get
concentration of 20μg/l.
Biofilms are fixed on the sticky material fiberous polystyrene (PS)
58
Observe microcystin concentration in the tank over time: 0; 1; 3; 5 and 6 days of the
experiment. Experimental temperature is 30°C. Use aeration to creat uniformity throughout
the experimental period.
59
PART IV. RESULTS AND DISCUSSION
4.1. Screening cyanobacteria Microcystis aeruginosa in natural samples
The purpose of this study is characteristics about cyanobacteria M.aeruginosa. Based on
the unique of M.aeruginosa cells with gas vacuoles, they often float on the water surface.
Therefore, we collected samples from nature, centrifuged at 9000 rpm /15minutes. Then the
samples were observed on Zeissmicroscope at 400 magnification.
Results are shown in Figure 4.1 and 4.2
Figure 4.1. Microcystis sp.MC01
Colonies, cells are spherical and blue-green
with gas vacuoles, cell diameter of 3-6 µm,
colorless mucilage.
Figure 4.2. Microcystis sp. MC02
Colonies with spherical cells, cell are pale
blue, 3-7 µm in diameter, small colonies with
visible mucilage.
In Figure 4.1 and 4.2, we observed the morphological characteristics of the samples
collected have many similarities with the theoretical description, such as the cells are
spherical, the colonies withvisible mucilage, withgas vacuoles inside the cell, the cells
diameter are 3-7μm. Our description above consistent with those described by Watanabe.
The samples were named MC01 and MC02 respectively.
Next study, we analyzed 16S rADN sequences. Results show that collected
cyanobacteria belong to M.aeruginosa (90-97%).
Study on collecting large amount biomass and ophilized procedure of cyanobacteria
Microcystis aeruginosa fromHoan Kiem lake
Inthis study, we aimed to collected large amount of biomass, for extraction MCs. We
conduct the following steps:
Cyanobacteria sampleswere collected on hot sunny days of summer in the year.
60
Figure 4.3. Collected samples at Hoan Kiem lake
Lyophilize procedure:
Collect samples with filter net No. 75
Centrifuge (7000rpm/20mins)
Collect submerge cyanobacteria biomass (Microcystis aeruginosa accounts> 90%)
Check morphology with Zeiss phase contrast microscope (×40)
Preliminary identify cyanobacteria Microcystis aeruginosa
Wash the biomass (1‰ NaCl)
Vacuum lyophilize cyanobacteria biomass at -83oC until dry
Preserve in plastic bag
61
Figure 4.4. Lyophilize biomass Microcystis aeruginosa
4.2. Taxonomy of heterotrophic bacteria Pseudomonas SP8
4.2.1. Morphological characteristics
In this study, we observed colonies on agar plate. Cells characteristics under scanning
electron microscope (SEM) with 15000 magnification. Heterotrophic bacteria SP8 are
Gram-negative, have flagella, capable of secrete pigments to culture medium and
fluorescence under ultraviolet.
Figure 4.5. Colonies of heterotrophic
bacteria SP8 (24 hours)
Figure 4.6. SEM image of heterotrophic bacteria
SP8 (x15000)
Fig 4.6 was taken under scanning electron microscope(SEM) with a magnification of
15000 showed that heterotrophic bacteria SP8 have cylindrical cells, the size of about1-2μm.
We were not observed flagella because the cell have mucilage.
Conclude: Base on morphological characteristics and other taxonomy data, we
preliminary classify heterotrophic bacteria SP8 belong to genus Pseudomonas, denoted
Pseudomonas SP8. The next study, we analyzed 16S rDNA sequence.
4.2.2. Phylogenetic 16S rDNA analysis
62
By helped of labotory “First base of Singapore” for 16S rDNA analysis, we had the
results of Pseudomonas SP8 sequence.
Heterotrophic bacteria
Pseudomonas SP8 strains
closely related to the strains
of the genus Pseudomonas.
The gene sequences was
similar 99% with species P.
fluorescens KC773765 và
14 other species that
published in GenBank.
Figure 4.7. PCR products of Pseudomonas SP8
Evolutionary distances were calculated to establish the database consists of
Pseudomonas SP8 sequences and some other related taxa of Pseudomonas, belong to
gamma-Proteobacteria. Phylogenetic tree (Figure 4.8) was drawn by neighbor-joining
method Knor measure = 0.005 nucleotide sequences. Các giá trị hiển thị tại các nhánh cây là
kết quả phân tích boostrap với độ lặp lại 1000 lần. Bootstrap values expressed as percentages
of 1000 replicates. High bootstrap values at branch points of Pseudomonas SP8 và P.
fluorescens KC773765 (96%) showed close relationship.
Conclude: Based on morphology, phylogenetic 16S rDNA analysis and other taxonomy
data, heterotrophic bacteria Pseudomonas SP8 isolated from Hoan Kiem lake were classified
in Pseudomonas genus and named Pseudomonas fluorescens SP8 Classification of
Pseudomonas fluorescens SP8 as follows:
Kingdom: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Class: Gammaproteobacteria
Oder: Pseudomonadales
Family: Pseudomonadaceae
Genus: Pseudomonas
Species: P. fluorescens
63
1500 bp
.
Figure 4.8. Neighbor-joining phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence indicating
the position of strain SP8 in relation to other related species
Species of genus Pseudomonas are usually species that cause disease inhumans, animal
sand plants, such as Pseudomonas aeruginosa is blue pus bacillus, Pseudomonas syringaeis
plant pathogen. However, the species Pseudomonas fluorescensare defined as non-toxic and
does not cause diseasein humans, this speciesis also known for resistance to several
speciesof plant pathogenic fungi and promote plant growth. This is of great significance in
the application of MCs degradation by heterotrophic bacteria SP8 intreating waters
contaminated with MCs and the outbreak of Microcystis including Hoan Kiem Lake.
4.2.3. Biomass Pseudomonas fluorescens SP8
P. fluorescens SP8 is incubated inshaking flasks on LB medium, after 24 hours in the
growth phase, strain is inoculated into10-liter fermenter with different inoculation rate (2, 5,
64
7, 10 and 15%) and incubated in appropriate conditions, variable stiring speed (50, 100, 150,
200 and 250rpm), different oxy supply (0.6; 0.8; 1; 1.2 and 1.4 liter oxy/liter medium/min)
and different times (12, 24, 36, 48, 60 and 72 hours). Results are shown in Figure 4.9.
P.fluorescens SP8 growth increases with fermentation time, peaked at 48 hours with
OD600 is 1.89 and decreases in the next hour incubation, til 72 hours OD600 reduced to 1.55
(Figure 4.9). Stirring speed had a great influence on the growth of P.fluorescens SP8, with a
stirring speed of 200 rpm/minute, OD600 is highest at 1.87..
12 24 36 48 60 720
0.5
1
1.5
2
2.5
Time (hours)
OD
600n
m
50 100 150 200 2500
0.20.40.60.8
11.21.41.61.8
2
Stiring speed (rpm/min)
OD
600n
m
2 5 7 10 150
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
Ratio culture (%)
OD
600n
m
0.6000000000000
01
0.8 1 1.2 1.40
0.5
1
1.5
2
2.5
Oxy (liter/medium liter/min)
OD
600n
m
Figure 4.9. Fermentation condition of heterotrophic bacteria P. fluorescens SP8 in 10
liter fermenter
Growth also increased along with the flow of oxy, OD reached 1.92 in the flow of oxy at
1 liter oxy/liter medium/min and start to reduce when the oxy flow increased to1.4 liters
oxy/liter medium/min to 1.72. Thus, stirring speed help the environment to be mixed and
oxy dispersed into the environment increased contact surface of bacteria and increase the
ability to absorb oxygen. The appropriate inoculaterate is 5-7% with OD reach1.81 to 1.83.
65
After fermention, biomass were collected by centrifuge and lyophilize until dry (about 2-
4% water). Then, biomass dry mixed with bran-rice sterile, preserve at 4ºC and controlled
wet, with bacteria concentration 108 used for the next study.
4.3. Model to treat microcystin toxins in labotory
4.3.1. Treating directly (free bacteria)
Bioproduct P.fluorescens SP8 is activated in LB 1/10 medium, temperature 28-30°C, in
36 hours. Initial heterotrophic bacteria strain was added (1 ×108cells/m2) in 25-liter tank with
20 liters water containing the microcystin concentration of 20μg/l. The biodegrade of MCs
occurs at30°C. After two days, sample donce and determine the concentration of microcystin
left in the tank.The result are shown infigure 4.10.
Figure 4.10 shows that free P.fluorescens SP8 was add to the medium,
biodegradationrate in 5 days reduce the amount of microcystin from 20µg/l to less than
1µg/l. At day 3, microcystin concentrations in the sample treated with bioproduct
P.fluorescens SP8 was 6.54µg/l.
Figure 4.10
Biodegradation of
MCs by free P.
fluorescens SP8
0 1 3 5-20
0
20
40
60
80
100
120
% MicrocystinHàm lượng microcystin
Time(days)
% M
icro
cyst
inC
once
ntra
tion
mic
rocy
stin
s (µ
g/l)
P.fluorescens SP8 was ciliated species, so the formation of membrane can help the
bacteria to move better and produce interactions between the surface and the cell . Also,the
formation of membrane makes heterotrophic bacteria exchange nutrients and metabolyse
more effectively in large volumes or to respond to the effects of the environment such as
nutrients and oxygen source. In subsequent studies, the application of biofilm in degradation
of microcystint oxins.
Degradation ability of P.fluorescens SP8 in the tank when treating directly have the
66
similarity with heterotrophic bacteria Sphingomonas S1 according to a study by Nguyen Thi
Hoai Ha and et al [4].
4.3.2. Treating using attached biofilm
Microorganism strains in naturerarely exist alone but often forming microbial
communities with a variety of physiological function and biochemistry. The membrane
forming occur in solid surface exposed to liquid environment. In this study, membrane
materials PS was used.
Detailed description of treatment tank:
Biofilms treatment tank in clude aeration, air filter with membrane size 0.22μm, a plastic
tank size of 60×20×20cm. When working, the cylindrical/rectangular paralle lepiped biofilm
has been placed at the center of the tank and a membrane system PS is placed vertically
around the tank, a aerator stone beneath (figure 4.11, 4.12).
Figure 4.11. Diagram of treatment tank
with biofilms
Figure 4.12. Models treatment tank with
biofilms
(1- Round; 2- Filter; 3- Air pump; 4- Aerator stone; 5- Cylindrical/rectangular paralle
lepiped biofilm; 6- PS menbrane; 7- Plastic tank)
Biofilms in which heterotrophic bacteria cells are fixed, are 20-30cm in length and 10cm in
height. Undercross-section, there are many films aligned parallel distance of 3 mmto create a
large surface are a for biofilm. Air is supplied continuously to an aerator stone beneath PS
menbrane via a sterile filter size 0.22μm.
Fixed biofilm:
67
Bioproduct P.fluorescens SP8 were activated in LB 1/10 medium, shaking 200rpm, at
30°C. After 24 hours, incubation liquid was poured/spray in and around the membrane into
the tank, the cells began to form biofilms on the surface of the PS membrane at 30°C in 24
hours.
After biofilm is formed, the membrane is washed with 10 liter lake water to remove the
loose adhesion cell and extend the culture medium. The lake water with microcystin
concentration of 20µg/l was added to the treatment tank.
Treatment tank temperature is set at 28-30°C for biodegradation process to take place.
Clean air is supplied continuously through the filter with size 0.22μm into the microbiology
container.
The air circulating through the air sinks. After 1 day, sample is taken to determine the
amount of microcystin. The results are shown in Figure 4.13.
Figure 4.13 shows the microcystin concentration (20 µg/l), same temperatures treatment
but treatment with biofilms of bacteria P.fluorescens SP8 shows better effect than treatment
with free heterotrophic bacteria.
0 1 2 3 4-20
0
20
40
60
80
100
120
% MicrocystinHàm lượng microcystin
Time (days)
% M
icro
cyst
inC
once
ntra
tion
mic
rocy
stin
s (µ
g/l)
Figure 4.13.
Biodegradation of
MCs by biofilm of
bacteria P.
fluorescens SP8
After only 3 days, microcystin concentration reduced to 5.2% corresponding to 1.04µg/l
microcystin. Til day 4 there was no microcystin in water samples.
Treating rate of biofilm system is faster than direct treating by free heterotrophic
bacteria about1-2days. Compared with the use of heterotrophic bacteria floating in the
water,water treatment heterotrophic bacteria membrane is significant benefits. Firstly, the
number of heterotrophic bacteria in membrane is much higher, facilitate optimal condition to
68
treat water. Secondly, apart from removing substance in water, the process is not followed
by the removal of heterotrophic bacteria from the environment.
4.4. Test bioproduct heterotrophic bacteria Pseudomonas fluorescens SP8 and evaluate
toxins degrade ability in artificial conditions
4.4.1. Effect of temperature on degradation of microcystin
The speed of MC degrade process by any heterotrophic bacteria, including P.fluorescens
SP8 depends mainly on temperature. Effect oftemperature on the degrad ability of
heterotrophic bacteria (1.0 ×108CFU/ml) to degrade microcystin with concentrations of
20µg/ml. The biodegradation of MCs byheterotrophic bacteria in the temperature range
between 10 and 35°C. Microcystin degradation takes place on the first day at all
experimental temperatures (Figure 4.14).
The highest decomposition rate reached at 30°C, however, the degrade rate during the
initial rapid decline phase was similar between the temperatures of 25, 30 and 35°C and
about 6.32µg/108CFU/day.
0 1 3 5 7 10 15 200
20
40
60
80
100
Time (days)
Đ/c 3010 C15 C20 C
% m
icro
cyst
in
Figure 4.14. MCs degradation by heterotrophic bacteria P.
fluorescens SP8 at 10, 15, 20, 25, 30 and 35°C
Microcystin
concentrations
decreased rapidly at
temperatures between
20 and 35°C, the
complete degradation
occurs in 5 days. At
these temperatures,
easily observe
vertical slope of the
graph of the
degradatio no ccurs
after an initial rapid
decline.
Degradation rate is lowest at 10°C and increased corresponding the temperature to
35°C with 1.08; 3.18; 4.76; 5.92; 6.32 and 4.19 µg/108CFU/day. At 10°C, the biodegradation
69
occurs very slowly and similar to heterotrophic bacteria Sphingomonas S1 degradation under
study by Nguyen Thi Hoai Ha and et al., this presents similarity when can not degrade MC
at 4°C [4].
Ability to degrade toxins by heterotrophic bacteriaatlow temperature related to the
breakdown of toxins in the winter when the water temperature is low.
The results showed thatthe optimal temperature for the biodegradation of bioproduct
P.fluorescens SP8 is 30°C, this is consistent with the natural temperature. At the optimal
temperature for growth of heterotrophic bacteria, the metabolism of heterotrophic bacteria is
rapid, produce many enzymes for the degradation of MCs. In contrast, at lower temperatures
or higher than the optimal temperature, metabolic heterotrophic bacteria and the production
of enzymes for biodegradation can be slow, and MCs degradationrate is slow as well.
4.4.2. Effect of the concentration of heterotrophic bacteria cells
The process of toxinbiodegradationalsodependson the numberof heterotrophic
bacteria. Optimal number of P.fluorescens SP8 to degrade 20μg/ml microcystinis evaluated
to be at 30°C (optimum temperature for degrading microcystin). Concentration
P.fluorescens SP8 added: OD600 = 0,1 (6,5×106 CFU/ml); OD600 = 0,3 (2,1×107 CFU/mL);
OD600 = 0,5 (4,0×107 CFU/mL); OD600 = 1 (1,0×108 CFU/mL); OD600 = 1,5 (1,32 ×108
CFU/mL).
The complete degradation of
MCs by P.fluorescensSP8 in
3 days in all the additional
concentration bacteria
(Figure 4.15) When the
amount added to the
incubated heterotrophic
bacteria higher than 4.2×107,
1.0×108 and
1.40×108CFU/ml, the
concentration of MCs only
remaining within 12.9 to
0 1 2 30
20
40
60
80
100
Time (days)
Đ/cOD = 0.1OD = 0.3OD = 0.5%
mic
rocy
stin
Figure 4.15. Influence of heterotrophic bacteria P.
fluorescens SP8 concentration on MCs degradation rate
70
25.1%.
Slow decomposition rate with low concentration of bacteria added (6.5 ×2.1×106 and
107CFU/ml). After 1 day of incubation with 6.5×106 and of 2.1×107CFU/ml, the
concentrations of MCs remaining are 88.9% and 45.3% respectively.
Degradation rate increases with the increase in the number of heterotrophic bacteria.
With the amount of heterotrophic bacteria are 4.0×107; 1.0×108 and 1.32×108CFU/ml, the
degradation rate does notdiffer significantly from the same degradation rate of
6.32µg/108CFU/day.
4.4.3. Effect of microcystin concentration
Effect of MCs concentration has also been studied. Depending on different heterotrophic
bacteria species, MCs degradation is different. At various times in water bodies containing
toxic Microcystis,MCs concentration varies, depending on the bloom level of cyanobacteria
Microcystis at different stages. Therefore, the study of ability to degrade MCs will help to
calculate the time to add bacteria to treat MCs toxin. In this study, MCs substrates are used
at concentration of 1, 10, 20 and 50μg/l is the concentration range may exist in Hoan Kiem
Lake according to previous studies of Nguyen Thi Hoai Ha and et al., initial bacteria density
was1×108CFU [4].
0 1 3 5 60
20
40
60
80
100
Time (days)
Đ/cMCs = 1 µg/mlMCs = 10 µg/mlMCs = 20 µg/mlMCs = 50 µg/ml%
mic
rocy
stin
Figure 4.16. Biodegradation of MCs by heterotrophic
bacteria P.fluorescens SP8 with different MCs
concentration (1, 10, 25 and 50 µg/ml)
Heterotrophic bacteria can use
microcystin as C and Nsource
for their growth, so high levels
of MCs is useful for the
growth of heterotrophic
bacteria. However, the
limiting impact of higher toxin
concentrations (>50µl/ml) and
limit the concentration of MCs
that P.fluorescens SP8 can
degrade, need further
evaluation, due to its impact
on the growth and metabolism
71
of heterotrophic bacteria not
yet to be determined.
Results of the study about effects of different concentrations of MCs on the
biodegradation are shown in Figure 4.16. Degradation rate by P.fluorescens SP8 increases as
the concentration of microcystin increase.
At low concentrations of microcystin (1 and 10µg/ml), MCs are whole degraded in one
day. When the toxin microcystin concentrations increased (20 and 50µg/ml), the degradation
takes places lowly.
72
PART V. CONCLUSION AND PETITION
Coclusion
1. Based on morphology and phylogenetic 16S rDNA analysis, heterontrophic bacteria
SP8 isolated form Hoan Kiem lake belonging to species Pseudomonas fluorescens,
growth well at 28-30oC; pH 7-8.
2. Suitable conditions for fermention of Pseudomonas fluorescens SP8 into10 liter
fermenter, reached OD>1,8, culture rate 5-7%, stiring speed 200 rpm/min, oxygen 1
liter air/liter volume/minute/ 48 hours.
3. MCs degradation by heterotrophic bacteria Pseudomonas fluorescens SP8 was ở 30oC,
bacteria concentration 108/ml, MC concentration 20µg/ml. Treating rate of biofilm
system is faster than direct treating by free heterotrophic bacteria about1-2days. Free
P.fluorescens SP8 treatment, biodegradationrate in 5 days At day 3, microcystin
concentrations in the sample treated with bioproduct P.fluorescens SP8 was 6.54µg/l.
After only 3 days, microcystin concentration reduced to 1.04µg/l microcystin.
Recommendations
o Because limited study time, the topic only studied on P. Fluorescens SP8 for MCs
degradation in water of Hoan Kiem lake.
o Continues to study about safety after treatmention
o Study on ecology after treating microcystin toxins.
73
REFERENCES
Vietnamese
1. Đặng Đình Kim, Dương Thị Thủy (2014), Vi khuẩn lam độc nước ngọt, NXB Khoa
học tự nhiên và Công nghệ.
2. Dương Đức Tiến và cộng sự (2002), Bảo vệ nguồn gen vi tảo (microalgae) đặc hữu
quý hiếm ở hồ Hoàn Kiếm – Hà Nội, Báo cáo khoa học trong chương trình tài trợ bảo
vệ môi trường và gìn giữ di sản văn hoá - Công ty Ford Motor.
3. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2010); Giáo trình vi sinh vật học- Tập 1-Thế giới vi
sinh vật, Nhà xuất bản đại học quốc gia Hà Nội.
4. Nguyễn Thị Hoài Hà (2008), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả năng
phân hủy độc tố của một số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội,
Viện Vi sinh và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
5. Nguyễn Thị Thu Liên (2008 – 2010), “Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử
(molecular marker) trong việc thăm dò và xác định sự hiện diện của một số loài tảo
lam độc hại trong một số thuỷ vực nước ngọt ở Việt Nam” Đề tài cấp- Đại học Quốc
gia, Hà Nội.
English
6. Bourne D.G., Jones G.J., Blakeley R.L., Jones A., Negri A. P. and Riddles P. (1996).
“Enzymatic pathway for the bacterial degradation of the cyanobacterial cyclic peptide
toxin microcystin LR”, Appl. Environ. Microbiol, 62(11): 4086.
7. Bourne D.G., Riddles P., Jones G.J., Smith W and Blakeley R.L (2001).
“Characterization of a gene cluster involved in bacterial degradation of the
cyanobacterial toxin microcystin LR”, Environ. Toxicol. 16(6): 523.
8. Carmichael, W. W., Beasley, V., Bunner, D. L., Eloff, J. N., Falconer, I., Gorham, P.,
et al. (1988). Naming of cyclic heptapeptide toxins of cyanobacteria (blue- green
algae). Toxicon,26, 971-973.
9. Dittmann, E., & Wiegand, C. (2006). Cyanobacterial toxins--Occurrence, biosynthesis
and impact on human affairs. Molecular Nutrition and FoodResearch, 50, 7-17.
74
10. Hai-Dong Huang, Wei Wang, Ting Ma, Guo-Qiang Li, Feng-Lai Liang and Ru-Lin
Liu, (2009), Sphingomonas sanxanigenen ssp. nov., isolated from soil. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 59.pp.719–723.
11. Heussen, C. and Dowdle, E. (1980) Electrophoretic analysis of plasminogen
activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and
copolymerized substrates. Analytical Biochemistry, 102, 196-202.
12. Hitzfeld, B. C., Höger, S. J., & Dietrich, D. R. (2000). Cyanobacterial toxins:
Removal during drinking water treatment, and human risk assessment.
Environmental Health Perspectives, 108, 113–122.
13. Lenka Šejnohová, (2008), Microcystis, New findings in peptide production, taxonomy
and autecology by cyanobacterium Microcystis, Masaryk University in Czech
Republic, Faculty of Science Department of Botany and Zoology & Institute of
Botany Czech Academy of Sciences.pp.16-38.
14. Luděk B., Pavel B. and Blahoslav M. (2009),“Toxins produced in cyanobacterial
water blooms – toxicity and risks”, Interdisc Toxicol., 2(2): 36–41.
15. Sakane T, Takeuchi M, De Bruyn A, Kereters K, Yokota A (1995), Distribution of
3-katolectose formation among Sphingomonas spp. and other members of alpha
subclass of Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol 45.pp.342-347.
16. Sivonen, K., & Jones, G. (1999). Cyanobacterial toxins. In: I. Chorus & J. Bartram
(Eds), Toxic Cyanobacteria in water: A guide to their public health consequences,
monitoring and management (pp. 41-111).
17. Stepanovic, S., Cirkovic, I., Ranin, L., & Svabic-Vlahovic, M. (2004). Biofilm
formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters
in Applied Microbiology, 38, 428–432.
18. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., & Prepas, E. E. (2005). Hepatotoxic
cyanobacteria: A review of the biological importance of microcystins in freshwater
environments. Journal of Toxicology and Environmental Health part B: Critical
Reviews, 8, 1-37.
Website
19. http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas
75
20. http://hanoi.vietnamplus.vn/Home/Ho-Hoan-Kiem-Thap-Rua-den-Ngoc-Son/
200910/213.vnplus
21. http://microbiologyglossary.wikispaces.com/Pseudomonas+fluorescens
22. http://www.iucnredlist.org/details/full/39621/0
23. http://www.lenntech.com/scientific-books/eutrophication/biology-freshwater-
pollution.htm#ixzz3051vcNe9
24. https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Pseudomonas
76