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LUIS ROSSI 1

CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITRO• Es el cultivo en medio nutritivo, bajo condiciones estériles,

de plantas, semillas, embriones, órganos, explantos, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores(pero también de células y tejidos animales).

• Existen otros términos cuyo significado se solapa parcialmente con el significado de cultivo in vitro:

Cultivo de tejidos vegetales: se refiere al cultivo in vitro de partes de la planta (tejidos o frecuentemente órganos)

Micropropagación: se usa para referirse a la utilización de las técnicas de cultivo in vitro aplicadas a la propagación vegetativa de plantas.

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITRO• El cultivo in vitro de plantas superiores es una técnica

que exige un control absoluto del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explanto. Los principales factores no biológicos que afectarán al desarrollo del cultivo in vitro como:

AMBIENTE QUÍMICO Composición del medio pH AMBIENTE FÍSICO Temperatura Luz y fotoperíodo

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROMEDIO DE CULTIVOMEDIO DE CULTIVO

• Es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua. Incluye sales inorgánicas, carbohidratos, vitaminas y aa. Se le denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias.

• Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo. También se debe añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones.

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITRONECESIDADES NUTRICIONALES Y HORMONALES DE NECESIDADES NUTRICIONALES Y HORMONALES DE

ORGANOS Y TEJIDOS VEGETALESORGANOS Y TEJIDOS VEGETALES • Agua• Sustancias orgánicas : Azúcares, Aminoácidos,

Vitaminas, Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Acido abcísico • Macroelementos: N, P, K, Ca, S, Mg.• Microelementos: Fe, Zn, B, Mn, Cu, Ni, Co, Al, Mo, I.• Mezclas de sustancias:

Extracto de levadura, leche de coco, extractos vegetales, hidrolizados de caseína, peptona y triptona

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITRO

• Los requerimientos nutritivos para un crecimiento in vitro óptimo varían: - con la especie, - son específicos de acuerdo a la parte de la planta que se esté cultivando - la respuesta que se desea obtener.

debido a estas necesidades específicas se han desarrollado muchas formulaciones para los medios de cultivo.

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROMEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO

• El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962), es muy usado, particularmente para regenerar plantas; existen numerosas variaciones comerciales de este medio.

• El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios derivados, usado para el cultivo de células y protoplastos, y también en la regeneración de plantas. La diferencia principal entre los medios MS y B5 es la < [nitratos]en B5.

• El medio WPM (1980) de [sales] está especialmente indicado para especies leñosas.

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROMEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO

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MEDIOS : MEDIOS : TIPOSTIPOS• Medio sólido: es todo aquel que contiene un agente

gelificante. La dureza del medio depende de 2 factores:

• 1. Ph• 2. Composición química del medio• Los gelificantes más usados en el cultivo in vitro son:• 1. Agar : Es una mezcla de polisacáridos extraídos de

un alga marina. La planta no puede digerirlo ni adsorberlo, y no interactúa con los componentes nutritivos del medio. El agar se funde a altas T (1000C), solidifica alrededor de los 400C y no se degrada con la luz. Generalmente se utiliza a una [ ] de 0,6 - 1%. El principal problema es su elevado costo.

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MEDIOS : MEDIOS : TIPOSTIPOS• Medio líquido: no se adicionado ningún gelificante.

• Su uso ofrece las siguientes ventajas e inconvenientes respecto al uso de medio sólido:

Facilita la absorción de nutrientes por el explanto. Es más fácil la manipulación para cambiar medios. Cualquier exudado de la planta se diluye con> facilidad. Algunas especies que crecen mal en medio líquido. Si resulta posible el cultivo en medio líquido, se debe

considerar el problema de la aireación. Se puede cultivar el explanto parcialmente sumergido, y si se necesita una inmersión total se debe utilizar un agitador.

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROpHpH

• Cuando se prepara un medio de cultivo, después de añadir todos sus componentes, se procede a ajustar el pH final al valor deseado, añadiendo NaOH 0.1 N ó HCl 0.1N al medio. En general, se trabaja a pH entre 5.2 y 5.8.

• Ajustado el pH se procede a esterilizar el medio en autoclave.

• Durante el curso del cultivo, el medio se irá acidificando progresivamente como resultado de la absorción diferencial de algunos de sus componentes, así como de la excreción de exudados por parte del explanto.

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROpHpH

• El control del pH inicial del medio y de su dinámica durante el cultivo tiene una gran importancia en el desarrollo de cualquier proyecto de cultivo in vitro.

• A pesar de su importancia, en muchos experimentos este control se limita a fijar su valor inicial sin reparar en los posibles efectos de su dinámica.

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROEFECTOS DEL pHEFECTOS DEL pH

Valores, <s a 3.5 impiden la solidificación de los agentes gelificantes añadidos a los medios sólidos

Si la evolución del pH del medio lo hace por debajo de 3.5 se puede producir su licuación.

Su valor puede afectar a la solubilidad de algunos componentes del medio de cultivo

Su valor puede afectar a la absorción de determinados nutrientes por parte del explanto (la absorción de iones NO3

- con la acidez del medio).

Su valor en el medio puede afectar al pH del citoplasma y como consecuencia a la actividad de muchos enzimas.

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROTEMPERATURATEMPERATURA

• La T a la que está expuesto el explanto cultivado in vitro afecta a la >ría de procesos fisiológicos y por lo que es un factor fundamental a controlar.

• Cada especie tiene un intervalo de T en el que se produce el crecimiento óptimo. El intervalo puede variar en función del: genotipo, órgano del que se ha obtenido el explanto, época del año, edad de la planta madre, fotoperíodo, etc.

• Adicionalmente puede existir interacción entre la T óptima de crecimiento y otros factores: la luz, la composición del medio (en algunos casos se obtiene > rendimiento haciendo fluctuar la T según el FP).

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROTEMPERATURATEMPERATURA

• La T óptima, exige de cámaras de cultivo y se pueden obtener resultados satisfactorios con T de incubación que oscilan entre los 20 y 280C.

• El control de la T es importante porque: - pueda afectar al crecimiento del cultivo - puede ser un factor que induzca determinados procesos fisiológicos: -- T ( de 4-50C) permiten superar los períodos de dormición de algunas leñosas y la conservación prolongada de determinados cultivos in vitro; -- T constante de 200 C induce la formación de raíces en la >ría de coníferas.

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROLA LUZLA LUZ

• Es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos autótrofos.

• Los aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos in vitro son:

La cantidad de luz: La irradiación La calidad de la luz: El espectro La alternancia de los ciclos de luz con los de

oscuridad: El fotoperíodo

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROLA LUZ: LA LUZ: LA IRRADIACIÓNLA IRRADIACIÓN

• La cantidad de luz que incide sobre las superficies fotosintéticas de las plantas determinará en gran medida la capacidad fotosintética de éstas.

• Esta cantidad de luz puede ser calculada midiendo la irradiancia: la energía radiante que llega a una superficie dada en un intervalo de tiempo.

• La irradiancia puede ser expresada en función de los fotones: µmol m-2 s-1

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• La irradiancia a las comprendidas entre 400 y 700 nm, permite obtener una medida de la radiación fotosintéticamente activa (PAR).

• Las necesidades de luz de los cultivos in vitro son inferiores a las de la planta in vivo, dado que el medio de cultivo contiene sacarosa, los cultivos in vitro se comportan sólo parcialmente de forma autotrófica.

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• Una irradiación excesiva produciría un notable de la T dentro del recipiente de cultivo debido al efecto invernadero.

• La irradiación habitual en el campo es nociva en condiciones in vitro, por lo que se usan irradiaciones mucho < (un 10% o incluso menos del valor de plena insolación).

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROLA LUZ: LA LUZ: EL ESPECTROEL ESPECTRO

• La luz es esencial para las plantas debido a que proporciona la energía necesaria para la fotosíntesis.

• Pero la luz tambien puede intervenir en otros procesos fisiológicos, como el fototropismo, la germinación, la floración,...

• Por ello es preciso conocer el espectro de la radiación que es activo en el proceso fisiológico estudiado.

• La cámara de cultivo deberá reproducir lo mejor posible ese espectro de luz activo, por lo que conviene conocer cual es el espectro que emiten las fuentes de luz y en que medida se adapta éste a las necesidades del cultivo.

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• Principales fuentes de luz usadas en las cámaras de cultivo: • LAMPARAS INCANDESCENTES: Producen la luz por

la incandescencia del filamento calentado por el paso de la corriente eléctrica. Buena parte del espectro se halla en la zona del rojo/rojo lejano. Producen gran cantidad de calor y mucho consumo de electricidad.

• LAMPARAS FLUORESCENTES: Producen la luz por la fluorescencia del gas sometido a un arco voltáico. El espectro de la luz producida es rico en la zona del azul, existen fluorescentes especiales con un espectro rico en la zona azul y roja. Consumen menos electricidad.

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• LAMPARAS DE VAPOR DE Hg Y Na: Producen la luz por efecto del paso de la corriente eléctrica a través de gases calientes de Hg (azul y verde) y Na (naranja). Son altamente eficientes en el consumo de electricidad.

• De todas ellas, son los fluorescentes las fuente de luz más usada en las cámaras de cultivo,

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CULTIVO IN VITROCULTIVO IN VITROLA LUZ: LA LUZ: EL FOTOPERIODOEL FOTOPERIODO

• Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, floración, tuberización,...) pueden ser activados por el # de horas diarias de luz que recibe la planta.

• De forma análoga, el # de horas de luz que recibe el explanto cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo.

• En general, el mejor FP in vivo será también el mejor FP in vitro.

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CULTIVOS CULTIVOS IN VITROIN VITRO TIPOSTIPOS• El material vegetal con el que se inicia un cultivo in vitro

puede ser cualquier célula, tejido u órgano de la planta. • Se puede partir de fragmentos de tallo, raíz, hoja,

meristemos, embriones,... es decir de tejidos somáticos, pero también se puede iniciar a partir de células o tejidos no somáticos: anteras, polen, microesporas, óvulos, etc.

• Según sea el explanto utilizado se hablará de cultivo de secciones nodales, cultivo de hoja, de meristemo, de polen, de embriones, etc.

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CULTIVOS CULTIVOS IN VITROIN VITRO TIPOSTIPOS

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• Las condiciones de cultivo pueden pretender la proliferación desorganizada de las células del explanto hasta dar lugar a un callo o incluso a un cultivo de células cuando se separan éstas del callo.

• Si se elimina la pared celular de las células se obtiene un cultivo de protoplastos.

• En otros casos se puede pretender la regeneración de la planta completa (morfogénesis) mediante la formación de raíces (rizogénesis) y/o de tallos.

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• La morfogénesis se produce a partir del explanto inicial mediante la formación de raíces y/o tallos en posición normal o en posición no normal (adventicias/os).

• Laa morfogénesis puede ser: a) morfogénesis indirecta : se produce después de la formación de un callo

• b) morfogénesis directa : se produce directamente del explanto sin que este pase por una fase de callo.

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• Embriones somáticos :Surgen cuando en el explanto se producen unas estructuras bipolares que presentan las propiedades morfológicas de los embriones zigóticos.

• Según que estos embriones somáticos surjan directamente del explanto o bien de un callo se habla de embriogénesis directa o indirecta, respectivamente.

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MICROPROPAGACIÓNMICROPROPAGACIÓN• Es el proceso de multiplicar plantas in vitro.• A través de la micropropagación, a partir de un

fragmento (explanto) de una planta madre, se obtiene una descedencia uniforme en condiciones de asepsia.

• Este proceso incluye varias fases:

0) Preparacion de la planta madre

1) Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia

2) Multiplicación de brotes

3) Enraizamiento

4) Aclimatación

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FASE 0: PREPARACIÓN DE FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRELA PLANTA MADRE

• Se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado para lo cual es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida.

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FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIACONDICIONES DE ASEPSIA

• Escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos de la planta madre, los cuales son desinfectados para luego obtener los explantos.

• En condiciones de asepsia (en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantos del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantos.

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FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIACONDICIONES DE ASEPSIA

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FASE II: MULTIPLICACIÓN FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTESDE LOS BROTES

• Durante esta fase se espera que los explantos que sobrevivieron de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos.

• Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar.

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FASE II: MULTIPLICACIÓN FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTESDE LOS BROTES

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FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOSENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS

• Para enraizar los explantos se utilizan 2 métodos:

ENRAIZAMIENTO IN VITRO • Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de

multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar.

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FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOSENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS ENRAIZAMIENTO EX VITRO• Los explantos se deben transferir a un sustrato, que

puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.Los explantos deben de plantarse en cámaras plásticas en el laboratorio.

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FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOSENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS

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FASE IV: ACLIMATACIÓN DE LOS FASE IV: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOSEXPLANTOS ENRAIZADOS

• Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.

• Tanto si los explantos fueron enraizados in vitro como ex vitro, en el momento en que se extraen los explantos de los recipientes de enraizamiento están poco adaptados a crecer en un invernadero.

• Los explantos deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero progresivamente la humedad relativa e progresivamente la intensidad de luz.

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CULTIVO DE MERISTEMOSCULTIVO DE MERISTEMOS• Es el cultivo in vitro meristemo apical que como media

mide 100x100 µm más los primeros primordios foliares.

• El cultivo de meristemos es un método efectivo para la eliminación de infecciones virales y es el material preferido para la conservación de germoplasma.

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CULTIVO DE MERISTEMOSCULTIVO DE MERISTEMOS• La razón principal por la cual las células meristemáticas son indemnes a los virus es que el meristemo carece de

tejidos vasculares, que es por donde se propagan los virus que van contaminando a la planta. Existen otros factores:

El meristemo apical tiene una > velocidad de crecimiento y en consecuencia el virus "no alcanza" al meristemo.

En una célula meristemática el virus tiene > dificultad de acoplamiento con los ribosomas, debido a que estás células tienen un código de trabajo muy definido.

Existe una competencia por uso de algunos metabolitos entre células y virus.•

• Figura 1. Sección de un meristemo apical de un tubérculo de patata visto al microscopio óptico Figura 2. Aspecto de una plántula de ajo obtenida por cultivo de meristemos.

• El tamaño óptimo a utilizar se decide tomando en cuenta dos factores: tamaño óptimo para la liberación del virus y tamaño óptimo para facilitar el cultivo. Existe una mayor posibilidad de obtener plantas libres de virus si sólo se aísla el meristemo, pero la posibilidad de que el meristemo sobreviva sin primordios foliares es muy pequeña. Por otro lado, utilizar meristemos más grandes (con más primordios foliares) hace que la probabilidad de obtener plantas libres de virus sea pequeña.

• De manera general se puede decir que los meristemos apicales tienen más probabilidad de estar libres de virus que los meristemos axilares, y que si los meristemos provienen de una planta en plena actividad hay mayor probabilidad de obtener plantas libres de virus.

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CÁMARAS DE CULTIVOCÁMARAS DE CULTIVO

• Una cámara de cultivo es un receptáculo diseñado para permitir el control de algunas variables del ambiente físico. Habitualmente se pueden controlar la T, la iluminación y el fotoperíodo y en algunos casos, menos frecuentes, la humedad del aire y su composición.

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