lucrari laborator

Upload: raraitu

Post on 19-Jul-2015

354 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE - GENERALITI

Laboratorul de microbiologie trebuie s cuprind dou compartimente: - o sal de pregtire a mediilor i obiectelor de lucru i de decontaminare, coninnd mese, un autoclav, o etuv, un congelator i un frigider (care va fi utilizat i pentru pstrarea tulpinilor microbiene). Tot aici se poate stoca sticlria, mediile de cultur precum i reactivii. - o sal de lucrri propriu-zise, de manipulare a culturilor microbiene, la adpost de curenii de aer, dotat cu mese cu suprafa neted, rezistent, impermeabil, cu conducte de gaz i prize electrice, un sistem de vid i de aer comprimat i o hot sterilizabil , cu radiaii ultraviolete (eventual o hot cu flux laminar). n msura n care este posibil, n legtur cu aceast sal, ar trebui s existe anexe prevzute cu termostate la diferite temperaturi ( 250C, 300C, 370C, 440C, 550C). Manipulrile de culturi microbiene sau de produse susceptibile s conin microorganisme se efectueaz innd cont de unele tehnici particulare prin care s se evite cele dou tipuri de contaminare: 1. contaminarea culturii sau a produsului ce trebuie analizat datorit personalului sau mediului inconjurtor; 2. contaminarea personalului sau a mediului nconjurtor de ctre microorganismele studiate. In laboratorul de microbiologie, operaia de baz este transferul de microorganisme dintr-un recipient n altul, lucrare ce se execut n zona steril de protecie din jurul flcrii becului de gaz. Sticlria cel mai des utilizat n laboratorul de microbiologie const n eprubete de diferite dimensiuni, flacoane Erlenmeyer, plci Petri, pipete Pasteur i pipete gradate. n ultima perioad sunt din ce n ce mai mult utilizate recipientele i pipetele din plastic, de unic folosin. Pentru prelevarea i inocularea culturilor se utilizeaz ansa sau firul metalic, fabricate din nicrom. Ustensilele de etalare permit repartizarea uniform a inoculului pe suprafaa mediilor solidificate i pot fi fabricate prin ndoirea unui tub sau a unei baghete din sticl. n afara acestor ustensile curente de lucru, mai pot fi ntrebuinate o serie de alte instrumente, n funcie de operaia efectuat. Laboratorul de microbiologie trebuie s aib n dotare urmtoarele aparate i echipamente:

robinet cu ap cald i rece, de preferin acionat cu piciorul;1

hot cu flux laminar sau ni sterilizabil, indispensabil lucrrilor de microbiologie bec de gaz tip Bunsen pentru lucrul n zona steril din jurul flcrii cu con albastru i pentru sterilizarea ansei etuv pentru sterilizarea sticlriei autoclav pentru sterilizarea mediilor de cultur i pentru decontaminarea obiectelor baie de ap termostatat frigidere pentru conservarea mediilor i a culturilor balane

termostat bacteriologic pentru incubarea culturilor

pH-metru microscoape

TEHNICI DE STERILIZARE A OBIECTELOR N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Distrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabil pentru pregtirea2

materialului de lucru i a mediilor de cultur. Un produs este considerat steril cnd nu mai conine forme de microorganisme ce pot fi revitalizate. Exist mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri de materiale ce trebuie tratate. n laboratorul de microbiologie de analize de rutin, cldura reprezint modalitatea de sterilizare cea mai ntrebuinat.

STERILIZAREA PRIN CLDUR Cldura umed Sterilizarea prin cldur umed se efectueaz n autoclavul cu aburi prin procedeul de autoclavare. Principiu: n atmosfera de vapori de ap sub presiune, toate bacteriile (inclusiv formele sporulate) sunt omorte dup 20 minute la 1210C. Aceasta este metoda cea mai eficient de sterilizare. Autoclavul permite: - pregtirea materialului (medii de cultur, diferite obiecte) n vederea utilizrii n laborator, prin distrugerea microorganismelor; - decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30 minute la 1210C). Microorganismele din produsele patologice, eantioanele de ap i produse alimentare analizate, din culturile microbiene de laborator etc, trebuie neaprat distruse. Aceste dou operaii ar trebui efectuate de preferin n dou autoclave diferite sau, cel puin,n mod separat. Timpul de sterilizare Duratele de sterilizare sunt date doar pentru obiecte, medii de cultur sau alte substane ce trebuie sterilizate n autoclav pentru analizele de rutin.

Materialul sterilizat Sticlrie curat Ap , ser fiziologic Parafin Sruri minerale Medii curente (bulion

Temperatura (0C) 121 121 121 121 1213

Presiunea (barr) 1 1 1 1 1

Timp (minute) 20 20 20 20 15 - 20

nutritiv, geloz nutritiv) Lapte degresat Medii coninnd substane termolabile (ex. glucide) Glucoz n soluie 110 0,5 20 115 110 0,7 0,5 15 20

Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul unor indicatori de sterilizare cum sunt hrtiile indicatoare: sunt comercializate benzi de hrtie special imprimate pentru a vira culoarea dac au fost ndeplinite condiiile de sterilizare. Pasteurizarea Sterilizarea trebuie s fie deosebit de pasteurizare, care reprezint doar un procedeu de conservare utilizat n industria alimentar. Pasteurizarea const n tratarea produsului la o temperatur n domeniul 560C - 850C, o durat variabil de la cteva minute pn la o or, n mediu umed, n funcie de produs. n aceste condiii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse, dar nu i formele sporulate. Tyndalizarea Tyndalizarea const n 2 - 3 pasteurizari repetate, alternate cu perioade n care proba este meninut n condiii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni, care devin vulnerabili trecnd n stare vegetativ i sunt distrui prin pasteurizare. Tyndalizearea se poate realiza n baie de ap, de exemplu, n urmtoarele condiii: nclzire la 560C (pn la 800C) timp de 1 or, 3 - 7 zile consecutiv, cu un interval de 24 de ore. Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor n mediile ce conin substane termolabile. Cldura uscat Sterilizarea prin cldur uscat se efectueaz n sterilizatoarele cu aer cald (etuve). Cldura uscat nu poate distruge bacteriile i n special sporii bacterieni, dect la o temperatur mai ridicat ca n cazul cldurii umede. Tratamentul pentru sterilizare cu cldur uscat este de 4 ore la 1400C sau 1 or la 1800C. Un alt procedeu de sterilizare prin cldur uscat este flambarea, care se4

efectueaz n flacra becului de gaz pentru: extremitatea firului ansei, exteriorul pipetelor, gtul eprubetelor i al flacoanelor. ALTE PROCEDEE DE STERILIZARE Sterilizarea prin filtrare Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o membran care reine bacteriile. Se pot utiliza filtre de portelan (Chamberland), de sticl poroas sau membrane tip Millipore, cu pori de diferite dimensiuni. Sterilizarea prin gaze toxice Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea materialului medico-chirurgical, a materialelor din plastic numite sterile, de unic folosin din industrie. Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor Radiaiile ultraviolete - sunt radiaii cu utilizare curent n laboratorul de microbiologie; ele sunt bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest tip de radiaii acioneaz n mod direct i au putere de penetraie sczut (civa milimetri). Lmpile germicide al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilor UV cu lungimea de und de 254 nm sunt utilizate : - pentru sterilizarea apei - pentru sterilizarea incintelor i a aerului ambiant Radiaiile gamma Radiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizante i au un efect puternic microbicid. Sunt dificil de produs i de utilizat i foarte periculoase datorit efectelor pe care le au asupra materiei vii. Acest tip de radiaii poate fi utilizat n sterilizarea materialului medical i microbiologic de folosin unic sau pentru sterilizarea unor deeuri. PREGTIREA I STERILIZAREA STICLRIEI N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE Pregtirea i sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de microbiologie este o operaie deosebit de important deoarece exactitatea rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselor microbiologice depind n mare msur de rigurozitatea cu care se efectueaz. Principalele operaii de pregtire a sticlriei de laborator sunt:5

- splarea - uscarea - executarea dopurilor i ambalarea - recipientele pot fi pregtite cu dop din vat hidrofob pentru a nu pstra umezeala dup autoclavare. Din ce n ce mai folosite sunt dopurile din celuloz comprimat (comercializate), sterilizabile pan la 2000C. Pentru nlocuirea eprubetelor cu dop de vat, n scopul pstrrii optime a culturilor, se pot utiliza tuburi prevzute cu capsule care se monteaz prin nurubare. Pentru evitarea contaminrii mediilor de cultur utilizate n analiza microbiologic sau n obinerea culturilor microbiologice, sticlria de laborator trebuie ambalat i sterilizat corespunztor. Sterilizarea se efectueaz la etuv (sau pupinel), iar materialele supuse acestei operaii trebuie s fie curate i mpachetate n hrtie sau aezate n conteinere metalice nchise. Sterilizarea uscat se poate aplica pentru articole din sticl (plci Petri, baloane, pipete, eprubete), obiecte din porelan, instrumentar metalic fr suduri n cositor, pulberi uscate etc. Aerul fiind slab conductor de cldur, sterilizatorul trebuie s uniformizeze temperatura i s asigure ptrunderea aerului fierbinte n obiectele de sterilizat. n calcularea timpului de sterilizare uscat trebuie avute n vedere urmtoarele etape:

perioada de nclzire la temperatura de sterilizare, socotit n general o or; perioada de meninere a temperaturii de sterilizare; perioada de rcire n care scderea temperaturii trebuie realizat treptat pentru evitarea spargerii obiectelor de sticl prin oc termic, aprox. 2 ore. n practic se procedeaz la alegerea unei temperaturi de sterilizare de 180o C i a

unei durate de o or. Din exces de pruden se practic sterilizri la temperaturi mai ridicate sau de durate mai mari. n unele cazuri aceast practic este duntoare deoarece, de exemplu, vata ordinar - la durate i temperaturi mari de sterilizare uscat - elibereaz gudroane ce pot inhiba creterea microbian. Materiale utilizate: - pipete; - plci Petri; - eprubete; - flacoane Erlenmayer; - vat hidrofob; - tifon; - hrtie ambalaj;6

- etuv. Mod de lucru: Se execut dopuri de vat hidrofob pentru eprubete, astfel nct s poat fi extrase uor n timpul inoculrii, iar densitatea materialului s asigure sterilitatea. Eprubetele se introduc in coul de srm i se acoper cu hrtie. Pipetele se astup la partea opus vrfului, cu un dop subire de vat care s rein microorganismele ce ar putea ptrunde n pipet pe la partea superioar. Pipetele se ambaleaz ntr-o fie de hrtie care se rsucete n jurul tubului de sticl, ncepnd de la vrf. Plcile Petri se ambaleaz n hrtie de ambalaj, n funcie de numrul necesar. Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultur se astup cu dop de vat nfurat n tifon. Toat sticlria se sterilizeaz 1 or la 180 oC la etuv, timp socotit din momentul atingerii temperaturii. Dup aceast perioad etuva se oprete i se ateapt rcirea materialului.

7

EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR Studiul morfologiei microbiene nu poate fi conceput fr utilizarea microscopului; examenul microscopic joac un rol important n studiul i identificarea germenilor, precum i n determinarea numrului acestora.

100 m domeniul microscopiei optice 10 m celule epiteliale globule roii din snge bacterii tipice 1 m micoplasme 100 nm virusuri 10 nm (100 ) proteine 1 nm (10 ) aminoacizi atomi 0,1 nm (1 ) domeniul microscopiei electronice

MICROSCOPUL OPTIC

8

Microscopul optic se compune dintr-un stativ pe care sunt montate un sistem de transmisie optic, o platin port-obiect i un sistem de iluminare. Sistemul de transmisie optic Ocularele au puterea de mrire de 5x, 7x, 10x, 15x, 20x i chiar 30x. n lucrrile curente cele mai des folosite sunt cele 7x i 10x. Ocularele au rolul de a mri imaginea preparatului, dar i de a aplatiza i lumina cmpul optic. Obiectivele reprezint un sistem optic bine centrat, constituit din una sau mai multe lentile destinate a forma o imagine real a obiectului. Puterea lor de mrire este invers proporional cu distana focal, adic cu distana dintre obiect i lentila pe care se formeaz imaginea. Calitatea esential a obiectivelor este puterea lor de rezoluie. Aceasta la rndul ei depinde de mrimea deschiderii unghiului pe care l face conul de raze care intr n lentil precum i de indicele de refracie al mediului dintre obiect i lentil. Obiectivele sunt fixate prin nurubare pe un revolver port-obiectiv care permite selecionarea rapid a unuia din ele, prin simpla rotire. Gama de obiective necesare n microbiologie se compune din trei obiective cu puterea de mrire de 10x, 20x, 40x i un obiectiv cu imersie cu grosismentul 90x. Acest obiectiv se folosete n cazul n care obiectul ce trebuie examinat este mai mic sau dac este necesar a se observa amnunte foarte fine. La obiectivul cu imersie este necesar a se interpune ntre obiect i lentila frontal a obiectivului un lichid transparent (ulei de cedru, ulei de parafin, balsam de Canada etc). Sistemul de iluminare se compune din surs luminoas i dintr-un condensator. Condensatorul este o pies care se gsete imediat sub platina microscopului i care are rolul nu att de a strnge (condensa) razele luminoase venite de la sursa de lumin, ct de a mri seciunea conului de lumin pentru o mai bun claritate a imaginii. Sistemul de reglare Deplasarea platinei port-obiect sau a sistemului optic se efectueaz cu ajutorul unei cremaliere, prin intermediul a dou butoane: unul mare care d o micare ampl i rapid (viza macrometric) i altul mic, pentru reglajul fin ( viza micrometric). Modul de utilizare a microscopului9

Preparatul este plasat pe platina microscopului, avnd grij s fie bine fixat n dispozitivul de prindere. Este selectat obiectivul; n general, un examen debuteaz cu utilizarea obiectivului cel mai mic. n practic, se utilizeaz obiectivul 10x, apoi 20x pentru un preparat necunoscut sau pentru drojdii i mucegaiuri i obiectivul 40x pentru bacterii. Se regleaz distana lentilei obiectivului fa de preparat prin micarea vizei macrometrice i a celei micrometrice. (Obiectivele au o distan de reglare care descrete cu puterea lor). Cutarea imaginii este apoi efectuat prin manevrarea butonului care acioneaz cremaliera, iar dup fixarea imaginii se face o nou reglare a acesteia. Curarea sistemului optic se efectueaz regulat cu xylol i nu cu alcool etilic. Reglarea intensitii luminii condensatorului se face innd seama de puterea de mrire a obiectivelor; cu ct aceasta este mai mare, cu att poziia condensatorului este mai ridicat.

EXAMENUL PREPARATELOR N STARE PROASPT Acest tip de operatie const n examinarea unui microorganism ntr-un mediu lichid ntre lam i lamel.

4.1. STUDIUL MICROSCOPIC AL CULTURILOR DE DROJDII Drojdiile reprezint un grup taxonomic complex i heterogen de microorganisme unicelulare eucariote, care se nmulesc prin nmugurire, ca form general de reproducere i n mod particular prin ascospori. Una din proprietile cele mai importante ale drojdiilor este aceea de a fermenta o serie de zaharuri, n condiii de anaerobioz, cu formare de alcool etilic, dioxid de carbon i compui secundari, care dau aroma caracteristic produselor fermentate, proprietate foarte mult utilizat n industria alimentar. Drojdiile au o compoziie chimic valoroas i, dup cultivare n condiii de aerare sunt utilizate ca surs de proteine cu denumirea de SCP (single cell protein) n alimentaia omului i a animalelor. Celula de drojdie are n mod obinuit form sferic, oval, cilindric, apiculat, sau form de sticl, cu dimensiuni medii de 4 - 14 m. Forma i dimensiunea celulei sunt caractere de specie i pot fi influenate de starea fiziologic i de condiiile de cultivare. Principiul metodei: Pentru evidenierea caracterelor morfologice i structurale ale drojdiilor10

se folosesc preparate microscopice n stare proaspt, studiate la microscop cu obiectivele 10x, 20x, 40x. Materiale utilizate: - ca materiale biologice se vor utiliza o tulpin de Saccharomyces cerevisiae i o tulpin de Candida utilis, cultivate pe mediu cu extract de mal-agar. - lame de microscop; - lamele de microscop - microscop; - pipete sterile; - ans; - eprubete sterile; - albastru de metilen; - alcool etilic 95 %; - ap distilat 100 ml; - sticlu picurtoare.

Mod de lucrua) Prepararea

colorantului -soluie albastru de metilen

Se cntresc 0,3 g albastru de metilen, peste care se adaug 30 ml alcool etilic 95 %. Dup dizolvarea colorantului n alcool se adaug 100 ml ap distilat. b) Evidenierea caracterelor morfologice De pe suprafaa mediului de cultur se recolteaz cu ansa o poriune din cultura de drojdie care se amestec ntr-o eprubet cu civa ml ap. Din suspensia de celule se depune pe lama microscopic o pictur cu diametrul de ~ 0,7 cm, n zona central, cu ajutorul unei pipete. Se acoper preparatul cu o lamel curat, evitndu-se formarea de bule de aer. Se examineaz la microscop cu obiectivele de 10x, 20x i 40x, reinndu-se forma celulei, prezena nucleilor, prezena celulelor nmugurite. c) Evidenierea celulelor autolizate O suspensie de celule de drojdie se amestec n volume egale cu o soluie de albastru de metilen diluat i dup 3-5 minute se execut un preparat umed: celulele autolizate vor apare intens colorate in albastru, comparativ cu celulele vii, necolorate. ntr-un cmp11

microscopic se vor determina numrul total de celule i separat, celulele autolizate, fcnduse raportul acestora.

STUDIUL MICROSCOPIC AL CULTURILOR DE MUCEGAI

Mucegaiurile (sau fungii filamentoi) includ microorganisme de tip eucariot, monocelulare sau pluricelulare, cu nutriie de tip absorbtiv, difereniate din punct de vedere morfologic i care se reproduc prin spori sexuai sau asexuai. Corpul mucegaiurilor const din celule filamentoase, ramificate, numite hife, care formeaz miceliul. Mucegaiurile pot fi monocelulare, cnd se dezvolt sub forma unei celule uriae cu ramificaii (miceliu coenocitic) sau pluricelulare, caz n care miceliul este septat prin perei despritori (miceliu necoenocitic). Aparatul reproductor este reprezentat de hifele reproductoare purttoare de spori sexuai sau asexuai. Principiul metodei: Pentru evidenierea caracterelor morfologice i structurale -hife vegetative i aparat reproductor - se efectueaz un preparat proaspt ntre lam i lamel sau un preparat n lactofenol, prin tehnica benzii adezive. Materiale utilizate: - culturi de Aspergillus niger i Penicillium sp.n plci Petri ; - lame microscopice; - lamele microscopice; - microscop; - pipete sterile; - ans; - lactofenol; - band adeziv transparent.

Mod de lucru: Se efectueaz un preparat umed ntre lam i lamel, n felul urmtor: din cultura n plci Petri se recolteaz cu ajutorul firului metalic, din partea marginal a coloniei i fr a deranja structura iniial a miceliului, o mic poriune, care se desprinde uor ntr-o pictur de ap steril sau lactofenol de pe lama microscopic. Se aeaz lamela evitnd formarea n12

preparat a bulelor de gaz i se face studiul cu obiectivele 10x, 20x i 40x. Pentru meninerea ct mai exact a structurii aparatului reproductor, se poate aeza uor banda cu partea adeziv peste cultura de mucegai din placa Petri, apoi se pune peste pictura de lactofenol de pe lama microscopic. Se examineaz cu aceleai obiective. Pentru cele dou tulpini fungice se observ forma hifelor, prezena septurilor hifale, prezena conidiforilor cu organele de fructificaie specifice genurilor Aspergillus i Penicillum.

4.3. EVIDENIEREA MICROSCOPIC A BACTERIILOR

Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot, cu un cromozom unic, cu dimensiuni medii ntre 0,5 - 8 m, care se nmulesc asexuat prin sciziune binar, izomorf. Bacteriile au un rol major n natur n transformarea compuilor organici n compui anorganici simpli, prin procesul de mineralizare a materiei organice nevii, contribuind la realizarea circuitelor unor elemente chimice de importan vital: carbon, azot, sulf, fosfor .a. n procesele industriale, bacteriile sunt utilizate drept culturi starter n unele procese fermentative din industria alimentar (fabricarea produselor lactate, n panificaie, la conservarea materiilor prime vegetale), la obinerea de enzime, proteine, aminoacizi, acizi organici, solveni, antibiotice, ngrminte biologice, insecticide , vitamine, hormoni etc. Principiul metodei: metoda se bazeaz pe efectuarea preparatului proaspt ntre lam i lamel din culturi bacteriene obinute din Bacillus subtilis i Lactobacillus sp. Materiale utilizate: - cultur n slanturi de Bacillus subtilis; - cultur de Lactobacillus in mediu lichid (mediul MRS); - lame microscop; - lamele; - ans; - ap distilat.

Mod de lucru: Pe lama microscopic se pune o pictur de ap steril cu diametrul de 0,7 -1 cm. Cu vrful firului metalic se recolteaz steril, la flacra de gaz, o poriune dintr-o cultur de13

Bacillus subtilis pe agar nutritiv, n eprubete. Cultura se omogenizeaz ntr-o pictur de ap, apoi se ia o lamel curat , se sprijin pe lam la un unghi de 45o , se deplaseaz pn cnd lamela devine tangent la pictur i se las s cad peste aceasta: lichidul n exces se absoarbe cu o hrtie de filtru. Un preparat bun nu trebuie s prezinte bule de aer; acestea pot determina aglomerri de celule i mpiedic o bun observare a proprietilor. Pentru executarea preparatului din culturile lichide de Lactobacillus, se recolteaz din proba omogenizat cu o pipet din care se las s cad pe lam o pictur, care se acoper apoi cu lamela. Se observ cu obiectivele 20x i 40x. Se vor urmri: n ambele cazuri- forma celulelor, eventual formarea de lanuri de bacili; prezena sporilor bacterieni n cazul preparatului cu Bacillus subtilis.

EXAMENUL PREPARATELOR BACTERIENE N STARE USCAT

Efectuarea unui preparat n stare uscat sau frotiu const n etalarea probei de studiat urmat de o uscare, de o fixare i, eventual, de o colorare. Frotiurile sunt realizate frecvent pentru bacterii sau pentru produse care conin bacterii, rareori pentru alte microorganisme.

PREPARAREA I STERILIZAREA MEDIILOR DE CULTUR

Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie s asigure microorganismelor cantitatea necesar de ap, sursa de carbon, de azot, sruri minerale, factori de cretere, deci care s le furnizeze substanele i energia necesare n procesele de cretere, reproducere i ntreinerea funciilor vitale. Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:

s corespund din punct de vedere nutritiv,

s aib o concentraie a substantelor dizolvate care s nu influeneze negativ schimburile osmotice ale celulei s nu conin substane toxice,14

s aib un anumit pH s fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel nct s se dezvolte numai celulele introduse prin inocul. Mediile de cultur se folosesc n practica de laborator sau n practica industrial i

sunt foarte difereniate n funcie de scopul urmrit. n tehnica de laborator mediile se folosesc pentru izolarea din mediul natural a diferitelor microorganisme, pentru obinerea de culturi pure, pentru ntreinerea culturilor selecionate. n scopuri industriale, mediile de cultur sunt utilizate pentru obinere de biomas sau a unor compui de natur microbian. Dup scopul utilizrii lor, mediile de cultur se mpart n:

medii de cultur generale care asigur dezvoltarea unui mare numr de

specii

medii de cultur selective care permit dezvoltarea unui numr restrns

de microorganisme

medii de cultur de difereniere care permit separarea speciilor n

funcie de anumite caractere biochimice

medii

de

mbogire

destinate

separrii

i

cultivrii

unor

microorganisme pretenioase din punct de vedere nutritiv sau care se afl n numr redus

medii de conservare medii de cultur industriale

Din punct de vedere al compoziiei chimice, mediile de cultur se mpart n 3 categorii:

medii naturale (empirice) de origine animal sau vegetal, cu o

compoziie chimic nedefinit n mod exact;

medii sintetice: acestea sunt soluii de substane chimice pure n ap

distilat, cu o compoziie perfect determinat;

medii semi-sintetice: sunt constituite din produse chimice bine definite,

dar i din produse de origine natural (cu compoziie cunoscut).

Constituenii principali ai mediilor de cultur sunt:15

1. Extracte de carne i macerate Aceste produse, comercializate n form concentrat sub denumirea de extracte de carne, conin n principal proteine puin hidrolizate, glucide, sruri minerale, vitamine hidrosolubile. Compoziia lor variaz n funcie de carnea utilizat pentru preparare. 2. Extracte de drojdie Aceste extracte, comercializate sub form deshidratat, sunt preparate din drojdia de bere, fiind utilizate ca surs de aminoacizi i de vitamine hidrosolubile (vitamine din complexul B). 3. Peptone i hidrolizate Peptonele reprezint un amestec de compui solubili n ap care provin n urma aciunii enzimelor asupra materialului proteic. Pot fi: pepton pepsic din carne, pepton tripsic din cazein (cu coninut crescut n triptofan), pepton pancreatic de cazein, pepton tripsic de carne, pepton papainic de soia, peptone compuse. Hidrolizatele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anorganici asupra proteinelor (acid clorhidric de ex.). Cel mai des ntrebuinat este hidrolizatul acid de cazein, coninnd aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte. 4. Agar-agarul sau geloza Agar-agarul denumit i geloz este un extract de alge roii (Rhodophyceae) din genul Gelidium i Gracilaria, recoltate n mrile Japoniei sau ale Noii Zeelande. Se dizolv n ap la o temperatur n jur de 900C i se solidific sub 450C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de cultur. Nu este degradat de microorganismele obinuite. Este comercializat n forma sa iniial deshidratat, numit agar fibre (foarte impur), sub form de paiete (mai puin impur), sau sub form de pulbere. Numeroase firme sunt specializate n producerea i comercializarea mediilor de cultur de laborator (firma Difco, Merck, Biokar, Oxoid). Mediile fermentative sunt medii de cultur industriale destinate producerii unor cantiti mari de celule sau produi de metabolism. n compozitia acestor medii intr ca surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zahrului i care conine 45 - 55% zaharoz, diferite tipuri de finuri, cereale boabe, zer bogat n lactoz, tre etc. Dintre sursele de azot cel mai des folosite sunt: finurile proteice de soia, sulfatul de amoniu, ureea, ngrmntul complex. Ca sruri minerale se adaug fosfai, sulfai, cloruri etc. Pentru cultivarea microorganismelor care necesit factori de cretere, se adaug extract de porumb (obinut prin concentrarea apelor rezultate la nmuierea porumbului, bogat in aminoacizi,16

vitamine, acid lactic, microelemente), extract de drojdie, extract din radicele de mal i germeni de gru i porumb.

17

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU NTRETINEREA BACTERIILOR, DROJDIILOR I MUCEGAIURILOR

Materiale utilizate: - balan cu precizie de 0,1 g; - pahare Berzelius; - sit azbest; - agar nutritiv pulbere; - mediu de cultur extract de mal - agar pulbere; - mediu extract de cartof-dextroz-agar pulbere; - eprubete cu dop, sterile; - pipete de 10 ml; - flacoane Erlenmayer; - bec de gaz; - autoclav cu gaze. Mod de lucru: Conform indicaiilor de pe flacoanele coninnd mediile de cultur pulverulente, se vor cntri cantitile necesare pentru a obine cte 1 litru din fiecare tip de mediu de cultur pentru eprubete i cte 300 ml mediu pentru baloanele Erlenmayer. n cazul n care nu exist medii deshidratate, procurate de la firme specializate, mediile se vor prepara prin cntrirea componentelor pentru volumul final dorit. Mediul de cultur se aduce la fierbere n paharele Berzelius de 1 l, pn la completa dizolvare a agarului, apoi se repartizeaz cte 10 ml n eprubete sterile, prevzute cu dop de vat, care se aeaz n couri de srm i se acoper cu hrtie. n mediu se determin pH-ul i, dac este necesar, se ajusteaz la valoarea dorit. Mediile cu agar nu trebuie s fie aduse la un pH mai mic de 6, deoarece agarul este parial hidrolizat n timpul sterilizrii la pH acid i nu se mai solidific la rcire. Cnd sunt necesare astfel de medii, pH-ul trebuie ajustat dup sterilizare. Baloanele Erlenmayer se astup cu dop de vat nvelit n tifon, se leag la gur cu hrtie i sfoar. Courile i baloanele Erlenmayer se introduc n autoclavul cu gaze, iar sterilizarea se face conform instructiunilor afiate lang aparat. Se nchide capacul autoclavului, se verific nivelul apei n vasul de nivel, se aprinde gazul i se ateapt apariia jetului de abur viu care este eliminat prin purj.18

Dup 10-15 minute de purjare se nchide robinetul purjei, iar presiunea indicat de manometru va urca pn la valoarea 1, unde va fi meninut timp de 20 min. prin micorarea flcrii. ntre presiune i temperatura din autoclav exist o corelaie, aa cum se prezint n tabelul urmtor:

Temperatura n grade Celsius 100 105 110 112 115 120 121 122 128 130 135 140

Presiunea n kg/m 3 0,00 0,20 0,43 0,55 0,69 0,99 1,00 1,33 1,55 1,72 2,16 2,65

Presiunea n atmosfere 0,00 0,20 0,42 0,50 0,67 0,96 1,00 1,29 1,50 1,65 2,09 2,56

Dup acest interval se oprete gazul, se ateapt scderea presiunii pe manometru, se deschide purja i dup 5 minute se poate deschide capacul autoclavei. n general, mediile de cultur trebuie s ofere o suprafa de dezvoltare suficient pentru microorganisme. De aceea , dup sterilizare tuburile cu mediu se nclin pentru ca s rmn cu o suprafa mare de cretere. nclinarea se face prin sprijinirea eprubetelor pe o baghet suficient de groas, innd seama ca mediul negelificat s nu ude dopul de vat, ci s se opreasc la 2 - 3 cm de acesta. Prin rcire, vaporii ce ies din mediul cald, se condenseaz pe pereii mai reci ai eprubetelor i cad sub form de picturi pe mediu, adunndu-se pe fundul eprubetei. Din aceast cauz, eprubetele cu mediul rcit nu se aeaz n poziie orizontal, ci vertical, in couri de srm. Acestea se acoper apoi cu o hrtie i se leag cu sfoar. Pentru a nu prepara n fiecare zi medii, sau, dac este nevoie de mai multe feluri de medii n acelai timp, acestea se pregtesc o dat i apoi se depoziteaz pentru pstrare.19

Sticlele cu medii se eticheteaz, notndu-se tipul mediului i data preparrii. Pentru evitarea uscrii se recomand pstrarea mediilor nutritive n frigider.

20

NSMNTAREA CULTURILOR DE BACTERII, DROJDII I MUCEGAIURI

Principiul metodei: Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultur n plci Petri sau n tuburi, att pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin refrigerare, ct i pentru obinerea culturilor stoc i de lucru, n diversele procese biotehnologice. Operaia de trecere a unei culturi dintrun vas de cultur n altul se numete repicare sau trecere, iar fragmentul de cultur ce se trece pe alt mediu se numete inoculum. n jurul flcrii becului de gaz exist o zon steril cu diametrul de aproximativ 20 cm, n lipsa curenilor de aer. Toate manipulrile care necesit deschiderea recipientelor sterile sau coninnd culturi trebuie efectuate n aceast zon de protecie.

NSMNTAREA N TUBURI Materiale utilizate: - culturi de Bacillus subtilis pe agar nutritiv; - culturi de Saccahromyces cerevisiae pe mediul extract de mal - agar; - culturi de Monascus purpureus , Aspergillus niger i Penicillium pe mediul extract de cartof - dextroz - agar; - fir de inoculare; - bec de gaz; - eprubete cu mediu sterilizat i nclinat (nutrient-agar, extract de mal-agar, extract de cartof-dextroz-agar); - termostat la 30 oC; - lamp bactericid. Mod de lucru: nsmnarea cu ansa Se terge suprafaa din interiorul niei de lucru cu un tampon mbibat cu alcool 95%. Se aprinde lampa bactericid i se las 15 minute pentru sterilizarea incintei de lucru. Se spal minile cu spun, apoi se cltesc cu alcool. Se aprinde becul de gaz i se regleaz21

flacra, care trebuie s aib conul de culoare albastr. Se ine eprubeta n care exist cultura ce trebuie repicat cu mna stng, n poziie oblic sau chiar orizontal. n mna dreapt se ine acul de repicat. Acesta se arde n flacra becului de gaz, inndu-l n poziie vertical pentru ca flacra s cuprind o poriune ct mai mare din el. Se ine n flacr pn ce mai mult de jumtate din ac se nroete, apoi se plimb de 2 -3 ori i restul acului pn la mner, n flacr. Dup aceea se apropie gura eprubetei de flacr i, cu degetul mic de la mna dreapt ndoit, se trage afar dopul de vat din gura eprubetei, apucndu-l de captul rmas afar. Nu i se d drumul dopului pe mas sub nici un motiv, ci se ine tot timpul n mn. Se trece gura eprubetei de 2 -3 ori prin flacr. Se introduce acul fierbinte n eprubet i se rcete, nu n cultur, ci alturi, pe o poriune de agar fr cultur. Se ia apoi o foarte mic poriune (de 1 - 2 mm) din cultur pe vrful acului (se alege poriunea cea mai tipic i mai curat a culturii respective). Se scoate acul din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul de vat din mna dreapt. Se las jos eprubeta i se ia, tot cu mna stng, o alt eprubet cu mediu steril. Acul de repicat cu fragmentul de cultur, se ine mai departe n mna dreapt ferindu-l acum de flacr. Se procedeaz cu eprubeta a doua la fel cum s-a procedat cu prima, adic: se ine n poziie orizontal sau putin oblic n mna stng, se scoate dopul cu degetul cel mic de la mna dreapt ndoit, inndu-se tot timpul operaiei de repicare n mn. Se trece gura eprubetei prin flacr, se introduce acul de repicare cu fragmentul de cultur, atingnd uor mediul (n centrul eprubetei), pn ce bucica de cultur rmne pe mediu. Uneori este bine ca fragmentul de cultur s fie puin afundat n mediu, pentru a face un contact mai strns cu el. Se scoate acul de repicat din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul din mna dreapt. Se trece i captul dopului care a fost inut cu mna prin flacr, dar foarte rapid. Se arde din nou acul n flacr pan la rou. Aceast operaie este absolut necesar i trebuie fcut cu rbdare, pentru a se evita infectarea mediilor urmtoare. Dup arderea acului se ia din nou eprubeta cu cultura ce trebuie repicat i se repet operaia de repicare cu o alt eprubet steril. Toate micrile descrise mai sus, din care const operaia de repicare, trebuie executate destul de repede pentru a nu permite infectarea mediilor sterile din eprubete. Ele trebuie fcute cu o oarecare ritmicitate i nu prelungite prea mult. De asemenea trebuie22

respectate o serie de indicaii, care la prima vedere par minore, dar de care depinde foarte mult reuita unei repicri. Astfel, trebuie avute n vedere: -inerea eprubetei n poziie orizontal n timpul repicrii pentru a evita cderea sporilor de ciuperci i bacterii din atmosfer pe mediu; -inerea acului de repicat n poziie vertical n flacr i nu orizontal, pentru ca arderea s se fac pe o poriune ct mai mare; -scoaterea dopului de vat cu degetul mic al minii drepte i inerea lui tot timpul n mn, pentru a-l feri de contaminri secundare; -arderea gurii eprubetei la scoaterea i introducerea dopului de vat, deoarece pe marginile exterioare ale eprubetei pot exista germeni de infecie secundar. Dup dezvoltarea culturii se observ aspectul , culoarea, tipul coloniilor, precum i eventuala prezen a contaminrii cu alte microorganisme.

23

NSMNTAREA N PLCI PETRI

Materiale utilizate: - plci Petri sterile - medii de cultur pentru bacterii, drojdii, mucegaiuri, aceleai ca n cazul nsmnrii n tuburi - culturi de bacterii, drojdii, mucegaiuri - pipete sterile - ap steril - fir de inoculare - bec de gaz - termostat

Mod de lucru Mediul de cultur steril se topete pe baie de ap, dup care se rcete la 470C i se repartizeaz n mod aseptic n plcile Petri, pentru evitarea unui condens prea mare pe capacul plcii. Se las mediul s se solidifice la temperatura camerei. Pentru economie de spaiu i pentru evitarea formrii unui condens prea abundent, plcile se pot aeza una peste alta, dac este posibil. Se agit tubul coninnd suspensia de celule n ap steril i se recolteaz cu pipeta aproximativ 2 ml din cultur, care se introduc n placa Petri, pe suprafaa mediului nutritiv. Se repartizeaz omogen, pe toat suprafaa, se scurge excesul de lichid i se termostateaz la temperatura convenabil. nsmnarea mediului de cultur din plcile Petri se poate face de asemenea, prin ncorporarea suspensiei de celule, astfel: se pipeteaz n placa steril, goal, 1 ml din suspensia de celule, dup care se toarn mediul topit i rcit la 45 - 470C i se omogenizeaz pentru repartizarea uniform a celulelor din cultur. Se las s se solidifice i se incubeaz.

24

DESFURAREA ACTIVITTII I PROTECTIA MUNCII N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE Microbiologia este o disciplin care necesit ordine, metod , rigoare i o curenie impecabil n timpul lucrului. n laboratorul de microbiologie trebuie respectate o serie de reguli de igien, fr de care nu pot fi aplicate metodele de lucru specifice acestei discipline, existnd totodat pericolul contaminrii propriei persoane, a celor din jur, precum i a materialelor care se manipuleaz. Numrul microorganismelor din ncperi variaz de la cteva sute / m3, n ncperi foarte curate, fr micri de aer, pn la zeci de mii n ncperi nentreinute igienic. Este cunoscut faptul c majoritatea microorganismelor din aer provin de pe sol, din depozitele de materie organic i ajung n aer odat cu particulele de praf. O alt categorie sunt microorganismele expulzate de pe mucoasele aparatului respirator prin tuse, strnut, vorbire i chiar n timpul respiraiei. Pentu desfurarea unei activitti normale de lucru n laboratoarele de microbiologie se vor respecta urmtoarele reguli:

ntreinerea n perfect stare de curenie a ncperilor (pardoseal,

perei, plafon i geamuri), combaterea insectelor i a mucegaiului;

ndeprtarea de pe mesele de lucru i din ncpere a tuturor obiectelor

inutile;

ntreinerea n perfect stare de curenie a aparaturii, mobilierului i

meselor de lucru;

tergerea meselor de lucru cu un dezinfectant nainte de nceperea

lucrului;

evitarea formrii curenilor de aer n ncperile de lucru; iradierea cu raze ultraviolete a atmosferei i suprafeelor de lucru

nainte de nceperea activitii

ntreinerea n perfect stare de curenie a minilor, mbrcmintei

i nclmintei persoanelor care lucreaz n laborator.

25

De aceea, n laboratorul de microbiologie :

purtai un halat de laborator dintr-un material neinflamabil, n stare bun, curat i dintr-o singur culoare; lsai-v hainele n vestiar sau n spaiul special amenajat; dup terminarea lucrrilor, halatul va fi pstrat n locuri speciale;

protejai-v uviele lungi de pr, purtai unghiile curate i tiate scurt; splai-v mainile cu ap cald i spun (de preferin lichid sau pudr, cu aciune bactericid) i tergei-le pe un prosop de hrtie de folosin unic nainte i dup manipularea microbiologic;

dup utilizarea sticlriei cu care ai manipulat microorganismele, aceasta trebuie depozitat separat n vederea autoclavrii;

ESTE INTERZIS ARUNCAREA OBIECTELOR CARE AU FOST N CONTACT CU MICROBII LA COUL DE GUNOI !

nu mncai, nu bei i nu fumai n incinta laboratorului; nu depozitai alimentele personale n frigiderul laboratorului; nu vorbii, nu strnutai i nu tuii n timpul nsmnrilor ;

n practica de laborator, principalele accidente pot apare la: - mini - tieturi sau inepturi cu pipete Pasteur sau cu cioburi de sticl; arsuri ale degetelor n timpul lucrului n zona steril din jurul flcrii de la becul de gaz; arsuri cu amestec sulfocromic; - ochi - prin proiectarea cioburilor de sticl sau a unor stropi de ap fierbinte sau substane chimice n timpul lucrului; - gur - ingerarea de produi toxici (reactivi) sau de culturi microbiene; acest tip de accidente este foarte rar, deoarece pipetele sunt prevzute cu un dop de vat la capt; - nas - inhalarea unei dispersii de germeni (aerosoli infecioi), din cauza practicilor greite de nsmnare sau cnd un tub de cultur microbian se sparge: acest tip de accidente poate fi evitat prin purtarea unei mti sterile din hrtie.

26