long-term striatal overexpression of gdnf selectively downregulates tyrosine hydroxylase in the...

11
Long-term striatal overexpression of GDNF selectively downregulates tyrosine hydroxylase in the intact nigrostriatal dopamine system Carl Rosenblad, 1 Biljana Georgievska 2 and Deniz Kirik 2 1 NsGene A/S, Ballerup, Denmark 2 Wallenberg Neuroscience Centre, Department Physiological Sciences, Lund University, Lund, Sweden Keywords: autoradiography, lentivirus, rat, striatum, substantia nigra Abstract Sustained neurotrophic factor treatment in neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease is likely to affect both degenerating and intact neurons. To investigate the effect of long-term glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) overexpression on intact nigrostriatal dopamine neurons, weinjected a recombinant lentiviral vector encoding GDNF, or green ¯uorescent protein, in the right striatum of young adult rats. Thirteen months after viral injection GDNF levels were 4.5 ng/mg tissue in the striatum and 0.9 ng/mg in the substantia nigra as measured by ELISA, representing a 25±100-fold increase above control vector- or nontransduced tissue. GDNF overexpression signi®cantly reduced tyrosine hydroxylase mRNA levels (by 39±72%) in the substantia nigra and ventral tegmental area neurons, and the optical density of tyrosine hydroxylase-immunoreactive innervation in the striatum was reduced by 25±52% with the most prominent reductions appearing caudally. No signi®cant reduction was seen in striatal vesicular monoamine transporter 2-immunoreactivity or [ 3 H]mazindole binding autoradiography to dopamine uptake sites, two other presynaptic markers in dopamine axon terminals. The striatal D1 and D2 receptor binding as determined by [ 3 H]SCH23390 and [ 3 H]spiperone binding, respectively, wasunaltered relative to the intact side in both treatment groups. Preproenkephalin mRNA levels in postsynaptic striatal neurons, which increase upon removal of striatal dopamine, were also unaffected by the GDNF treatment. Taken together our ®ndings indicate that sustained GDNF administration to intact nigrostriatal dopamine neurons selectively reduces tyrosine hydroxylase expression, without altering striatal dopamine transmission to the extent that compensatory changes in several other components related to dopamine storage and signalling occur. Introduction A growing body of evidence indicate that glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) exert profound neurotrophic and phar- macological effects on injured nigrostriatal dopamine (DA) neurons and may therefore be useful to prevent the neurodegeneration under- lying Parkinson's disease. Injections of GDNF protein have been shown to prevent the death of injured nigrostriatal dopamine neurons in vivo (Beck et al., 1995; Sauer et al., 1995; Tomac et al., 1995; Kearns et al., 1997; Tseng et al., 1997), as well as the retrograde degeneration of DA axons induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine (Kirik et al., 2000a; Rosenblad et al., 2000a). GDNF can also promote sprouting from axotomized DA neurons (Kirik et al., 2000a, b; Rosenblad et al., 2000b; Georgievska et al., 2002). Preservation and/or regeneration of striatal DA axon terminals is pivotal for recovery of motor function (Bjorklund et al., 2000) and is seen following GDNF administration to the DA axon terminals in the striatum, but not substantia nigra (SN) (Kirik et al., 2000a, b). More- over, functional recovery is best obtained with sustained GDNF treatment as indicated by recent studies in rodent and primate models of Parkinson's disesase. Kirik et al. (2000b) showed that striatal but not nigral GDNF expression from a recombinant adeno-associated virus vector could prevent degeneration as well as induce sprouting and functional recovery in the partial 6-hydroxydopamine lesion model, and Kordower et al. (2000) found that GDNF expression from a recombinant lentiviral (rLV) vector attenuated cell loss and functional impairments in a primate model of Parkinson's disease. From a clinical perspective, it may be preferable if a protective therapy in patients with Parkinson's disease can be initiated early in the course of the disease to prevent further cell loss. Because not all DA neurons degenerate uniformly, this will mean that some intact DA neurons also receive sustained GDNF treatment. In the intact nigros- triatal system, exogenous GDNF increases DA levels and DA turnover on the treated side shortly after injection into the SN or striatum, and induced a turning response when animals were challenged with amphetamine (Hudson et al., 1995; Beck et al., 1996; Horger et al., 1998). In line with these observations, electrophysiological recordings from cultures of early postnatal DA neurons have shown increased quantal release (Pothos et al., 1998) and enhanced excitability (Yang et al., 2001) following GDNF administration. However, the effects of continuous long-term GDNF administration (several months) to intact nigrostriatal DA neurons remain unknown. In the present study we addressed this question by overexpressing GDNF for 13 months in striatal cells ofintact rats by means of an rLV-GDNF vector, followed by evaluation of pre- and postsynaptic components in the dopamine signalling pathway using immunohistochemistry, binding autoradio- graphy and in situ hybridization techniques. European Journal of Neuroscience, Vol. 17, pp. 260±270, 2003 ß Federation of European Neuroscience Societies doi:10.1046/j.1460-9568.2003.02456.x Correspondence: Dr Carl Rosenblad, as above. E-mail: [email protected] Received 12 July 2002, revised 1 October 2002, accepted 8 November 2002

Upload: carl-rosenblad

Post on 06-Jul-2016

213 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

�������� ������ ������������ �� ���� � ������ ��������� ��� ������� ������� �� �� ��� ������ ����������� ������� ���

��� ����� ��� !� "��� ��������#�$ ��� ����% &���#$������� �� �������� ������������������ ������������ ������� ���������� �� ���������� ��������� !��� "��#����� � !���� �$����

��������% �������������� � �����#����� ���� ��������� ���������� �����

'������

(������� ������������ ������ �������� �� ����������������� ������� ��� � )��#����* ����� � �#� � �� ������ ���������������� ��� ������ ������+ ,� ���������� ��� ������ �� ������� � �� �� ����������� ������������ ������ -����. �������������� ������ ����������� ������� ������� �� ��"����� � ���������� �������� ������ ������������� �� ����� /�������� �������� �� �������� ������ �� ����� ��� � ���+ ,������� ���� ����� ���� ��"������ ���� ��� ���� 0+1 ��2� ���� �� ��� ������ ��� 3+4 ��2��� ��� �������� ����� � ������ �� 5�6('� ����������� � $17 33��� � ������� ����� ������ ������� �� ������������ ����+���� ������������ ����8���� � ������� ������� ������� �� ��' ��� -�� 947:$;. �� ��� �������� ����� ��� ������ ������� ���� ������� ��� ��� ������ ������ �� ������� ������� ��������������� ����������� �� ��� ������ �� ������� ��$171$; ���� ��� �� �������� ��������� ��������� ����� �+ �� ����8���� ��������� �� ��� �� ������ ����� �� ����������������� $��������������� �� <9=>�%���� � ������� ��������������� �� ������� ����#� ���� ��� ����� ���������� ��#�� ��������� ���� ������ + ,�� ������ � ��� �$ �������� ������� � ��������� �� <9=>(�=$9943 ��� <9=>�������� ����������������� �� �� ��� ����� �� ����� �� ��� ������ ��� �� ���� �������� �����+ )�������#���� �� ��' ��� �� ���������� ������ ������� ����� ������� ���� ����� �� ������ �������� ���� � � ���������� �� ��� ���� ��������+ ,�#�� �������� ��� 8������������� ���� ������� ���� ������������ �� ������ ����������� ������� ������ � ������ � ������ ������� ������� ����������� ������� � ������ ������ ������� �������� �� ��� ������ ���� ���������� ������ �� ����� ����� ���������� ���� �� ������� ������ ��� ���� ��� �����+

6�����������

� ������� �� �� � ����� ������� ���� ����� ���� �������� �

������������ ������ ������ ����� ������� ������������ �� �����

����������� ������� �� ������ ������������� ������� ���� �������

�� �� ��������� �� ������ �� ��� ��� ��� ���������������� �����

���� ��!�����"� ������# $��������� �� ���� ������� �� � ����

����� �� ��� ��� ��� ���� �� ������ ������������� ������� �������

�� ���� �%��! �� ��#& '(()* +���� �� ��#& '(()* ,���� �� ��#& '(()*

-����� �� ��#& '((.* ,���� �� ��#& '((.�& �� ���� �� ��� ���������

����������� �� �� ����� ����� � ������������� /������������

�-���! �� ��#& 0111�* 2������� �� ��#& 0111��# ���� ��� ���� �������

��������� ���� �������3� �� ������� �-���! �� ��#& 0111�& �*

2������� �� ��#& 0111�* ������� �!� �� ��#& 0110�# ����� �����

��4�� ������������ �� �������� �� ���� ��������� �� �� ���� ���

���� �� �� ����� �������� �%���!��� �� ��#& 0111� �� �� ����

��������� ���� ������������� �� ��� �� ���� ��������� �� ���

��������& ��� ��� ���������� ����� �+�� �-���! �� ��#& 0111�& ��# 5����

� ��& ���������� ���� �� �� ���� ������� ���� �������� ����

��������� �� ������� � ������ ������ �� ����� �� ������� �����

�� ��!�����"� �������# -���! �� �� �0111�� ����� ���� �������� ��� ���

������ ���� ���������� ���� � ����������� �������������� ����

����� ���� ��� ��� ����������� �� ���� �� ����� ��������� ��

���������� ���� �� �� ��� ������� /������������ ������ ����&

�� -������ �� ��# �0111� ���� ���� ���� ���������� ���� �

����������� ����� ���� ��67� ����� ��������� ���� ���� �� ����������

����������� �� � ������� ���� �� ��!�����"� ������#

���� � �������� ��������� �& �� �� �� ���������� �� � �������� �

������ �� �������� ���� ��!�����"� ������ ��� �� �������� ���� �� ���

������ �� ��� ������ �� ��� ��� ������� ���� ����# %������ ��� ��� ��

������� ��������� ��������& ���� ���� ���� ���� ���� ������ ��

������� ���� ����� � �������� ���� ���������# $� ��� ������ �������

������� �����& ��������� ���� ��������� �� �� ��� �� �� ����� ��

�� ��� ������ ��� ������ ����� ��������� ���� ��� +� �� ��������& ��

����� � ������� �������� ���� ������� ���� ��������� ����

����������� �8���� �� ��#& '(()* %��! �� ��#& '((/* 8����� �� ��#&

'((9�# $� ���� ���� ����� ����� ������& ������������������� ���������

���� �������� �� ���� ��������� �� ������� �� � ����� ��������

:������ ������� � ����� �� ��#& '((9� �� ������� ����������� �;���

�� ��#& 011'� ��������� ���� �������������# 8��� ��& ��� ������� ��

���������� ��������� ���� ������������� ��� ���� ������� �� ������

������������� �� ������� ������ ��!����# $� ��� ������� ��� ��

������ ���� :������� � � ������������ ���� ��� '< ������ ��

�������� ����� �� ������ ���� � ����� �� �� �67����� �����& �������

� � �������� �� ���� �� ����������� ���������� �� ��� �������

���������� ������ ����� �������������������& ������ ���������

����� �� �� ��� �����3����� ������:���#

�� ����� ��� ��� �� ��� �������� ��� ��� �� �������� ���� � ���� ����� �� �� ����� ��� ������� ��������

��='1#'1>/4�#'>/1�()/9#011<#10>)/#�

�� ���������= �� ?��� 2�������& �� ��� �#

@�����= ���A������#!

������� �� ���! ����� ����� � "���#� ����� �������� $ ����%#� ����

?������ ��� �����

����� �����

7+7�� �������� ��67� ������ ���� ������ �� ������� ����

����� �B������ �� ��#& '((.* 2������� �� ��#& 0111��# %���C& ���

�������� ������� �82�?57�D ������� ��� ���� ��� ����� C����

������ ������� ��� � �� ���� ��� ������������ ���� ��� ������

������� �5�#� �� �?57�29#(' ���� 0(<, �����# 7��������������

��� ������������ ���� �������� �� �� 0 �� < ����� ������������ ��

����������� �� ''/ 111 � � �������������������# ,�� ����� �� �67��� ����� ����! ��� '#'� '19 ,E4�6 �� �������� � ������ ������� ��

��� ����������� ����������� �� 0(<, �����# ,�� ���� �������� ����� ���

�������� ��� �67����� �� �67��� ���� ����!� ����� �� 2��

���� ���� ������:�� �� ������� ��� ����� � �� +������� �� ��#& '((<�

�� ���� ��� ����� ������� ���������� ����� �,E� �� ���� ��������

����� ������� ��� �67��� & ��� ����� �� ��� �67����� ����� ���

�������� �� �� '#0� '19 ,E4�6#

� ������ ����� ���

��� ���! �� �� ��� ������������ ������� ��� ������� �������� ��

��� ��������� ��� � ��� @������ ?�������� ��� E�� �� 6��������

������� �� 6�� E�� �����# ������� ���� ����� �� � '0 = '0 � �����4

��!���� ���� ���� ������ �� ��� ���� �� �����# $� �����& 0> ������

+������F����� ���� �� 001 � � ��� ���� �� ������� ���� ���# ���

����������� ������ ������� ���� ����������3� ����� ��������� ��

0�6 �67��� ��� 9� �� �67����� ��� ')� �� � ' = 0 ����� ����

����! ��#�# '#'F'#0� '1) ,E� ��� ������� ���� ��� ������ �� ��� �����

�������� �� ��� ��������� ����������= ��� � ��'#1��& 56��0#/��& �7��)#1 �� �>#)��& ,�� 1#1* �� ����& � � 1#1��&

56��<#.��& �7��)#1 �� �>#)��& ,�� 1#1# ������� ���

@6$+� ��� >� �� ������������� ��� < �� / ��� �67��� ��

�67�����& �������� ��� ���� ����������3� ���� ���� �����������

��� �.1��4!�& �����!��������& +�����& ��������� �� ��� ������

:���!� ������� ���# ��� @6$+�& 0��������! ������� ������ ����

��� ������� ��� ����� �� ��� ������ �������� ��� ������� ��� ��

��������� ���3� �� � ���# ��� ��� +�& � 0�� ������� ����� ���

��!�� �� ��� ����������� ������� �����# %����� ��� ������������� ��

�� ��� �����3����� ���� ��������� ���3�� �� � ���# +�������

�'>��� ���� ��� �� � ������� �� ����������� ���� ������ ��

������ ����� �����# ������� ��� ������������������� �������

��� )4������ ���� ����������3� ���� ���� ������������� �� ������

������� ������� ���� )1�6 ������ �� ���� �����������& ������� �

011�6 ������� ����������������� >G ������������� ��8 .#0F

.#>�# ,�� ������ ���� ����H�� ��� <F/ � �� ��� ���� H���� �& ������

����� �� <1G ������� ��� 0> � �� ��� ���� ��� ������ �� >1��������!�������� �� � ����3��� ���������#

������� � ����������

%����� �� �'� �� �0���������� ��� �������� �� ������� �

������� �� ��# �0111�# %���C& �������� ���� ����� �� ���� ����

�������� ��� ' �& ����� �� ,��� ������ �)1�5 ,����8?�& '01�5��?�&

)�5 ?�?�0& �� '�5 5�?�0* �8 .#(� �� > �? ��� )���& ������� �

���������� ���� '#0) �5 I<8J+?80<<(1 ������H� ���� �� 9/?�4����*

�@� 6��� +������ ������� ��� (1���# E������H� ������ ���

�������� �� ������� �������� �� ��� �������� �� ' �5 ���C��

��������� �+�����������& +�# 6����& 5K& E+��# +������� ��� �0

�������� ������ ���� �������� �� ' �5 I<8J��������� ������H�

���� �� ')#. ?�4����* �@��� '11 �5 !��������� ��� ����! ������

�� ����������0 ���������* +������������ ��� ' �# ��������H� ������

��� �������� �� ��� �������� �� '�5 ��������� �+������������#

��������� ��� ������ �� ������ �� ��� �� 80K �0��� ����� ���

�������� ���� ��� ��� �� ������ �� ��������������� � H��

�I<8J8���H��& ��������& %��!�& E-�& �� ������ ��� 0'F09 ��

�� > �?#I<8J��3����� ������ �� ������� ����������� ��� �������� ��

������� � 8��� �� ��# �'((9�# +������� ���� ����������� �� ,����

%����� �)1�5,����8?�& <11�5��?�& )�5-?�* �8 .#(� ��� )��� ��

> �?& ������� � /1��� ���������� �� ��� ���� ������ ����������

'1 �5 I<8J��3����� ������H� ���� �� 0>?�4����* �@�� �� )1 �5

���������� �+������������ �� ��� ��� ������ �� ������������

����!� �����# ��������H� ������ ��� �������� �� ��� �������� ��

'11�5 ����������� �+������������# +������� ���� ���� ����� ��

������ �0�� �� 80K& ��� ���& ������ �� ��������������� � H��

�I<8J8���H��& ��������� �� ������ ��� '> �� �� > �?#

�� ���� �����������

&� ��� �����3����� ��� �������� �� ������� ��� ����� �?�������

�� ��#& '((0* ?������� L %���!���& '(()� ����� ��� ��������������

������ ������������ �� ��� ������� �������� �,8* �� '>>'F'>99�

�� ��� ��������!������� � @* �� <00F</1�# ����� ���� <� ���������� ���� I<)+J�, �'0)1?�4����* �@�� ����� �������� ����

�������������������� ���� @����� %������& E+�� �� ����H�

����� ?��������� ,@ ������� �?��������& E+�� �� �����H� ���� �����

�� �'1( �#�#�#4��# +������� ���� ����� �� H�� �� >G ��������

������ �� ����������������� ������ � %+� ��� '1���& ������� �

����� ������ �� %+ �)��� �����& �� �������� �� .1G �� ()G

������� �0��� �����# � ����� �� >)�6 �� �����3����� ������ ��������

��� '1. �#�#�# �� �����4�6 ��� ������ �� ���� �������# ,�� ���� ���

���� �� �� ������ �� �������� �� �����H� �������� �� >0 �? � ��

�����# ,�� �� �� ����� ���� ���� � �� )) �? �� '� ++? �1#')5 ��?�4

1#1')5 ����� �������� �� ����� >� �� ��� ���� ������� �� H����

����� �� ���� ����������� �� ��� ��� ������ ����� ������ ��

��������������� H�� ���5��& ��������& E-� ��� <F9 �� �� 01 �?#,�� ����� ���� ���� ���� �� ��:�� �������� �$����& E-� ��

������ ��� <F> ���!� ������ ����� � ����� �� -��! ��'(

�-��!�& H�� �� ���� <<< ������ �� ������������� ���� �����

�����#

��� ������������

$������������������ ��� �������� �� ������� ��� �����

�2������� �� ��#& 0111��# +������� ���� :������ �� <G 80K0 ���

)��� �� ����������� �� ������ �- %+� 1#0)G ,����� M�'11� 0G

������ ��� ' �& ������� � ���������� �� ������ ���������� ������

����!�� ������� �' = 0111& ?�������& E+��& ����� �����,8

�' = 0111* ?��������& ������ ����� �������� ��������� ������������0

�75�,* ' = '111& ?�������� �� ���� ��������� �' = 0111& 2 L �

������& E+�� � ������� �� ���� �����������# +����:����� ��������

���� ����� ����� �����& �������� ��� 0 � ���� ���������� �������

������ I������ ���������!�� � ������& E+��& ����� ����������

�7����� 6�����������& E+��& ����� ����������� ���-K& ������!�& ��

����� ��������� �7����� 6������������& �������� ��J& � ���F������F

��������� ��%? !��* 7����� 6������������ �������� �� ��������

������ ������������& �� H���� ������3� ������<�<����������3�����+������������ �� � ���������# ,�� �������� ���� ������ ����

����������������� ����� �� �� �������� ���� � M#

��������� ��������

,�� ����� �� �'& �0& �� �� ����������� ������& �� ,8� �� 75�,�

������������ � ����� ����� �� ��� ����������� ������� � ���������

��� ������� ����� ����� ��� �$8 '#/0 $���� ������� �� �������

��� ����� �-���! �� ��#& '((9�# %���! �� ����� ������ ��� �������

���� ������� ����� � ������ ���2�� ������ ����� �� �� K�����

%M/1 ���������� �� � 5�������� �< ����5�� ��������# K������

����� ��� ������� � ��������� ��� �������� �� 0 �� < �����������

6�������� ���� ��������� �� ������ ������� ������� 0/'

� 011< ��������� �� @������� ������������ +��������& �� ����� ��� ��� �� ��� �������& ��& 0/1F0.1

�� ��� ��'#1��& �� �1#/��& �� �'#1��& �1#0�� �� �1#/���� ��� ����� �� ������ L D�����& '((9�# ��������H� ������� �����

��� ������� ���� ��� �������� �� ������������� ������� ��� ����

�����H� ������ ����C����������& ��������� �� ������������& �� �� ���

������ �������� �� �������� �������� ��� �������������������#

$����� ��� ������� �� �������� �� ��� �� ,8 �� @ �2�� ����

������ ����� � 6���� ����������& � ������ ��� ������ �8����

�����& N����� �� ��� K������ <#1 ������� ��� �� � ���� 5��������

�> ��������# �� 01� �����H������ � ����! �� ����� ����� ������

������ ������� �� ��� +�& ������ ��������� ���� �7,��& �� �����������

������� �� � ����� ������� �� ��� ����� ���� ���� ��� ���� ��!��

����� ��������� �� ��!�H��# $����� ���� ��� +� �� 7,� ���

������� �� ��� �������� ������������ �� �� ��� �)#1 ��

�)#<�� �� ��� ����� �� ������ LD����� �'((9�* �������� ��� �������

�� @ �2�� ��� ��!�� �� �� �� �1#)��# $� ��� ����� ���������

������� ������ ���� ��� ��� �� ������ ���� �� �����& ��� ����� ������

������ ����� ���� � �������� ����� �� ���!� ������ �������� ���

������� �� �� ��� ������������ ��!�H�� ����� ��� ����� �� ��� ��

������ ������ � �� ��� ���� ��� ���� ������� ����� ��� +����$����

������� ��� �� � ?����� �������� � ������� ������ �� ��������

������� � �� ��� ����# E������H� ������ ��� ������� �� �� �������

������ � �� �� �� �����# � ������� �� .) �� <) ����� ����

������� �� ���� ��� �� ��� +� �� 7,�& �������� ��# ,�� �� ��� ��

@ �2�� �� ��� �������� ��� ������� � �������� ��� �:��� ��3�

������� �� ��� ��� �� ��� �������� �� ���� ��� ����� ��� ����� ��

������ ����� �������#

,�� ������ �� ,8������������� � �$2� �� 75�,�$2 ������

������� ��� ������� � �������� ��� ������������ � ������� �������

�� ��� ����� �������� ������� �� ��� �������� ����� ����� �� �����

��������� � �������� ������� ��� +�& �� ������� ��� ����� �+���� L

K�����& '((>�#

�������� ��������

?��������� �� �������� ���������� ������������ ��� ��� �����

������ ��������� ������� �� ������� ���K7�* ������ �� ��� ����

���� ���� �����H���� � ��� '�� �������-���� ����# ?����������

�� ������ �� ��� �� ����& ������ ���� ������ �� �������� ,8 �� @

�2�� ����� ��� ��� ����� �� ������� ������# ��� ��� �����������

(� 1#1) ��� �������� �����H����#

��� �

������� �������� ��������� �� ����

,������� ������ ����� �67 ����������& ��� �� �$2 ����� ���� ����

�������� �� ��� �������� �� �67��� ��������� ������� ����# '?�#

%��� ������� �� ���� ���� �������� ��� ��� ������� �� �� �$2

����� �� ��� ��������� �� ��������3� ���� �������# $� �������

������� ���� �67����� ������ ���� �������� ��� ���� �� ���

�������� ����# '�� �� �� ��� +� ���� ���������� ���� ��� ������ ��

��� ����������� ���# ,�� ������� �� �����$2 ��� ������& ����� ��

���������� ���� ���� ����� ������� ���� ��� ������������� �����#

?��������� ���� ��� ��������� ���� ������������ �� �� ���

����������� ���& ������ �� ��� �� ���� �� �������� � @6$+� ����

�������� �����H����� ���� �� ��� �������� �>#)(� 1#9' ��4�� ������*

(� 1#11'� �� +� �1#9<� 1#0) ��4�� ������* (� 1#11'� �� �������

���� ��� �������� ������������� ��� �1#1>� 1#1' ��4�� ������ ��

1#1<� 1#1' ��4�� ������ �� ��� �������� �� +�& �������� ���# ,��

�������� ���� �� ��� �� ��� +� �������� ������� ���� ����������

��������� �� ������� ���� �������� ������������� ���������� �������

�������� �!� �� ��#& 0110�#

��� ���� ��� ������� �� !"

$� �������� ������� ��� ������� �������� ��� ,8 � �� ��� �����

�3�����& � ��������� ������ ��� ������ �� ��� +� �� 7,� ����# 0�

�� %�# ,�� �� �� �� ,8 �2�� ��� ������� �� ��� ������ �� ������

��� �� �67��� ������� ������� ����# 0��& ������� ��� ������ ���

������ ����� �� ��� ������ ��� �� �67����� ������� ����# 0%�#

$��������� �� ������������� �������� ����� ���� ��� �� ������ ����

������ �� ��� �� ����� ����� ������������ ����!��� �� ��� +� ����

�������� �� 7,� ����# 0?& �� ��� ��� ������# ?������ ���� ���

������������� ������ ��� ����# 0? �� @� ��� ������ �� ������4���� ���

������ ����� ������������ �� �67������������ ������� ����# 0�

�� ��# �� ���� ��� ��������� ��� ����� � �� �67��� ��������

������� ���� ��� ������# O�����H������ ����� ���� ��� ������ ��

�$�# '# ,�������� ���������� ���� �67��� �� �67����� ������ �� ��� �������� �� '< ������ ����������������# +������� �������� �������� ��� ����������������������� ���� � ������ �������� ���������� ��� �������� �67����� ���& ��� ��� �� �67��� �%� �������& ���������� ���� � ��������� �� ���� ������������ �������� �����# �?� �� �$2 �����& ����������� �� �������� ���������& ��� ���� �� � 1#)������� �� 0F<�� ��� ���� ���������� ��� ��������������# ��& ������ ��������* ���& ������* ���& ��������# +���� ���& /11��#

� 011< ��������� �� @������� ������������ +��������& �� ����� ��� ��� �� ��� �������& ��& 0/1F0.1

0/0 ?# 2������� �� ��#

�$�# 0# ,������ ���������2�� ���������� �� +� ��7,��������# �� ��%� ��������������� ���� ��� ��������������� H�� ������������ ������!�� ������� ��� �� ,8 �2�� �� ��� ������ ������� ��� �� �67����� ������ ������� �%� �� ������� �� �67��� ������ ���# %������H�� �? �� �� �� ��!�H�� �@ �� ������������� �������� �� �������� ���� �������� ������� ��� ���������� ����� ��������� � ��� ���� ����� �� ? �� @� ���� � ���!� �������� �� ��� ������ ����� �� ������ � ������ ����� ������ ����� ������������ ����!��� �� ��� ���� ������ ��� �� �� �� �� ������� ���� ��� ������ ��� �? �� @�# ��������� �� ���������� ����� ��������� ����������� ������� �� ��� ����������� ��� ���� �� � ���!�� ����� ���������� �� ,8# +���� ���& 911�� �� �� %�* >1�� �?F��#

� 011< ��������� �� @������� ������������ +��������& �� ����� ��� ��� �� ��� �������& ��& 0/1F0.1

6�������� ���� ��������� �� ������ ������� ������� 0/<

,8 �2��4���� �� ��� ������ ��� �� �67��� ������� ��� �����

������������ ���� ���� �� ��� �������� ��� �'19� '1G �� '11� 9G

�� ��� +� �� 7,�& �������� ��* ���# <�# % ��������& ��� ,8 �2��4

���� ��� ����� �����H����� �� ��� ����������� +� �� 7,� �� �67�

������������ ������� ��� 09� >G �� /'� <G �� ���� �� ��� ������

���& �������� ��* (� 1#1'* ���# 0��#

���� �� �������� �� ��� �������� �� ,8 �2�� �� ��� ��

������� �� ��� +� �� 7,� ��������� ���� � ������ �� ��� ������

�� ,8 ������� �� �������� � ,8 ������������ ��# $� ��� ��������&

��� ,8�$2 ����� ����� �� ��� ������ �� �67��� ������� ��� ���

������� �� ��� ������������ �� ��� ������� ����# >��%�# % ��������& ��

��� �67������������ ����� � ���!�� �������� �� ,8 �������� ���

���� �� ��� ������ ��� �� ������� ���� ��� ������# ,�� �����

�������� �� � ����� ����������� ���� ��� ���� ��������� ���������

�� ������������ �� ����� ������� �� ��� �������� ����# >?�# �� �����

�� �������� ��������� �� ,8�$2 H���� ���� ���� ����� ��� �������

������� ����������# K������ ����� ������������ �� ,8�$2 ����� �����

�� ����� ������������ �� ��� ������� ��� �������� ���H��� ����

����������# $� ��� �67������������ ����� ��� ����� �� ,8 �����

�������� �� �� ��� ����������� �� ������� ���� ��� ������������� ���&

��� ����� �� .)� )#'G& //� <#9G& >9� /#'G �� ��� �������& ����

�� ����� ��������& �������� �� �(� 1#1' ��� ��� �� ���* ���# )��# ��

�������� ������� ���� ��� ������ ��� ��� ���� �� �� �������

������� �� �� �� ��� ����� �� ��� ������� �'''� <#/G& (>� 0#>G

�� '0'� '.G& �� ��� �������& ���� �� ����� ��������& �������

�� ��* ���# )��#

�� ��� �� �� �� ��� ���� ����� �� ��� +� ���� ��������& ��� ,8�$2

������� �������� ������� ��������� ���� ��� +� ���� ���������� ����

���� �� ��� ������ ��� �� ���� �� ������������ �� �67��� �������

������� ����# >� �� 8�& ������� �� �67������������� ������� ���

+� ���� �������� ����� �� ������� ����� �� ���� ������ ������

,8�$2 ������� ����# >$�# O�����H������ ����� � �����H���� ��������

�� ��� ������ �� ,8�$2 ������ ������� �� ��� ������ ��� �� �67�

���� ������� �9)� >#(G� �� ������� ���� ��� ������ ���& �� ���

�67��� ������� ��� �'19� >#.G* (� 1#1) ��� ���� �����������*

���# )%�#

��#! ��� ���������

,� ������� �� �������� �� ��� �������� �� ,8 �2�� �� ,8 ������� ��

��� +� �� �������� ��� ������� �� � ���� �� �� ��������� �� ���

�������� �� ���� ����� �� ��� +� �� ������������� �� ,8 �������& ��

�������� ������ �������� ��� ������������������� ���� �� ������

������ ������� 75�,& ������� ���!�� ��� ������������� �� �������

�5����� �� ��#& '(((�# $� �������� �� ,8& ��� �������� 75�,�$2 ����� ��

���� ��� �:���� ���� �� ���� ���� �� ������ ��������� �����

����# >�F��# ,��� ��� ���H��� � ������� ����� ������������&

����� � ��� ����� �����H����� ������� ��� ������ �� ������ ��� ��

������ ��� �67��� �((� <#'G� �� �67����� �'1/� >#(G� �����

�(� 1#1) ��� ��� ������������# +�������& ��� ������ �� 75�,�$2

����� �� ��� +� �� ���� �67��� � �� �67������������ ������� ���

�������� �� ���� �� ��� ������ ��� �(� 1#1)* ���# )%�

�$� ��� �% ������ ��� �# ��������������� � ����������

����������� �� ����!� ����� ��� ��!�� �� ����������� �� ����������� ��

�� ���������� � ���� �� �� ������������� ��& �� �� �������� �� ���

������ �� ������ ����� ���� ������ � ���� � ������������& ��

�������� ������ ������������� ���� I<8J��3����� �� ��������

��������# $��������� �� ��� ��������������� H��� ����� � ������

������ �� ��� �������� �� ������� ��������� ����# /�� �� ���

������ ��� ���������� �� ��� ������ �� �������� ���� �� ������

�67��� � �� �67������������� �������# ,��� ��� ���H��� �

���������� ������������ �� ��� ������� �� ����� �������� �����

�� �����H���� ��������� ��� ���� ������� ��� �67��� �� �67�

���� ������ ������ �� ������ ������������ �� �� �(� 1#1)* ������

��K7��* ���# /��# ,�� ����� �� ��� ������ ������� �� ��� ��������

������ '1<� (#(G �� ��� ������� ��������& �� 9)� '1G �� ��� �����

�� ������� ����� ��� �67��� # ,�� ������������ ����������� �� �67�

������������ ������� ���� (>� .#)G �� 90� )#)G �� ��� �������

�� ����� ��������& �������� ��#

?������ �� ����������� �' �� �0 �������� ������ ��� ����

������� ��������� ������� �� �� ������������ �� ��� �������� ��

I<8J+?80<<(1 �� I<8J��������� ������ ������������� ��� ������

���� ��� �� �� �������� �� ���� ��������� ����� �����������

������� �� ��� ������ �� �' �� �0 ���������& �������� ��# ��������

I<8J+?80<<(1 ������ ��� ���� �� ��� �������� �� ������� ������

���� ����� ����# /%�& �� ���� �� �� ��� +� ���� ���������� ���� ���

������# ?��������� �� ����� �� �' �������� ������ �� ��� �����

������� ��� �� �67��� �� �67����� ������ ������� � ��� ����

�� �����H���� ��������� �� ������ ��� ������� �� ����� ��������

�'1>� <#0G �# ('� <#/G& �� .1� (#'G �# (<� )#)G& �������

�� ��* (� 1#1)& ������ ��K7�* ���# /@�# �����������& �� �����H����

��������� �� ������ ����� ��� ����� � ������� ��� ������ ��

��������� ��� �� ������ ��� �� �� ��� ���� ����� �(� 1#1)�#

+������� �� ��� �' ��������& � ��������� ������ �� ��� �0 �����

I<8J��������� ��� ���� ���������� ��� �������� ������� �� ���� �� ��

��� +� ����# /? �� ��� ��� ������# �� �����H���� ��������� ��

�������� I<8J��������� ������ ��� ���� ������� ������� ��� ��������

���� �� ������������� ���� �� �67��� � �� �67������������ �������

����# /��& ��� ������� ��� ������ ���� �� �67��� � �� �67������

�������� �������& ������ �������� �9/� .#0G �� ('� 0#>G& ����

����� ��� �� ������ �.<� ''G �� 9.� ''G* (� 1#1) ��� ���

������������#

&������'������� �(�#

�������!������� �2�� �� ��� �� � ���� ���� �� �������� �� ��������

���������� ������� ��������� ���� �� �� ��� �� ����� �� ��� ��������

������� �� ��#& '(('�# ,� �� �������� ������� ����� ,8 �� ��� �� ���

������������� �� ������� ��� ������ � �� � ���� �� �� ���� � ���

����������� ������� �� �������� �� ��� �����3����� ��� @

�2��# ?���� ���������� @ �2�� ���� ���� ���������� ���

�������� ����# .�F��# ,�� ����������� �� ��� �� ������ ��� �������

�� ��� ������ �� ������ ��� �� ���� �67��� � ����# .� �� %� ��

�67������ ����# .? �� �� ������ �������# ,��� ��� ���H��� �

������� ����� ������� �� ��� �� ����� ����� ���� ��!H�� ������

�$�# <# O�����H������ �� ��� ����� �� ������4���� ����� � �����H���� ��������� �� ���� ��� +� �� 7,� �� ���� ������ �������# �(� 1#11' ����������� ��� �67��� ������� ����� ��������#

� 011< ��������� �� @������� ������������ +��������& �� ����� ��� ��� �� ��� �������& ��& 0/1F0.1

0/> ?# 2������� �� ��#

�$�# ># ?������ �������� ������� ��� �������� �� ���������� ����� �� ��� ������ ��& � �� ��& �67��� ������� �%& @ �� 8� �� �67������������ �?& � �� $����� ������������ ��� ������ �� ,8�$2 �� 75�,�$2 ����� ����� �� ��� �������� ��F�� �� ���� ����� �� ��� +� ��F$�# �������� ���� ��������� ��� �������� ,8�$2����� ����� ��� ���!�� ����� �?� �� ������� ���� ��� ������ ���& �� ������� ������������� �%� ����# ,�� ����� �� ������������� ���� ������ ������������ �� ��� ���� ��������� �� ��� ����� �� ������� �������# % ��������& ��� 75�,�$2 ����� ����� �� ������� �������� ��� ������� �� ������ ���& �67��� ��@� �� �67������������� ������� ���# �� ��� ����� ��� +� ���� �������� �� ����������� ������� ������� �� ������� ����� ,8�$2 ������� �� ��������������� ���� ��� +� ���� ���������� �$� ������� ���� ��� ������ ��� �� �67��� ������� �@� ���# �� ������ �����H������ ������� �� $�& ��� ������� ������� �� ���+� ���� �������� �� ����������� ������� ������� ���� ������� ���� ����� ,8 ���������� �H��� ���������� ������� ������ ������ � �������� ��������������� �� ���� ���� �� ��� ������ ��� ����� ���������# +���� ���& /11 �� ��F��* <11�� ��F$�# +,2& ��������* � & ������ �������#

� 011< ��������� �� @������� ������������ +��������& �� ����� ��� ��� �� ��� �������& ��& 0/1F0.1

6�������� ���� ��������� �� ������ ������� ������� 0/)

�� �������� ���� ��������& ����� � ��� ����� ������� �� �67�

�� � �('� 0G� �� �67������ �(/� 'G� ������ �������& �������

�� �� ����# .@�#

�������

,� �� �������� ��� ������� �� ��������� ���������� ���� ����������

���� �� ������ ������������� �� �������& �� ������� �67�����& ��

�67��� ������� �����& ���� ��� �������� �� ���� ���� ����# ��

'<������ ���������������� �����H����� ��� ��� �� ��� �� ����

�0)� �� '11���� ������� ���� ��� ������������� ����������� ����

���� ���� ���� �� ��� ����������� ��������& �� +� �������� ��

���������� ������ ��������� �� ������� ���� �������� ��������������

���������� �������* ������� �!� �� ��#& 0110� �� �67������������

�������# �� � ������ �� ��� ���� � ������������& �������� ,8 �2��

�� ��� ���� ����� �����H�����& �� � ����� � .0G �� <(G �� ���

�$�# )# ��� O�����H������ �� ��� ������� ����� �� ,8�$2 ����� ����� �� ��� ��������# ����������� ������� ����� � �����H���� �������� �� ��� ����� ������������ �� ��� ������� ���� 5������� �� ������ ��� ������� ��� ���� ���������� �� ��� ����� ������� �(� 1#1'& ������ ��K7� ������� � ��� '��������F-����* �� )4������# �%� ?��� ������ �� ���� � �����H���� �������� �� ��� ������ �� ,8�$2 �,8�� �������& ��� ��� 75�,�$2 �75�,��& ������� ����� +� ���� �������� �� ����������� ������� �� ������� �� �67��� ������� ����� �(� 1#1)& +�����"� ������* �� /4������# ,��� �������� ���� ��� ,8 �� ������� ����� ����� ��� �������� ����� �� � ���������� �� +� ���� �������� �����# �������� �����H����� �������� ���� �� ������� �������#

�$�# /# 2����������� � ���������������� ���� ��������������� H��� ���� ������ �� I<8J��3����� �� ���������� �� ����!� ����� ���& I<8J+?80<<(1 ������������� �' ��������� �%� �� I<8J��������� �� �0 ��������� �?� �� ������� �������� ������� ��� ��������# �������� �����H� ������ ��� ���� ���������� ����������� ������� �� ��� �������& �� �� ��� ��������� ��� ���� �� ������ ��� ������� �� ����� �������� ��������� ���� � ������������ �� �������� � ������������ ������������ �I<8J��3�����& �* I<8J+?80<<(1& @* I<8J���������& �* (� 1#1)& ������ ��K7��# +���� ���& ')11��#

� 011< ��������� �� @������� ������������ +��������& �� ����� ��� ��� �� ��� �������& ��& 0/1F0.1

0// ?# 2������� �� ��#

+� ���� �������� �� 7,� �������& �������� ��& �� �� ��� �����

������� ��� ��� ,8�$2 ���� ����� ���� �� ��� ���� ��������� �� ���

�������� �� )G �� �)0G ���� ��� ���� ��������� ��������� �������

��� �� ��� ����� ������� �� ��� ��������� �� ���� �� �� ��� ,8�$2 ����

����� �� ��� +� ��')G ,8�$2 ��������# ,�� ������� �� ,8 �2��

�� ,8�$2 ���� ��� ���������� � �� ����������� ������� �� �

������ �� ����� �� ���������������������� ���!��� ���� �� 75�,�

$2 ���� �������� ����� �� ���� ������& I<8J��3����� ������ ��

�������� �� ����!� �����& �' �� �0 �������� ������ �����& �� ��� �� ���

�� @ �2�� �� ��� ��������#

,� ���� ��� ��� ���������� ���� ��� �������� �� ,8 �2�� �� ,8�

$2 ��� ������� �� � ���� �� ������������� ��������� �� �� �������� ���

����� �� 75�,�$2 �� I<8J��3����� ������ �� �������� ��������#

%��� ��� 75�, �� ��� �� ����������� ��� ������ ������������ ��

�� ����� �� ��� �������� �8����� �� ��#& '((.* 5����� �� ��#& '(((�& ��

�� � ���� ����� �� �������� ��������� �� �� ��� �� ����� ����� ��

���� �� �������� ���� ��!�����"� ������ �5����� �� ��#& '((.* 5�����

�� ��#& '(((�# ,�� ������� �� ������� �� �������� 75�,�$2 ��

I<8J��3����� ������ ��������� ���� ��������� ��������� �������

������� ���� ,8 �� ���� ������� �� ����������� �� �� �������

�$�# .# &� ��� �����3����� �� ������� �������� ������� ��� �������� ����� � ����� �����H� ��� @ �2�� ��F��# %������H�� ���������������� ���� �������� ����� �� ������ �� ��� �� �������� ���H��� �� ��� �������� ���������� ���� ���������� �� ����� ��3� ���� ���������� �������# ���!�H�� ���������������� ���� �������� ������ �� ������4���� �� ��� �67��� � �� �67������������ ����# �@�# ,�� �������� @ �2�� �� ��� �� ������� � ������� ����� �� ��� �� ������ ����!�H�� ������ � ��� ����� �����H����� ���� ��� ������ ��� �� ������ �67������ �� �67��� ������� ������� �(� 1#1)& +�����"� ������* �� )4������# +������� �� ���& )1��#

� 011< ��������� �� @������� ������������ +��������& �� ����� ��� ��� �� ��� �������& ��& 0/1F0.1

6�������� ���� ��������� �� ������ ������� ������� 0/.

������� ��� ������ �� �� ������� �� ��� +� �� ����� ���� �������

����� �� ��� �������� ������� ������# $���������& ��� ������ �������

���� �� 75�,�� I<8J��3����� ������ ���� ������� ��� ����������

���� ,8������� �������� ������� ��� ������������� ������ ����

�������� ���������& ����� ��� ���� ����� � ��������� ���� ������

���� �� ����� ������� �-���! �� ��#& 0111�* -���! �� ��#& 0111�*

������� �!� �� ��#& 0110�& ��� ��� ����� �� ��� ������ �� �����& ��

����� ��� ���� ��� ���� ���� �� ��� �� ��������� ��� ����# $� ����

���� ��� H����� ���� ���� ��� ����������� ,8& 6� L 8��� �'((.�

������� ���� ���������� ���������� �������� �� <��4� � �� ��� +� ���

'> �� ����� ��� ������ �� ,8�$2 ������� �� ��� +� �� .1G �� ����

�� ��� ������ ���& ������� �� ��� ��������� ��� ��������� �� ���

������ �� ���������� ��$�������� ������� ���������� �� ,8�& ��

5����� �� �� �'(((� ���� ���� ��������� �� '1�� ���� ���� ��� +�4

7,� ���� �� ���� �����H����� ����� ��� ���� �� �� ��� ,8 ��������

�� �����:���� ,8 �2�� ���������� � >1F/)G �� . �� �����

���������# ?������ �� ����� H�����& � ������ ��� �� ��� ���!��

� ��H �� ��#& 0110� ������� �� �������� ������ �� �������� ,8�$2

������� ��������� �67����� ���������& ��������� � ����������

������������ �� ,8# 8��� ��& �� ���� ��� ��� �������� �� ,8�$2 ���

��������� � �� �������� ������ �� �� ������������$2 �������# ,���

���� �� ���� ��C��� �������� �� � �� �������� �� �������� �������

�� ���� �����& ������ ���� ������ ��������� ,8 ��� �� ������

������� ����������& ���� ��� � ��������� �� ��� �������� ������� ����

��!� ���� �������� � �� �� �������� ������ � ���� ������� �� ���

��������# ,��� ������� ���� �� ���:�� �� � ������ �� ������������� ��

������� �� �� ����� ��������� �� ��H���� �� ����������� ����� H�����

�� ��� ��������� �� ������ ������������� �������# 5���� ��& �� ���� ���

� ��H �� ��#& 0110� �� �������� �� ,8�$2 ���� ������ ��� ���� ����

��������� ���� �� �� ������������� �� ����� ����� � ��������>�

������'&0&<&/���������������& �� ��� ������� ������� � �67�

���� ���������& ������������� ��� ������ ���� ���� ���������� �� ���

������ ������� ����& ��� ����� �� ���������� �& ���� �����

���������#

,�� ��������� ����� ��� ���������� ,8 �������������

������� ������� ��� ��� H����� ��� ���������� ���� � ���� �����

���� �������� ��� ���� �� �� ������������� �� �������& ����� �� ����

���� �� � ����������� ������������� �� ,8 �� ���� �� ������ ���

������� ���� �� �� ����� ������� ���! �� ������ �� ���# ,�� �� �� ��

,8 �2�� �� ������� ��� �������� �� ���������� �� �� ���� ������

���� ������������� �� ��� ,8 ���� �� ������� �������������� �-����

L 7����& '((/� �� ������ � ������! ���������� ��������� ��������

���� �� �� ��������� ��� ���� �������# ��� �������& ������� �� ���

�� ,8 �2�� �� ,8 ������� ��� ���� ����� ��������& ��� ���

������������& ��������������� � ������������� �� ��� �� ��������� �

������������� �� ��� �� �������� ������� ����������� �$���� �� ��#&

0111�# ,��������& �� �� ���������� ���� ����� �� ������ ���������������

�����& ����������� �� ���������� � ����� ���� ���� ����������� ��

������������ ������ ����� ���� ������������� �� ������ �� �������#

2�������� ���� �� ������� �� � ����� ���� ��� ����������� H����

���� �� ��� :������ ��3� �� �������� �� ������� �� �������� ���������

���� �������� � ����� �� ��#& '((9* ;��� �� ��#& 011'�# +����& ���

�� ��� �� �� �� ��� �������� ��4�� +� ��� ���������� �������� ��� 'F<

���!� ��������� � ������ ���� ��������� �8���� �� ��#& '(()* %��!

�� ��#& '((/* 5����� �� ��#& '((/�# $������� �� ���� ,8 ���� �� ���

������� � 6���� ������������� �� �� ����� �� �� � ���� ����

���� ���� ������� � ���������� �� ��� ������������� ����� �����

� ����������� �������������� ���� ����� �-���! �� ��#& 0111��#

������& ���������� ������ ���� ���� ��������� ���������� ����

������������� �� ��� ������ ������������� �� ����� ������� � ����

� ������� ���� ����� ��� ������������� ��� �� �������� �� ��������

����& ���������� ���� �� � ������ �� �� ��� ������� ����� �� ���

����������� ��� �8���� �� ��#& '(()* -���! �� ��#& 0111�* �����

��� �!� �� ��#& 0110�# $� �� ���� �������� ���� ���� �������������

������ ��������� ��� �� ������� ���� �� ���������& ������ ��

� ������ ����� �� ���� �� ����������� �� ���������& ����� �� ����

���� ���� � ������ � ������! ���������� �� ,8 �� ��� �������������

�������# $� ��� ������ �� ,8 �� ��� �� �� ����� � �������� �� ����

����� � ������� �� �� ��� �� �����& ��� ������ �� ��� �� �� �����

������ ������� �� ��� ������ �� ��������� ���� �� ������� ����

�������� ���������� ���� ���������# $���& �� � �������� ���

�������� �!� �� ��#& ���������� ���� �� ��� ���� ���� ��������

�������� ���� � ������������ ���� �� �67 ����� ������� �� ��� �������

��� �� �� � ������������ ������������� �� ,8 ������� �� ��� ��

,8 ���� �� � �� / ���!�& ������� �������� �� �� ��� :���!� ������ ��

������ �� ��� ��������� � �� ��� ��������� ������# ,��� ����

������� ���� ������� ��4�� ����� �� �� �� �� � ���� ������� � ���

���� �� ���� ���� ,8 �� ��:���� �� �������� ������ �� �� ��� �� ���

��������#

+������ �� ��� ����� ������ �� ���������� ���� �������� ����� ��

������� � 75�, ������������ �� �� I<8J��3����� ������& ���

�� ��� �� ����������� �������� �' �� �0 �������� ������ �� @

�2������ �������� ��������� ���� ���������# $� ������� ���

��� �� ��!�����"� ������ ����� �������� �� ���������� ��� ����

������� � ���� �� �� �� ���� ��������� ������� /���������

���� �������& �� ���������������� � ����������� �� �� ��������

�����������& ��!������� ������� �� �2�� �� ��� �,��� �� ��#& '(9<*

������ �� ��#& '(('� �� ���� �� �0 �������� ������ �?����� �� ��#& '(..�

�� � ���� ������� �� ��������# +������ ���� ����������� �������

�� � ���� ���� ���� �� ���� ������ ������� �� ������ ���� ��������

���� ��!�����"� ������ � ������ �� ��#& '(((* ?���� �� ��#& 0110�#

�������� �� �������� �� ������� ���� ��� ��������� ���� ���������

����� ���������� ��� ����� ���� �� � �������� ���� ��� ��������

�?������ �� ��#& '((/�& ��� ������ ����� ����� �����& �� ����� �

�������� 75�, ������������ �� �� I<8J��3����� ������& �� ���

�������� �� ��� �� ����������� ���������� �� �� ���������� �� ���

������� ��� ��� ���������� ���� ��� ������ ���� ����������

��������� �� ,8 ����� ������� ������� �������� �� ����������#

8��� ��& �� ��� ��� ���� ��� ������� ��� ���� ��� ��� ����������

���� � ���������� ��� ���� �� ��� �������& ��� ���� �� ���� ��

����� � ���� ������� ��������� �� ,8 �� ���& ����� ���� �� ����

��� �� ������� �� �� �������� ������ �� @ �2��#

���� ����

,�� ������� ��� ��� ��� � ����� ��� ��������� ������������� ��

,8 �� ������������� �� ������� �� � ������ �� ��������� � ������������

�� ���� �� ��� ��������# �� ��� ����������� ���������� ���� ��

�������� ���� ��������� �������� ������ � �������� �� ��������

���� ��!�����"� ������ �%���!���L6�� ���& 0111* %���!��� �� ��#&

0111�& �� ������� ����������� ��������� �� ������� ����� ��� �����

������ �� ������������� �����:������ �� ���� ��� �� ��������� ��

��� ������ �������# $� ��� ������� ��� ��� �� �� �� ���� ��������

���� ��� �67 ����� ��� >#) ��4�� ������& ����� �� ���� ���� 01����

������ ���� ��� 1#0 ��4�� ������ ���� ��� ���� �������� ��� ��������

��� ��������������� �� ��� ������������� �� ����� �%���!��� �� ��#&

0111�# $� �� ��������� �������� ���� ��� ��� ��������� ��� ,8 ��������

� ���������� ��� ������ �� ���� ����������# K�� ����� ���� ����

���� ��� ������� ��� � ��� ����� �� �� ����������� ������� ���

������ � ������������ �� ���� �� ��� �������� �� +� �� ����� H�����

�� ���� ������ � ��� �������� �������� ������� �� ���� ������

����� �� ��� +� �������� �!� �� ��#& 0110�# ������ ������ ���� �� � ��

����� ��� ��C����� �� ��� �� ���� �� ������������� ��� ��� �����

����� ,8 �������������#

� 011< ��������� �� @������� ������������ +��������& �� ����� ��� ��� �� ��� �������& ��& 0/1F0.1

0/9 ?# 2������� �� ��#

'�#��� �������

,�� ������� ���� ��!� �� ����! ��� ����� %��P�!��� ��� ������� ������������ ������� ���������� ��� �����������& �� ?������ 6������ ��� ���� ����������� �� ��� �67 ������ �� E��� N���& %����� 8��������& ����-����K��Q� �� 6��� 5����� ������� ��� ��������� ��������� ����������# ,��� ������ �������� � ������ ���� ��� +����� 5����� 2������� ?������ ������������� ,����� �������� ((�M��'<09)� �� ��� ?��� ������ �������� ����� @������� ?��������� �O6-<�?,�'(((�11.10� �� ��� O����� �� 6��� ��5��������� �� 6� ��� 2�������� �������� �� ��� @������� ?����������O$�<�?,�0110�1'111�#

'�����������

��& �������������* ����& ����� ���� �������� � ������������ ������* �� &����� C��������� �������* $2& ������������ �* %+& ��������� ������� ������* @& ��������!�������* �67& ����������� ����� ���� �����* +�& ���������������* ,8& ������� ��������* 75�,& �������� ��������� ������������0*7,�& ������ ��������� ����#

���������

%��!& -#�#& $����& $#& 7�� ���& N#& %������& ,#N#& 6�������& N#D# L 8����& �#�'((/� ���� ������ � ���������!� ����� �� �������� ���� �� ����������������� �� ��������� ��������# ��� ��& ��& //)F/.<#

%��!& -#�#& 7�� ���& N#& �����& ,#& ������& -#& 5�����& %#& 7�����& 2#�#&2��������& �# L 8����& �# �'(()� 5������������ ����������� ��������������� � ���� ���� ������������ ����������� �� ��� ���� �����#���� �& ���& <<(F<>'#

%���!���& �#& -���!& �#& 2�������& ?#& ������� �!�& %#& 6������& ?# L5����& 2#N# �0111� ,����� � ������������� � ���� ������ ��� ��!�����"�������= ��� �� ���� ����& ��7 �� ����� ���� ������ ��� ���� �������� ������ �� ��� ������������� ����� �� ��� ��� ��!����� ����# ) ��� �& ���&90F(9#

%���!���& �# L 6�� ���& K# �0111� ��!����� ������ ���� ������ �� ������� ��� ������# ��� *��& �& '01.F'019#

?����& �#& %���& +#& 2�����& �#8#& 8���!�����3& K#& %���& #N# L ��& #,#�0110� $������� �� ��������!������� �2�� �� ��� �� ��� ������� �� ��!����� ������ �������� ���� �� ���������� �!�������# � ��� �+���'�� �,� ��� ��& ��& '9/F'(/#

?�������& -# L %���!���& �# �'(()� ����������������������� ���� ������������ ������������� �������� �����������# $$$# 2��������� � ���� �������� ������������� ���������# ) ��� � *�� ) ��� �& ��& 0/<F0.0#

?�������& -#& D�������& -# L %���!���& �# �'((0� ������������ ���������� ������������� �2�� ���������� �� ������������� �������� ����������� � ��������������� ���������# ( �� ���� -��� ��� .�-& ��& '1>9(F'1>(<#

?������& 5#& %�������& 7#& 2�������7�3���& 2#& ����������& ?#& ���& ;#& N� �����& �# L +� ����& 5# �'((/� �� ����!� �����& �' �� �0 ���������& �0 ����������!������� �2��� �� ��� ������������ �� �� ��� �������� ����������� ����� ������� ����������� �����������#�� � ��� ���& �& 0)''F0)01#

?�����& $#& %���& �#2# L +���& +#8# �'(..� �������� �������� ����������������� ����������� ������������ ���� ����� ������������ ��#�������& ���& )(/F)(9#

������� �!�& %#& -���!& �#& 2�������& ?#& 6������& ?# L %���!���& �# �0110���������������� �� ��� ��� ��!����� ���� � ������������� ���� ������������ ����� � ����� ���� �����# ��� � ��� �& ��& .)F90#

������&?#2#&5�����& N#�#&;����&D#+# $$$ �'(('��������� ������������ ���������� �������& ��������� & �� ��!������� ���������� �� �������� �������= ������ �����3����� ������������� �������# � ��� ���& ��& '1'/F'1<'#

8���& %#& ?�������& �#2# L %�������& N#5# �'((9� ?���������3����� ��������� ���� ����� ��������� �� 6��K � ��������� ������� �������������� �� ��� /�������������������� ��� ���� �� ��!�����"� ������#�,� ��� ��& ���& <<>F<>0#

8�����& +#5#& ;�& 8#& 8������& ?#N#& @����& 2#8# L 6� �& �#$# �'((.�+���������� ������3����� �� ��������� ������� �� ��� ������� ������������� ��� �������� �� ���������� �����# � ��%� ��� ��& ���& 0''F00.#

8�����& %#�#& ���������& 5#?#& ��������& 5# #& D���& 6#?#& ������& -#,#&2�������& ?#& -���!& �#& 5�����& %#& +������& 6#& N������& @# N�& 5�������&N#& 2��������& �#& %���!���& �#& 7�����& 2#�#& 8���& 5#�# L �������& 8#+#�'((9� ��������� ������ ������ ������� �� ��� � �� �� �������� �� ������������������ �������# � ��� ���& ��& >(0(F>(<.#

8����& N#& ��������& �#?#& �������& �#�#& 8���& 5#�#& 8������& �#& %���& #& 6����& �#+#& 5��!���� �& 6#& 6���& N#�#& ?������& �# L 8�����& %#N# �'(()������ ���� �������� � ������������ ������ �������� ������� ������������������� �� ����# ) ��� � )���& ��& >0)F><0#

$����& +#& ������& 5#& -����& +#& ,�����& +#& +������!�& 5# L ��!��& ,#�0111� ,8 ������� �� �2�� �� ������������� ����������� ������� ��������������� � ���������� ��� ��� ������������ �����������# ) ��� �*�� ) ��� �& ��& '<<F'</#

-�����& ?#5#& ?���& D#�#& +����& -#& -�����& 2# L ����& �#5# �'((.� �������������� ������� /�K8��= ���� �������� �� ��:�������� ��� ���������������# � ��� ���& ��& .'''F.''9#

-���!& �#& 2�������& ?# L %���!���& �# �'((9� ?���������3����� �� ���� ������� �������������� � ������� ��������� ������� ������� �� ��� �������������������� ����� ����� � ������������� /������������ �� ��� ���#�,� ��� ��& ���& 0)(F0..#

-���!& �#& 2�������& ?# L %���!���& �# �0111�� ����� ����� �� � ����������������������� ������� ������ � ���� �� ��� ������������� /�K8�� ���������� ����� �� ��� ���� �� ������������� �� ��� ������� ������# �� ���� ���& ��& <9.'F<990#

-���!& �#& 2�������& ?#& %���!���& �# L 5����& 2#N# �0111�� 6�����������7������� ���� �������� �� ���� �� ��� ��� ��!�����"� ����=������������� ��� ��� ����������� ����������� �������� ���������� �������������� ��� ������� ������������� �����# � ��� ���& �& >/9/F>.11#

-������& N#8#& @�����& 5#@#& %����& N#& 5�& +#;#& ?��& ;#& 6� ������& 6#&5�%���& N#& ?���& @#;#& ��H& +#& 2�������& %#B#& %����& D#�#& 8����& N#@#& 3���!�& 2#& ,����& 5#�#& ?�� �& #& 6���& B#& ,����& �#& 8������& #&������& �# L���������& # �0111� ���������������� ��� ���� � ����� ���� ����� ��� �� �� ���� �� ������� ����� �� ��!�����"� ������# �������&��& ./.F..<#

-����& +#?# L 7����& -#@# �'((/� $�������� ���������� �� ������� ������������ �� �� ���� ����������# � ��� ��'�%& ��& >><F>/0#

6�& M# L 8���& ,# �'((.� ����� ���� �������� � ������������ ������ ��� ��������& ��� ��� ��������� �� ������� ��������& �� ������ �������������������� �� ���� ����# � ��%� ��� ��& ���& >9>F>(>#

5�����& �#& 5�����& �#& ?�����& ,#& �������& �#& ���& �# L 2������& �# �'((/�$���������� �� ������������� ���������� �� ����= ������� �� ��������� �� ����� ���� ��� �� ����# �� � ('� %����& ���& 0>.F0)/#

5�����& ?#N#& +��& N#8#& N��& ,#8#& %��!& -#�# L �������& @#N# �'(((� 2����������� ������� �������� ���� ������������� �� ������ ������� � ����� ������������ � ������������ ������# �!����& �& 0>'F0><#

5�����& �#D#& @���!���& N#�#& ���3& N#,#& �����& +#�#& 5���& �#?#& 2�&�#%# L 6� �& �#$# �'(((� $������������� ������� �� �������� ���������� ����������� �75�,0� ������� �� ��!�����"� ������# �,� ��� ��&���& '<9F'>9#

5�����& �#D#& +����& N#-#& 8������& ?#N#& ���3& N#,#& 5���& �#?#& 2�& �#%# L6� �& �#$# �'((.� $������������� ������� �� ������� ����������� ��������� ��!�����"� ������# -�� ��� ��& �& )<1F)<(#

��H& +#& 6� ������& 6#& ?��& ;#& 5�& +#;#& @�����& 5#& %�!�& 2#& ������& �#&8������& #& ���������& # L -������& N#8# �0110� 6���� ����� ��� �������� ���� �������� � ������������ ������ ��������� ��� ������ �� ������������������� ������� �� ������� ����� �� ������������� �����������#� ��� ���& ��& >(>0F>()>#

������& �# L D�����& ?# �'((9� /'� �� ) ��� �� ��� ����,�� ��� ������#������� ����& +�� �����#

������& 5#�#& 5�������& @#�#& ,�����& �#& 6��& +#& ?����& N#�#& N����& @#&%���& �#& N������& 5#& ���& 2#8#& 5�-����& $#�#& %�����& ?# L ���& @#-#�'(((� +������� ����������� ���!��� �� ������� ���� 6�� �����& ��3�������"� �� ��!�����"� �������= ����������� �����������# ) ���& ��� �9�&'>>(F'>/9#

�����& @#�#& �� ���& 7# L +��3��& �# �'((9� ��������� �������� �� :��������� ������� ������� ������� �� ��������� �� ��� :������ ��3�#� ��� ���& ��& >'1/F>''9#

�������& B#& +����C��& ?#& �������& 2#& 6������& #& O����& �# #& N�����& #& ����& D# L D������& �#-# �0111� ��������������� ��� �� ��������������� �������!� ����� �� ������� �' �� �0 ��������� �� � /������������� �� :��������� ��� ������������ ��� ���� �� ������������������������ ��������� ����� ������� �� ������� �� �������� �������������������& �������� �� ���������# ��� �������& ��& <..F<99#

2�������& ?#& ��������& 5#& 8�����& ?#& %���& �#& 5���& 5#& N�������& N#&����& 6#& -���!& �#& ����& E#�#& 6������& ?#& ,����& �#& %���!���& �# LN�������& ,#@# �0111�� &� ���� ���������� �� ������ ������� ������� ������ ���� ���� �������� �� ��� �� �� ���������� ������ ����������4�������# *�� ���� ��� ���& ��& '((F0'>#

2�������& ?#& -���!& �# L %���!���& �# �0111�� +�:������� ������������� ������ ���� ��� ���������� ����� �� �������� �������� ������� ��������� � �� �� ������ ��������� ��� ��� �������� ������� ����� �� �������������� �� �� ��� ������� /�K8�� ������ ����# �,� ��� ��& ���& )1<F)'/#

+����& 8# L K�����& D#8# �'((>� �������� � ����������� �� �������������������� ������� ��������� ������������� �������� ������� ���� /������

� 011< ��������� �� @������� ������������ +��������& �� ����� ��� ��� �� ��� �������& ��& 0/1F0.1

6�������� ���� ��������� �� ������ ������� ������� 0/(

�������= � ������� ��������� ������� �� ����������������� ��� ����� ���# ��� �������& ��& >1'F>')#

+����& 8#& 2�������& ?# L %���!���& �# �'(()� ����� ���� �������� ������������� ������ ��� ��� ������������ ������ ������ ���� < ��� �������� ����������� �� ������ ����������� ������� ��������� ��������/������������ ������# ( �� ���� -��� ��� .�-& ��& 9(<)F9(<(#

�� +�������& E#& +���& N#& ��!��& ?# L ,����& �# �'((<� 7�� �� ������� �������� �������H����� ���� ��� ' ��� ���� ��� �������� �� ������������# � �� ��& ��& >(>)F>())#

,���& �#& ?����& @# L +������3& N# # �'(9<� $������� �� �����!������� �2���� ��!������� ������� �� ��� �������� ����� ��� ��������� �� ���������� ���0F< ���!�# ( �� ���� -��� ��� .�-& �& <9>'F<9>>#

,����& �#& 6��: ���& @#& 6��& 6#�#& K����& +#K#& ;����& �#& 8�����& %#N# LK����& 6# �'(()� ��������� �� ������ �� ��� ������������� ���������������� � ���� �� ����# ���� �& ���& <<)F<<(#

,����& N#6#& %�����& @#@#& B���& �#�# L ���������& # �'((.� ���� ��������������� ���������� ���� ��� ����� ����� ��������� ����� ����������� �� ��������� ��� �� �� ��� �������� �������# � ��� ���& ��& <0)F<<<#

;���& �#& ����& 6#& B����& �#& �� N������& +#D#N#& +���& 6#& D�& ?# # L 6�& %#�011'� ���� ������ �������� ����������� �� ����� -��� �������� ��������� ����������� �������# ��� ��� ���& & '1.'F'1.9#

B������& 2#& ���& �#& 5����& 2#N#& ������& 6# L ,����& �# �'((.� 5��������������� ����� ���� ����� ����� �� ��H����� ���� ��� �� �� ����# ���)�����'���& ��& 9.'F9.)#

� 011< ��������� �� @������� ������������ +��������& �� ����� ��� ��� �� ��� �������& ��& 0/1F0.1

0.1 ?# 2������� �� ��#