LUCIANA BALESTRIN

ESTUDO FITOQUMICO E AVALIAO DAS ATIVIDADES

ALELOPTICA, ANTIBACTERIANA E ANTIOXIDANTE DE

Dorstenia multiformis MIQUEL, MORACEAE

Dissertao apresentada como requisitoparcial obteno do grau de Mestre emCincias Farmacuticas, Curso de PsGraduao em Cincias Farmacuticas,Setor de Cincias da Sade,Universidade Federal do ParanOrientador: Profa. Dra. Marilis DallarmiMiguelCo-orientador: Prof. Dr. Obdulio GomesMiguel

CURITIBA

2006

ii

Dedico este trabalho a

Deus, e aos meus pais e

irmos, pela pacincia e

amor.

iii

Ao meu namorado Jos,

por incentivar e compartilhar

todos os momentos da

execuo deste trabalho.

iv

AGRADECIMENTOS

Universidade Federal do Paran.

Ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas.

Aos professores e colegas do Programa de Ps-Graduao.

Dra. Marilis Dallarmi Miguel, pela orientao e amizade.

Ao Dr. Obdlio Gomes Miguel, pela dedicao e pacincia.

Ao Botnico Dr. Gert Hatschbach, pela identificao da espcie vegetal.

indstria farmacutica As Ervas Curam, pela doao do material vegetal.

Ao laboratrio de Controle de Qualidade II da UFPR, representado pela

Profa Wanda N. Abraho e Geni Peruzzo, pela cooperao na avaliao da

atividade antibacteriana.

Ao Departamento de Qumica, em especial Profa. Dra. Ana Luiza, pelas

anlises de ressonncia nuclear magntica.

Clzia, pela anlise de cromatografia gasosa acoplada espectrometria

de massa.

Aos amigos Joo e Josiane, pelo auxlio.

Em especial amiga Cludia Alexandra de Andrade, companheira na

realizao dos ensaios biolgicos.

Ao Paulo da Farmacotcnica e Hilda da Fitoqumica, pela colaborao.

vSUMRIO

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................ viiiLISTA DE GRFICOS........................................................................................ xLISTA DE QUADROS E TABELAS.................................................................. xiLISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS....................................... xiiRESUMO..........................................................................................................xivABSTRACT ...................................................................................................... xv1 INTRODUO .............................................................................................. 012 OBJETIVOS.................................................................................................. 042.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................... 042.2 OBJETIVOS ESPECFICOS...................................................................... 043 REVISO DA LITERATURA......................................................................... 053.1 ENQUADRAMENTO TAXONMICO......................................................... 053.2 CONSIDERAES SOBRE A FAMLIA MORACEAE............................... 053.3 CONSIDERAES SOBRE O GNERO Dorstenia.................................. 063.3.1 Aspectos fitoqumicos do gnero Dorstenia ............................................ 073.3.1.1 Cumarinas, triterpenos e esterides..................................................... 073.3.1.2 Flavonides.......................................................................................... 113.3.1.3 Estirenos .............................................................................................. 163.3.2 Aspectos farmacolgicos do gnero Dorstenia ....................................... 173.3.3 Aspectos toxicolgicos do gnero Dorstenia........................................... 183.4 CONSIDERAES SOBRE Dorstenia multiformis, MIQUEL .................... 193.4.1 Sinonmia vulgar...................................................................................... 193.4.2 Sinonmia cientfica ................................................................................. 193.4.3 Distribuio geogrfica............................................................................ 193.4.4 Usos populares ....................................................................................... 203.4.5 Descrio botnica de Dorstenia multiformis .......................................... 213.4.6 Aspectos fitoqumicos de Dorstenia multiformis ...................................... 223.4.7 Aspectos toxicolgicos de Dorstenia multiformis..................................... 234 MATERIAL E MTODOS.............................................................................. 244.1 OBTENO DO MATERIAL VEGETAL..................................................... 244.2 CONSERVAO ....................................................................................... 244.3 OBTENO DO EXTRATO BRUTO E FRAES.................................... 244.4 ANLISES ORGANOLPTICAS................................................................ 264.5 TEOR DE SLIDOS .................................................................................. 264.6 PESQUISA DE GRUPOS FITOQUMICOS NOS EXTRATOS E

FRAES.................................................................................................. 274.6.1 Extrato alcolico 20%.............................................................................. 284.6.1.1 Pesquisa de alcalides......................................................................... 284.6.1.2 Pesquisa de flavonides....................................................................... 294.6.1.2.1 Leucoantocianidinas.......................................................................... 294.6.1.2.2 Heterosdeos flavnicos .................................................................... 294.6.1.2.3 Flavonis ........................................................................................... 304.6.1.2.4 Dihidroflavonides............................................................................. 304.6.1.2.5 Dihidroflavonis................................................................................. 314.6.1.3 Pesquisa de cumarinas ........................................................................ 314.6.1.4 Pesquisa de heterosdeos antraquinnicos.......................................... 334.6.1.5 Pesquisa de esterides e triterpenos ................................................... 33

vi

4.6.1.5.1 Reao de Liberman-Bouchard......................................................... 344.6.1.5.2 Reao de Keller Kelliani .................................................................. 344.6.2 Extrato aquoso ........................................................................................ 344.6.2.1 Pesquisa de heterosdeos antocinicos ............................................... 354.6.2.1.1 Primeiro teste .................................................................................... 354.6.2.1.2 Segundo teste ................................................................................... 354.6.2.2 Pesquisa de heterosdeos saponnicos................................................ 364.6.2.3 Pesquisa de heterosdeos cianognicos .............................................. 364.6.2.4 Pesquisa de cidos volteis ................................................................. 374.6.2.5 Pesquisa de taninos ............................................................................. 374.6.2.5.1 Diferenciao entre taninos hidrolisveis e condensveis ................ 384.6.2.6 Pesquisa de cidos fixos...................................................................... 384.6.2.7 Pesquisa de aminogrupos .................................................................... 394.7 ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DOS COMPOSTOS...................... 394.7.1 Isolamento de compostos da poro solvel em acetona....................... 394.7.2 Identificao dos compostos isolados da poro solvel em acetona .... 424.7.2.1 Anlise via CLAE da amostra CRS1 .................................................... 424.7.3 Isolamento de compostos da poro no solvel em acetona................ 434.8 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA ..................................... 434.8.1 Preparo do material................................................................................. 444.8.2 Preparo das amostras ............................................................................. 444.8.3 Preparo dos discos de papel................................................................... 454.8.4 Meio de cultura........................................................................................ 454.8.5 Preparo do inculo .................................................................................. 464.8.6 Teste de atividade antibacteriana............................................................ 464.9 AVALIAO DA CONCENTRAO MNIMA INIBITRIA........................ 474.9.1 Preparo do inculo .................................................................................. 474.9.2 Preparo das amostras ............................................................................. 484.9.3 Teste da concentrao mnima inibitria................................................. 484.10 AVALIAO DA ATIVIDADE ALELOPTICA.......................................... 484.10.1 Preparo das amostras........................................................................... 494.10.2 Preparo do material............................................................................... 504.10.3 Teste de germinao............................................................................. 514.10.4 Teste de crescimento ............................................................................ 514.11 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE........................................ 524.11.1 Ensaio da reduo do complexo fosfomolibdnio ................................. 524.11.2 Abordagem do potencial antioxidante por cromatografia em camada

delgada.................................................................................................. 535 RESULTADOS E DISCUSSO..................................................................... 545.1 AVALIAO DAS CARACTERSTICAS ORGANOLPTICAS.................. 545.2 TEOR DE SLIDOS NO EXTRATO ETANLICO BRUTO E NAS

FRAES.................................................................................................. 545.3 PESQUISA DE GRUPOS FITOQUMICOS NOS EXTRATOS E

FRAES.................................................................................................. 555.3.1 Anlise sistemtica com extrato alcolico 20%....................................... 555.3.2 Anlise sistemtica com extrato aquoso ................................................. 575.4 SEPARAO E PURIFICAO DE COMPOSTOS.................................. 585.4.1 Anlises realizadas em cromatografia em camada delgada ................... 585.5 ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DOS COMPOSTOS PRESENTES

NAS AMOSTRAS CRS1 E CRS2.............................................................. 60

vii

5.5.1 Identificao dos compostos presentes na amostra CRS1 porcromatografia gasosa acoplada a massa ................................................ 60

5.5.2 Ressonncia magntica nuclear de carbono e hidrognio da amostraCRS1 ....................................................................................................... 66

5.5.3 Ressonncia magntica nuclear de carbono e hidrognio da amostraCRS2 ....................................................................................................... 66

5.6 CROMATOGRAMA DA AMOSTRA CRS1 EM CLAE UTILIZANDOCOMO PADRO PSORALENO E BERGAPTENO ................................... 82

5.7 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ..................................... 835.7.1 Difuso em gar...................................................................................... 835.7.2 Concentrao inibitria mnima............................................................... 875.8 AVALIAO DA ATIVIDADE ALELOPTICA............................................ 905.8.1 Avaliao da germinao ........................................................................ 905.8.2 Avaliao do crescimento........................................................................ 925.8.2.1 Avaliao da porcentagem de crescimento de Lactuca sativa ............. 935.9 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE.......................................... 955.9.1 Ensaio pelo mtodo de reduo do complexo fosfomolibdnio............... 955.9.2 Ensaio pelo mtodo de cromatografia em camada delgada.................... 986 CONCLUSES........................................................................................... 100REFERNCIAS.............................................................................................. 102ANEXO .......................................................................................................... 107

viii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 DIHIDROFURANOCUMARINA ISOLADA DE Dorsteniacontrajerva ................................................................................. 08

FIGURA 2 FURANOCUMARINAS PRESENTES EM Dorstenia excentrica 09FIGURA 3 CUMARINA PRESENTE EM Dorstenia poinsettifolia ................ 09FIGURA 4 FURANOCUMARINA E DERIVADO BENZOFURANO DE

Dorstenia gigas ......................................................................... 10FIGURA 5 FLAVONAS E DERIVADO BENZOFURANO DE Dorstenia

Psilurus...................................................................................... 12FIGURA 6 FLAVONIDE ISOLADO DE Dorstenia barteri.......................... 13FIGURA 7 FLAVONIDE PRENILADO DE Dorstenia poinsettifolia ........... 14FIGURA 8 FLAVONIDE PRENILADO DE Dorstenia psilurus................... 14FIGURA 9 FLAVONIDES PRENILADOS DE Dorstenia mannii................ 16FIGURA 10 ESTRUTURA DA SIRIOGENINA............................................... 18FIGURA 11 A ESPCIE Dorstenia multiformis, MIQUEL, MOSTRANDO

AS RAZES E PARTES AREAS.............................................. 23FIGURA 12 A ESPCIE Dorstenia multiformis, MIQUEL, MOSTRANDO

DIMENSES DAS RAZES E PARTES AREAS..................... 23FIGURA 13 FLUXOGRAMA DA OBTENO DO EXTRATO BRUTO,

RESDUO RESULTANTE E FRAES .................................... 26FIGURA 14 FLUXOGRAMA ILUSTRATIVO DO FRACIONAMENTO DA

PORO SOLVEL EM ACETONA ......................................... 42FIGURA 15 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DAS FRAES

OBTIDAS EM COLUNA CROMATOGRFICA COM APORO SOLVEL EM ACETONA ......................................... 60

FIGURA 16 CROMATOGRAMA DE CG/EM, RELATIVO ANLISE DAAMOSTRA CRS1....................................................................... 62

FIGURA 17 ESPECTRO DE MASSA DA AMOSTRA CRS1 PARAPSORALENO, COM TEMPO DE RETENO EM 11,19 ......... 63

FIGURA 18 ESPECTRO DE MASSA DO PSORALENO DATABASE/NIST1998, PARA COMPARAO COM ESPECTRO DOCROMATOGRAMA COM O TEMPO DE RETENO 11,19.... 64

FIGURA 19 ESPECTRO DE MASSA DA AMOSTRA CRS1 PARABERGAPTENO, COM TEMPO DE RETENO EM 13,39....... 65

FIGURA 20 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A MASSA PARABERGAPTENO DATABASE/NIST98......................................... 60

FIGURA 21 ESPECTRO DE MASSA DA AMOSTRA CRS1 PARA OISOPSORALENO, COM TEMPO DE RETENO EM 11,19 ... 66

FIGURA 22 ESPECTRO DE MASSA DO ISOPSORALENODATABASE/NIST 1998, PARA COMPARAO COMESPECTRO DO CROMATOGRAMA COM TEMPO DERETENO 11,19 ..................................................................... 67

FIGURA 23 ESPECTRO DE RMN 13C (200 MHZ em CDCl3) PARA OPSORALENO, BERGAPTENO E ISOPSORALENO................. 72

FIGURA 24 ESPECTRO DE RMN 1H (200 MHZ em CDCl3) PARA OPSORALENO E BERGAPTENO ............................................... 73

FIGURA 25 ESPECTRO EXPANDIDO DE RMN 1H PARA COMPOSTOSISOLADOS DA AMOSTRA CRS1 ............................................. 74

ix

FIGURA 26 ESTRUTURA QUMICA DA ALFA AMIRINA ............................. 77FIGURA 27 ESTRUTURA QUMICA DA BETA AMIRINA............................ 77FIGURA 28 ESPECTRO de RMN 13 C DA AMOSTRA CRS2 DE 3-o-

acetato de-amirina e 3-o-acetato de-amirina ................... 78FIGURA 29 ESPECTRO DE RMN 13 C EXPANSO REFERENTE DE 14

A 33 ppm PARA AMOSTRA CRS2 DE 3-o-acetato de-amirina e 3-o-acetato -amirina .............................................. 79

FIGURA 30 ESPECTRO DE RMN 13 C EXPANSO REFERENTE DE 32A 60 ppm PARA AMOSTRA CRS2 DE 3-o-acetato de-amirina e 3-o-acetato -amirina .............................................. 80

FIGURA 31 ESPECTRO DE RMN 13 C EXPANSO REFERENTE DE 95A 190 ppm PARA FRAO CRS2 DE 3-o-acetato de -amirina e 3-o-acetato-amirina............................................. 81

FIGURA 32 ESPECTRO EXPANDIDO DE RMN 1H NA FAIXA DE 0,0 A7,5 ppm DA AMOSTRA CRS2 CORRESPONDENTE A 3-o-acetato de-amirina e 3-o-acetato de-amirina amirina ... 82

FIGURA 33 ESPECTRO EXPANDIDO DE RMN 1H NA FAIXA DE 4,20 a5,50 REFERENTE A CRS2 DE 3-o-acetato de-amirina e3--o-acetato de -amirina......................................................... 83

FIGURA 34 CROMATOGRAMA POR CLAE DA AMOSTRA CRS1 ............. 84FIGURA 35 CONTROLE DE ESTERILIDADE DO ENSAIO ......................... 88FIGURA 36 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DA FRAO

CLOROFRMIO PARA S. aureus............................................. 89FIGURA 37 FOTOGRAFIA DO MIC PARA A FRAO HEXANO, COM A

BACTRIA Escherichia coli ...................................................... 91FIGURA 38 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELO ENSAIO DE REDUO

DO COMPLEXO FOSFOMOLIBDNIO PARA O EXTRATOETANLICO BRUTO, FRAES E SUBSTNCIASISOLADAS................................................................................. 98

FIGURA 39 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELO ENSAIO DECROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA ........................ 101

xLISTA DE GRFICOS

GRFICO 1 PORCENTAGEM DE CRESCIMENTO DA RADCULA DELactuca sativa ............................................................................... 94

GRFICO 2 PORCENTAGEM DE CRESCIMENTO DO HIPOCTILO DELactuca sativa ............................................................................... 95

xi

LISTA DE QUADROS E TABELAS

QUADRO 1 ENQUADRAMENTO TAXONMICO DE Dorsteniamultiformis..................................................................................... 05

TABELA 1 QUANTIDADES DAS AMOSTRAS IMPREGNADAS NOSDISCOS DE PAPEL, EM g.......................................................... 45

TABELA 2 CARACTERSTICAS ORGANOLPTICAS DO EXTRATOETANLICO BRUTO DE Dorstenia multiformis ............................ 54

TABELA 3 TEOR DE SLIDOS DO EXTRATO ETANLICO BRUTO EFRAES DE Dorstenia multiformis ............................................. 55

TABELA 4 ANLISE SISTEMTICA DO EXTRATO HIDROALCOLICODE Dorstenia multiformis ............................................................... 57

TABELA 5 ANLISE SISTEMTICA DO EXTRATO AQUOSO...................... 58TABELA 6 DESLOCAMENTOS EM ppm DO ESPECTRO DE RMN 13C E

1H PARA SUBSTNCIA ISOLADA PSORALENO ........................ 67TABELA 7 DESLOCAMENTOS, EM ppm, DE RMN 13C E 1H PARA

SUBSTNCIA ISOLADA BERGAPTENO ..................................... 68TABELA 8 - DESLOCAMENTOS, EM ppm, DE RMN 13C E 1H PARA

SUBSTNCIA ISOLADA ISOPSORALENO.................................. 69TABELA 9 VALORES DE DESLOCAMENTO QUMICO DE RMN

13C/DEPT/1H (CDCLl, TMS, ) PARA A AMOSTRA CRS2 ........... 74TABELA 10 CONCENTRAO DOS COMPOSTOS IDENTIFICADOS NA

AMOSTRA CRS1 .......................................................................... 83TABELA 11 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE Dorstenia multiformis,

POR DIFUSO EM GAR ............................................................ 84TABELA 12 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE Dorstenia multiformis

CONCENTRAO INIBITRIA MNIMA ...................................... 89TABELA 13 TESTE DE SCOTT-KNOTT REALIZADO NOS NDICES DE

VELOCIDADE DE GERMINAO DE Lactuca sativa NOENSAIO ALELOPTICO ............................................................... 91

TABELA 14 TESTE DE SCOTT-KNOTT REALIZADO NA AVALIAO DOCRESCIMENTO DE Lactuca sativa .............................................. 93

TABELA 15 VALORES DE ABSORBNCIA, RELATIVOS AO EXTRATOBRUTO, FRAES E SUBSTNCIAS ISOLADAS DEDorstenia multiformis, a 695NM .................................................... 97

xii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

AlfaACN AcetonitrilaANVISA Agncia Nacional de Vigilncia SanitriaATCC American Type Culture Colection BetaBaCl2 Cloreto de brioC Graus CelsiusC CarbonoCa(OH)2 Hidrxido de clcioCCD Cromatografia em camada delgadaCDCl3 Clorofrmio deuteradoCG/EM Cromatografia gasosa/espectrometria de massaCLAE Cromatografia lquida de alta eficinciacm CentmetroCRS1 Composto do resduo solvel em acetona 1CRS2 Composto do resduo solvel em acetona 2DPPH Difenil-picril-hidrazilE. coli Escherichia coliFeCl3 Cloreto frricog GramaHCl cido clordricoH2O guaH3PO4 cido fosfricoH2SO4 cido sulfricoIVG ndice de velocidade de germinaoKg KilogramaKOH Hidrxido de potssioM MolarMeOH Metanolmg Miligramamin MinutoMHz MegahertzMIC Concentrao mnima inibitriamL Mililitromm Milmetro MicroN NormalNaOH Hidrxido de sdioNa3PO4 Fosfato de sdioNH4OH Hidrxido de amnionm NanmetroOH Hidroxilap Pginappm Parte por milhop/v Peso/volume Marca registradaRDC Resoluo da diretoria colegiadaRMN 1H e 13C Ressonncia magntica nuclear de prton e carbono

xiii

TMSO TetrametilsilanoUFPR Universidade Federal do ParanUV Ultravioletav/v Volume/volume

xiv

RESUMO

O presente trabalho realizou estudo sobre Dorstenia multiformis, Miquel,

pertencente famlia Moraceae, utilizando-se todas as partes da planta.

partir do resduo obtido do extrato bruto etanlico, por meio de separao em

coluna cromatogrfica de slica-gel, obteve-se 4,5g de um material cristalino

denominado CRS1 e 80,8mg de material denominado CRS2. Da anlise de

CG/EM e RMN 1H e 13C na amostra CRS1, e aps doseamento por CLAE,

verificou-se a presena de 90% de psoraleno e 10% de bergapteno. Da anlise

de RMN 1H e 13C realizada com a amostra CRS2, identificou-se dois

constituintes: acetato de -amirina e acetato de -amirina. O extrato etanlicobruto, fraes e substncias isoladas foram avaliados quanto ao seu potencial

biolgico, por meio dos ensaios de atividade aleloptica, antibacteriana e

antioxidante. Para avaliao da atividade aleloptica verificou-se a velocidade

de germinao e o comprimento da radcula e do hipoctilo de sementes de

Lactuca sativa, em presena das amostras e controles gua destilada e

metanol. A verificao da atividade antibacteriana foi realizada por meio dos

testes de difuso em disco e concentrao inibitria mnima, e a atividade

antioxidante foi verificada atravs dos testes de reduo do complexo

fosfomolibdnio e reao com DPPH em placa cromatogrfica. Os resultados

obtidos com o estudo aleloptico indicaram influncia inibitria do extrato

etanlico bruto e das fraes sobre a germinao das sementes de Lactuca

sativa, em vrias concentraes testadas. O crescimento da radcula e do

hipoctilo das sementes foi influenciado inibitoriamente pela frao hexano nas

maiores concentraes testadas. O extrato etanlico bruto inibiu o

desenvolvimento da bactria Salmonella thiphymurium, e a bactria

Staphylococcus epidermidis teve seu crescimento inibido em presena das

fraes hexano e clorofrmio. Todas as amostras testadas apresentaram certo

grau de atividade antioxidante, especialmente a frao clorofrmio.

Palavras chave: alelopatia, fitoqumica, atividade antibacteriana e antioxidante.

xv

ABSTRACT

The present work is a study about Dorstenia multiformis, Miquel, which belong

to Moraceae family, utilizing all the parts of the plant. From the residue obtained

from the ethanolic gross extract through separation on chromatographic colums

of silica-gel, it was obtained 4,5g of a crystalline material called CRS1 and

80,8mg of a material called CRS2. From de analysis of CG/MS and RMN 1H

and 13C on the sample CRS1, and after dosage by HPLC it was verified the

presence of 90% psoraleno and 10% bergapteno. From the analysis of RMN 1H

and 13C developed with the sample CRS2, two constituents were identified: -amirina acetate and -amirina acetate. The gross ethanolic extract, fractionsand isolated substances were evaluated in relation to its biological potential

through assays of alelopathic, antibacterial and antioxidating activity. In order to

evaluate the alelopathic activity it was verified the germination speed and the

radicle and hippocotil length of Lactuca sativa seeds, in the presence of

samples and destilled water and methanol control. The verification of

antibacterial activity was developed through disc diffusion and minimal inhibitory

concentration tests, and the antioxidating activity was verified through tests of

phosphomolibdeny complex reduction and reaction with DPPH on

chromatographic plate. The obtained results with the alelophatic study showed

inhibitory influence of gross ethanolic extract and fractions on Lactuca sativa

seeds germination, for several tested concentrations. The growth of seeds

radicles and hippocotil had the inhibitory influence by hexano fraction on the

highest concentrations tested. The gross ethanolic extract inhibited the

development of bacteria Salmonella thiphymurium, and bacteria

Staphylococcus epidermidis had its grown inhibited in the presence of hexano

and chloroform fractions. All the tested samples showed a certain degree of

antioxidating activity, specially the chloroform fraction.

Key-words: alelopathy, phytochemistry, antibacterial and antioxidating activity.

16

1. INTRODUO

A busca do homem por solues que pudessem aplacar suas dores e

doenas foi sempre incessante e remonta seu aparecimento na face da Terra

(SILVA, 2001).

Nesse contexto, desde os primrdios das civilizaes, as plantas tm

sido utilizadas pelo homem, como fonte de alimento e de tratamento de

doenas, devido sua abundncia na natureza e facilidade de obteno. O

emprego das plantas no controle de diversas doenas e pragas talvez seja to

antigo quanto o prprio aparecimento da humanidade (FRANA, 2001).

Indcios do uso de plantas medicinais e txicas foram encontrados nas mais

antigas civilizaes, onde o homem primitivo, ao procurar plantas para o seu

sustento, foi descobrindo espcimes com ao txica ou medicinal. Os

benefcios obtidos com a utilizao emprica levaram o homem a buscar

sempre novas plantas, para o tratamento de diversas patologias, e a

experincia acumulada foi transmitida por inmeras geraes, levando ao

descobrimento de alguns dos mais valiosos medicamentos utilizados na

medicina moderna (SIMES e colaboradores, 1986).

Alm dos benefcios, observou-se muitas reaes txicas associadas a

plantas, levando necessidade de estudos criteriosos relativos sua

utilizao. Diversos autores tm apontado a importncia dos estudos qumicos

e farmacolgicos, em vrias espcies vegetais, pela intensa produo de

metablitos secundrios, que podem ser medicinais ou txicos, principalmente

nas espcies dos ecossistemas tropicais (BRITO & BRITO, 1993). Atualmente,

estima-se que existam aproximadamente 500.000 espcies de plantas

terrestres, das quais so conhecidos aproximadamente 50.000 metablitos

secundrios (MONTANARI; BOLZANI, 2001).

Em nosso pas, h uma grande diversidade de plantas com potencial

teraputico, o que estimula os pesquisadores no estudo de suas possveis

aes teraputicas, bem como aes txicas, a fim de produzir medicamentos

com garantia de eficcia e segurana. Pesquisadores da rea de produtos

naturais mostram-se impressionados pelo fato desses produtos encontrados na

natureza revelarem uma gama quase inacreditvel de diversidade, em termos

17

de estrutura e de propriedades fsico-qumicas e biolgicas (WALL & WANI,

1996).

A riqueza da biodiversidade da flora brasileira, associada aos

levantamentos etnobotnicos, etnofarmacolgicos, farmacognsticos e

fitoqumicos, permitiu aos pesquisadores isolar compostos biologicamente

ativos a partir de diferentes espcies vegetais, os quais podem se constituir em

modelos tanto para a sntese de frmacos quanto de outros produtos para

aplicao agrcola ou florestal (GUERRA; NODARI, 2001).

Os resultados dos estudos e pesquisas acerca das propriedades

antimicrobianas de produtos obtidos de plantas tm sido promissores, sendo

que muitos compostos qumicos tm sido isolados de espcies vegetais

brasileiras e de outras partes do mundo, com potente atividade antimicrobiana,

de grande interesse para a indstria farmacutica e a medicina (YUNES e

CALIXTO, 2001).

Esses estudos possibilitam a obteno de molculas apropriadas para a

produo de antimicrobianos efetivos, com efeitos desejveis e especficos, e

sem efeitos colaterais ao hospedeiro (RECIO e colaboradores, 1989; MITSHER

e colaboradores, 1987; YUNES e CALIXTO, 2001).

A busca por herbicidas que possam ser extrados de fontes naturais

essencialmente importante para as plantas medicinais, uma vez que no

recomendado o uso de agrotxicos sintticos no cultivo destas, podendo haver

contaminao com resduos txicos, ocasionando problemas para a sade,

alm de poder causar reduo na concentrao dos princpios ativos do

vegetal (REIS; MARIOT, 2001).

Ao se tratar da qualidade de uma droga com fins medicinais, o principal

parmetro a ser considerado a correta identidade botnica, e, nesse

contexto, a anlise fitoqumica qualitativa apresenta-se como uma importante

anlise nos processos de inspeo da matria-prima vegetal, uma vez que, a

partir da publicao, pela ANVISA, da RDC n17, em 24 de fevereiro de 2000,o fabricante de fitoterpicos passa a ser responsvel por comprovar as

indicaes e a dosagem, baseando-se na padronizao de marcadores

qumicos, e utilizando-os, inclusive, no controle de qualidade da matria-prima.

Existem vrios estudos fitoqumicos relativos ao gnero Dorstenia,

porm no h estudos fitoqumicos especficos para a Dorstenia multiformis,

18

que amplamente utilizada no Brasil, em formulaes para tratamento de

distrbios menstruais, bem como outras indicaes, em diversas formas

farmacuticas. Dentro do gnero Dorstenia existem vrias espcies conhecidas

popularmente como carapis ou caiapis, todas elas dotadas de

propriedades medicinais e, na grande maioria desse comrcio, a espcie no

identificada (FLORA BRASILEIRA, 1983).

Dessa forma, para garantir a qualidade das formulaes, torna-se

necessrio identificar um marcador qumico especfico, assegurando a

utilizao da espcie na produo dos medicamentos.

Vrios trabalhos acadmicos e artigos indicam que diversos tipos de

danos teciduais, inclusive em tecidos vitais, so causados por grupos de

substncias qumicas, conhecidas como radicais livres, produzidas

naturalmente em grandes quantidades no organismo. Dessa forma, j se

conhece bastante sobre o papel dos radicais livres na produo de doenas,

buscando-se agora tentativas de interveno que possam minimizar os danos

causados. Tais intervenes precisam, obviamente, assumir a forma de um

ataque aos radicais livres, e este se d pelo uso de substncias com atividade

antioxidante (YOUNGSON, 1996).

Todas essas proposies justificam o estudo qumico e biolgico da

espcie Dorstenia multiformis, com o intuito de contribuir para a qualidade das

formulaes j existentes, bem como identificar ativos com possibilidade de

aplicao em formulao farmacutica.

Considere-se ainda que, de acordo com as perspectivas da

modernidade, a sade do futuro estar voltada para a medicina preventiva,

onde a cincia buscar na natureza meios profilticos que auxiliem o homem

na defesa de seus males (MIGUEL, 1999).

19

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Realizar estudo da composio qumica de Dorstenia multiformis, Miquel

e verificar possveis aplicaes biolgicas da espcie, por meio de seus

constituintes qumicos presentes no extrato bruto, fraes, ou isoladamente.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Detectar e isolar compostos qumicos presentes no extrato etanlico e

respectivas fraes de Dorstenia multiformis M.

Identificar os constituintes qumicos isolados, a partir da anlise de

dados obtidos por espectrometrias de CG/EM e RMN 1H e 13C.

Avaliar atividade antibacteriana do extrato etanlico, fraes e

substncias isoladas de Dorstenia multiformis M.

Avaliar atividade antioxidante do extrato etanlico, fraes e substncias

isoladas de Dorstenia multiformis M.

Avaliar atividade aleloptica do extrato etanlico, fraes e substncias

isoladas de Dorstenia multiformis M.

20

3. REVISO DA LITERATURA

3.1 ENQUADRAMENTO TAXONMICO

O enquadramento taxonmico de Dorstenia multiformis, Moraceae,

segundo CRONQUIST (1981) e ENGLER (1998), est demonstrado no quadro

1.

QUADRO 1 ENQUADRAMENTO TAXONMICO DE Dorstenia multiformis

ENGLER (JOLY, 1998) CRONQUIST (1981)

Diviso Angiospermae Magnoliophyta

Classe Dicotyledoneae Magnoliopsida

Subclasse Archichlamydeae Hamamelidae

Ordem Urticales Urticales

Famlia Moraceae Moraceae

Gnero Dorstenia Dorstenia

Espcie multiformis Multiformis

3.2 CONSIDERAES SOBRE A FAMLIA MORACEAE

As plantas da famlia Moraceae so predominantemente arbreas ou

arbustivas, sendo raras as herbceas. Caracterizam-se por apresentar folhas

inteiras, dispostas alternadamente, simples ou, raramente, compostas, sempre

protegidas no boto por duas estpulas (JOLY, 1975). Freqentemente,

apresentam as paredes celulares, especialmente da epiderme ou tricomas,

mineralizadas com carbonato de clcio ou slica; estmatos anomocticos;

presena de estpulas, porm, algumas vezes, em nmero reduzido, como

ocorre no gnero Dorstenia (CRONQUIST, 1981).

As flores so muito pequenas, de sexo separado, reunidas em densas

inflorescncias, protegidas por sries de elementos do perianto (em nmero de

2 a 6). Flores masculinas com estames ismeros e opostos aos segmentos do

perianto. Flores femininas com perianto rudimentar ou ausente, constitudas

por um ovrio spero composto de 2 carpelos e um s lculo (dos 2 carpelos,

21

muitas vezes s um se desenvolve) com um s vulo. Estigmas 2, estiletes 2

(JOLY, 1975).

Fruto drupceo, com exocarpo descendente, com sementes perenes, o

receptculo comum freqentemente amadurece com os ovrios, formando um

sicnio carnudo. As sementes possuem embrio reto ou, mais freqentemente,

curvado, os cotildones freqentemente desiguais, algumas vezes um dos

cotildones encontra-se totalmente suprimido; endosperma carnudo e oleoso

(CRONQUIST, 1981).

A famlia composta de cerca de 61 gneros, com mais de 1000

espcies, e se encontra bem representada no Brasil, tanto por espcies

indgenas, quanto por cultivadas. freqente, de um modo geral, nas regies

tropicais e subtropicais de todo o mundo, sendo menos comum em climas

temperados. Os gneros mais numerosos da famlia so Ficus, com cerca de

600 espcies; Dorstenia, com aproximadamente 125 espcies, e Cecropia,

com cerca de 50 espcies (JOLY, 1975; CRONQUIST, 1981).

Entre os gneros nativos no Brasil, destacam-se Ficus, Brosimum,

Dorstenia e Cecropia (JOLY, 1975).

3.3 CONSIDERAES SOBRE O GNERO Dorstenia

O gnero Dorstenia, conhecido popularmente como caapi ou carapi,

um exemplo de erva na famlia e se caracteriza pelas inflorescncias

disciformes (resultantes da fuso dos pednculos) com flores ssseis inseridas

no lado superior (JOLY, 1975).

Segundo ABEGAZ e colaboradores (2002), o gnero Dorstenia possui

muitas plantas que so utilizadas como anti-ofdicas, anti-infecciosas e anti-

reumticas, na terapia medicamentosa base de plantas medicinais, em

muitos pases da frica e Amricas do Sul e Central.

Vrias espcies de Dorstenia so utilizadas na medicina humana,

principalmente contra doenas de pele, por causa da presena de compostos

biologicamente ativos. A ocorrncia de furanocumarinas tem sido amplamente

demonstrada na famlia Moraceae. Estudos de identificao e quantificao de

furanocumarinas em "carapi" (espcies de Dorstenia, Moraceae) so

22

realizados, atualmente, no Brasil, por causa de suas propriedades medicinais

contra doenas de pele (CARDOSO e colaboradores, 1999).

3.3.1 Aspectos fitoqumicos do gnero Dorstenia

De acordo com ABEGAZ e colaboradores (2002), o gnero Dorstenia

reconhecido como uma rica fonte de cumarinas prenil e geranil substitudas,

chalconas, flavonas e flavanonas.

3.3.1.1 Cumarinas, triterpenos e esterides

BAUER e NOLL (1986) isolaram e identificaram, dos extratos etreo e

alcolico dos rizomas de Dorstenia brasiliensis Lam., duas furanocumarinas

lineares: psoraleno (0,28%) e bergapteno (0,08%), que so substncias

fotossensibilizantes.

Por meio do fracionamento inicial do extrato etanlico dos rizomas de

Dorstenia heringeri Car. & Val. (Moraceae), VILEGAS e colaboradores (1992)

separaram cidos graxos, furanocumarinas simples e uma furanocumarina

monoterpnica.

Triterpenos pentacclicos, esterides e furanocumarinas foram

identificados nas fraes hexnicas dos rizomas ou folhas de cinco espcies de

Dorstenia (Moraceae) (D. bahiensis Kl., D. bryoniifolia Mart ex. Miq., D.

carautae C.C.Berg, D. cayapiaa Vell. e D. heringerii Car. & Val). Os compostos

terpenides isolados tm sido relatados como os responsveis pelo uso

popular de espcies de Dorstenia como antiofdicos (VILEGAS e

colaboradores, 1997).

TOVAR-MIRANDA e colaboradores (1998) isolaram e identificaram, das

razes de Dorstenia contrajerva, a dihidrofuranocumarina (2S*,1S*)-2,3-dihidro-

2-(1-hidroxi-1-acetiloximetiletil)-7H-furo[3,2-g][1]benzopirano-7-ona, cuja

estrutura encontra-se representada abaixo.

FIGURA 1 DIHIDROFURANOCUMARINA DE Dorstenia contrajerva

OO O ORMe OR2

1

I

MeO OMe

CH2

II

23

Trs derivados fenilpropanides conhecidos, estearil-p-cumarato

[octadecanil-3-(4-hidroxifenil)prop-2-enoato], estearil-ferulato [octadecanil-3-(4-

hidroxi-3-metoxifenil)prop-2-enoato] e psoraleno foram isolados a partir de

Dorstenia psilurus (NGADJUI e colaboradores, 1998).

O triterpeno butirospermol foi isolado de extratos de Dorstenia

poinsettifolia (TSOPMO e colaboradores, 1998).

CARDOSO e colaboradores (1999) determinaram a presena de

furanocumarinas (psoraleno, bergapteno, pimpinelina e isopimpinelina) nos

rizomas e partes areas de Dorstenia tubicina, Dorstenia asaroides e Dorstenia

vitifolia, e em amostras comerciais.

Estudos fitoqumicos das razes de Dorstenia excentrica levaram ao

isolamento e identificao de furanocumarinas, a saber, um diastereoismero

do prandiol (figura 2-I), com a configurao 2S,1S; 4-[3-(4,5-dihidro-5,5-

dimetil-4-oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3,2-g][1]benzopirano-7-ona; 7H-furo[3,2-

g][1]benzopirano-7-ona (psoraleno figura 2-II) e 7-hidroxi-cumarina. As

furanocumarinas 7 - hidroxi-cumarina, psoraleno e o dmero do psoraleno

tambm foram isolados de D. lindeniana, enquanto 5-[3-(4,5-dihidro-5,5-dimetil-

4-oxo-2-furanil)-butoxil]-7H-[3,2-g][1] benzopirano - 7 - ona e bergapteno esto

presentes nas razes de D. drakena (ROJAS-LIMA e colaboradores, 1999).

FIGURA 2 DIASTEREOISMERO DO PRANDIOL PRESENTE EM Dorstenia excentrica

OO O

II

O

H

AcOMeHO

O O

I

24

NGADJUI e colaboradores (1999) isolaram e identificaram, dos brotos de

Dorstenia poinsettifolia, poinsettifolactona (figura 3) - uma nova dihidro-4-

prenilcumarina -, alm de uma rara dihidrocumarina 4-fosfo-substituda.

FIGURA 3 CUMARINA PRESENTE EM Dorstenia poinsettifolia

O

Me

MeO

O

OMe

Furanocumarinas geranil substitudas tm sido identificadas em muitas

espcies do gnero Dorstenia (ABEGAZ e colaboradores, 2002).

Uma nova furanocumarina glicosilada, -l-ramnopiranosil-(1 6)--d-glucopiranosil-bergaptol (1), foi isolada de Dorstenia contrajerva, juntamente

com trs furanocumarinas conhecidas, catequina e epicatequina (CACERES e

colaboradores, 2001).

FRANKE e colaboradores (2001) isolaram uma srie de

furanocumarinas preniladas, lineares e angulares (ex., dorstegina figura 3-I),

e um derivado benzofurano (figura 3-II) das folhas e brotos de Dorstenia gigas

(Moraceae), planta de ocorrncia endmica na ilha de Socotra (Yemen).

FIGURA 3 FURANOCUMARINAS DE Dorstenia gigas

LOPES e colaboradores (2001) isolaram um anlogo do psoraleno,

denominado dorstenina, 5- (3- (4,5-dihidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil) -butoxi) -

O

MeMe

O O O MeO O CH2 OHII

25

7H-furo (3,2-g) (1) benzopirano-7-ona, de espcies de Dorstenia (Moraceae).

Dorstenina apresentou propriedades fotossensibilizantes e mutacionais frente a

cepas selvagens de E. coli e S. cerevisiae, porm, com menor efeito

genotxico, comparado s altas atividades do psoraleno e bergapteno.

CARDOSO e colaboradores (2002) apresentam anlises da composio

qumica em furanocumarinas do infuso e decocto de "Carapi" (espcies de

Dorstenia), que so utilizadas no Brasil contra vrias doenas. De acordo com

esses autores, o contedo em furanocumarinas revelou uma diferena

insignificante entre infuso e decocto. Dorstenia tubicina e D. asaroides

apresentaram psoraleno e bergapteno somente nos rizomas, enquanto D.

vitifolia apresentou isopimpinelina em ambos, rizomas e partes areas.

D. prorepens apresentou os compostos conhecidos: psoraleno,

bergapteno, beta-sitosterol e seus derivados D-glucopiranosdicos (ABEGAZ e

colaboradores, 2002).

UCHIYAMA e colaboradores (2002) isolaram e identificaram dois

triterpenides, cido dorstnico A e B, alm de um diterpenide j conhecido

(tipo isopimarane) e seis cumarinas, das razes de Dorstenia brasiliensis. Os

dois triterpenides apresentaram citotoxicidade moderada contra clulas

leucmicas (L-1210 e HL-60).

3.3.1.2 Flavonides

Foram isolados e identificados, dos brotos de Dorstenia manii, trs

flavonides prenilados e um geranilado: 3,4-(2,2-dimetilcromano)-2,4-

dihidroxichalcona (dorsmanin A); bis(2,2-dimetilcromano)flavanona (dorsmanin

B); 7,8-(2,2-dimetilcromeno)-6-geranil-3,5,3,4-tetrahidroxiflavonol (dorsmanin

C) e 6,8-bis(3,3-dimetilalil)-3,5,7,4-tetrahidroxi-3-metoxiflavonol (dorsmanin D).

Tambm foram identificados os flavonides conhecidos: 3,4-(2,2-

dimetilcromeno)-2,4-dihidroxichalcona; 6-(3,3-dimetilalil)-5,7,4-trihidroxi-3-

metoxiflavona e 6,8-bis(3,3-dimetilalil)-5,7,3,4-tetrahidroxiflavanona (canflavin

B) (NGADJUI e colaboradores, 1998).

Dois novos flavonides: 6,7-(2,2-dimetilcromano)-5,4-dihidroxiflavona e

3,4-4,5-bis-(2,2-dimetilcromano)-2-hidroxichalcona, juntamente com o j

conhecido 6-(3-metilbut-2-enil)apigenina, e duas chalconas, (E)-1-[2,4-dihidroxi-

26

3-[3-metilbut-2-enil]fenil]-3-[4-hidroxifenil]-prop-2-en-1-ona e (E)-1-[2,4-

dihidroxi-5-[3-metilbut-2-enil]-fenil]-3-[4-hidroxi-3-[3-metilbut-2-enil]fenil]-prop-2-

en-1-ona foram caracterizados a partir do tecido foliar de Dorstenia

kameruniana (ABEGAZ e colaboradores, 1998).

NGADJUI e colaboradores (1998) isolaram e caracterizaram, de

Dorstenia psilurus, duas novas flavonas, dorsilurins A (figura 4-I) e B (figura 4-

II), e um novo derivado benzofurano (figura 4-III).

FIGURA 4 FLAVONAS E DERIVADO BENZOFURANO DE Dorstenia psilurus

Me

MeHO

Me

Me OH

O

O

HO Me

Me

OH

I

Me

Me OH

O

OHMe

MeO

O

Me

Me

HO OH

II

O

CO2Me

OHIII

27

Dois novos flavonides geranilados, poinsettifolins A e B, foram

isolados de extratos de Dorstenia poinsettifolia. Tambm foram isolados a

flavona 5,7,4-trihidroxi-8-prenilflavona (licoflavona C), as chalconas 4,2,4-

trihidroxi-3-prenilchalcona (isobavachalcona) e isobavacromeno, e o

carotenide lutena (TSOPMO e colaboradores, 1998).

A investigao dos brotos de Dorstenia mannii forneceu 6,8-diprenil-

5,7,34-tetrahidroxiflavanona, e quatro novas flavanonas preniladas,

denominadas dorsmanins E-H e caracterizadas como 5,6-7,8-bis-(2,2-

dimetilcromano)-3,4-dihidroxiflavanona; 7,8-[2-(1 - hidroxi -1-metiletil)-

dihidrofurano] - 6 - prenil - 5,3,4-trihidroxiflavanona; 6,7 - [2-(1 - hidroxi - 1 -

metiletil)dihidro-furano] - 8 - prenil - 5,3,4-trihidroxiflavanona, e 6-prenil-8-(2-

hidroxi-3-metilbut - 3 - enil) - 5,7,3,4-tetrahidroxiflavanona, respectivamente

(NGADJUI e colaboradores, 1999).

Um novo flavonide, dorstenona (figura-5), foi isolado de Dorstenia

barteri, juntamente com trs flavonides conhecidos, 4,2,4-trihidroxi-3-

prenilchalcona; 4,2,4-trihidroxi-3,3-diprenilchalcona, e 5,7,4-trihidroxi-8-

prenilflavona (TSOPMO e colaboradores, 1999).

FIGURA 5 FLAVONIDE DE Dorstenia barteri

Me

CO

OH

OH O

OH

OHCH2 CH C

CH3CH3

OH

28

Foram isolados e identificados, dos brotos de Dorstenia poinsettifolia,

dorspoinsettifolin (figura 6), uma nova 7,8-(2,2-dimetilpirano) - 4

metoxiflavanona, alm de trs flavonides prenilados conhecidos, 4 -

hidroxiloncocarpin, 4 - metoxi-loncocarpin e 4-hidroxiisoloncocarpin, alm de

raras chalconas geranil e prenil substitudas (NGADJUI e colaboradores, 1999).

FIGURA 6 FLAVONIDE PRENILADO DE Dorstenia poinsettifolia

O

Me

Me

O

Me Me

O O

OH

OH

29

NGADJUI e colaboradores (1999) isolaram e identificaram, das razes de

Dorstenia psilurus, trs compostos fenlicos: 6,8-diprenil-3[O],4-(2,2-

dimetilpirano)-3,5,7-trihidroxiflavona; 3,6-diprenil-8-(2-hidroxi-3-metilbut-3-enil)-

5,7,2,4-tetrahidroxiflavona, e um raro derivado flavonide (figura 7) com

modificao nos anis B e C, denominados respectivamente de dorsilurins C, D

e E.

FIGURA 7 FLAVONIDE PRENILADO DE Dorstenia psilurus

O

Me

Me

O

Me Me

O

O OH

Quatro novas flavanonas preniladas, dorsmanins I (figura 8-I) e J (figura

8-II), e epi-dorsmanins F (figura 8-III) e G (figura 8-IV), identificados,

respectivamente como 6,7-(2,2-dimetilpirano)-8-prenil-5,3,4-

trihidroxiflavanona; 6,7-(2,2-dimetildihidropirano)-8-prenil-5,3,4-

trihidroxiflavanona e 2-epmeros de dorsmanins F e G foram isolados das

partes areas de Dorstenia manii, juntamente com 13 flavonides conhecidos:

4-hidroxiloncocarpina; 4-metoxiloncocarpina; 6-prenilcrisoeriol; 6,8-

diprenileriodictiol; gancaonin P e dorsmanins A-H (NGADJUI e colaboradores,

2000).

30

FIGURA 8 FLAVONIDES PRENILADOS DE Dorstenia mannii

I

OMeMe

MeMe

OH

O

O

OH

OH

I

O

O

OH

OH

MeMe

OH

OMeMe

II

O

C

Me

Me

HO

CH2OH

CHC

CH2H3C

O

O

OH

OH

III

OC

Me

HO

Me

MeMe

OH

O

O

OH

OH

IV

31

D. mannii forneceu um derivado geranil, oito flavanonas dipreniladas e

um flavonol. D. psilurus forneceu todos os compostos triprenilados encontrados

no gnero Dorstenia e um destes compostos o nico a apresentar o anel B,

da estrutura dos flavonides, modificado para uma dienona. O flavonide 4-

hidroxiloncocarpina foi encontrado em Dorstenia prorepens e Dorstenia zenkeri.

Flavonides prenilados tm sido amplamente relatados somente em espcies

africanas de Dorstenia (ABEGAZ e colaboradores, 2002).

Os brotos de Dorstenia prorepens forneceram a chalcona digeranilada,

5,3-(3,7-dimetil-2,6-octadienil)-3,4,2,4-tetrahidroxichalcona, sendo o nico

exemplo de uma chalcona digeranilada encontrado na literatura. Dorstenia

zenkeri forneceu a 3,4-(3-hidroxi-2,2-dimetilhidropirano)-4,2-dihidroxichalcona;

4,2,4- trihidroxichalcona; 4,2,4-trihidroxi-3-prenilchalcona, e uma bichalcona,

alm dos compostos p-hidroxibenzaldedo e dorsmanin A. Uma nova chalcona,

6-prenilcrisoeriol (22 R = Ome) foi obtida a partir de D mannii (ABEGAZ e

colaboradores, 2002).

Trs flavonides prenilados, dinklagins A, B e C, identificados

respectivamente como (-)-6-(3,3-dimetilalil)-7-dihidroxi-6, 6-dimetilcromeno-

(4,3,2,3)-flavanona; (+)-5,4,5xi-trihidroxi-6,6-dimetilcromano-(7,6,2,3)-

flavona e (+)6-(2xi-hidroxi-3-metil-3-butenil)-5,7,4-trihidroxiflavona foram

isolados dos brotos de Dorstenia dinklagei, juntamente com os compostos j

conhecidos 6-prenilapigenina; 4-hidroxiloncocarpina; estipulina e 5,4-dihidroxi-

6,6-dimetilcromano-(7,6,2,3)-flavona (NGADJUI e colaboradores, 2002).

3.3.1.3 Estirenos

WOLDU e colaboradores (1988) isolaram trs novos estirenos de D.

barnimiana (Moraceae), os quais foram identificados como: 6-metoxi-5-vinil-

benzofurano; 4,6-dimetoxi-5-vinilbenzofurano e 2,4-dimetoxiestireno.

Os primeiros exemplos de ocorrncia natural de estirenos foram

identificados em D. barnimiana (ABEGAZ e colaboradores, 2002).

CASAGRANDE e colaboradores (1974) determinaram a estrutura da

siriogenina (figura 9), isolada de Dorstenia contrajerva.

32

FIGURA 9 ESTRUTURA DA SIRIOGENINA

3.3.2 Aspectos farmacolgicos do gnero Dorstenia

Os dados farmacolgicos sobre o gnero Dorstenia so escassos, mas

sabe-se que todas as espcies do gnero conhecidas como carapi so

dotadas de qualidades medicinais (FLORA BRASILEIRA, 1983).

Extratos de 87 espcies, pertencentes a 8 gneros da famlia Moraceae,

foram avaliados para constituintes fototxicos, utilizando a bactria gram-

negativa E. coli. Somente 2 das 72 espcies do gnero Ficus testadas foram

positivas para metablitos fototxicos. Em contraste, todas as espcies

testadas do gnero Dorstenia (5 espcies) e Fatoua (1 espcie) apresentaram

graus variados de atividade antimicrobiana ativada pela luz. Extratos das razes

apresentaram compostos fotossensibilizantes mais potentes, ou maiores

concentraes de fototoxinas, em comparao aos extratos de folhas ou flores.

Furanocumarinas (5-metoxipsoraleno e psoraleno) foram identificados nos

extratos de todas as espcies que apresentaram fototoxinas (SWAIN e

DOWNUM, 1990).

De acordo com RUPPELT e colaboradores (1991), a infuso a 10%

(planta seca) e 20% (planta fresca), correspondendo a 1 e 2 g/kg,

respectivamente, de Dorstenia brasiliensis, demonstrou atividade analgsica

e/ou anti-inflamatria, por administrao oral.

IHO

Me

H

OHMe

OH

OO

33

O extrato metanlico de Dorstenia multiradiata, utilizada na medicina

tradicional nigeriana, foi ativo, em concentraes de 50 microgramas/mL ou

menos, contra a Leishmania visceral isolada (IWU e colaboradores, 1992).

Compostos terpenides tm sido relatados como os responsveis pelo

uso popular de espcies de Dorstenia como antiofdicos (VILEGAS e

colaboradores, 1997).

Extratos de D. multiradiata apresentaram atividade antileishmanial.

Extratos e/ou compostos de outras espcies apresentaram atividades anti-

inflamatria, analgsica, antioxidante e citotxica (ABEGAZ e colaboradores,

2002).

De acordo com DIMO e colaboradores (2001), o extrato metanlico de

Dorstenia psilurus apresentou efeitos antihipertensivos em ratos

hiperinsulinmicos e hipertensos, alimentados com frutose. Alm disso,

observou-se diminuio nos nveis de colesterol e insulina.

O uso de furanocumarinas, que possuem propriedades

fotossensibilizantes, combinado com exposio radiao UV-A, constitui um

tratamento comum para vitiligo, psorase e outras doenas de pele. Deve-se

ressaltar, no entanto, que, apesar dos benefcios, altas doses de

furanocumarinas aumentam o risco de desenvolvimento de carcinomas

cutneos. As espcies de Dorstenia que so utilizadas no Brasil apresentam

doses considerveis de furanocumarinas (CARDOSO e colaboradores, 2002).

3.3.3 Aspectos toxicolgicos do gnero Dorstenia

Alm das propriedades medicinais, as espcies do gnero Dorstenia

conhecidas como carapi apresentam alguns princpios txicos. Talvez este

fato justifique a repulsa dos animais herbvoros por estas plantas (FLORA

BRASILEIRA, 1983).

3.4 CONSIDERAES SOBRE Dorstenia multiformis, MIQUEL

3.4.1 Sinonmia vulgar

34

Segundo COIMBRA (1942), Dorstenia multiformis possui vrios nomes

populares, alguns dos quais so utilizados comercialmente: caapi, caiapi,

carap, carapi, conta de cobra, contra herva, liga osso, tapor e ti.

De acordo com a FLORA BRASILEIRA (1983), pode-se citar como

sinnimos populares: caiapi-do-grande, capa-homem, carapi e contra-

veneno.

CRUZ (1995) apresenta os seguintes nomes vulgares para a espcie:

caapi, caiapi, carap, carapi, capi, contraerva e liga osso.

COIMBRA (1942) cita alguns sinnimos estrangeiros, a saber,

contrayerba (espanhol), contraierva (italiano), contrayerve (francs), widergift,

peruvianische e gilfwurzel (alemo).

3.4.2 Sinonmia cientfica

Segundo MISSOURI BOTANIC GARDEN (2004)

A espcie Dorstenia multiformis tambm pode ser citada como:

Dorstenia multiformis var. arifolia, Dorstenia multiformis var. ceratosanthes,

Dorstenia multiformis var. ficifolia, Dorstenia multiformis var. ramosa.

3.4.3 Distribuio geogrfica

Essa espcie vegetal originria do Brasil, habitando em So Paulo,

Gois, Mato Grosso, Bahia, Pernambuco e Minas Gerais (CRUZ, 1995). Nasce

espontaneamente no Estado de So Paulo, mais precisamente na Serra do

Mar, onde aparece com freqncia. Planta silvestre, muito resistente s

queimadas e secas (FLORA BRASILEIRA, 1983).

3.4.4 Usos populares

A espcie Dorstenia multiformis encontra vrias aplicaes teraputicas

e usos populares, porm sem comprovao cientfica. uma planta brasileira

conhecida por suas propriedades medicinais (FLORA BRASILEIRA, 1983),

sendo estas especialmente vinculadas s suas razes (CRUZ, 1995).

35

Possui importncia medicinal como tnica, estimulante, diafortica

(sudorpara), diurtica, emenagoga (COIMBRA, 1942; FLORA BRASILEIRA,

1983) e anti-febril, e em associao com o taiui, na forma de tintura,

apresentando excelentes resultados na reparao de fraturas dos ossos

(CRUZ, 1995).

Dessa forma, a planta preconizada para combater a priso de ventre,

perturbaes do estmago, gastrite, anemia, clorose, febres tifides,

desarranjos do tero, supresso das regras, diarrias, disenterias, febres

intermitentes, afeces do aparelho respiratrio, cistites etc (CRUZ, 1995).

Popularmente, utilizada na anemia, na atonia do aparelho digestivo,

nas diarrias, nas febres tifides e nas menstruaes doloridas e tardias

(COIMBRA, 1942; FLORA BRASILEIRA, 1983). Alm disso, aumenta o volume

da urina, tornando-a clara (COIMBRA, 1942).

Os rizomas de Dorstenia multiformis, associados ao taiui, so usados

empiricamente em nosso pas, para a reparao de fraturas dos ossos, na

forma de cozimento (CRUZ, 1995). Os sertanejos usam a massa do rizoma em

cataplasmas, com essa mesma finalidade, e consideram-no antdoto contra o

veneno de cobras (COIMBRA, 1942).

Suas razes e rizomas tambm so considerados antifebris, diaforticos

e expectorantes (FLORA BRASILEIRA, 1983).

As formas farmacuticas habituais so: infuso, decocto, extrato fluido,

p, tintura, elixir, vinho, xarope (COIMBRA, 1942) e cpsulas.

3.4.5 Descrio botnica de Dorstenia multiformis

A espcie Dorstenia multiformis apresenta-se como uma planta

herbcea, de rizoma carnoso e ramificado, com caule curto, rasteiro e mais ou

menos subterrneo. As folhas so longo-pecioladas, oblongas ou ovaladas,

divididas em vrios lobos, inteiras ou pinatifidas, verde-escuras na parte

superior e plidas na inferior. Apresenta flores de tamanho bastante reduzido e

frutos do tipo castanha (FLORA BRASILEIRA, 1983).

Segundo a FARMACOPIA BRASILEIRA (1926), o rizoma de Dorstenia

multiformis, parte usada, apresenta-se macroscopicamente de forma cilndrica,

36

irregular, tortuoso, mais dilatado na parte inferior e medindo de 5 a 10cm de

comprimento por 10 a 20mm de largura (figura 10).

Em quase toda a sua extenso, apresenta numerosas brcteas foliceas

lanceoladas, de 4 a 6mm de comprimento, e algumas cicatrizes oval-

triangulares, salientes, produzidas pela queda dos pecolos; bem como

numerosas radculas delgadas e longas.

Sua colorao apresenta-se como pardo-esverdeada e possui cheiro

aromtico agradvel, semelhante ao do figo, e sabor que, de pouco

pronunciado, torna-se acre.

Sua estrutura microscpica apresenta alguns plos tectores cnicos,

unicelulares, e plos glandulosos, pediculados, capitados, pluricelulares. O

lenho representado por feixes fibro-vasculares, bastante largos e curtos,

constitudos por numerosos vasos, que so dispostos em filas radiais

separadas por algumas clulas de paredes pouco espessas (separadas entre

si por largos raios medulares), e recobertos exteriormente por um lber

desprovido de fibras esclerenquimticas.

FIGURA 10 A ESPCIE Dorstenia multiformis, MIQUEL, MOSTRANDO AS RAZES E

PARTES AREAS

37

FIGURA 11 A ESPCIE Dorstenia multiformis, MIQUEL, MOSTRANDO DIMENSES DAS

RAZES E PARTES AREAS

3.4.6 Aspectos fitoqumicos de Dorstenia multiformis

Segundo COIMBRA (1942), os principais constituintes qumicos

encontrados em Dorstenia multiformis so dorstenina, cido dorstnico, leo

essencial, sais e matrias gordurosas e ppticas etc.

BARBOSA (2000), em screening fitoqumico, detectou a presena dos

seguintes grupos qumicos: glicosdeos flavnicos, aminogrupos e cumarinas,

no extrato hidroalcolico, e cidos fixos, cidos volteis, taninos condensados e

aminogrupos, no extrato aquoso.

3.4.7 Aspectos toxicolgicos de Dorstenia multiformis

O uso do carapi, em doses inadequadas, pode causar srios

transtornos ao ser humano, como intoxicao na forma de vmitos, intenso

ardor no estmago, disenterias e ulceraes na mucosa (FLORA BRASILEIRA,

1983).

38

4. MATERIAL E MTODOS

4.1 OBTENO DO MATERIAL VEGETAL

A espcie Dorstenia multiformis foi fornecida pela indstria farmacutica

"As Ervas Curam", em maro de 2004. A coleta foi efetuada na Fazenda Capo

Grande, situada no municpio de Jata, estado de Gois, em janeiro de 2004. O

material enviado consistia em todas as partes da planta, secas, estabilizadas e

modas.

Uma amostra da planta inteira foi enviada ao Museu Botnico Municipal

de Curitiba, para identificao botnica, e encontra-se registrada neste museu

sob o nmero 37440.

4.2 CONSERVAO

At o momento do uso, o material foi mantido em saco de papel,

devidamente fechado e identificado, ao abrigo da luz e da umidade.

4.3 OBTENO DO EXTRATO BRUTO E DAS FRAES

Foram submetidos 5Kg do material vegetal (conforme descrito

anteriormente) extrao por refluxo, com etanol absoluto, em aparelho de

soxhlet. O extrato obtido foi filtrado com algodo e concentrado em evaporador

rotatrio Laborota, sob presso reduzida, com aquecimento em banho-maria a

temperatura de, aproximadamente, 40C, sendo, em seguida, armazenado em

frascos mbar. Aps 24 horas, o extrato concentrado foi filtrado a vcuo,

obtendo-se o extrato etanlico bruto e o resduo correspondente, os quais

foram armazenados separadamente em frascos mbares.

39

O extrato bruto etanlico foi fracionado, por meio de partio lquido-

lquido em aparelho de soxhlet modificado (CARVALHO, 2001), utilizando-se

solventes de polaridade crescente (hexano, clorofrmio e acetato de etila).

Esse procedimento resultou nas fraes hexano, clorofrmio, acetato de etila e

hidroalcolica remanescente.

O resduo resultante da filtrao do extrato concentrado foi lavado com

acetona, obtendo-se as pores solvel em acetona (I) e no solvel em

acetona (II).

FIGURA 12 FLUXOGRAMA DA OBTENO DO EXTRATO BRUTO E O RESDUO

RESULTANTE

5 Kg (divididos em 7 extraes) de Dorstenia multiformis M. (plantainteira, seca e moda)

Extrao com etanol (refluxo)

o

Concentra

FiltraResduo

Lavagem comacetona

Poro solvelem acetona

Poro nosolvel em

acetona

eFiltrao com algodo em evaporador rotatrio a vcuo

o a vcuo, aps 24 horas

Extrato etanlico bruto extrao com hexano

Extrato remanescente extrao com clorofrmio

Extrato remanescente xtrao com acetato de etila

Frao hidroalcolicaremanescenteFra

c

Frao hexano

Fraolorofrmio

o acetatode etila

40

4.4 ANLISES ORGANOLPTICAS

As anlises organolpticas consistiram na avaliao dos parmetros de

cor, odor, sabor e pH do extrato etanlico bruto, utilizando-se dos sentidos da

viso, olfato e paladar, e do aparelho de medio pHmetro.

4.5 TEOR DE SLIDOS

Consiste na determinao da quantidade de matria slida presente em

1mL de amostra.

Para essa anlise, utilizou-se tcnica adaptada de MIGUEL (2003), onde

trs cadinhos de porcelana foram previamente secos em estufa e pesados

(aps esses procedimentos, os cadinhos foram manipulados com auxlio de

pina metlica, sem contato manual). Em seguida, adicionou-se, em cada

cadinho, 1mL da amostra e levou-se estufa a 100C. Foram realizadas

pesagens a cada hora, at obter-se um valor constante de peso, para cada

cadinho.

O resultado consiste na mdia dos trs valores finais de peso da matria

seca, e apresentado em forma de porcentagem.

A determinao do teor de slidos foi realizada para o extrato etanlico

bruto e as fraes hexano, clorofrmio e acetato de etila.

4.6 PESQUISA DE GRUPOS FITOQUMICOS NOS EXTRATOS E FRAES

A pesquisa fitoqumica tem por objetivos conhecer os constituintes

qumicos de espcies vegetais ou avaliar a sua presena. Quando no se

dispe de estudos qumicos sobre a espcie de interesse, h necessidade de

uma abordagem qumica, isto , um exame rpido e superficial, que fornea

uma viso geral da composio qumica da droga ou da planta, indicando os

41

grupos de metablitos secundrios relevantes da mesma; isto feito por meio

da anlise fitoqumica preliminar (MATOS; MATOS, 1989; SIMES e

colaboradores, 2000).

Nesse contexto, para direcionar o estudo qumico, realizou-se a

identificao dos principais grupos qumicos presentes na espcie Dorstenia

multiformis, utilizando-se as metodologias descritas por MOREIRA (1979),

MATOS e MATOS (1989) e MIGUEL (2003) com algumas adaptaes. De

acordo com essa metodologia, so utilizados os extratos alcolico a 20% e

aquoso, e suas respectivas fraes, para as determinaes fitoqumicas.

4.6.1 Extrato alcolico 20%

Para o preparo do extrato alcolico a 20%, pesou-se 40g do material

vegetal seco e modo, e adicionou-se 200mL de etanol 70%, que corresponde

ao lquido extrator. O material foi levado ao banho-maria por 1 hora a 70C, emfrasco aberto. Aps esse perodo, foi filtrado em algodo e o volume

completado para 200mL com o lquido extrator.

A partir do extrato hidroalcolico assim obtido, foi realizado o

fracionamento, segundo um gradiente de polaridade. Os solventes utilizados

foram: hexano, clorofrmio e acetato de etila.

Para esse procedimento, o extrato foi concentrado at aproximadamente

1/3 do volume inicial, com o intuito de eliminar o excesso de etanol. Em funil de

separao, foram utilizadas cinco alquotas de 20mL para cada solvente e

agitados. A frao final foi recolhida e chamada de frao hidroalcolica

remanescente. Cada frao obtida foi completada para 200mL com o

respectivo lquido extrator (hexano, clorofrmio, acetato de etila e etanol) e

armazenada em frasco mbar, em geladeira.

Obteve-se assim as fraes hexano, clorofrmio, acetato de etila e

hidroalcolica, que foram utilizadas para pesquisa de alcalides,

leucoantocianidinas, flavonides, cumarinas, antraquinonas, esterides e

triterpenos.

4.6.1.1 Pesquisa de alcalides

42

Os alcalides so compostos de carter bsico e sua solubilidade em

diferentes reagentes, modifica em funo do pH. Os alcalides na forma bsica

so solveis em solventes orgnicos e insolveis em solventes aquosos; na

forma de sal, so solveis em solventes aquosos e insolveis em solventes

orgnicos (DIAS, 2005).

Esta pesquisa fundamenta-se na capacidade que os alcalides

possuem, em estado de sal, de combinar-se com iodo e metais pesados como

bismuto, mercrio e tungstnio e formarem precipitados (DIAS, 2005).

Dessa forma, a determinao qualitativa de alcalides feita com a

utilizao de reativos considerados gerais para alcalides: soluo de iodo-

iodeto de potssio (Reativo de Wagner), mercrio tetraiodeto de potssio

(Reativo de Mayer), tetraiodeto bismuto de potssio (Reativo de Dragendorff),

soluo de cido pcrico (Reativo de Hager), cido slico tngico (Reativo de

Bertrand), p-dimetilamino benzaldedo (Reativo de Ehrlich) e Reativo de Vitali-

Morin (promove a nitrao de alcalides).

Uma alquota de 50mL de cada frao obtida pelo processo descrito

anteriormente foi evaporada em banho-maria a 50C. O resduo foi dissolvido

em 1ml de etanol e acrescido de 20mL de HCl 1%. Utilizou-se 5 tubos de

ensaio para cada amostra testada, sendo transferidos 1ml do respectivo extrato

clordrico em cada tubo, para a pesquisa de alcalides com os reativos citados

(2 gotas para cada reativo). Considera-se positiva a presena de alcalides na

amostra com as seguintes visualizaes para os reativos:

Mayer: formao de precipitado branco ou leve turvao branca. Dragendorff: formao de precipitado de colorao tijolo. Bouchardat:: formao de precipitado de colorao alaranjada. Bertrand: formao de precipitado branco ou leve turvao branca.

Para cada amostra, utilizou-se um tubo somente com o extrato clordrico,

servindo como controle negativo.

4.6.1.2 Pesquisa de Flavonides

Flavonides so compostos cuja estrutura se baseia num esqueleto

carbnico C6-C3-C6, com um anel cromano ostentando um segundo anel

aromtico na posio 2. As principais categorias estruturais gerais so

43

flavonas, flavanonas, flavonis, antocianidinas e isoflavonas. Em alguns casos,

o anel heterocclico de seis membros substitudo por um anel de cinco

membros (auronas) ou aparece em uma forma isomrica de cadeia aberta

(chalconas). Os flavonides tambm so encontrados na forma de derivados

glicosilados, metilados, acilados, prenilados ou sulfatados (ROBERS e

colaboradores, 1997).

Esta pesquisa baseia-se na modificao da estrutura dos flavonides em

presena de cido.

4.6.1.2.1 Leucoantocianidinas

As leucoantocianidinas so consideradas flavonides monomricos 3,4-

diis ou raramente 4-is. Esta pesquisa explica-se com a reao de reduo da

leucoantocianidina (de colorao amarela) em antocianidina (de colorao

vermelha) em presena de cido clordrico (DIAS, 2005).

Foram levados secura 10mL das fraes hexano, clorofrmio, acetato

de etila e hidroalcolica, em banho-maria (50OC), retomados em 5mL de etanol

e adicionadas 5 gotas de HCl concentrado. Levou-se ebulio. A reao

positiva com o desenvolvimento de colorao vermelha.

4.6.1.2.2 Heterosdeos Flavnicos

Levou-se secura em banho-maria (50OC) 10mL das fraes hexano,

clorofrmio e acetato de etila, adicionou-se 5mL de etanol e transferiu-se para

tubos de ensaio. A frao hidroalcolica no foi levada secura, apenas

transferida diretamente (5mL) para um tubo de ensaio. A cada tubo de ensaio

foram adicionados 200mg de limalha de ferro e HCl fumegante (lentamente).

Reao positiva com desenvolvimento de colorao vermelho a vermelho

sangue.

4.6.1.2.3 Flavonis

A presena de flavonis foi verificada por meio do teste do oxalo-brico

ou reao de Taubock. A reao pode ser explicada pela formao de

44

quelatos, produzindo um deslocamento batocrmico na banda I dos derivados

do cido bornico, que so compostos obtidos do cido brico, com

substituies na molcula por dois radicais orgnicos. A reao oxalo-brica,

em particular dos flavonides (flavonis), determina o aparecimento de

fluorescncia amarelo-esverdeada, enquanto as flavanonas e isoflavonas no

acusam esta propriedade e os compostos antocinicos coram-se, mas no

produzem fluorescncia (MOREIRA, 1979).

Foram transferidos 10mL de cada frao para um bcker e levados

secura. Adicionou-se 5 gotas de acetona e 30mg da mistura cido brico e

cido oxlico, na proporo 1:1, levando novamente secura. Ao resduo,

adicionou-se 5mL de ter etlico. A visualizao foi realizada com observao

no ultravioleta, em tubo de ensaio.

4.6.1.2.4 Dihidroflavonides

Em cpsulas de porcelana, foram adicionados 10mL de cada frao e

levados secura em banho-maria. Em seguida, levou-se ao fogareiro,

adicionando cristais de acetato de sdio, 0,1ml de anidrido actico e 0,1mL de

HCl concentrado. A reao considerada positiva com o desenvolvimento de

colorao roxa.

4.6.1.2.5 Dihidroflavonis

As fraes dissolvidas em 5mL de etanol (conforme descrito

anteriormente) foram acrescidas de uma pastilha de zinco e HCl fumegante

(lentamente), mantendo o recipiente em banho de gelo (reao exotrmica) e

dentro da capela. A reao positiva observada com o desenvolvimento de

colorao vermelho a vermelho sangue.

4.6.1.3 Pesquisa de Cumarinas

Cumarinas so lactonas derivadas dos cidos -hidrocinmicos quesofrem orto-hidroxilao e depois fechamento do anel situado entre o grupo

orto-hidroxila e o grupo carboxila de cadeia lateral, seguido de isomerizao

45

trans para cis da ligao dupla de cadeia lateral. Quando isoladas, aparecem

na forma de cristais prismticos, incolores, com odor e sabor amargo

(ROBBERS e colaboradores, 1997).

As cumarinas so derivados da 5,6-benzo-2-pirona (-cromona).Originam-se do cido trans-cinmico que, por oxidao, resulta no cido o-

cumrico, cuja hidroxila fenlica condensa com uma unidade de glicose. Esse

composto isomeriza no seu correspondente cis, o qual, por ciclizao, forma a

cumarina. A prenilao nas posies C-6 e C-8 do anel benznico de uma 7-

hidroxi-cumarina conduz formao de pirano ou furanocumarinas (SIMES e

colaboradores, 2000).

O teste para a avaliao da presena de cumarinas baseado na

converso do cido o-hidroxicinmico em sal alcalino fluorescente, e deve-se

propriedade das cumarinas de se dissolverem em lcali custica, com clivagem

do anel pirrlico e formao do cido o-hidroxicinmico ou sais de seus nions.

Sem irradiao da luz ultravioleta, nenhuma fluorescncia exibida; no

entanto, quando irradiamos com luz ultravioleta, a forma cis da molcula do sal

migra para a forma trans, exibindo fluorescncia com colorao azul ou verde

amarelada dentro de poucos minutos, aumentando at o mximo.

Comparaes efetuadas entre a forma cis e trans do nion cumarnico

demonstraram que apenas na forma trans o hidrognio do grupo fenlico est

localizado para possibilitar sua quelao (anel de seis membros), visto que a

insaturao no bloqueada pelo grupo carboxila, havendo possibilidade da

ligao quelato relacionar-se com a fluorescncia. O foto-efeito tambm

aparece em solues alcalinas dos derivados cumarnicos que no possuem

hidroxila livre ligada ao grupo benznico, havendo relao entre os

substituintes e o grau de fluorescncia.

Derivados cumarnicos que tenham grupos OH livres ligados ao anel

benznico mostram fluorescncia azul intensa no estado slido e em solues

alcalinas, no ocorrendo foto-efeito em solues alcalinas para esses

compostos. Dessa forma, torna-se difcil estabelecer um teste especfico para

estas cumarinas, pois difcil observar qualquer fluorescncia produzida por

irradiao, j que elas possuem fluorescncia prpria (NAKASHIMA, 1993).

Para essa pesquisa, adicionou-se, ao extrato hidroalcolico, HCl 2N, at

pH 1, e 5mL de HCl concentrado. A mistura foi resfriada e transferida para um

46

funil de separao para extrao com ter etlico (2 X 10mL). As duas fraes

obtidas foram reunidas e concentradas em banho-maria at volume de 5mL. As

fraes hexano, clorofrmio e acetato de etila foram levadas ao banho-maria

50OC (30mL) at secura e recuperadas em 5mL de ter etlico.

Para tubos de ensaio, transferiu-se 3ml de cada extrato etreo e

adicionou-se 2ml de NaOH 2N. Os tubos de ensaio foram levados ao UV

(365nm), por 15 minutos.

Para reao positiva observa-se no ultravioleta o aparecimento de

fluorescncia azul ou verde amarelada.

Paralelamente, com o restante dos extratos etreos, foram marcados,

em um papel de filtro, trs pontos com manchas de aproximadamente 1cm de

dimetro. As manchas 1 e 2 foram tratadas com NaOH 1N e, sobre a mancha

1, foi colocada ainda uma moeda e levadas cmara de ultravioleta a 365nm,

novamente deixando em exposio por 15 minutos. A reao tida como

positiva com o desenvolvimento de fluorescncia, com colorao azul ou verde

amarelada na mancha 2.

4.6.1.4 Pesquisa de Heterosdeos Antraquinnicos

A observao da presena de antraquinonas devida ionizao das

hidroxilas fenlicas destes compostos, por meio da Reao de Borntraeger.

Foram transferidos, para cinco bales, 30ml de cada frao, e

adicionados 5ml de soluo aquosa de H2SO4 a 10%. A mistura foi deixada em

refluxo por uma hora, e posteriormente filtrada, adicionando-se, em seguida,

30ml de H2O. Transferiu-se para um funil de separao, para extrao com ter

(2 X 10ml). As fraes obtidas foram reunidas e concentradas em banho-maria

, at um volume de 5ml, e colocadas em um tubo de ensaio, adicionando-se

5ml de NH4OH (Reao de Borntraeger). A reao considerada positiva com

observao de colorao vermelha.

4.6.1.5 Pesquisa de Esterides e Triterpenos

A reao de Liberman-Bouchard (anidrido actico cido sulfrico

concentrado) empregada para a verificao de esterides e triterpenos; os

47

primeiros desenvolvem colorao mutvel com o tempo, enquanto que os

ltimos desenvolvem colorao estvel (HASHIMOTO citado por SIMES et

al., 2000).

A reao de Keller-Kelliani utilizada para a verificao da presena de

glicosdeos cardiotnicos, que determinada pela caracterizao do ncleo

esteroidal destes, alm de outras formas, que detectam a presena de uma

lactona insaturada em C-17, caracterstica dos desoxi-acares (SIMES,

2000). A colorao azul ou verde na fase actica indica reao positiva para

desoxi-acar (MATOS; MATOS, 1989).

Foram evaporados 30ml de cada frao, at a secura e, com o auxlio de

um basto, os resduos foram redissolvidos em 5ml de clorofrmio e filtrados

em algodo. De cada uma das amostras assim preparadas pipetou-se 0,1; 0,5

e 1,0ml, que foram transferidos para trs tubos de ensaio, e o volume

completado para 2ml com clorofrmio.

4.6.1.5.1 Reao de Liberman-Bouchard

Para essa reao, foi adicionado aos tubos de ensaio 1ml de anidrido

actico e lentamente 2ml de H2SO4 concentrado. A colorao indica:

- rsea ou azul: presena de funo carbonila na posio 3 e duplo enlace

nas posies 5 e 6 ou 7 e 8.

- Verde: funo hidroxila em 3 e dupla ligao entre 5 e 6 ou 7 e 8.

- Amarela: grupamento metila no carbono 14.

4.6.1.5.2 Reao de Keller Kelliani

Foram levados secura 2ml dos extratos clorofrmicos preparados

anteriormente. Os resduos foram dissolvidos com 2ml de cido actico glacial

e 0,2ml de soluo aquosa de cloreto frrico 1%. As misturas foram ento

transferidas para tubos de ensaio contendo 2ml de H2SO4. O desenvolvimento

de colorao azul ou verde na zona de contato entre as duas fases indica a

presena de desoxiacares, sendo:

- azul: esterides

- verde: triterpenos

48

4.6.2 Extrato aquoso

Para o preparo do extrato aquoso foram pesados 40g do rizoma de

Dorstenia multiformis, seco e modo, e adicionou-se 200ml de gua (lquido

extrator). Levou-se ao banho-maria por 1 hora a 70oC, sendo em seguida

filtrado e o volume completado para 200ml com o lquido extrator.

Este extrato foi submetido aos testes para antocianinas, heterosdeos

saponnicos, heterosdeos cianogenticos, taninos, amino grupos, cidos fixos

e cidos volteis.

4.6.2.1 Pesquisa de Heterosdeos Antocinicos

As antocianinas so pigmentos hidrossolveis encontrados

principalmente nas flores e frutos, com coloraes que vo do roxo ao violeta e

azul. Encontram-se na forma de sais, e possuem carter anftero, ou seja, com

cidos formam sais de oxnio corados de vermelho; com bases reagem

atravs das hidroxilas fenlicas livres e adquirem a colorao azul, devida

estrutura quinide formada. Dessa forma, as coloraes dos compostos

antocinicos variam com o pH.

Para essa pesquisa foram realizados dois testes, descritos a seguir.

4.6.2.1.1 Primeiro teste

Separou-se trs pores de 5ml do extrato aquoso, em trs tubos de

ensaio previamente marcados. Procedeu-se da seguinte forma:

Tubo 1: acidificou-se com HCl 1% (at pH aproximadamente 4) reao

positiva observada para tons avermelhados.

Tubo 2: alcalinizou-se com NaOH (pH aproximadamente 10) - tons azulados.

Tubo 3: neutralizou-se a pH 7 - tons violceos.

4.6.2.1.2 Segundo teste

49

Transferiu-se, para um funil de separao, 10ml do extrato aquoso, e

procedeu-se extrao com lcool butlico, obtendo-se duas fraes de 10ml.

As fraes foram reunidas em uma cpsula de porcelana e concentradas at

5ml. Adicionou-se 5 gotas de HCl concentrado, e levou-se para aquecimento

at ebulio. A colorao vermelha indica formao de antocianidina, devido ao

efeito batocrmico.

4.6.2.2 Pesquisa de Heterosdeos Saponnicos

As saponinas apresentam estruturas com assimetria hidrfilo-

hidrofbica, fazendo com que haja reduo da tenso superficial dos

compostos em soluo aquosa, com conseqente formao de espuma

mediante agitao, caracterizando as propriedades emulsivas destes

compostos (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997).

Utiliza-se os trs tubos de ensaio preparados para o teste citado

anteriormente (heterosdeos antocinicos), os quais so agitados

energicamente, durante cinco minutos, e mede-se a altura da espuma formada.

Em seguida, so deixados em repouso por 30 minutos e a presena de

saponinas determinada pela observao de espuma persistente, com altura

superior a 1cm.

4.6.2.3 Pesquisa de Heterosdeos Cianognicos

Os heterosdeos cianogenticos produzem cido ciandrico nas plantas e

so acompanhados por enzimas (-glicosidases) responsveis pela catlise dahidrlise (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997).

A presena de heterosdeos cianognicos na amostra observada pela

formao de isopurpurato de sdio, atravs da reao descrita abaixo.

A um tubo de ensaio, foram adicionados 5ml do extrato aquoso, de

modo a no umedecer as paredes do tubo, e 1ml de H2SO4 10% ou 1N.

Suspendeu-se uma tira de papel picro-sdico, com o auxlio de uma rolha de

cortia, mantendo em banho-maria (60OC) por 30 minutos. O resultado positivo

para heterosdeos cianognicos observado pelo desenvolvimento de

colorao marrom a vermelho no papel picro-sdico.

50

O papel picro-sdico preparado embebendo tiras de papel de filtro com

1cm de largura em soluo de cido pcrico 1% e secando-as ao abrigo da luz.

As tiras pcricas secas so embebidas em soluo de carbonato de sdio 10%,

secas e armazenadas em frasco mbar.

4.6.2.4 Pesquisa de cidos Volteis

Procedeu-se da mesma forma que para o teste anterior (heterosdeos

cianognicos), utilizando-se uma fita de pH. A presena de cidos volteis

observada pela mudana de pH para valores abaixo de sete.

4.6.2.5 Pesquisa de Taninos

Os taninos podem ser caracterizados por reaes de colorao ou de

precipitao. Como a presena de lcool pode interferir, este deve ser

removido das amostras para a determinao. As reaes tradicionais de

precipitao com gelatina ou p de pele, sais de alcalides e metais pesados

so ainda utilizadas para a deteco de compostos dessa classe. Taninos

condensados e hidrolisveis podem ser diferenciados atravs da reao de

Stiasny (HCl concentrado e formol), ocorrendo precipitao destes ltimos; no

sobrenadante pode-se detectar a presena de taninos hidrolisveis atravs, por

exemplo, da reao com cloreto frrico, com desenvolvimento de colorao

azul (SIMES et al., 2000).

Foram transferidos 1ml de extrato aquoso para cinco tubos de ensaio e

adicionou-se os seguintes reagentes:

Tubo 1: 3 gotas de cloreto frrico. Colorao azul ou verde, com formao ou

no de precipitado resultado positivo para taninos.

Tubo 2: 1 a 3 gotas de sulfato amoniacal. Colorao azul ou verde resultado

positivo.

Tubo 3: 1 a 3 gotas de cloridrato de emetina. Formao de precipitado

resultado positivo.

Tubo 4: 5ml de cido actico (gota a gota) e 5ml de acetato de chumbo.

Presena de precipitado resultado positivo.

51

Tubo 5: 3 gotas de dicromato de potssio 1%. Desenvolvimento de precipitado

resultado positivo.

4.6.2.5.1 Diferenciao entre taninos hidrolisveis e condensveis

Uma alquota de 20ml do extrato aquoso foi transferida para um balo, e

adicionados 6ml de formaldedo e 4ml de HCl 37% fumegante. Permaneceu em

refluxo por uma hora, acoplado a um condensador. Filtrou-se e lavou o resduo

com etanol 50%, para retirar o excesso de formaldedo e HCl, e sobre o

resduo adicionou-se KOH 5%, com desenvolvimento de colorao. Dividiu-se,

ento, o material em duas pores.

1 poro: adio de gotas de soluo aquosa de Ca(OH)2 5%. O

desenvolvimento de colorao indica presena de taninos condensados.

2 poro: adio de excesso de acetato de sdio e gotas de soluo aquosa

de FeCl3 a 1%. Desenvolvimento de colorao azul indica reao positiva para

taninos hidrolisveis.

4.6.2.6 Pesquisa de cidos Fixos

A reao de caracterizao de cidos fixos se d atravs do reativo de

Nessler, que identifica a amnia associada em forma de sal amoniacal. Este

reativo contm amnia, e a visualizao indicada pela formao de um sal

amoniacal na presena de cidos fixos. Os cidos fixos so identificados

separadamente dos cidos volteis porque durante o processo realizado

tratamento com cido sulfrico, e posterior evaporao em banho-maria,

fazendo com que estes volatilizem.

Em um balo, foram adicionados 20ml do extrato aquoso e 2ml de

NaOH 1N, que permaneceram em refluxo por 30 minutos. Aps resfriamento,

acidificou-se com H2SO4 2N e procedeu-se extrao com ter etlico (3

pores de 10ml). Os extratos etreos foram reunidos e tratados com carvo

ativo, sendo em seguida filtrados e evaporados em banho-maria (50 C) at a

secura. O resduo foi deixado em estufa por 10 minutos, resfriado e adicionou-

se 5ml de NH4OH 1N. Em uma tira de papel de filtro concentrou-se duas

manchas (3 gotas em cada mancha) com o resduo amoniacal, deixando na

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estufa at secar, e sobre uma das manchas foi gotejado o reativo de Nessler. A

colorao marrom nessa mancha indica a presena de cidos fixos. Os cidos

frmico, propinico e aminoactico no formam manchas, pois no fixam a

amnia, apresentando reao negativa.

4.6.2.7 Pesquisa de Aminogrupos

Os aminogrupos so detectados por nebulizao com o reativo de

Ninhidrina e aquecimento. O reativo de Ninhidrina detecta os compostos em

cuja estrutura haja presena de nitrognio, principalmente aminocidos.

Foram concentrados 5ml do extrato aquoso at aproximadamente 1ml (a

50 C). Em dois pontos previamente determinados, em uma cromatoplaca de

CCD, depositou-se 3 gotas do extrato concentrado e, aps seco, colocou-se

uma gota do reativo Ninhidrina sobre uma das manchas, aquecendo em estufa

durante 15 minutos (90-100 C). O desenvolvimento de colorao azul-violcea

indica a presena de aminogrupo. Exceo: prolina e hidroxiprolina cor

amarela.

4.7 ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DOS COMPOSTOS

4.7.1 Isolamento de compostos da poro solvel em acetona

A poro solvel em acetona (I) foi analisada por CCD analtica (placas

de slica gel Merck), utilizando a fase mvel tolueno/acetato de etila, nas

propores 93:7 e 80:20, a qual demonstrou ser a mais adequada para a

separao dos compostos presentes nessa amostra. A placa cromatogrfica foi

observada na luz ultravioleta, em ondas curtas e longas, e a revelao se deu

utilizando-se como reveladores soluo alcolica de hidrxido de potssio a 5%

e soluo de vanilina sulfrica.

A poro I foi eluda em coluna cromatogrfica (50 x 7,5 cm) de silicagel

60 (0,063 a 0,200mm) Merck.

A pastilha a ser cromatografada foi preparada com slica-gel 60 na

proporo de 5 partes em relao quantidade de amostra, e evaporada

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secura em banho-maria a 50OC, sob constante homogeneizao. Utilizando-se

coluna de vidro, preparou-se a slica-gel a ser depositada na proporo de 5

partes em relao quantidade de pastilha. A quantidade de amostra utilizada

para a coluna cromatogrfica em questo foi de 38,9g, correspondente

poro solvel em acetona do resduo do extrato bruto.

O sistema eluente utilizado iniciou com 100% de hexano, tendo acetato

de etila como gradiente de polaridade, com variao de 5%, at 100% de

acetato de etila (utilizou-se 200ml para cada gradiente de fase mvel). Foram

coletadas 46 fraes, com aproximadamente 100ml cada. A eluio continuou

com acetato de etila, utilizando metanol como gradiente, com variao de 10%;

foram coletadas 20 fraes, com aproximadamente 100ml cada, totalizando 66

fraes.

As fraes 1-6 foram concentradas em evaporador rotatrio, a presso

reduzida e temperatura de, aproximadamente 40C (aquecimento em banho-

maria), at um volume aproximado de 20ml de hexano. Em seguida, foram

levadas ao freezer (-5C). As fraes 7-66 foram levadas secura, emevaporador rotatrio, sendo solubilizadas em 20ml de hexano (fraes 7-12) e

metanol (fraes 13-66), e levadas ao freezer (-5C). Esses procedimentosforam realizados com o objetivo de se obter uma pr-purificao das

substncias presentes nas fraes coletadas.

Aps 24 horas, as fraes que apresentaram precipitado foram filtradas

a vcuo e o material resultante das filtraes foi pesado e acondicionado em