magistrski Študijski program laboratorijska … · univerza v ljubljani fakulteta za farmacijo...
TRANSCRIPT
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
MATEJA MATJAŽ (ŠTIRN)
MAGISTRSKA NALOGA
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM LABORATORIJSKA
BIOMEDICINA
Ljubljana, 2016
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
MATEJA MATJAŽ (ŠTIRN)
ANTIOKSIDATIVNE LASTNOSTI IZBRANIH BARBITURATOV IN
CIKLIČNIH IMIDDIOKSIMOV
ANTIOXIDATIVE PROPERTIES OF SELECTED BARBITURATES
AND CYCLIC IMIDEDIOXIMES
MAGISTRSKA NALOGA
Ljubljana, 2016
Magistrsko nalogo sem opravila na Katedri za farmacevtsko kemijo, Fakultete za
farmacijo, pod mentorstvom doc. dr. Janeza Mravljaka, mag. farm.
Zahvala
Za vso strokovno pomoč, nasvete in koristne napotke pri izdelavi magistrske naloge se
iskreno zahvaljujem mentorju doc. dr. Janezu Mravljaku, mag. farm.
Največja zahvala pa gre mojemu možu Gregorju in mojim staršem, ki so mi omogočili
študij, verjeli vame ter me spodbujali in podpirali.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo izdelala samostojno pod mentorstvom doc. dr. Janeza
Mravljaka, mag. farm..
Mateja Matjaž
Komisija za zagovor magistrskega dela:
1. Predsednik: izr. prof. dr. Matjaž Jeras
2. Mentor: doc. dr. Janez Mravljak
3. Član: doc. dr. Jurij Trontelj
Mateja Matjaž Magistrska naloga
I
KAZALO VSEBINE
POVZETEK .............................................................................................................................. III
ABSTRACT .............................................................................................................................. IV
KAZALO SLIK ........................................................................................................................... V
KAZALO PREGLEDNIC ........................................................................................................ VII
SEZNAM OKRAJŠAV ........................................................................................................... VIII
1. UVOD ..................................................................................................................................... 1
1.1. OKSIDATIVNI STRES ................................................................................................... 1
1.2. ANTIOKSIDANTI ........................................................................................................... 1
1.3. REAKTIVNE ZVRSTI .................................................................................................... 2
1.4. HIDROKSILNI RADIKAL ............................................................................................. 4
1.5. HIDROPEROKSILNI RADIKAL ................................................................................... 4
1.6. FENTONOVA REAKCIJA ............................................................................................. 4
1.7. HABER-WEISSOVA REAKCIJA .................................................................................. 6
1.8. ŽELEZO ........................................................................................................................... 6
1.8.1. OKSIDACIJSKE OBLIKE ŽELEZA ....................................................................... 8
1.9. BARBITURATI ............................................................................................................... 8
1.9.1. RAZVOJ IN UPORABA BARBITURATOV .......................................................... 9
1.9.2. MEHANIZEM DELOVANJA BARBITURATOV ................................................ 10
1.9.3. BARBITURATI IN TIOBARBITURATI ............................................................... 10
1.10. CIKLIČNI IMIDDIOKSIMI ........................................................................................ 11
1.11. DOLOČANJE ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI ................................................ 11
1.11.1 SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA DPPH ............................................... 12
1.11.2. KELACIJA ŽELEZA(II) ....................................................................................... 14
1.11.3. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z ŽELEZOM(II) 15
2. NAMEN DELA ..................................................................................................................... 16
3. MATERIALI IN METODE .................................................................................................. 17
3.1.1. TOPILA IN REAGENTI ......................................................................................... 17
3.1.2. POTROŠNI MATERIAL ........................................................................................ 18
3.1.3. OPREMA ................................................................................................................. 19
3.4. PRIPRAVA VZORCEV IN STANDARDOV ............................................................... 20
3.4.1. OPIS VZORCEV ..................................................................................................... 20
Mateja Matjaž Magistrska naloga
II
3.4.2. OPIS STANDARDOV .............................................................................................22
3.4.3. SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA DPPH .................................................22
3.4.3.1. PRIPRAVA RAZTOPIN VZORCEV ...................................................................22
3.4.3.2. PRIPRAVA RAZTOPINE STANDARDA ...........................................................23
3.4.4. ZMOŽNOST KELACIJE ŽELEZA(II)....................................................................23
3.4.4.1. PRIPRAVA RAZTOPIN VZORCEV ...................................................................23
3.4.4.2. PRIPRAVA RAZTOPIN STANDARDOV ..........................................................24
3.4.5. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z ŽELEZOM(II) ...24
3.4.5.1. PRIPRAVA RAZTOPIN VZORCEV ...................................................................24
3.4.5.2. PRIPRAVA RAZTOPINE STANDARDA ...........................................................24
3.5. ANALIZA VZORCEV IN STANDARDOV ..................................................................25
3.5.1. POSTOPEK DOLOČANJA SPOSOBNOSTI REDUKCIJE DPPH RADIKALA..25
3.5.1.1. IZRAČUN VREDNOSTI EC50 .............................................................................26
3.5.2. POSTOPEK DOLOČANJA ZMOŽNOSTI KELACIJE ŽELEZA(II) ....................26
3.5.2.1 IZRAČUN VREDNOSTI EC50 ..............................................................................27
3.5.3. POSTOPEK DOLOČANJA UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNE TITRACIJE
SPOJIN Z ŽELEZOM(II) ...................................................................................................28
4. REZULTATI IN RAZPRAVA ..............................................................................................29
4.1. ANTIOKSIDATIVNA SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA DPPH ..................29
4.1.1. KVERCETIN ............................................................................................................29
4.1.2. VZORCI ...................................................................................................................30
4.1.3. KOMENTAR REZULTATOV REDUKCIJE RADIKALA DPPH ........................33
4.2. ZMOŽNOST KELACIJE ŽELEZA(II) ..........................................................................36
4.2.1. EDTA ........................................................................................................................37
4.2.2. KVERCETIN ............................................................................................................38
4.2.3. VZORCI ...................................................................................................................39
4.2.4. PRIMERJAVE MED SPOJINAMI ..........................................................................42
4.3. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z ŽELEZOM(II) ..........45
4.3.1. KVERCETIN ............................................................................................................45
4.3.2. VZORCI TESTIRANIH SPOJIN .............................................................................46
4.3.3 REZULTATI UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNE TITRACIJE ŽELEZA(II) ...51
5. SKLEP ....................................................................................................................................52
VIRI IN LITERATURA ............................................................................................................54
Mateja Matjaž Magistrska naloga
III
POVZETEK
Preučevanje barbituratov in tiobarbituratov je v zadnjih letih pripeljalo do v številnih novih
odkritj njihovih inhibitornih, antimikrobnih in antioksidativnih učinkov. Prav tako so
ciklični imiddioksimi (npr. glutarimiddioksim) znani po tvorbi kompleksov z elementi
prehodnih kovin. Spojine, ki kompleksirajo železo in druge prehodne kovine, lahko
preprečijo nastanek nevarnih hidroksilnih radikalov, ki nastanejo v Fentonovi reakciji.
Hidroksilni radikali lahko zaradi svoje visoke reaktivnosti hitro vstopijo v nadaljnje
reakcije in povzročijo oksidativne poškodbe celic, saj v človeškem telesu ni ustreznega
mehanizma za njihovo odstranjevanje.
Namen našega dela je bil ugotoviti antioksidativne lastnosti in vezavne sposobnosti za
dvovalentno železo izbranih 5-benziliden(tio)barbituratov ter cikličnih imiddioksimov.
Zanimalo nas je, kako bodo spremembe v strukturah vzorcev, prisotnost hidroksilnih
skupin in zamenjava barbituratnega dela s tiobarbituratnim vplivale na redukcijo radikala
1,1-difenil-2-pikrilhidrazila (DPPH) ter na sposobnost kelacije železa(II). V raziskavo smo
vključili šest spojin 5-benziliden(tio)barbituratov in dve spojini cikličnih imiddioksimov
(glutarimiddioksima in sukcinimiddioksima). Kot pozitivno kontrolo smo uporabili
kvercetin in EDTA, s katerima smo potrdili ustreznost meritev naših vzorcev. Izbrane
spojne smo ovrednotili s tremi različnimi metodami: s sposobnostjo redukcije radikala
DPPH, zmožnostjo kelacije železa in z UV-Vis spektrofotometrično titracijo spojin z
železom(II).
S primerjavo dobljenih rezultatov smo ugotovili, da 5-benziliden(tio)barbiturati, ki imajo
kateholno skupino, izkazujejo najboljšo redukcijo DPPH in kelacijo železa(II). Ugotovili
smo tudi, da metilacija amidnih dušikov, lega hidroksilne skupine na meta mestu v
fenilnem obroču in petčlenski obroč v sukcinimiddioksimu negativno vplivajo na
antioksidativno in kelacijsko aktivnost spojin. Prisotnost žvepla v strukturi 5-
benzilidentiobarbituratov izboljša redukcijo radikala DPPH, a zmanjša oziroma izniči
zmožnost kelacije železa(II). Domnevamo, da se lahko železo(II) veže tudi preko
barbituratnega dela molekule. Na osnovi vseh ugotovitev sklepamo, da najboljšo redukcijo
radikala DPPH in kelacijo železa(II) izkazujejo barbiturati, ki imajo v svoji strukturi več
hidroksilnih skupin.
Ključne besede: Barbiturati, glutarimiddioksim, antioksidanti, kelacija železa(II).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
IV
ABSTRACT
The study of barbiturates and tiobarbiturates in recent years has led to many new
discoveries of their inhibitory, antimicrobial and antioxidant effects. Cyclic imidedioximes
(glutarimidedioxime) are also known of their ability to form complexes with transition
metals. Compounds that are complexing iron(II) and other transition metals can prevent the
formation of dangerous hydroxyl radicals generated by the Fenton reaction. Due to its high
reactivity, hydroxyl radicals can quickly enter into further reactions and cause oxidative
damage to cells in the human body, because there is no proper mechanism for their
removal.
The aim of our work was to determine the antioxidant properties and binding capacity for
divalent iron of selected 5-benzylidenebarbiturates and cyclic imidedioximes. We wanted
to find out how the changes in the molecular structure of the samples, the presence of
hydroxyl groups and replacement of barbiturate with tiobarbiturate affect on the reduction
of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical and on the ability to chelate iron(II). Our
research focused on six compounds of 5-benzylidene-(tio)barbiturates and two cyclic
imidedioximes (glutarimidedioxime and succinimidedioxime). As a positive control the
quercetin and EDTA was used, to which the results of measurements on our samples were
compared. Selected compounds were evaluated by three different methods: the ability to
reduce DPPH radical, capability of chelating iron(II) and UV-Vis spectrophotometric
titration of the compounds with iron(II).
By comparing the results, we have found that 5-benzyliden(tio)barbiturates, that have a
catechol group, show the best reduction of DPPH radical and the chelation of iron(II). We
have also found that the methylation of amide nitrogens, meta- position of the hydroxyl
group in the phenyl ring and the five-membered ring in succinimide dioxim negatively
affect the activity of the compounds. The presence of sulfur in the structure of 5-
benzylidenetiobarbiturates improves the reduction of DPPH radical, but reduces or
eliminates the ability of iron(II) chelation. We assume that the iron(II) binds also via
barbiturate moiety. Out of all findings, we concluded that the best reduction of DPPH
radicals and the iron(II) chelation exhibit barbiturates, which have more hydroxyl groups
in its structure.
Keywords: Barbiturates, glutarimidedioxime, antioxidants, iron(II) chelation.
Mateja Matjaž Magistrska naloga
V
KAZALO SLIK
Slika 1: Prikaz elektronske konfiguracije železa. ................................................................. 8
Slika 2: 5,5-disubstituirana-barbiturna kislina (barbiturat). ............................................. 11
Slika 3: Radikal DPPH (α,α-difenil-β-pikrilhidrazil). ........................................................ 12
Slika 4: Redukcija DPPH• v prisotnosti AO. ...................................................................... 13
Slika 5: Kompleks med ferozinom in železom. .................................................................... 14
Slika 6: Titracija kvercetina z Fe2+
. Desno je titracijska krivulja kompleksa (kvercetin-
Fe2+
) pri valovni dolžini 425 nm (27). ................................................................................. 15
Slika 7: Čitalec mikrotitrskih ploščic Synergy™ H4 Hybrid Reader na katerem smo izvedli
meritve redukcije DPPH• in kelacije železa. ....................................................................... 19
Slika 8: Prikaz vzorcev pred analizo. ................................................................................. 20
Slika 9: Mikrotitrska ploščica z reakcijami redukcije DPPH• v triplikatih. ....................... 25
Slika 10: Razpored nanašanja raztopin vzorcev in reagentov na mikrotitrsko ploščico v
triplikatih pri ugotavljanju zmožnosti kelacije železa. ........................................................ 27
Slika 11: UV-Vis Spektrofotometer CARY 50 CONC, ki smo ga uporabljali za titracijo
vzorcev z železom(II). .......................................................................................................... 28
Slika 12: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije kvercetina (μmol/L).
............................................................................................................................................. 29
Slika 13: Prikaz pomembnih skupin v molekuli kvercetina, ki pripomorejo k njegovi
učinkoviti antioksidativni aktivnosti. ................................................................................... 30
Slika 14: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 1 (μmol/L). 30
Slika 15: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 2 (μmol/L). 31
Slika 16: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 3 (μmol/L). 31
Slika 17: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 4 (μmol/L). 31
Slika 18: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 5 (μmol/L). 32
Slika 19: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 6 (μmol/L). 32
Slika 20: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 7 (μmol/L). 32
Slika 21: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 8 (μmol/L). 33
Slika 22: Prikaz resonančne stabilizacije radikala spojine 6. ............................................ 34
Slika 23: Tavtomerija pri tiobarbituratu 6. Nastali tioenol je donor vodika. .................... 36
Slika 24: A: Etilendiamintetraocetna kislina - [EDTA]4-
. B: Kelatni kompleks med EDTA
in Fe2+
. ................................................................................................................................. 37
Slika 25: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije
EDTA (μmol/L). ................................................................................................................... 38
Slika 26: Verjetna vezavna mesta med molekulo kvercetina in Fe2+
. ................................. 38
Slika 27: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije
kvercetina (μmol/L). ............................................................................................................ 39
Slika 28: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije
spojine 1 (μmol/L). ............................................................................................................... 39
Slika 29: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije
spojine 2 (μmol/L). ............................................................................................................... 40
Mateja Matjaž Magistrska naloga
VI
Slika 30: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije
spojine 3 (μmol/L). .............................................................................................................. 40
Slika 31: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije
spojine 4 (μmol/L). .............................................................................................................. 40
Slika 32: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije
spojine 5 (μmol/L). .............................................................................................................. 41
Slika 33: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije
spojine 6 (μmol/L). .............................................................................................................. 41
Slika 34: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije
spojine 7 (μmol/L). .............................................................................................................. 41
Slika 35: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije
spojine 8 (μmol/L). .............................................................................................................. 42
Slika 36: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 10 μmol/L kvercetina v prisotnosti 0,
2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 in 50 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance kompleksa
Kvercetin-Fe2+
pri 425 nm od koncentracije Fe2+
. ............................................................. 45
Slika 37: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 1 v prisotnosti 0, 2,5,
5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 40, 50 in 60 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance
kompleksa spojine 1-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 346 nm. ............................................. 46
Slika 38: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 2 v prisotnosti 0, 2,5,
5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30 in 35 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance kompleksa
spojine 2-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 348 nm. .............................................................. 47
Slika 39: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 3 v prisotnosti 0, 2,5,
5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160, 200, 240, 280 in 320
μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance kompleksa spojine 3-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri
285 nm. ................................................................................................................................ 48
Slika 40: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 4 v prisotnosti 0, 2,5,
5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 160, 200, 280 in 320 μmol/L Fe2+
.
B) Odvisnost absorbance kompleksa spojine 4-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 315 nm. ... 49
Slika 41: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 5 v prisotnosti 0, 5,
10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 in 70 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance kompleksa
spojine 5-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 345 nm. .............................................................. 49
Slika 42: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 10 μmol/L spojine 6 v prisotnosti 0, 2,5,
5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120 in 140 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost
absorbance kompleksa spojine 6-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 350 nm. ........................ 50
Mateja Matjaž Magistrska naloga
VII
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Predstavniki reaktivnih zvrsti. ...................................................................... 2
Preglednica II: Predstavitev strukturnih lastnosti spojin in njihovih molekulskih mas. .... 20
Preglednica III: Opis kemijskih struktur in molekulskih mas standardov. ........................ 22
Preglednica IV: Pripravljene koncentracije raztopin testiranih spojin za določanje
njihove sposobnosti redukcije DPPH•. ................................................................................ 23
Preglednica V: Pripravljene koncentracije testiranih spojin za določanje njihovih
zmožnosti kelacije železa. .................................................................................................... 24
Preglednica VI: Sestavine reagentov in vzorcev nanešenih na mikrotitrsko ploščico. ...... 25
Preglednica VII: Priprava reakcijskih raztopin za določanje kelacije železa(II). ............ 27
Preglednica VIII: Vrednosti EC50 antioksidativne sposobnosti redukcije DPPH•. ........... 33
Preglednica IX: Vrednosti EC50, ki predstavljajo zmožnosti preiskovanih spojin za
kelacijo železa. ..................................................................................................................... 44
Mateja Matjaž Magistrska naloga
VIII
SEZNAM OKRAJŠAV
OKRAJŠAVA RAZLAGA OKRAJŠAVE
AMPA α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazol propionska kislina
AO antioksidant
ATP adenozin trifosfat
DNA deoksiribonukleinska kislina
DPPH• 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil radikal
EC50 50 % efektivna koncentracija
EDTA etilendiamintetraocetna kislina
ESI ionizacija z razprševanjem v električnem polju
GABA gama-aminomaslena kislina
GC plinska kromatografija
HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti
R2 koeficient determinacije
RNS reaktivne dušikove zvrsti
ROS reaktivne kisikove zvrsti
RZ reaktivne zvrsti
UV ultravijolična svetloba (200 – 350 nm)
Vis vidna svetloba (350 – 700 nm)
Mateja Matjaž Magistrska naloga
1
1. UVOD
1.1. OKSIDATIVNI STRES
Oksidativni stres povzročajo reaktivne zvrsti (RZ), ki vsakodnevno nastajajo v človeškem
telesu in v okolju. V organizmu imajo dvojno vlogo. Z reaktivnim delovanjem lahko
povzročijo škodo na proteinih, lipidih in nukleinskih kislinah, kar vodi v različna
bolezenska stanja. Oksidativne poškodbe spremljajo številne (pato)fiziološke procese kot
so: kardiovaskularne bolezni, diabetes, ateroskleroza, nevrodegenerativne bolezni
(Alzheimerjeva in Parkinsonova), rak, revmatoidni artritis in staranje. Po drugi strani pa so
RZ lahko izredno pomembne za pravilno delovanje fizioloških funkcij, saj sodelujejo pri
imunski obrambi (fagociti), prenosu signalov, vazodilataciji žilne stene, so intermediati pri
presnovnih procesih in aktivatorji nekaterih encimov.
V organizmu je ves čas vzpostavljeno dinamično ravnotežje med RZ (oksidanti) in
antioksidativno zaščito. Kadar pa se to ravnotežje poruši v korist oksidantov, nastane
oksidativni stres. Povečano delovanje oksidantov je mogoče ob zmanjšanem delovanju
antioksidativnih mehanizmov ali pri povečanem nastajanju RZ v telesu. Zmanjšano
antioksidativno delovanje se lahko pojavi zaradi mutacij in pomanjkanja antioksidativnih
snovi, aminokislin ter drugih esencialnih sestavin, ki jih dobimo s hrano. Povečano
nastajanje RZ pa lahko povzročijo sevanje, onesnaženost okolja, citotoksične kemikalije,
zdravila, vnetje, izpostavljenost zvišanim koncentracijam kisika in prisotnost toksinov (1).
1.2. ANTIOKSIDANTI
Antioksidanti (AO) so snovi, ki se sintetizirajo in vivo ali jih vnesemo v telo s prehrano. So
različnega izvora, struktur, velikosti ter fizikalnih in kemičnih lastnosti. Preprečijo
nastanek radikalov, upočasnijo in ustavijo oksidacije sprožene z radikali, ter preprečijo
delovanje singletnega kisika in sodelovanje ionov prehodnih kovin v prenosu signalov.
Najpomembnejši in najučinkovitejši AO v človeškem telesu so endogenega in encimskega
izvora (superoksidna dismutaza, katalaza), sledijo jim blažilci šoka (albumin, transferin,
Mateja Matjaž Magistrska naloga
2
sečna kislina), esencialne spojine (vitamin C in E, aminokisline, koencim Q10, skvalen) in
ostale spojine naravnega izvora (karotenoidi, flavonoidi, polifenoli).
Antioksidanti reagirajo z radikali tako, da jim ponudijo vodikove atome (nenasičene
maščobe, enoli, fenoli, polifenoli, sečna kislina, dihidrokinoni), dvojne vezi (bilirubin,
polinenasičene maščobne kisline, karoteni) ali pa kompleksirajo ione prehodnih kovin, s
čimer preprečijo prenos elektronov v redoks reakcijah (transferin, albumin, haptoglobin,
metalotionein, ceruloplazmin). Antioksidanti so stalno prisotni v vseh delih celic, tkiv in
telesa, saj je nastanek radikalov nepredvidljiv. Njihova koncentracija v celicah je približno
tri velikostne razrede višja, kot je pričakovana koncentracija primarnih radikalov. Za
učinkovito odstranjevanje RZ, pa se AO med seboj povezujejo v mrežo antioksidantov (1,
2).
1.3. REAKTIVNE ZVRSTI
Preglednica I: Predstavniki reaktivnih zvrsti.
RADIKALI NERADIKALI
O2•-
superoksidni radikal H2O2 vodikov peroksid
•OH hidroksilni radikal HOCl hipoklorna kislina
ROO•
peroksilni radikal 1
O2 singletni kisik
RO•
alkoksilni radikal O3 ozon
HOO•
hidroperoksilni radikal ONOO-
peroksinitrit
NO•
dušikov oksid HNO2 dušikova(III) kislina
NO2•
dušikov dioksid NO-
nitroksilni anion
RS•
tioilni radikal H2S vodikov sulfid
RSO•
sulfinilni radikal RSOH sulfenska kislina
RSO2•
sulfonilni radikal RSO3H sulfonska kislina
RSO2OO• sulfonilperoksilni radikal NO
+ nitrozilni (nitrozonijev) kation
Mateja Matjaž Magistrska naloga
3
Reaktivne zvrsti so lahko kisikove, dušikove, žveplove, ogljikove ali halogenske spojine
ali atomi, delimo jih na radikale in neradikale (Preglednica I). Radikali nenehno nastajajo v
naravi in v živih organizmih. To so lahko atomi, ioni, molekule ali kompleksi, ki imajo v
svoji strukturi vsaj en nesparjen elektron. Označujemo jih s piko in končnico –il. Imajo
paramagnetne lastnosti in so obarvani. Izjema so elementi prehodnih kovin, ki imajo
podobne lastnosti, vendar jih ne uvrščamo med radikale. Nesparjen elektron teži k
vzpostavitvi elektronskega para, kar je vzrok za kemično reaktivnost radikalov. Njihova
življenjska doba je zelo kratka, od nekaj milisekund do nekaj sekund, lahko pa so tudi
stabilni desetletja (nitroksidni radikal). V živih organizmih nastajajo v zelo nizkih
koncentracijah (10-7
- 10-11
mol/L) in so na meji ali izven dosega detekcije z običajnimi
analitskimi metodami. Nastajajo v enoelektronskih redoks redukcijah in oksidacijah ter pri
homolitski cepitvi kovalentne vezi pod vplivom svetlobe, sevanja ali toplote. Glavni vir
radikalov izven organizma so različna sevanja, UV svetloba, ultrazvok, kajenje, kemikalije
in onesnaževanje. Znotraj organizma pa nastajajo v mitohondrijski dihalni verigi, pri
transportu kisika s hemoglobinom, pri oksidativnem izbruhu imunskega sistema ter pri
metabolizmu telesu lastnih spojin in ksenobiotikov.
Radikali lahko nenadzorovano vstopijo v reakcijo s prvo spojino, ki jo srečajo, in sicer po
enem od naslednjih treh načinov (3):
Odtegnitev (abstrakcija) vodikovega atoma /1/:
R1• + R2-H → R1-H + R2
• /1/
Adicija na dvojno vez /2/:
R1• + CH2=CH-R2 → R1-CH2-
•CH-R2 /2/
Reakcija z drugim radikalom /3/:
R1• + R2
• → R1-R2 /3/
Radikalske reakcije so hitre, razvejane, stalno prisotne in nanje ne vplivajo okoliški pogoji.
So velikokrat verižne reakcije, v katerih nastajajo novi, stabilnejši radikali (1, 4).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
4
1.4. HIDROKSILNI RADIKAL
Hidroksilni radikal (•OH) sodi med reaktivne kisikove zvrsti (ROS). Njegov nastanek je
zelo nevaren dogodek, saj reagira zelo hitro, s hitrostno konstanto 108 - 10
11 Lmol
-1s
-1 in
neselektivno s prvo organsko spojino, ki jo sreča. Vstopa v reakcije z adicijo na dvojno
vez, z abstrakcijo vodika ali z drugim radikalom. Z lahkoto sproži lipidno peroksidacijo,
poškoduje nukleinske kisline, proteine in dela škodo, kjerkoli se v organizmu pojavi.
Človeško telo nima ustreznega mehanizma za odstranjevanje že nastalih •OH. Najbolj
znana reakcija, v kateri nastaja •OH, je Fentonova reakcija. V naravi in organizmih nastaja
v večstopenjskih reakcijah, ki jih najpogosteje katalizirajo železovi in bakrovi kovinski
ioni. Hidroksilni radikal lahko nastane tudi pri homolitski cepitvi kovalentne vezi v
vodikovem peroksidu pod vplivom UV svetlobe /4/, pri radiolizi vode z rentgenskim ali
gama žarčenjem, iz ozona, peroksinitrita in v reakciji hipoklorne kisline s superoksidnim
radikalom (1, 2).
H-O-O-H + UV → 2 •OH /4/
1.5. HIDROPEROKSILNI RADIKAL
Hidroperoksilni radikal ali perhidroksilni radikal (HOO•) je protonirana oblika
superoksidnega radikala. Reakcija je v ravnotežju pri pKa okoli 4,8 /5/, zato je HOO• v
citozolu celice prisoten le v približno 0,3%. Njegova visoka reaktivnost in stanje brez
naboja mu omogočata enostaven prehod celičnih membran. Hidroperoksilni radikal deluje
kot oksidant v številnih biološko pomembnih reakcijah, kot je abstrakcija vodika iz
tokoferola in polinenasičenih maščobnih kislin. Sodeluje v lipidni peroksidaciji in ima
morebiti tudi vlogo pri staranju (5).
•O2
− + H2O ⇌ HOO
• + OH
- /5/
1.6. FENTONOVA REAKCIJA
Fentonova kemija je osnovni primer radikalske reakcije katalizirane s prehodnimi
kovinami. Zmes vodikovega peroksida in Fe2+
soli lahko oksidira številne organske
molekule, pri tem pa nastane zelo nevarni hidroksilni radikal (1). Henry John Horstman
Fenton je leta 1876 v »Chemical News« prvič omenil oksidacijo vinske kisline z Fe2+
in
Mateja Matjaž Magistrska naloga
5
H2O2 (6). Kasneje so Fe2+
-H2O2 poimenovali Fentonov reagent, reakcijo pa Fentonova
reakcija.
V Fentonovi reakciji se Fe2+
z vodikovim peroksidom oksidira do Fe3+
, pri čemer nastane
•OH in hidroksidni anion (OH
-) /6/ (1).
Fe2+
+ H2O2 → Fe3+
+ HO• + OH
– /6/
Poleg železa, lahko pri nastanku •OH sodelujejo tudi bakrovi ioni /7/. Ti se lahko dobro
vežejo na različne biološke molekule in so poleg železovih ionov tudi pomemben vir •OH
in vivo (1).
Cu+ + H2O2 → Cu
2+ + HO
• + OH
– /7/
Fe3+
se nato z drugo molekulo vodikovega peroksida reducira (regenerira) nazaj do Fe2+
.
Pri tem nastaneta še hidroperoksilni radikal (HOO•) in proton /8/.
Fe3+
+ H2O2 → Fe2+
+ HOO• + H
+ /8/
Vsota reakcij /6/ in /8/ je disproporcionacija vodikovega peroksida, v kateri nastaneta dva
različna kisikova radikala (•OH in HOO
•) in voda (H
+ + OH
–) (1). Radikala
•OH in HOO
•
hitro in neselektivno reagirata v sekundarnih reakcijah z organskimi spojinami (7, 8). Če v
eksperimentalnih pogojih ob nastanku •OH ni prisotne nobene druge snovi, ta reagira z
vodikovim peroksidom /9/ ali oksidira Fe2+
/10/.
HO• + H2O2 → H2O + H
+ + O2
•- /9/
HO• + Fe
2+ → Fe
3+ + OH
- /10/
Zaradi tega lahko visoke koncentracije Fe2+
in H2O2 znižajo koncentracijo •OH. Skupna
reakcija je /11/:
2 H2O2 → Fe2+
(sol/katalizator) → O2 + 2 H2O /11/
Nastanek drugih reaktivnih zvrsti v Fentonovi reakciji ni znan. Hitrostna konstanta reakcije
Fe2+
s H2O2 je manjša od 102 M
-1s
-1. Če pa je Fe
2+ vezano na določene ligande, kot so ATP,
citrat, oksalat, pirofosfat ali EDTA, je hitrostna konstanta večja. Ligandi lahko preprečijo
oksidacijo Fe2+
, precipitacijo in lovijo •OH. Tako je npr. kelat železo-EDTA zelo dober
Mateja Matjaž Magistrska naloga
6
Fentonov reagent. Na splošno so lahko železovi kelatorji zaviralci ali spodbujevalci
Fentonove reakcije. Spremenijo lahko redukcijski potencial železa, in sicer tako, da
spodbujajo ali zavirajo oksidacijo s H2O2. Sterično preprečijo dostop H2O2 do železa in
spodbujajo oksidacijo Fe2+
v Fe3+
, ki je manj reaktivno v reakciji s H2O2. Lahko pa tudi
prestrežejo in lovijo hidroksilne radikale, ter tako vzdržujejo višjo koncentracijo železovih
ionov v raztopini (1).
1.7. HABER-WEISSOVA REAKCIJA
Frizt Haber in Joseph Joshua Weiss sta leta 1932 opisala mehanizem nastanka •OH iz
vodikovega peroksida in O2•-, kar danes imenujemo Haber-Weissova reakcija. Reakcija
nastanka •OH je počasna, ciklična in katalizirana z železom (9).
1. stopnja: Redukcija Fe3+
do Fe2+
/12/:
Fe3+
+ •O2
− → Fe
2+ + O2 /12/
2. stopnja: Fentonova reakcija /13/:
Fe2+
+ H2O2 → Fe3+
+ OH− +
•OH /13/
Neto reakcija je Haber-Weissova reakcija /14/:
•O2
- + H2O2 →
•OH + OH
- + O2 /14/
Sprva so predvidevali, da •OH po Haber-Weissovem mehanizmu nastaja v celicah in v
telesu povzroča oksidativni stres. Kasneje pa se je izkazalo, da ni tako. V živih organizmih
nastajajo •OH v večstopenjskih reakcijah, ki jih katalizirajo kovinski ioni (železovi,
bakrovi). Z železovimi ali bakrovimi ioni katalizirane reakcije H2O2 imenujemo Fentonove
reakcije (10).
1.8. ŽELEZO
Večino ionov prehodnih kovin (železovih, bakrovih, manganovih in kromovih) uvrščamo
med RZ. V svoji strukturi imajo nesparjene elektrone, zato lahko sodelujejo v
enoelektronskih redoks redukcijah in oksidacijah. Ker težijo k pritegnitvi ali oddaji
elektrona in vzpostavitvi elektronskega para, so kemično reaktivne spojine. Elektroni brez
para (tripletno stanje) dajejo prehodnim kovinam paramagnetne lastnosti (1). Železo se v
Mateja Matjaž Magistrska naloga
7
naravi nahaja predvsem v stabilnih oksidacijskih oblikah Fe3+
(feri) in Fe2+
(fero), v
sulfidih, oksidih in hidroksidih. Najverjetneje so sprva na zemlji prevladovale Fe2+
spojine,
ki so v vodi dobro topne. Ko pa je na planetu pričela koncentracija kisika naraščati, so se
oksidirale do manj topnih Fe3+
spojin in se izoborile iz vode (11). V biološkem sistemu
imajo kovinski ioni funkcionalno in strukturno vlogo. Kot biološki katalizatorji sodelujejo
v prenosu elektronov ter pri aktivaciji in transportu manjših molekul, kot je kisik (7). V
človeškem telesu, celicah, plazmi in ostalih zunajceličnih tekočinah je železo prisotno v
zelo nizkih koncentracijah, kar je zelo natančno uravnavano z vezavo na proteine
(transport in shranjevanje). Prosto železo lahko v organizmu povzroči veliko škode, saj
katalizira neželene radikalske reakcije kot so avtooksidacije in nastanek radikalov po
mehanizmu Fentonove reakcije (•OH) (1, 12).
Železo v Fe2+
in Fe3+
obliki je zelo pomembna in esencialna sestavina različnih beljakovin
(hemoglobin, encimi dihalne verige, citokromi, katalaza, mieloperoksidaza v nevtrofilcih),
ki sodelujejo pri prenosu kisika in v metabolizmu. Železo je udeleženo tudi v izgradnji
DNA, v procesu biotransformacije ksenobiotikov in v številnih encimih, ki katalizirajo
redoks reakcije (1, 11). Pomanjkanje železa v človeškem telesu lahko povzroči
sideropenično in hipokromno anemijo, njihovo kopičenje pa zastrupitev, sideroblastno
anemijo in dedno hemokromatozo (13). Za zdravljenje zastrupitev z železom uporabljamo
desferoksamin, ki lahko kelira elementarno železo ter Fe3+
ione na transferinu in feritinu,
deferasiroks in deferipron. Pravzaprav lahko preveč ali premalo železa v telesu povzroči
oksidativni stres s prekomerno proizvodnjo reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Te lahko
oksidirajo različne biomolekule v telesu in povzročijo nastanek številnih bolezni ter
staranje. Zaradi tega imamo v celicah prisotne encime, ki odstranjujejo ROS ter zmanjšajo
njihovo koncentracijo, še preden lahko pridejo v stik s prehodnimi kovinskimi ioni. Slednje
namreč lahko povzroči nastanek veliko bolj nevarnih kemičnih zvrsti, kot je •OH. O2
•-
odstranjujejo superoksid dismutaza, H2O2 pa katalaza in glutationska peroksidaza. Že
nastali oksidativni stres tudi lahko povzroči uhajanje železa iz sistema. Fentonova in
Fentonovi podobne reakcije so najverjetneje prvi kemični načini nastanka ROS v naravi.
Zato ima Fentonova kemija odločilno vlogo v fizioloških in patoloških procesih v živih
organizmih (1, 7, 14).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
8
1.8.1. OKSIDACIJSKE OBLIKE ŽELEZA
Pri elementih prehodnih kovin se z elektroni polnijo s- in d-orbitale. Pri oksidaciji oddajo
kovinski atomi najprej elektrone iz s- in nato še iz d-orbitale, pri tem pa postanejo kovinski
kationi (Slika 1). Delna zasedenost d-orbital daje kationom prehodnih kovin številne
tipične lastnosti: več stabilnih oksidacijskih stanj, obarvanost, magnetne lastnosti in
katalitične lastnosti pri enoelektronskih redoks reakcijah (11).
Slika 1: Prikaz elektronske konfiguracije železa.
Sol Fe2+
je šibko redukcijsko sredstvo in se v raztopini ob prisotnosti kisika počasi oksidira
do Fe3+
. Fe2+
tako zapade eno-elektronski oksidaciji (odda e- kisiku), kisik iz zraka pa se
pri tem reducira (sprejme e-) do O2
•- /15/ (1).
Fe2+
+ O2 ⇌ Fe3+
+ O2•- /15/
V naravi pa obstajajo tudi železove (IV), (V) in (VI) zvrsti, ki so manj pogoste in navadno
nastopajo kot kratkoživi intermediati v biokemičnih reakcijah. Feril ali železov(IV) ion
sodeluje pri delovanju katalaz, peroksidaz in citokroma P450. Reaktivne so tudi
železove(V) zvrsti, ki lahko oksidirajo aminokisline. Železove(VI) zvrsti (K2FeO4), pa so
močna oksidativna sredstva (1).
1.9. BARBITURATI
Pred odkritjem barbituratov so tekom 19. stoletju v medicini uporabljali različne
pomirjevalne, hipnotične in antikonvulzivne spojine. Drugo polovico 19. stoletja so
imenovali kar »alkaloidna era«. V psihiatriji so tako uporabljali kloralhidrat, morfij, opij,
alkaloide iz družine Solanaceae, hiosciamin, hioscin, atropin, paraldehid, sulfonal, cinkov
oksid, bromid, indijsko konopljo in druge spojine. Te spojine so bile zdravju škodljive in
Mateja Matjaž Magistrska naloga
9
strupene, saj so povzročale številne neželene učinke, npr. razdražljivost, halucinacije,
delirij, letargijo ter nevrološke in gastrointestinalne bolezni. Z odkritjem dietil-barbiturne
kisline pa se je začelo obdobje velikega napredka farmakološkega zdravljenja psihiatričnih
in nevroloških bolezni. Barbiturati so bili uporabni tudi za zdravljenje nespečnosti in
epileptičnih napadov, ter začetniki na področju intravenske anestezije (15, 16).
1.9.1. RAZVOJ IN UPORABA BARBITURATOV
Začetek razvoja barbituratov in njihovih derivatov sega v leto 1864, ko je nemški kemik
Adolf von Baeyer iz propandiojske kisline (malonska kislina) in sečnine (urea) sintetiziral
barbiturno kislino (malonil urea). Sintezni proces barbiturne kisline pa je leta 1879 razvil
in izpopolnil francoski kemik Edouard Grimaux in omogočil nadaljnji razvoj njenih
derivatov. Leta 1881 sta Conrad in Guthzeit sintetizirala dietil-barbiturno kislino,
imenovano tudi barbital, malonal ali gardenal. Josef Freiherr von Mering in Hermann Emil
Fischer sta leta 1903 proučila lastnosti ter hipnotične učinke dietil-acetiluree in 5,5-dietil-
barbiturne kisline in ugotovila, da ima slednja zelo močan hipnotični učinek. Tako je 5,5-
dietil-barbiturna kislina pod imenom Veronal® postala prvo zdravilo iz skupine
barbituratov. Veronal® je imel hipnotične, pomirjevalne in antikonvulzivne učinke.
Uporabljali so ga kot pomirjevalno in uspavalno sredstvo. Kasneje so sintetizirali in
testirali okoli 18 barbituratnih analogov, med njimi tudi hipnotik fenobarbital s
podaljšanim farmakološkim učinkom. Ta je pod imenom Luminal® postal zelo pogosto
uporabljano zdravilo v bolnišnicah in pri ambulantni oskrbi bolnikov. Znani barbiturati so
tudi butobarbital (Neonal®), amobarbital (Amytal
®), sekobarbital (Seconal
®), pentobarbital
(Nembutal®
), tiopental (Pentothal®) in pentobarbital za intravensko anestezijo (15, 16).
Do danes so sintetizirali že več kot 2.500 različnih barbituratov in njihovih derivatov. Od
tega so jih okoli 50 vpeljali v klinično uporabo. Barbiturati in njihovi derivati povzročajo
odvisnost, kar so ljudje pričeli izkoriščati. Leta 1962 je bilo v Ameriki 250.000 odvisnikov
od barbituratov. Prevelik odmerek pa lahko povzroči tudi smrt, zaradi česar so barbiturate
in njihove derivate zlorabljali za samomore. Poleg tega imajo tudi številne neželene
stranske učinke in ozko terapevtsko okno, zaradi česar so jih zamenjale novejše učinkovine
iz drugih skupin zdravil, kot so npr. benzodiazepini (15, 16).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
10
Danes je terapevtska uporaba barbituratov omejena. V Sloveniji se uporabljajo le še v
anesteziji ter pri preprečevanju epilepsij. Barbiturna kislina in njeni derivati izkazujejo
različne biološke učinke: antibakterijske, antisklerotične, hipotenzivne, spazmolitične,
antiepileptične, hipnotične in sedativne. Delujejo lahko tudi kot lokalni anestetiki, proti
vnetjem, raku in inhibirajo metaloproteinaze. Pogosto jih uporabljajo tudi v sintezi
bioaktivnih molekul in v drugih bioloških reakcijah (15, 16).
1.9.2. MEHANIZEM DELOVANJA BARBITURATOV
Barbiturati pomirjujoče delujejo na centralni živčni sistem tako, da se vežejo na receptor
GABAA in ob vezavi endogenega liganda gama-aminomaslene kisline (GABA) povečajo
pretok kloridnih anionov. Vežejo se na drugo vezavno mesto kot benzodiazepini in
zmanjšajo vzdraženost celične membrane živčnih celic. Vežejo se lahko tudi na glutamatni
receptor AMPA ter ovirajo vezavo molekule živčnega prenašalca glutamata, nastanek
akcijskega potenciala v postsinaptični membrani in kemični prenos signala med živčnimi
celicami (16).
1.9.3. BARBITURATI IN TIOBARBITURATI
5-ariliden- in 5-benzilidenbarbiturati nastanejo v reakciji Knoevenaglove kondenzacije,
med aktivirano metilensko skupino v barbiturni ali tiobarbiturni kislini in aldehidi ali
ketoni. Preučevanje barbituratov in tiobarbituratov je v zadnjih letih privedlo do novih
odkritij njihovih številnih inhibitornih (zaviranje delovanja kolagenaze-3, matričnih
metaloproteinaz, encimov rekombinantnega citokroma P450, tirozinaze in ureaze),
antimikrobnih in antioksidativnih učinkov (17).
Barbiturati (5,5-disubstituirane barbiturne kisline) so šibke kisline in so močno lipofilne
(Slika 2). V kemični reakciji z NaOH se enostavno pretvorijo v natrijeve soli, ki so
vodotopne. Lipofilnost molekule se še poveča z vezavo ogljikovih atomov na mesto R2 in s
prisotnostjo žvepla (tiobarbiturati).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
11
Slika 2: 5,5-disubstituirana-barbiturna kislina (barbiturat).
Lipofilnost spojine zelo vpliva na njeno spodobnost prehajanja cerebrospinalne bariere
(možgansko-krvna bariera). Bolj kot je spojina lipofilna, hitreje in lažje prehaja bariero,
ima pa tudi krajši čas delovanja. Vendar pa mora spojina za uspešno delovanje doseči tudi
želeno topnost v hidrofilnih medijih (16).
1.10. CIKLIČNI IMIDDIOKSIMI
Ciklični imiddioksimi (npr. glutarimiddioksim) so spojine, ki so znane po tvorbi
kompleksov z elementi prehodnih kovin. Glutarimiddioksim tvori z Fe3+
celo zelo močne
1:1 in 2:1 (glutarimiddioksim:Fe3+
) komplekse, kar so potrdili s preučevanjem kristalne
strukture. Na kovinske ione se koordinira tridentatno, preko dveh oksimskih kisikovih
atomov in enega imidnega dušikovega atoma. Glutarimiddioksim nastane v reakciji med
glutaronitrilom in hidroksilaminom pri temperaturi 80-90 °C (18).
1.11. DOLOČANJE ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI
Vse večje zavedanje o pozitivnih lastnostih AO na zdravje organizma in obstojnost hrane
je vodilo v preučevanje antioksidativnih aktivnosti tovrstnih spojin. Za njihovo
preučevanje uporabljamo različne tehnike (19):
o spektroskopske (UV-Vis spektrofotometrija),
o elektrokemične (voltametrija, amperometrija, biosenzorji) in
o kromatografske tehnike (GC, HPLC).
Antioksidativna aktivnost je sposobnost spojin, da zavirajo oksidativne reakcije različnih
biomolekul v organizmu. Določanje njihovih antioksidativnih aktivnosti pa je način
ugotavljanja zaščite pred reaktivnimi zvrstmi. Do sedaj so predlagali in modificirali že več
Mateja Matjaž Magistrska naloga
12
različnih metod določanja, ki običajno temeljijo na neposredni reakciji preučevane spojine
z radikali ali na reakciji s prehodnimi kovinami. V nadaljevanju smo opisali tri UV-Vis
spektrofotometrične principe določanja antioksidativnih aktivnosti spojin (20).
1.11.1 SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA DPPH
1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH•) je stabilni sintezni radikal, ki ima v središču svoje
strukture dušik z nesparjenim elektronom (Slika 3). Stabilnost mu omogoča delokalizacija
prostega elektrona, ki preprečuje dimerizacijo molekule. Je temno vijolično obarvana
spojina, ki ima maksimalno absorpcijo v vidnem delu spektra, pri 517 nm (21).
Antioksidanti, ki lovijo in reducirajo DPPH•, imajo pogosto protivnetno aktivnost in
varujejo pred staranjem in rakom (22).
Slika 3: Radikal DPPH (α,α-difenil-β-pikrilhidrazil).
Metoda z DPPH• je UV-Vis spektrofotometrična tehnika, ki temelji na redukciji DPPH
• z
AO. Prvi jo je leta 1958 opisal Marsden Blois, ki je kot vzorčni AO uporabil aminokislino
cistein. Modifikacijo metode pa je nato leta 1995 izvedel Brand-Williams s sodelavci, kar
je še vedno temelj za nadaljnja raziskovanja antioksidativnega delovanja s tem postopkom
(23).
Antioksidativna spojina donira vodikov atom DPPH• in ga reducira v stabilno diamagnetno
molekulo 1,1-difenil-pikrilhidrazin (Slika 4). Nastanek 1,1-difenil-pikrilhidrazina se kaže z
bledenjem temno vijolične barve in pojavom bledo rumenega obarvanja zaradi pikrilne
skupine, kar zaznamo v obliki upada absorbance pri 517 nm (23).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
13
Slika 4: Redukcija DPPH• v prisotnosti AO.
Rezultate testa z DPPH• navadno podajamo kot vrednost EC50. To je efektivna
koncentracija AO, ki reducira 50% začetne koncentracije DPPH• v določenem času. Nižja
kot je vrednost EC50, bolj učinkovito AO reducira DPPH• pod eksperimentalno enakimi
pogoji (21).
Lastnosti testa
Metoda z DPPH• je hitra in priročna metoda. Za njeno izvedbo ne potrebujemo dragh
reagentov in sofisticirane opreme. Njeno največja prednost je, da lahko pod enakimi pogoji
testiramo hidrofilne in lipofilne antioksidativne spojine. Slaba lastnost te metode pa je, da
pogoji zelo odstopajo od bioloških, saj uporablja DPPH• kot nadomestek za peroksilne
radikale (ROO•) in metanol ali etanol kot topilo. Določanje motijo karotenoidi, ker
absorbirajo svetlobo pri 515 nm in prekrijejo spekter DPPH•. Poleg tega lahko na ta način
določamo le neposredne reakcije z DPPH•, kar pa je odvisno od strukture AO. Zaradi tega
lahko s to metodo ugotovimo antioksidativne lastnosti spojin le na splošno (21).
Reducenti DPPH radikala
Blois je ugotovil, da poleg cisteina DPPH• reducirajo tudi askorbinska kislina, α-tokoferol
(vitamin E), glutation, aromatski amini (p-aminofenol) in polihidroksi aromatske spojine
(hidrokinon) (23). Danes vemo, da so dobri reducenti DPPH• predvsem polifenolne
spojine, ker so donorji vodikovega atoma. Več kot imajo prisotnih hidroksilnih skupin,
boljši reducenti DPPH• so (24).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
14
1.11.2. KELACIJA ŽELEZA(II)
S testom kelacije železa določamo sposobnost tekmovanja AO za Fe2+
z drugim
kelatorjem, kot sta npr. 2,2'-bipiridin ali ferozin. Če kelator reagira z dvovalentnim
železom, se tvori obarvan kelat z ustreznim absorpcijskim maksimumom. 2,2'-Bipiridin
tvori z Fe2+
rdeče (AMax = 522 nm), ferozin pa vijolično obarvan (AMax = 562 nm) kelat
(21).
Ferozin (natrijeva sol 3-(2-piridil)-5,6-difenil-1,2,4-triazin-p´,p´´-disulfonske kisline) je
leta 1970 sintetiziral Lawrence L. Stookey. Želel je ustvariti dobro občutljiv in cenovno
ugoden reagent za določanje železa (Slika 5). Pred sintezo ferozina so za določanje železa
uporabljali druge kelatorje kot so: fenantrolin, 4,7-difenil-1,10-fenantrolin, 2,2'-bipiridin,
2,4,6-tris(2-piridil)-1,3,5-triazin in fenil 2-piridil ketoksim. Njihova uporaba je bila
omejena zaradi zahtevne in dolgotrajne organske sinteze, ki je bila tudi draga. Ferozin je
topen v vodi, zato se lahko uporablja tudi za neposredno določitev železa v njej (25).
Slika 5: Kompleks med ferozinom in železom.
Sposobnost kelacije železa določimo UV-Vis spektrofotometrično, z merjenjem
absorbance vijolično obarvanega kelata med ferozinom in Fe2+
, pri različnih koncentracijah
testirane spojine /16/. Reakcijska raztopina vsebuje testirano spojino, FeCl2 in ferozin. Če
testirana spojina kelira Fe2+
, nastane po dodatku ferozina v reakcijsko raztopino manj
vijoličnega kelata Fe(ferozin)34-
. Ta je stabilen v pH območju med 4 in 9 in ima
maksimalno absorbanco pri 562 nm (26).
3 Ferozin2-
+ Fe2+
⇌ Fe(ferozin)34-
/16/(24)
Mateja Matjaž Magistrska naloga
15
Kako dobro testirana spojina kelira železo, ugotovimo z izračunom odstotka prisotnega
vijoličnega kelata Fe(ferozin)34-
, ter z določitvijo vrednosti EC50. Slednja predstavlja
koncentracijo testirane spojine, ki kelira 50% Fe2+
ionov. Kot pozitivno kontrolo v testu
navadno uporabljamo EDTA. Metoda antioksidativne sposobnosti kelacije Fe2+
je hitra in
enostavna, zato jo lahko uporabljamo za testiranje večjega števila vzorcev (21).
1.11.3. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z
ŽELEZOM(II)
Z UV-Vis spektrofotometrično titracijo lahko preučujemo sposobnost spojin za tvorbo
kompleksov z Fe2+
ali katerim drugim kovinskim kationom (Cu2+
, Fe3+
, Mg2+
, Al3+
, Co2+
,
Ni2+
). V reakcijsko raztopino preučevane spojne postopoma dodajamo raztopino Fe2+
in
merimo absorpcijski spekter. Kinetiko nastanka kompleksa med spojino in Fe2+
spremljamo preko sprememb v UV-Vis absorpcijskem spektru. Ko v reakcijsko raztopino
testirane spojine, ki kelira železo, prvič dodamo Fe2+
ione, se v absorpcijskem spektru
lahko pojavi nov vrh pri določeni valovni dolžini. Novonastali vrh simbolizira
stehiometrični nastanek kelata med preučevano spojino in Fe2+
. Z nadaljnjim dodajanjem
Fe2+
ionov se vrh viša, vse dokler ne doseže ekvivalentne točke, kar kaže na konec titracije.
Nato ob upoštevanju valovne dolžine, kjer se nahaja novonastali vrh, izrišemo titracijsko
krivuljo. Preko sprememb v absorbanci titracijske krivulje pa določimo vezavno
stehiometrijo med testirano spojino in Fe2+
. Kot pozitivno kontrolo lahko uporabimo
kvercetin, ki tvori z železom komplekse v razmerju 1:1 in 1:2 (Fe2+
: kvercetin) (Slika 6)
(27, 28).
Slika 6: Titracija kvercetina z Fe2+
. Desno je titracijska krivulja kompleksa (kvercetin-Fe2+
) pri
valovni dolžini 425 nm (27).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
16
2. NAMEN DELA
Vse večje zavedanje o pomembnosti uporabe in delovanja antioksidantov v vsakodnevnem
življenju nas vodi v preučevanje različnih snovi in s tem v odkrivanje njihovih
antioksidativnih lastnosti. Antioksidanti nas namreč varujejo pred škodljivim delovanjem
reaktivnih zvrsti, ki ves čas nastajajo v organizmu in izven njega in povzročajo oksidativni
stres. Med najnevarnejše radikale sodi hidroksilni radikal (•OH), saj človeško telo nima
učinkovitega mehanizma za njegovo odstranjevanje. Omenjeni radikal nastaja v Fentonovi
reakciji, ki jo katalizirajo prehodne kovine, kot je Fe2+
. V človeškem telesu je železo varno
spravljeno v depojih (vezano na proteine), nastale ROS (superoksid in peroksid) pa takoj
odstranjujejo različni encimi, da bi preprečili njihovo medsebojno delovanje in nastanek
•OH.
Namen magistrskega dela je ugotoviti antioksidativne lastnosti izbranih derivatov 5-
benziliden(tio)barbituratov in cikličnih imiddioksimov. Antioksidativne lastnosti nekaterih
5-arilidenbarbituratov so v literaturi že opisali (33). Zato smo se odločili, da bomo preverili
tudi antioksidativne lastnosti naših izbranih spojin. V ta namen bomo uporabili tri različne
metode: sposobnost redukcije radikala DPPH, kelacijo železa in UV-Vis
spektrofotometrično titracijo spojin z železom(II). Zanima nas, kako bodo razlike v
strukturah spojin vplivale na njihovo sposobnost vezave Fe2+
in redukcijo DPPH•. Testirani
benziliden(tio)barbiturati se med seboj razlikujejo glede na prisotnost kisika ali žvepla, ter
glede na položaje in število hidroksilnih skupin na fenilnem obroču (benzilidenski del), ki
so pri nekaterih spojinah zaestrene z metilno skupino. Izbrana ciklična imiddioksima pa se
med seboj razlikujeta po številu ogljikovih atomov v svoji strukturi.
Vzorce bomo predhodno raztopili v ustreznem topilu. Za standarda bomo uporabili
kvercetin in EDTA, ki bosta predstavljala primerjalno (referenčno) meritev. Po izvedenih
meritvah bomo za vsak vzorec in standard izrisali ustrezne grafe in antioksidativne
lastnosti spojin vrednotili s pomočjo izračunanih vrednosti EC50. Tako bomo skušali
ugotoviti, katere strukturne lastnosti vplivajo na boljše antioksidativne sposobnosti
preiskovanih spojin. Znano je, da radikali reagirajo z antioksidanti tako, da jim odtegnejo
vodikove atome iz fenolnih –OH skupin (30). Žveplo pa ima antioksidativne in
antimikrobne lastnosti. V biokemiji celice so zelo pomembne tudi tiolne skupine, ki so
prav tako donorji vodikovih atomov. Zato izhajamo iz hipoteze, da bodo spojine, ki imajo
Mateja Matjaž Magistrska naloga
17
več hidroksilnih skupin in možne tavtomere z –SH skupinami v svojih strukturah,
izkazovale boljše antioksidativne lastnosti.
3. MATERIALI IN METODE
3.1.1. TOPILA IN REAGENTI
1. MiliQ® prečiščena voda
2. Metanol, absolutni, ≥ 99,8 %, Merck, Nemčija
3. Etanol, absolutni, brezvodni, p.a., Carlo Erba, Italija
4. 1 mol/L raztopina NaOH (M(NaOH) = 39,997 g/mol, trdno agregatno stanje,
Merck, Nemčija)
V 1.000 mL merilno bučko smo natehtali 40 g NaOH, ga raztopili v vodi, dopolnili
z vodo do oznake in premešali.
5. 50 mmol/L NaOH
v 50 mL merilno bučko smo napipetirali 2,5 mL 1 mol/L NaOH, dopolnili z vodo
do oznake volumna in premešali.
6. 500 mmol/L kalij-acetatni pufer, pH 5,5
Za pripravo 500 mmol/L kalij-acetatnega pufra s pH 5,5, smo uporabili trden
kalijev acetat (CH3COOK, Merck, Nemčija), ocetno kislino (CH3COOH, Merck,
Nemčija) in prečiščeno vodo. Pripravili smo 100 mL pufra.
7. 120 mmol/L kalij-fosfatni pufer, pH 7,4
Za pripravo 120 mmol/L kalij-fosfatnega pufra s pH 7,4, smo uporabili kalijev
hidrogen fosfat (K2HPO4, Merck, Nemčija), kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4,
Merck, Nemčija) in prečiščeno vodo. Pripravili smo 100 mL pufra.
8. Topilo za raztapljanje vzorcev: 50 mmol/L NaOH : brezvodni metanol = 1 : 4
(v/v) = 20 mL : 80 mL.
9. 125 μmol/L raztopina DPPH• (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil, M = 394,32 g/mol,
Merck, Nemčija)
V 20 mL merilno bučko smo natehtali 5,92 mg trdnega DPPH•, ga raztopili v
etanolu in dopolnili z etanolom do oznake. Dobili smo 750 μmol/L raztopino
DPPH•. V penicilinko smo odpipetirali 1,5 mL 750 μmol/L raztopine DPPH
• in ji
dodali 7,5 mL brezvodnega etanola. Tako smo pripravili 125 μmol/L delovno
Mateja Matjaž Magistrska naloga
18
raztopino DPPH•, ki smo jo zaščitili pred svetlobo. Končna koncentracija DPPH
• v
reakcijski raztopini vzorca je bila 62,5 μmol/L.
10. 1 mmol/L raztopina ferozina (3-(2-piridil)-5,6-difenil-1,2,4-triazin-4´,4´´-
natrijeva sol disulfonske kisline, trdno agregatno stanje, M = 492,46 g/mol, Sigma-
Aldrich, ZDA)
V 20 mL merilno bučko smo natehtali 49,24 mg ferozina, ga raztopili v 500
mmol/L kalij-acetatnem pufru s pH 5,5 in dopolnili s 500 mmol/L kalij-acetatnim
pufrom s pH 5,5 do oznake volumna. Pripravili smo 5 mmol/L raztopino ferozina.
Nato smo v penicilinko odpipetirali 1 mL 5 mmol/L raztopine ferozina in ji dodali
4 mL 500 mmol/L kalij-acetatnega pufra s pH 5,5. Dobili smo 1 mmol/L raztopino
ferozina. Končna koncentracija ferozina v vzorcu za meritev je bila 333 μmol/L.
11. 250 μmol/L raztopina FeCl2 (M(FeCl2∙4H2O) = 198,81 g/mol, trdno agregatno
stanje, Sigma-Aldrich, ZDA)
V 20 mL merilno bučko smo natehtali 23,84 mg FeCl2∙4H2O, ga raztopili v vodi in
z vodo dopolnili do oznake volumna. Pripravili smo 6 mmol/L raztopino FeCl2.
Nato smo v penicilinko odpipetirali 200 μL 6 mmol/L raztopine FeCl2, ter ji dodali
4,6 mL vode. Dobili smo 250 μmol/L delovno raztopino FeCl2 (redčili smo 1 : 24).
Končna koncentracija FeCl2 v vzorcu za meritev je bila 41,67 μmol/L.
12. 1 mmol/L raztopina FeCl2 (M(FeCl2∙4H2O) = 198,81 g/mol, trdno agregatno
stanje, Sigma-Aldrich, ZDA)
V 20 mL merilno bučko smo natehtali 19,88 mg FeCl2∙4H2O, ga raztopili v vodi in
z vodo dopolnili do oznake volumna. Pripravili smo 5 mmol/L raztopino FeCl2.
Nato smo v penicilinko odpipetirali 250 μL 5 mmol/L raztopine FeCl2 in ji dodali 1
mL vode. Pripravili smo 1 mmol/L raztopino FeCl2 (redčili smo 1 : 5).
3.1.2. POTROŠNI MATERIAL
Kiveta iz kvarčnega stekla, 2,5 mL
Stojala za epruvete in kivete
Plastične epruvete
20 mL merilne bučke
Čaše
Infuzijske stekleničke 100 mL
Mateja Matjaž Magistrska naloga
19
Penicilinke
Plastični zamaški za penicilinke in epruvete
Erlenmajerice,
TPP® mikrotitrske ploščice, 96 vdolbinic (Techno Plastic Products AG, Švica)
Kovinska žlička
Plastična žlička
Aluminijasta folija
3.1.3. OPREMA
Čitalec mikrotitrskih ploščic Synergy™ H4 Hybrid Reader (BioTek Instruments,
Združene države Amerike) (Slika 7)
UV-Vis Spektrofotometer CARY 50 CONC (Varian Inc., Agilent Technologies,
Združene države Amerike)
Analitska tehtnica AE-240S (Mettler Toledo, Združene države Amerike )
pH meter MP 220, Mettler-Toledo (Združene države Amerike)
Inkubator VorTemp 56, Labnet International (Združene države Amerike)
Avtomatske pipete Transferpette 5 mL in 1000 μL (Brand GMBH, Nemčija)
Ultrazvočna kadička Sonis 4 (Iskra Pio, Slovenija)
Programska oprema: statistični program Microsoft Office Excel 2010
Slika 7: Čitalec mikrotitrskih ploščic Synergy™ H4 Hybrid Reader na katerem smo izvedli meritve redukcije
DPPH• in kelacije železa.
Mateja Matjaž Magistrska naloga
20
3.4. PRIPRAVA VZORCEV IN STANDARDOV
3.4.1. OPIS VZORCEV
Vzorci od 1 do 6 so derivati barbiturne kisline (5-benzilidenbarbiturati in 5-
benzilidentiobarbiturati). Sintetizirali so jih na Katedri za farmacevtsko kemijo, Fakultete
za farmacijo, v okviru diplomske naloge Lee Seljak, pod mentorstvom doc. dr. Naceta
Zidarja. Vzorec 7 je glutarimiddioksim (ciklični imidni dioksimski derivat), vzorec 8 pa
derivat sukcinimida (sukcinimiddioksim). Spojini 7 in 8 je sintetiziral doc. dr. Žiga Jakopin
na Katedri za farmacevtsko kemijo, Fakultete za farmacijo (Slika 8). Molekulske strukture
testiranih spojin so prikazane v Preglednici II.
Preglednica II: Predstavitev strukturnih lastnosti spojin in njihovih molekulskih mas.
Št. Oznaka Struktura in IUPAC ime Bruto
formula
M
(g/mol)
1. 1
5-(3,4-dihidroksibenziliden)pirimidin-
2,4,6(1H,3H,5H)-trion
C11H8N2O5 248,19
2. 2
5-(4-hidroksi-3-
metoksibenziliden)pirimidin-
2,4,6(1H,3H,5H)-trion
C12H10N2O5 262,22
Slika 8: Prikaz vzorcev pred analizo.
Mateja Matjaž Magistrska naloga
21
3. 3
5-(4-butoksibenziliden)pirimidin-
2,4,6(1H,3H,5H)-trion
C15H16N2O4 288,30
4. 4
5-(3-hidroksi-4-
metoksibenziliden)pirimidin-
2,4,6(1H,3H,5H)-trion
C12H10N2O5 262,22
5. 5
5-(3,4-dihidroksibenziliden)-2-
tioksodihidropirimidin-4,6(1H,5H)-dion
C11H8N2O4S 264,26
6. 6
5-(4-hidroksi-3-metoksibenziliden)-2-
tioksodihidropirimidin-4,6(1H,5H)-dion
C12H10N2O4S 278,28
7. 7
2,6-bis(hidroksiimino)piperidin
C5H9N3O2 143,14
8. 8
2,5-bis(hidroksiimino)pirolidin
C4H7N3O2 129,12
Mateja Matjaž Magistrska naloga
22
3.4.2. OPIS STANDARDOV
Preglednica III: Opis kemijskih struktur in molekulskih mas standardov.
Št. Oznaka Struktura Bruto formula M
(g/mol)
1. Kvercetin
2-(3,4-dihidroksifenil)-3,5,7-
trihidroksi-4H-1-benzopiran-4-on-
,3,3',4',5,6-pentahidroksiflavone
C15H10O7 302,24
2. EDTA
Etilendiamintetraocetna
kislina dinatrijeva sol
C10H14N2Na2O8·2H2O 372,24
3.4.3. SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA DPPH
3.4.3.1. PRIPRAVA RAZTOPIN VZORCEV
Za meritve smo pripravili po 5 mL 1 mmol/L raztopin spojin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 in 8. Za vsak
vzorec smo s pomočjo enačbe 𝑚 = 𝑐 ∙ 𝑉 ∙ 𝑀 izračunali ustrezno maso, ki smo jo natehtali
v penicilinko. K vsaki natehti smo nato dodali po 2,5 mL topila za raztapljanje, vzorce
sonicirali v ultrazvočni kopeli, dokler se niso v celoti raztopili, in jim nato dodali po 2,5
mL etanola ter jih dobro premešali. Raztopine vzorcev smo nato z etanolom redčili do
ustreznih koncentracij, ki smo jih merili (Preglednica IV).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
23
Preglednica IV: Pripravljene koncentracije raztopin testiranih spojin za določanje njihove sposobnosti
redukcije DPPH•.
Vzorci in
standard
Raztopine
vzorca
(μmol/L)
Končna koncentracija
vzorca v reakcijski
raztopini (μmol/L)
Koncentracijsko
razmerje
DPPH˙ : vzorec
1.
2, 3, 4, 7, 8 500 250 1 : 4
2. 250 125 1 : 2
3. 125 62,5 1 : 1
4. 62,5 31,3 1 : 0,5
5.
1, 5, 6
31,3 15,65 1 : 0,25
6.
Kver
ceti
n 15,65 7,83 1 : 0,125
7.
7,83 3,91 1 : 0,063
8. 3,91 1,96 1 : 0,031
9. 1,96 0,98 1 : 0,016
10. 0,98 0,49 1 : 0,008
3.4.3.2. PRIPRAVA RAZTOPINE STANDARDA
Za standard smo uporabili 1 mmol/L raztopino kvercetina, ki smo jo pripravili v
brezvodnem etanolu. V infuzijsko stekleničko smo natehtali 1,5 mg kvercetina, mu dodali
2,5 mL metanola in 2,5 mL etanola ter suspenzijo sonicirali v ultrazvočni kopeli tako
dolgo, dokler se ves kvercetin ni raztopil. Nato smo z redčenjem v etanolu pripravili
ustrezne koncentracije standarda, ki smo jih izmerili (Preglednica IV).
3.4.4. ZMOŽNOST KELACIJE ŽELEZA(II)
3.4.4.1. PRIPRAVA RAZTOPIN VZORCEV
Za meritve smo pripravili po 5 mL 1 mmol/L raztopin spojin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 in 8. Za vsak
vzorec smo izračunali ustrezno maso, ki smo jo natehtali v penicilinko. Nato smo k vsaki
natehti dodali po 2,5 mL topila za raztapljanje, suspenzijo sonicirali v ultrazvočni kopeli,
da se je ves vzorec raztopil in nato vsakemu dodali po 2,5 mL 500 mmol/L kalij-acetatnega
pufra s pH 5,5.
S topilom in 500 mmol/L kalij-acetatnim pufrom s pH 5,5 (1 : 1), smo vseh osem raztopin
vzorcev redčili tako, da smo pripravili od 31,3 do 1.000 μmol/L raztopine, ki smo jih
izmerili (Preglednica V).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
24
Preglednica V: Pripravljene koncentracije testiranih spojin za določanje njihovih zmožnosti kelacije železa.
Raztopine vzorcev (μmol/L) Končna koncentracija vzorca v
reakcijski raztopini (μmol/L)
1. 1000 500
2. 667 333,5
3. 500 250
4. 250 125
5. 125 62,5
6. 62,5 31,3
7. 31,3 15,7
3.4.4.2. PRIPRAVA RAZTOPIN STANDARDOV
Za standard smo uporabili 1 mmol/L raztopini kvercetina in EDTA. Raztopino EDTA smo
pripravili na enak način kot raztopine vzorcev, raztopino kvercetina pa v brezvodnem
etanolu. V penicilinko smo natehtali 1,5 mg kvercetina, mu dodali 5 mL brezvodnega
etanola in suspenzijo sonicirali v ultrazvočni kopeli, vse dokler se ves kvercetin ni raztopil.
Razredčine raztopin EDTA smo pripravili po enakem postopku kot raztopine vzorcev.
Ustrezne redčitve kvercetina pa smo pripravili z uporabo 500 mmol/L kalij-acetatnega
pufra s pH 5,5 (Preglednica V).
3.4.5. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z ŽELEZOM(II)
3.4.5.1. PRIPRAVA RAZTOPIN VZORCEV
Za meritve smo pripravili po 5 mL 1 mmol/L raztopin spojin 1, 2, 3, 4, 5 in 6. Za vsak
vzorec smo najprej izračunali ustrezno maso, ki smo jo natehtali v penicilinko. Nato smo
vsakemu vzorcu dodali po 2,5 mL topila za raztapljanje in suspenzijo sonicirali v
ultrazvočni kopeli, da se je ves vzorec raztopil, nato pa dodali še po 2,5 mL brezvodnega
etanola in vse dobro premešali.
Raztopine 1, 2, 3, 4, 5 in 6 s koncentracijo 1 mmol/L smo nato redčili s 120 mmol/L kalij-
fosfatnim pufrom s pH 7,4 in tako pripravili 50 μmol/L koncentracije vzorcev 1, 2, 3, 4, 5
ter 10 μmol/L koncentracijo vzorca 6.
3.4.5.2. PRIPRAVA RAZTOPINE STANDARDA
Za standard smo uporabili kvercetin. V penicilinko smo natehtali 2 mg kvercetina in mu
dodali 1,65 mL MeOH ter 1,65 mL 120 mmol/L kalij-fosfatnega pufra s pH 7,4, suspenzijo
Mateja Matjaž Magistrska naloga
25
pa sonicirali v ultrazvočni kopeli, dokler se ves kvercetin ni raztopil. Pripravili smo 2
mmol/L raztopino, ki smo jo nato razredčili s 120 mmol/L kalij-fosfatnim pufrom s pH 7,4,
do 10 μmol/L koncentracije, ki smo jo uporabili za meritve.
3.5. ANALIZA VZORCEV IN STANDARDOV
3.5.1. POSTOPEK DOLOČANJA SPOSOBNOSTI REDUKCIJE DPPH
RADIKALA
Za meritve vsakega vzorca in standarda smo pripravili vsaj pet različnih koncentracij, kot
smo to že predhodno opisali v tem poglavju. Pripravili smo tudi raztopino reagenta DPPH•
za meritve sposobnosti spojin za njihovo redukcijo. Absorbanco temno vijolično
obarvanega DPPH• smo merili v prisotnosti različnih koncentracij testiranih spojin, in sicer
po 30, 60 in 90 minutni inkubaciji v temi, pri sobni temperaturi, da smo lahko določili
optimalen čas poteka reakcije.
Vzorce, standard in reagente smo v triplikatih nanesli na mikrotitrske ploščice s 96
vdolbinicami (Slika 9 in Preglednica VI).
Slika 9: Mikrotitrska ploščica z reakcijami redukcije DPPH• v triplikatih.
Preglednica VI: Sestavine reagentov in vzorcev nanešenih na mikrotitrsko ploščico.
Reakcijska raztopina Sestavine
Preiskovani vzorec/standard 150 μL vzorca + 150 μL DPPH•
Slepi vzorec (ozadje vzorca) 150 μL vzorca + 150 μL etanola
Slepi vzorec DPPH• 150 μL DPPH
• + 150 μL etanola
Etanol (ozadje DPPH•) 300 μL etanola
Mateja Matjaž Magistrska naloga
26
V reakcijsko raztopino smo dodali 150 μL vzorca/standarda in 150 μL reagenčne raztopine
DPPH•, ter mešanico inkubirali 30 minut v temi pri sobni temperaturi. Nato smo s
spektrofotometričnim čitalcem mikrotitrskih ploščic Synergy™ H4 Hybrid Reader in
programom GEN5 izmerili absorbance pri 517 nm. Postopek smo ponovili še po 60 in 90
minutah od začetka inkubacije. Rezultate smo izrazili v obliki povprečnih vrednosti treh
izmerjenih absorbanc po 90 minutni inkubaciji.
3.5.1.1. IZRAČUN VREDNOSTI EC50
Z uporabo naslednje enačbe smo najprej izračunali odstotek inhibicije DPPH•:
I (%) = (A0 – (A1 – A2))/A0 ∙ 100
A0 je absorbanca slepega vzorca DPPH•, A1 je absorbanca preiskovanega vzorca, A2 pa
absorbanca slepega vzorca. Odstotek inhibicije smo nato podali kot obseg redukcije DPPH•
v % in za vsako testirano spojino s pomočjo programa Microsoft Excel 2010 narisali
ustrezen graf v odvisnosti od uporabljene koncentracije preiskovane spojine. Nato smo
izračunali še standardne napake predvidenih vrednosti y za vsak x v regresijski analizi
(funkcija STEXY). Nazadnje smo izračunali še koncentracijo spojine, ki reducira 50%
začetne koncentracije DPPH• (EC50). Vrednost EC50 smo izračunali z uporabo enačbe za
regresijsko premico in jo podali v obliki EC50 ± standardna napaka.
3.5.2. POSTOPEK DOLOČANJA ZMOŽNOSTI KELACIJE ŽELEZA(II)
Za vsak vzorec in standard smo pripravili po sedem različnih koncentracij, tako kot smo to
že opisali tem poglavju. Pripravili smo tudi oba reagenta in sicer 250 μmol/L raztopino
FeCl2 in 1 mmol/L raztopino ferozina. Reagente in vzorce/standarde smo nato v triplikatih
nanesli na mikrotitrske ploščice s 96 vdolbinicami (Slika 10).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
27
Slika 10: Razpored nanašanja raztopin vzorcev in reagentov na mikrotitrsko ploščico v triplikatih pri
ugotavljanju zmožnosti kelacije železa.
Preglednica VII: Priprava reakcijskih raztopin za določanje kelacije železa(II).
Reakcijska
raztopina Sestavine
Preiskovani vzorec 150 μL vzorca + 50 μL FeCl2 + 100 μL ferozina
Slepi vzorec 150 μL vzorca + 50 μL FeCl2 + 100 μL prečiščene vode
Slepi vzorec reagenta 75 μL topila za raztapljanje vzorcev + 75 μL 500 mmol/L kalij-
acetatnega pufra s pH 5,5 + 50 μL FeCl2 + 100 μL ferozina.
V reakcijsko raztopino smo dodali 150 μL vzorca in 50 μL raztopine FeCl2, ter jo
inkubirali 15 minut na sobni temperaturi, da je potekla reakcija med preiskovano spojino in
Fe2+
(Slika 10). Potem smo dodali 100 μL raztopine ferozina in reakcijsko zmes inkubirali
60 minut na 37 °C v temi, da je potekla reakcija med ferozinom in preostalim prostim Fe2+
(Preglednica VII). Na koncu smo s spektrofotometričnim čitalcem mikrotitrskih ploščic in
programom GEN5 izmerili absorbance pri 562 nm.
3.5.2.1 IZRAČUN VREDNOSTI EC50
Z uporabo naslednje enačbe smo najprej izračunali odstotek inhibicije nastalega kompleksa
Ferozin-Fe2+
:
I (%) = (A0 – (A1 – A2))/A0 ∙ 100
A0 je absorbanca slepega reagenta, A1 absorbanca preiskovanega vzorca in A2 absorbanca
slepega vzorca. Odstotke inhibicije smo nato preračunali v odstotke prisotnega kompleksa
Ferozin-Fe2+
, nato pa s programom Microsoft Excel 2010 za vsako testirano spojino
narisali graf odstotka (%) prisotnega vijoličnega kelata Fe(ferozin)34-
v odvisnosti od
koncentracij preiskovane spojine. Koncentracijo spojine, ki kelira 50% Fe2+
ionov, EC50,
smo izračunali z enačbo za regresijsko premico in jo podali v obliki EC50 ± standardna
Mateja Matjaž Magistrska naloga
28
napaka. V primerih, ko preiskovane spojine niso izkazovale linearne odvisnosti, smo
vrednosti EC50 odčitali neposredno iz grafa.
3.5.3. POSTOPEK DOLOČANJA UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNE
TITRACIJE SPOJIN Z ŽELEZOM(II)
V stekleno kiveto smo odpipetirali 2,5 mL predhodno pripravljene raztopine
vzorca/standarda z ustrezno koncentracijo ter s pomočjo UV-Vis spektrofotometra izmerili
titracijski spekter v območju 200 - 600 nm (Slika 11). Nato smo k vzorcu/standardu dodali
1 mmol/L raztopino FeCl2, mešanico inkubirali 5 minut pri sobni temperaturi in ponovno
izmerili titracijski spekter. Koncentracijo FeCl2 v raztopini vzorca/standarda smo
postopoma zviševali, vse do nasičenja z železom.
Nato smo preučili titracijske spektre vzorcev. Poiskali smo vrhove in izozbestične točke, ki
nakazujejo na vezavo preiskovane spojine z železom in njeno nasičenje. Izozbestična točka
je specifična valovna dolžina, pri kateri se med kemično reakcijo absorbanca vzorca ne
spreminja. Pri ustrezni valovni dolžini, ki smo jo določili glede na titracijski spekter
spojine, smo nato s pomočjo programa Microsoft Excel 2010 narisali graf nasičenja.
Slika 11: UV-Vis Spektrofotometer CARY 50 CONC, ki smo ga uporabljali za titracijo vzorcev z železom(II).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
29
4. REZULTATI IN RAZPRAVA
4.1. ANTIOKSIDATIVNA SPOSOBNOST REDUKCIJE RADIKALA
DPPH
4.1.1. KVERCETIN
Kot pozitivno kontrolo smo uporabili učinkovit antioksidant kvercetin, ki ga uvrščamo
med rastlinske polifenole (flavonole). V večjih koncentracijah je prisoten npr. v čebuli,
brokoliju, čaju, vinu, paradižnikih, jabolkih in borovnicah. Kvercetin dokazano učinkovito
reducira DPPH• (29).
Slika 12: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije kvercetina (μmol/L).
Vrednost EC50 za kvercetin je bila 6,2 ± 0,1 μmol/L (Slika 12). Podobno vrednost so dobili
tudi Locatelli in sodelavci, in sicer EC50 = 6,58 μmol/L (29). Ujemanje vrednosti potrjuje
ustreznost izbrane metode za določanje sposobnosti redukcije DPPH•, zato smo nadaljevali
meritve na vzorcih. Za dobro antioksidativno aktivnost so pomembne številne hidroksilne
skupine, njihovi medsebojni položaji, in prisotnost konjugiranih dvojnih vezi. K
učinkovitemu antioksidativnemu delovanju kvercetina pomembno pripomore dvojna vez
konjugirana s karbonilno skupino (obroč C), kateholna skupina (obroč B) ter hidroksilni
skupini na mestih 3 in 5 (Slika 13) (30). Kvercetin v reakciji z radikalom donira proton in
Mateja Matjaž Magistrska naloga
30
postane radikal. Nastali nesparjeni e- v njegovi molekuli se delokalizira po konjugiranem
delu molekule, kar se kaže v nizki energiji in nereaktivnosti radikala (31).
Slika 13: Prikaz pomembnih skupin v molekuli kvercetina, ki pripomorejo k njegovi učinkoviti antioksidativni
aktivnosti.
4.1.2. VZORCI
Rezultati redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracij preiskovanihih spojin
(μmol/L) so prikazani v obliki grafov (Slike 14-21).
Slika 14: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 1 (μmol/L).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
31
Slika 15: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 2 (μmol/L).
Slika 16: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 3 (μmol/L).
Slika 17: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 4 (μmol/L).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
32
Slika 18: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 5 (μmol/L).
Slika 19: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 6 (μmol/L).
Slika 20: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 7 (μmol/L).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
33
Slika 21: Prikaz redukcije DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 8 (μmol/L).
Preglednica VIII: Vrednosti EC50 antioksidativne sposobnosti redukcije DPPH•.
Spojina R1 R2 X (EC50 ± SD)μmol/L
1 OH OH O 11,5 ± 0,1
2 O-Me OH O 431,4 ± 74,7
3 H O-Bu O /
4 OH O-Me O /
5 OH OH S 9,4 ± 0,5
6 O-Me OH S 10,3 ± 0,2
7 519,5 ± 6,7
8 /
Kvercetin 6,2 ± 0,1
4.1.3. KOMENTAR REZULTATOV REDUKCIJE RADIKALA DPPH
Za fenolne antioksidante je znano, da so dobri donorji vodikovih atomov. Njihovi radikali
pa so zaradi resonančne delokalizacije nesparjenih elektronov okrog aromatskega obroča
razmeroma dobro stabilni. Ob odtegnitvi vodikovega atoma nastane pri spojinah 1, 2, 4, 5
in 6 primarni kisikov radikal. Stabilnost takega radikala pa vpliva na antioksidativno
sposobnost spojine. Zato je zelo pomembno, da se lahko radikal resonančno stabilizira z
delokalizacijo elektrona po fenilnem obroču. Delokalizacija se lahko prenese tudi na
(tio)barbiturni del molekule preko dodatno konjugirane dvojne vezi, kar okrepi stabilnost
Mateja Matjaž Magistrska naloga
34
radikala in izboljša antioksidativne lastnosti spojine (Slika 22). Vzorci 1, 2, 5 in 6 imajo v
fenilnem obroču hidroksilno skupino na para mestu, to pa omogoča delokalizacijo
elektrona po celotnem (tio)barbituratu. Spojina 4 pa vsebuje hidroksilno skupino le na
meta mestu, zato lahko poteče delokalizacija elektrona izključno znotraj fenilnega obroča
(32).
Slika 22: Prikaz resonančne stabilizacije radikala spojine 6.
Spojina 1 je v primerjavi s kvercetinom izkazala zelo dobro sposobnost redukcije DPPH•
(Slika 14). Vzrok za to je v prisotni dodatni hidroksilni skupini na meta mestu
benzenovega obroča, ki močno izboljša antioksidativne lastnosti omenjene spojine, saj se
ob tem znatno zmanjša disociacijska energija vezi H-O v hidroksilni skupini na para mestu.
Učinek antioksidativnega delovanja je močnejši kot pa če bi se dodatna hidroksilna
skupina nahajala na orto položaju (30). Antioksidativne lastnosti nekaterih 5-
arilidenbarbituratov so v literaturi že opisali. Tako so Khalid M. Khan in sodelavci že
testirali spojino 1 (EC50 = 6,2 μmol/L) (33). Vrednost EC50, ki smo jo določili mi, in sicer
EC50 = 11,5 μmol/L je višja, najverjetneje zaradi razlik v uporabljenih reakcijskih pogojih.
V literaturi smo namreč zasledili podatek, da na sposobnost in občutljivost redukcije
DPPH• pomembno vplivajo vrsta in količina topila, vrednost pH, koncentracije reagentov
in vzorcev, reakcijski čas ter prisotnost vode in kovinskih ionov, zaradi česar so lahko
vrednosti EC50 višje ali nižje. Tako imajo npr. metanolne in vodne raztopine spojin večjo
občutljivost in boljšo sposobnost za redukcijo DPPH• kot etanolne (29, 34, 35).
Spojina 2 je izkazala slabšo redukcijo DPPH• (Slika 15). V svoji strukturi ima na
benzenskem obroču eno hidroksilno skupino na para in eno metoksi skupino na meta
Mateja Matjaž Magistrska naloga
35
mestu. Metiliranje ali glikoziliranje hidroksilnih skupin lahko znatno zmanjša oziroma celo
izniči antioksidativno delovanje polifenolnih spojin (30). V tem primeru je prisotna
metoksi skupina zelo verjetno vzrok za zmanjšano antioksidativno aktivnost te spojine v
primerjavi s spojino 1.
Spojina 3 v svoji strukturi nima hidroksilnih skupin, ki bi donirale vodikov atom, zato ne
povzroča redukcije DPPH•, kar smo tudi pričakovali (Slika 16). Spojina 4 vsebuje
hidroksilno skupino na meta mestu, metoksi skupino pa na para mestu. Njuna položaja zelo
vplivata na znatno zmanjšanje antioksidativne aktivnosti (30). Graf prikaza redukcije
DPPH• (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 4 (μmol/L) (Slika 17) kaže, da je spojina
izkazala okoli 11% redukcijo DPPH•, ki se z višanjem koncentracije ni kaj dosti
spreminjala.
Spojini 5 in 6 sta glede na kvercetin izkazali zelo dobro redukcijo DPPH•. Spojini imata
barbituratni obroč zamenjan s tiobarbituratnim. Spojina 5 (EC50 = 9,4 μmol/L), ki se od
spojine 1 (EC50 = 11,5 μmol/L) razlikuje le v atomu žvepla v barbituratnem delu, je med
testiranimi vzorci pokazala najboljše antioksidativno delovanje (Slika 18). Spojina 6
((EC50 = 10,3 μmol/L), ki se od spojine 2 (EC50 = 431,4 μmol/L) prav tako razlikuje le v
atomu žvepla, pa je bila po sposobnosti redukcije DPPH• na drugem mestu (Slika 19).
Žveplo je znano po antioksidativnih in antibakterijskih lastnostih, zaradi česar se kot
antioksidant veliko uporablja predvsem v prehrambni industriji, in sicer v obliki
žveplovega dioksida in sulfitov. Tudi tiolne spojine so zelo pomembne v biokemiji celice.
Nahajajo se v cisteinu oz. v cistein vsebujočih beljakovinah ali manjših molekulah
(glutation). Žveplovi radikali (R-S•) so stabilne spojine, ki večinoma med seboj reagirajo
do še bolj stabilnih disulfidov (R-S-S-R). Tiolne (-SH) skupine imajo zelo pomembno
vlogo pri odstranjevanju ROS in RNS v celičnem metabolizmu. Tiolatne (R-S-) skupine pa
so nukleofili in vstopajo v reakcije z različnimi elektrofili ter reagirajo z ioni težkih kovin.
Tako pomembno pripomorejo k obrambi organizma pred RZ. Spojine s tiolnimi in
tiolatnimi skupinami so dobri donorji vodikovega atoma oziroma elektronov, zato jih
uvrščamo med antioksidante (30). Tako lahko trdimo, da prisotnost žvepla v barbituratnem
delu molekule pripomore k pomembnem zvišanju antioksidativne aktivnosti (Slika 23).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
36
Slika 23: Tavtomerija pri tiobarbituratu 6. Nastali tioenol je donor vodika.
V analizo smo vključili tudi glutarimiddioksim (7) in sukcinimiddioksim (8), in sicer zato
ker sta po volumnu molekule podobna barbiturni kislini in ker nas je zanimalo, kako
sprememba v velikosti molekule (5- ali 6-členski obroč) vpliva na njune antioksidativne
sposobnosti. Obe spojini imata v svoji strukturi dve hidroksilni (oksimski) skupini, ki
lahko služita kot donorja vodika oziroma elektronov. Spojina 7 je v primerjavi s
kvercetinom slabo reducirala DPPH• (Slika 20). Za spojino 8 pa vrednosti EC50 nismo
mogli določiti, saj je pri 13,6 % redukciji DPPH• dosegla nasičenje (Slika 21).
Sukcinimiddioksim sestavlja petčlenski obroč, medtem ko molekula glutarimiddioksima
vsebuje šestčlenski obroč. Najverjetneje petčlenski obroč spojine 8 zmanjša njen
redukcijski potencial in/ali ji daje bolj togo strukturo, ki onemogoča njeno dostopnost v
reakciji z DPPH•, zato je ta spojina neaktivna. Glede na ostale preiskovane spojine sta
vzorca 7 in 8 pokazala najslabše antioksidativne učinke na DPPH•.
4.2. ZMOŽNOST KELACIJE ŽELEZA(II)
Pomemben mehanizem delovanja AO je kompleksiranje ionov prehodnih kovin (železa,
bakra, kroma, kobalta...), ki katalizirajo radikalske reakcije in tako pospešijo številne
oksidacije. Antioksidanti, ki so zmožni kelirati nevezano železo, zmanjšajo in preprečijo
možnost nastanka škodljivega hidroksilnega radikala, proti kateremu nimamo učinkovitega
obrambnega sistema. Kot smo že omenili, med učinkovite AO sodijo tudi polifenolne
spojine, kamor uvrščamo kvercetin (30). Za pozitivni kontroloi smo zato izbrali AO
kvercetin, poleg tega pa tudi kelator EDTA, za katera je znano, da dobro kelirata Fe2+
.
Najpogostejše koordinacijsko število za Fe2+
in Fe3+
je 6 (oktaedrična razporeditev
ligandov). Koordinacijsko število je odvisno predvsem od vrste vezanega liganda (donor
elektronov) na centralni kation. Ligandi se med seboj razlikujejo v naboju (nevtralni,
anionski in kationski) in so lahko enovezni ali večvezni. Večvezni ligandi se na kovinski
kation vežejo preko več atomov. Imenujejo jih tudi kelatni ligandi ali kelatorji (11). V
kelatih (grško chelè pomeni klešče) ležijo kelatni ligandi okoli kovinskega atoma v obliki
Mateja Matjaž Magistrska naloga
37
rakovih klešč. Pri kelaciji pride do tvorbe dveh ali več koordinacijskih vezi med osrednjim
kovinskim kationom in večveznim ligandom, ki se z več atomi veže v kelatni kompleks
(36). Najznačilnejši večvezni ligand je etilendiamintetraocetna kislina - [EDTA]4-
, ki se ob
deprotonaciji veže na kovinski kation preko šestih donorskih atomov (Slika 24).
Slika 24: A: Etilendiamintetraocetna kislina - [EDTA]4-
. B: Kelatni kompleks med EDTA in Fe2+
.
Koordinacijsko število je odvisno tudi od velikosti ligandov. Večji kot so, manj se jih
lahko veže na centralni kation. Fe3+
lahko veže šest fluoridnih anionov ([FeF6]3-
- oktaeder)
in le štiri kloridne anione ([FeCl4]- - tetraeder). Nastanek koordinacijske spojine je
energetsko ugoden proces, na katerega vpliva energija vezi med kovino in ligandom,
energija polja ligandov, razporeditev ligandov ter odbojne sile med njimi (11).
4.2.1. EDTA
Etilendiamintetraocetna kislina (EDTA) je zelo močan kelator magnezija, kalcija, železa in
drugih kovinskih ionov. Zato jo pogosto uporabljamo v različnih analiznih metodah, in
sicer za odstranjevanje kovinskih ionov ali za dokazovanje njihove prisotnosti. Molekula
EDTA se poveže z železom preko šestih donorskih atomov in ga popolnoma obda (Slika
24B). Kompleks med EDTA in železom je redoks aktiven. Vrednost EC50 = 21,1 ± 0,7
μmol/L, ki smo jo določili izkazuje zelo dobro zmožnost kelacije železa(II) (Slika 25).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
38
Slika 25: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije EDTA (μmol/L).
4.2.2. KVERCETIN
Dvovalentno železo se najverjetneje veže na kvercetin preko vezavnega mesta 3-hidroksi-
4-keto z 2,3-dvojno vezjo (obroč C). Druga verjetna vezava poteka preko kateholnega dela
spojine (obroč B), tretja pa še preko 5-hidroksi-4-keto vezavnega mesta, vendar pa je ta
manj verjetna, saj je nastali kompleks manj stabilen (Slika 26) (30, 37). Da je
najverjetnejše vezavno mesto Fe2+
tisto na obroču C so ugotovili tudi Guo in sodelavci
(27). Opisana vezavna mesta Fe2+
so značilna tudi za druge polifenolne antioksidante, pa
tudi za spojine, ki v svoji strukturi vsebujejo fenole. Vrednost EC50, ki smo jo določili za
kvercetin je bila 133,9 ± 10,9 μmol/L (Slika 27).
Slika 26: Verjetna vezavna mesta med molekulo kvercetina in Fe2+
.
Mateja Matjaž Magistrska naloga
39
Slika 27: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije kvercetina
(μmol/L).
4.2.3. VZORCI
Slika 28: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 1 (μmol/L).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
40
Slika 29: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 2 (μmol/L).
Slika 30: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 3 (μmol/L).
Slika 31: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 4 (μmol/L).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
41
Slika 32: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 5 (μmol/L).
Slika 33: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 6 (μmol/L).
Slika 34: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 7 (μmol/L).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
42
Slika 35: Količina prisotnega Ferozin-Fe2+
kompleksa (%) v odvisnosti od koncentracije spojine 8 (μmol/L).
4.2.4. PRIMERJAVE MED SPOJINAMI
Za antioksidativno delovanje spojin 1 in 2 je prisoten fenol s prostimi hidroksilnimi
skupinami in ustreznim redoks potencialom (kateholna skupina). Železo se lahko veže tudi
preko kisikovih in dušikovih atomov v barbituratnem delu spojine (1, 2, 3, 4). Za
barbiturno kislino je znano, da ima sposobnost kelacije ionov prehodnih kovin (38).
Spojna 1 (EC50 = 120,4 μmol/L) je izkazovala dobro zmožnost kelacije železa, in sicer še
nekoliko boljšo od kvercetina, pod enakimi testnimi pogoji. Iz grafa je razvidno, da med
količino prisotnega kelata Ferozin-Fe2+
(%) in koncentracijo spojine 1 ni linearne
odvisnosti. Spojina se je kmalu po 50% kelaciji Fe2+
pričela obnašati nelinearno, zato
nismo mogli izračunati standardnega odklona in smo posledično vrednost EC50 odčitali
neposredno iz grafa (Slika 28). Možni vzrok za to, da se pri višjih koncentracijah spojine 1
delež nastalega Ferozin-Fe2+
kompleksa ne zmanjšuje linearno, je lahko v slabši topnosti
preiskovane spojine v izbrani zmesi topil. Spojina 1 najverjetneje veže železo preko dveh
hidroksilnih skupin na benzenskem obroču ter preko barbituratnega dela molekule (30, 38).
Glede na to da, torej kaže lastnosti večveznega kelatnega liganda, predvidevamo, da z Fe2+
sočasno tvori koordinacijske vezi preko kateholnega in barbituratnega dela, kar vodi v
zvitje molekule in nastanek kelatnega kompleksa.
Spojina 2 je imela zelo šibko zmožnost kelacije železa(II) (EC50 = 9085,1 μmol/L). Na
fenilnem obroču ima eno hidroksilno in eno metoksi skupino. Za slednjo je značilno, da
zmanjša ali izniči zmožnost vezave železa (30). Izkazovanje šibke aktivnosti je
najverjetneje povezano z vezavo železa na barbituratni del molekule (38). Glede na
Mateja Matjaž Magistrska naloga
43
vrednost EC50 in potek grafa (Slika 29) vidimo, da spojina izkazuje tako šibko aktivnost,
da lahko trdimo, da v kompetitivnem ferozinskem testu ni zmožna močneje vezati železa.
Tudi spojina 3 je izkazala šibko zmožnost kelacije železa(II) (EC50 = 6406,7 μmol/L)
(Slika 30). V svoji strukturi nima hidroksilnih skupin na fenilnem obroču. Njena šibka
aktivnost je zato najverjetneje povezana le s kelacijo Fe2+
preko barbituratnega dela
molekule (38). Spojina 3 je kljub šibki sposobnosti kelacije pokazala boljšo aktivnost kot
spojina 2, česar nismo pričakovali. Morda je za to kriva metilacija na fenilnem obroču v
spojini 2 ali pa prisotnost hidrofobnega efekta. Spojina 3 bi namreč lahko tvorila micelije,
ki lahko vežejo Fe2+
.
Še slabše rezultate smo dobili s spojino 4, ki sploh ni kazala zmožnosti kelacije železa. Na
mestu 3 v fenilnem obroču ima vezano metoksi skupino, na mestu 2 pa hidroksilno
skupino. Odstotek kompleksa Ferozin-Fe2+
se z višanjem koncentracije spojine ni zniževal
(Slika 31).
Vrednosti EC50 za spojino 5 nismo mogli določiti, saj ta ni dosegla 50% kelacije Fe2+
(Slika 32). Spojina ima barbituratni del molekule zamenjan s tiobarbituratnim, poleg tega
pa še dve hidroksilni skupini pripeti na fenilnem obroču. Pričakovali smo, da bo dobro
kelirala železo, kar je bilo sprva tudi videti, nato pa se je zgodil obrat in prisotnost
kompleksa Ferozin-Fe2+
je ponovno pričela naraščati. Predvidevamo, da je tako kot pri
spojini 1, za nelinearni odziv vzrok slabša topnosti spojine v izbrani zmesi topil. Spojina 5
je podobna spojini 1, le da ima v svoji strukturi žveplov atom. Slednji verjetno vpliva na
njeno slabšo kelacijsko sposobnost. Podobno je bilo tudi s spojino 6, ki ni imela zmožnosti
za kelacijo železa. Odstotek kompleksa Ferozin-Fe2+
se z višanjem njene koncentracije ni
zniževal (Slika 33). Spojina 6 je podobna spojini 2, le da ima v barbituratnem delu
molekule žveplo. Tako lahko za spojini 5 in 6 trdimo, da prisotnost žvepla v barbituratnem
delu molekule negativno vpliva na kelacijo železa.
Glutarimiddioksim (7) so testiral že Sun in sodelavci in ugotovili, da tvori komplekse z
ioni prehodnih kovin (železom, bakrom, nikljem in svincem). Z Fe3+
tvori celo zelo močne
komplekse (18). Spojina 7 je glede na uporabljena pozitivna standarda izkazovala srednje
dobro kelacijo Fe2+
(EC50 = 601,2 μmol/L) (Slika 34). Molekulo glutarimiddioksima
sestavlja šestčlenski obroč z dvema oksimoma (tu se nahajata hidroksilni skupini) in enim
imidnim dušikovim atomom, kar omogoča tridentatno kelacijo železa.
Sukcinimiddioksim (spojina 8) pa ni bil sposoben kelirati železo. Odstotek prisotnega
kompleksa Ferozin-Fe2+
je bil enak, ne glede na zviševanje koncentracije spojine (Slika
Mateja Matjaž Magistrska naloga
44
35). Spojina 8 ima v svoji strukturi petčlenski obroč. Hidroksilni skupini sta zaradi tega
bolj oddaljeni, molekulska struktura pa je verjetno bolj toga, kar očitno onemogoča zvitje
molekule in s tem zmožnost kelacije železa.
Preglednica IX: Vrednosti EC50, ki predstavljajo zmožnosti preiskovanih spojin za kelacijo železa.
Spojina R1 R2 X (EC50 ± SD) μmol/L
1 OH OH O 120,4
2 O-Me OH O 9085,1 ± 53,5
3 H O-Bu O 6406,7 ± 47,9
4 OH O-Me O /
5 OH OH S /
6 O-Me OH S /
7 601,2 ± 12,6
8 /
Kvercetin 133,9 ± 10,9
EDTA 21,1 ± 0,7
Mateja Matjaž Magistrska naloga
45
4.3. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNA TITRACIJA SPOJIN Z
ŽELEZOM(II)
4.3.1. KVERCETIN
Slika 36: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 10 μmol/L kvercetina v prisotnosti 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15,
20, 25, 30, 40 in 50 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance kompleksa Kvercetin-Fe2+
pri 425 nm od
koncentracije Fe2+
.
Za pozitivni standard smo uporabili antioksidant kvercetin. UV-Vis spektrofotometrično
titracijo z Fe2+
smo izvedli v kalij-fosfatnem pufru s pH 7,4. Po dodatku Fe2+
smo izmerili
padec absorbance prostega kvercetina pri 376 nm, nastajanje novega vrha pri 425 nm in
izozbestično točko pri 403 nm, kar je vse posledica nastanka kompleksov med kvercetinom
in železom (Slika 36A). Nato smo izrisali titracijsko krivuljo pri 425 nm, ter zabeležili
nastanek kompleksa 1:1, kvercetin:Fe2+
(Slika 36B).
Podobno meritev so izvedli tudi Guo in sodelavci, ki so preučevali nastanek kompleksov
med kvercetinom ter Fe2+
in Fe3+
. Z UV-Vis spektroskopsko analizo so ugotovili, da
kvercetin tvori komplekse z Fe2+
v razmerju 2:1 in 1:1, kar so potrdili tudi z ESI masno
spektrometrijo (27). Mi smo zaznali le kompleks 1:1, kompleksa 2:1 pa ne. Eden od
možnih vzrokov za to bi lahko bila oksidacija Fe2+
do Fe3+
. Raztopina Fe2+
je bila namreč
med meritvijo izpostavljena zraku. Razlika v rezultatih pa je verjetno tudi posledica
različnih pH pogojev, uporabljenih topil in metodoloških pristopov. Kljub temu lahko
Mateja Matjaž Magistrska naloga
46
trdimo, da so naši rezultati UV-Vis spektrofotometrične titracije kvercetina z Fe2+
ustrezni,
zato smo nadaljevali z analizo izbanih spojin.
4.3.2. VZORCI TESTIRANIH SPOJIN
Spojina 1
Za spojino 1 smo že pri kelaciji železa(II) ugotovili, da dobro kelira železo. To smo
potrdili tudi z UV-Vis spektrofotometrično titracijo Fe2+
. Pred dodatkom Fe2+
smo zaznali
vrh pri 341 nm. Ta se je nato po dodatku Fe2+
pričel pomikati rahlo v desno proti 349 nm,
dokler spojina ni začela dosegati nasičenja in se je naraščajoči vrh začel pomikati nazaj v
levo. Spojina je nato v prisotnosti 50 μmol/L Fe2+
dosegla nasičenje (Slika 37A). Izrisali
smo titracijsko krivuljo pri 346 nm in zabeležili nastanek kompleksov 2:1 in 1:1 spojine
1:Fe2+
(Slika 37B).
Slika 37: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 1 v prisotnosti 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5,
15, 20, 25, 30, 40, 50 in 60 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance kompleksa spojine 1-Fe2+
od koncentracije
Fe2+
pri 346 nm.
Spojina 2
Spojina 2 je v testu zmožnosti kelacije Fe2+
izkazala tako šibko aktivnost, da bi jo lahko
označili za neaktivno. Z UV-Vis spektrofotometrično titracijo pa smo ugotovili, da temu ni
Mateja Matjaž Magistrska naloga
47
tako. V testu zmožnosti kelacije Fe2+
smo uporabili reagent ferozin, ki tekmuje za vezavo
železa s testirano spojino. Ferozin pa lahko odtegne železo iz kompleksa s testirano
spojino, če ta ni dovolj stabilen. Pri UV-Vis spektrofotometrični titraciji Fe2+
v raztopini ni
prisotnega drugega tekmeca za železo, zaradi česar je spojina 2 lahko vezala železove ione.
Tako smo v UV-Vis spektru zaznali naraščanje absorbance pri 348 nm, izozbestično točko
pri 430 nm in padec absorbance pri 479 nm (Slika 38A). Pri 348 nm smo izrisali graf
titracijske krivulje in ugotovili nastanek kompleksov 4:1, 3:1 in 1:2 (Slika 38B).
Slika 38: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 2 v prisotnosti 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5,
15, 20, 25, 30 in 35 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance kompleksa spojine 2-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 348 nm.
Spojina 3
Spojina 3 ni pokazala jasne aktivnosti. Celoten UV-Vis spekter je po dodatku Fe2+
ves čas
le naraščal (Slika 39A). Pri 285 nm smo nato izrisali graf titracijske krivulje, ki je v
prisotnosti 25 μmol/L Fe2+
izkazoval rahlo spremembo v naklonu in s tem nastanek
kompleksa 2:1 (Slika 39B).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
48
Slika 39: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 3 v prisotnosti 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5,
15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160, 200, 240, 280 in 320 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost
absorbance kompleksa spojine 3-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 285 nm.
Spojina 4
Absorpcijski spekter spojine 4, je prav tako kot pri spojini 3 le naraščal in kljub visokim
dodanim koncentracijam Fe2+
ni dosegel nasičenja. Izrisani absorpcijski spekter in graf pri
315 nm nista pokazala jasne aktivnosti (Slika 40A). V grafu odvisnosti absorbance
kompleksa spojine 4-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 315 nm smo zaznali le rahlo
spremembo v naklonu, kar bi lahko kazalo na nastanek kompleksa v razmerju 2:1 (Slika
40B).
Spojina 5
Po dodatku Fe2+
smo v absorpcijskem spektru spojine 5 zaznali naraščanje absorbance pri
345 nm (Slika 41A). Ta je naraščala do koncentracije 70 μmol/L Fe2+
, nato pa je dosegla
plato. Pri 345 nm smo nato izrisali graf titracijske krivulje, ki je pokazal nastanek
kompleksa med spojino 5 in Fe2+
v razmerju 2:1 (Slika 41B).
Mateja Matjaž Magistrska naloga
49
Slika 40: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 4 v prisotnosti 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5,
15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 160, 200, 280 in 320 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance
kompleksa spojine 4-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 315 nm.
Slika 41: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 50 μmol/L spojine 5 v prisotnosti 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30,
35, 40, 50, 60 in 70 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance kompleksa spojine 5-Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 345 nm.
Mateja Matjaž Magistrska naloga
50
Spojina 6
Titracijo z Fe2+
smo izvedli s koncentracijo 10 μmol/L spojine 6, in sicer zaradi močne
obarvanosti njene raztopine. Absorpcijski spekter je po dodatku raztopine Fe2+
ionov ves
čas naraščal (Slika 42A). Titracijsko krivuljo smo izrisali pri 350 nm in zaznali rahlo
spremembo v njenem naklonu (Slika 42B). To bi lahko predstavljalo nastanek kompleksa
spojine 6-Fe2+
v razmerju 1:2. Spojina 6 v ferozinskem testu kelacije železa ni bila aktivna.
Vzrok za to je najverjetneje odtegnitev Fe2+
iz njenega šibkega kompleksa 6-Fe2+
s
ferozinom. V testu UV-Vis spektrofotometrične titracije spojin z Fe2+
pa v raztopini ni bilo
prisotnega nobenega drugega tekmeca za železo, zato smo najverjetneje lahko zaznali
šibko sposobnost spojine 6 za vezavo železa.
Slika 42: A) UV-Vis Spektrofotometrična titracija 10 μmol/L spojine 6 v prisotnosti 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5,
15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120 in 140 μmol/L Fe2+
. B) Odvisnost absorbance kompleksa spojine 6-
Fe2+
od koncentracije Fe2+
pri 350 nm.
Mateja Matjaž Magistrska naloga
51
4.3.3 REZULTATI UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIČNE TITRACIJE
ŽELEZA(II)
Z UV-Vis spektrofotometrično titracijo smo preverili sposobnost preiskovanih spojin za
vezavo železo(II). Želeli smo pojasniti rezultate meritev, ki smo jih pridobili s testom
kelacije železa(II). V tem testu kelacije smo uporabili reagent ferozin, ki z vzorcem
tekmuje za vezavo Fe2+
, ki pa ga lahko tudi odtegne iz manj stabilnega kompleksa. V UV-
Vis spektrofotometrični titraciji železa(II) pa ni prisotnega nobenega tekmeca, zato lahko
na ta način zaznamo tudi šibko vezavo železa (2). Dobro vezavno sposobnost za Fe2+
smo
ponovno ugotovili pri spojini 1, ki ima v svoji strukturi kateholno skupino. Spojina 5, ki je
podobna spojini 1, pa je zopet hitro dosegla nasičenje. Ta spojina ima v strukturi
barbituratni del zamenjan s tiobarbituratnim, kar očitno vpliva na njeno zmanjšano
aktivnost. Zelo šibko aktivnost, ki je najverjetneje povezana z aktivnostjo barbituratnega
dela molekule, pa smo zaznali še pri spojinah 3, 4 in 6, (38). Rezultate UV-Vis
spektrofotometrične titracije železa(II), ki so posledica nastanka kompleksov in aktivnosti
barbituratnega dela molekule, bi morali potrditi še z drugimi analiznimi tehnikami, npr. z
ESI masno spektrometrijo.
Mateja Matjaž Magistrska naloga
52
5. SKLEP
Ugotovili smo, da so imele spojine, ki v svoji strukturi vsebujejo kateholno
skupino, najboljše antioksidativne učinke v smislu redukcije DPPH• in kelacije
železa(II).
Položaj hidroksilne skupine na para mestu v fenilnem obroču omogoča v nastalem
radikalu delokalizacijo prostega elektrona po celotnem (tio)barbituratnem delu
molekule, kar okrepi stabilnost radikala in izboljša antioksidativne lastnosti
tovrstnih spojin. Dodatna hidroksilna skupina na orto mestu znatno izboljša
antioksidativne lastnosti.
Prisotnost žvepla v strukturi 5-benzilidentiobarbituratov izboljša redukcijo DPPH•,
a obenem zmanjša oziroma izniči sposobnost kelacije železa(II), kar smo potrdili
tudi z UV-Vis spektrofotometrično titracijo železa(II).
Metiliranje hidroksilnih skupin zmanjša oziroma izniči antioksidativno delovanje
spojin.
Odsotnost hidroksilnih skupin v bezilidenskem obroču povzroči antioksidativno
neaktivnost.
Petčlenski obroč daje sukcinimiddioksimu bolj togo molekulsko strukturo, kar
onemogoča vezavo Fe2+
in izniči njegovo potencialno sposobnost redukcije DPPH•.
Glutarimiddioksim (spojina 7), ki ima šestčlenski obroč, je v primerjavi s
sukcinimiddioksimom (spojina 8) izkazal boljšo antioksidativno aktivnost.
Fe2+
se lahko šibko veže tudi preko kisikovih in dušikovih atomov v barbituratnem
delu spojine.
V okviru magistrske naloge smo potrdili našo hipotezo, da 5-benziliden(tio)barbiturati, ki
imajo v svoji strukturi več hidroksilnih skupin vezanih na fenilni obroč, kažejo boljše
antioksidativne lastnosti. Ugotovili smo tudi, da lahko na aktivnost spojin vplivajo različne
strukturne spremembe osnovnega 5-benziliden(tio)barbiturata, ki bodisi okrepijo,
zmanjšajo ali celo izničijo njihovo antioksidativno sposobnost (položaji hidroksilnih
skupin v fenilnem obroč ali njihova metilacija). Predpostavljali smo, da bodo imeli
tiobarbiturati boljše antioksidativne lastnosti, kar smo tudi potrdili z njihovo sposobnostjo
redukcije radikala DPPH. S testom ugotavljanja zmožnosti kelacije železa(II) pa smo prišli
Mateja Matjaž Magistrska naloga
53
do zaključkov, da je prisotno žveplo povzročilo slabšo kelacijo Fe2+
, zato smo to delovno
hipotezo zavrnili.
Mateja Matjaž Magistrska naloga
54
VIRI IN LITERATURA
1. Halliwell B, Gutteridge: Free radicals in biology and medicine. Oxford University
Press Inc., New York, 2007: 38-45, 79-80, 132-142, 187-188, 195-198, 645, 669-
677.
2. Pečar S.: Radikali v našem življenju. Kemija v šoli, 2006:18(3): 13-19.
3. Osredkar J.: Oksidativni stres. Zdrav Vestn, 2012: 81: 393-406.
4. Pečar S.: Radikali v našem okolju. Kemija v šoli, 2006: 18(2): 26-30.
5. de Grey A.D.N.J.: HO2•: The Forgotten Radical. DNA and Cell Biology, 2002:
21(4): 251-257.
6. Koppenol W.H: The centennial of the Fenton reaction. Free Radical Biology and
Medicine, 1993: 15:645-651.
7. Prousek J: Fenton chemistry in biology and medicine. Pure and Applied Chemistry,
2007: 79(12): 2325–2338.
8. Fenton's reagent. Spletna stran: http://en.wikipedia.org/wiki/Fenton%27s_reagent
(dostop: januar 2015).
9. Haber–Weiss reaction. Spletna stran:
http://en.wikipedia.org/wiki/Haber%E2%80%93Weiss_reaction (dostop: januar
2015).
10. Šuput D: Reaktivne kisikove zvrsti v patofizioloških procesih. In: Temelji
patološke fiziologije, 2. Izd, Ljubljana, 2011: 24.
11. Obreza A, Mravljak J, Perdih F: Farmacevtska kemija I. Univerza v Ljubljani,
Fakulteta za farmacijo, Ljubljana, 2014: 7-35, 197-204.
12. Higgins T, Beutler E, Doumas B.T.: Hemoglobin, Iron and Bilirubin. In: Tietz
Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Elsevier Saunders, St
Louis, Missouri, 2006: 1186-1190.
13. Šuput D, Bunc M.: Anemije, In: Patofiziologija s temelji fiziologije. Inštitut za
patološko fiziologijo, Ljubljana, 2002: 15-17.
14. Zdravila z ATC klasifikacijo V03AC. Spletna stran:
http://www.registerzdravil.si/atc/V03AC (dostop: marec 2015).
15. Lopez-Munoz F, Ucha-Udabe R, Alamo C.: The history of barbiturates a century
after their clinical introduction. Neuropsychiatric Disease and Treatment, 2005:
1(4): 329-343.
Mateja Matjaž Magistrska naloga
55
16. Moniri N.H. Sedative-Hypnotics. In: Foy's Principles of Medicinal Chemistry.
Lippincott Williams & Wilkins, a Wolters Kluwer business, Philadelphia,
Baltimore, 2013: 489-490.
17. Biling Sokmen B., Ugras S., Yucel Sarikaya H, et al. Antibacterial, Antiurease, and
Antioxidant Activities of some Arylidene Barbiturates. Appl Biochem Biotechnol,
2013: 171: 2030-2039.
18. Sun X, Xu C, Tian G, Rao L.: Complexation of glutarimidedioxime with Fe(III),
Cu(II), Pb(II), and Ni(II), the competing ions for the sequestration of U(VI) from
seawater. Dalton Trans, 2013: 42(40): 14621-14627.
19. Ahmad S, Arshad M. A., Ijaz S, et.al.: Review on methods used to determine
Antioxidant activity. IJMRD, 2014: 1(1): 35-40.
20. Sochor J, Ryvolova M, Krystofova O, et. al.: Fully automated spectrometric
protocols for determination of antioxidant activity: advantages and disadvantages.
Molecules, 2010: 15(12): 8618-8640.
21. Charles D.J.: Antioxidant properties of spices, herbs and other sources. Springer
Science+Business Media, New York, 2013: 12-14.
22. Hossain U, Bhattacharya S.: Synthesis of O-prenylated and O-geranylated
derivatives of 5-benzylidene2,4-thiazolidinediones and evaluation of their free
radical scavenging activity as well as effect on some phase II
antioxidant/detoxifying enzymes. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17, 2007: 1149-1154.
23. Molyneux P.: The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for
estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol., 2004: 26(2): 211-
219.
24. Shahidi F.: Natural Antioxidants: Chemistry, Health Effects, and Applications.
AOCS Press, ZDA, 1997: 216.
25. Stookey L.L.: Ferrozine – A new Spectrophotometric reagent for iron. Analytical
Chemistry, 1970: 42 (7): 779-781.
26. Pratap Chandran R, Vysakhi M.V., Manju S, et. al.: In vitro free radical scavenging
activity of aqueous and methanolic leaf extracts of aegle tamilnadensis abdul kader
(rutaceae). Int J Pharm Sci, 2013: 5(3): 819-823.
27. Guo M, Perez C, Wei Y, et al.: Iron-binding properties of plant phenolics and
cranberry's bio-effects. Dalton Trans., 2007: 4951-4961.
Mateja Matjaž Magistrska naloga
56
28. Geng J, Li M, Wu L, et.al.: Liberation of Copper from Amyloid Plaques: Making a
Risk Factor Useful for Alzheimer’s Disease Treatment. J. Med. Chem., 2012: 55:
9146-9155.
29. Locatelli M., Gindro R., e tal.: Study of the DPPH•-scavenging activity:
Development of a free software for the correct interpretation of data. Food
Chemistry, 2009: 114: 889-897.
30. Pečar S, Mravljak J. Šumi Življenja ali radikali in druge reaktivne snovi v telesu.
Slovensko farmacevtsko društvo. Ljubljana, 2015: 138-198.
31. Bentz A. B.: A Review of Quercetin: Chemistry, Antioxidant Properties, and
Bioavailability. Spletna stran: http://www.jyi.org/issue/a-review-of-quercetin-
chemistry-antioxidant-properties-and-bioavailability/ (dostop: junij 2015).
32. Brand-Williams W, Cuvelier M.E., Berset C: Use of a Free Radical Method to
Evaluate Antioxidant Activity. LWT- Food Science and Technology, 1995: 28: 25-
30.
33. Khan K. M, Ali M, Ajaz A, et al.: Synthesis of 5-Arylidene Barbiturates: A Novel
Class of DPPH Radical Scavengers. Letters in Drug Design & Discovery, 2008:
5(4): 286-291.
34. Sharma O. P., Bhat T. K.: DPPH antioxidant assay revisited. Food Chemistry,
2009: 113: 1202-1205.
35. Dawidowicz A. L., Wianowska D., Olszowy M.: On practical problems in
estimation of antioxidant activity of compounds by DPPH• method (Problems in
estimation of antioxidant activity). Food Chemistry, 2012: 131: 1037-1043.
36. Kelacija. Spletna stran: http://sl.wikipedia.org/wiki/Kelacija (dostop: marec 2015).
37. Mladenka P, Macakova K, Filipsky T, e tal.: In vitro analysis of iron chelating
activity of flavonoids. Journal of Inorganic Biochemistry, 2011: 105: 693-701.
38. Ikotun A. A, Ojo Y, Obafemi C, Egharevba G: Synthesis and antibacterial activity
of metal complexes of barbituric acid. Afr. J. Pure Appl. Chem., 2011: 5(5): 97-
103.