małgorzata dołowy autoreferat załącznik 2a€¦ · 1. posiadane dyplomy i stopnie i naukowe a/...
TRANSCRIPT
Zakład Chemii Analitycznej
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
w Sosnowcu
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Załącznik 2a
Autoreferat
Małgorzata Dołowy
Sosnowiec 2016
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
2 | S t r o n a
Spis treści
1. Posiadane dyplomy i stopnie i naukowe………………………………………………3
2. Informacja o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych………….3
3. Osiągnięcia stanowiące podstawę habilitacji…………………………………………4
3.1. Tytuł osiągnięcia naukowego ...................................................................................... 4
3.2. Wykaz publikacji stanowiących podstawę habilitacji ................................................. 4
3.3. Omówienie celu naukowego w/w prac i osiągniętych wyników ............................... 7
3.3.1. Wstęp .................................................................................................................... 7
3.3.2. Cel badań .............................................................................................................. 8
3.3.3. Prezentacja i omówienie wyników badań ............................................................ 9
3.3.4. Podsumowanie wyników badań stanowiących podstawę habilitacji i wnioski . 25
4. Pozostałe osiągnięcia naukowo – badawcze…………………………………………27
4.1. Działalność naukowo-badawcza przed uzyskaniem stopnia naukowego doktora .... 27
4.1.1. Wykaz oryginalnych publikacji naukowych opublikowanych przed uzyskaniem
stopnia naukowego doktora .............................................................................................. 28
4.2. Działalność naukowo-badawcza po uzyskaniu stopnia naukowego doktora ............ 29
4.2.1. Wykaz oryginalnych publikacji naukowych opublikowanych po uzyskaniu
stopnia naukowego doktora (niezwiązanych z habilitacją)............................................... 31
4.2.2. Współpraca z jednostkami naukowymi .............................................................. 36
4.2.3. Nagrody i wyróżnienia za działalność naukowo-badawczą ............................... 37
4.2.4. Odbyte kursy i szkolenia .................................................................................... 38
4.2.5. Działalność dydaktyczna i opieka nad studentami ............................................. 38
4.2.6. Działalność organizacyjna .................................................................................. 41
4.2.7. Recenzje prac dla czasopism .............................................................................. 41
4.2.8. Udział i kierowanie projektami badawczymi ..................................................... 42
4.2.9. Członkostwo w towarzystwach naukowych ...................................................... 43
5. Podsumowanie osiągnięć naukowych na dzień 31.03.2016 według bazy Web of
Science (WoS)…………………………………. ………………………………………..43
6. Literatura……………………………………………………………………………...43
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
3 | S t r o n a
IMIĘ I NAZWISKO: Małgorzata Dołowy
1. Posiadane dyplomy i stopnie i naukowe
a/ magister inżynier technologii chemicznej w specjalności technologia nieorganiczna i
elektrochemia
Wydział Chemiczny, Politechnika Śląska w Gliwicach, 1999
promotor: prof. dr hab. inż. Jerzy Piotrowski
tytuł pracy magisterskiej: „Badania dynamiki procesu adsorpcji mocznika na węglach
aktywnych i zeolitach”
b/ kwalifikacje do pracy nauczycielskiej
Fakultatywne Studium Pedagogiczne, Ośrodek Badań i Doskonalenia Dydaktyki,
Politechnika Śląska w Gliwicach, 1999
c/ doktor nauk chemicznych w zakresie chemii
Instytut Chemii, Wydział Matematyki, Fizyki i Chemii, Uniwersytet Śląski w Katowicach,
2004
promotor: prof. dr hab. Alina Pyka-Pająk, prof. zw. SUM
tytuł pracy doktorskiej: „Porównanie rozdziału i właściwości lipofilowych wybranych
kwasów żółciowych badanych chromatografią cieczową”
2. Informacja o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych
1999-2002 Katedra i Zakład Chemii Ogólnej i Analitycznej, Wydział
Farmaceutyczny Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach, asystent
2003-2006 Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Ogólnej i Analitycznej,
Wydział Farmaceutyczny Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach,
asystent
Od 2006 do nadal Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Ogólnej i Analitycznej,
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach (do 2007 Śląska
Akademia Medyczna), adiunkt
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
4 | S t r o n a
3. Osiągnięcia stanowiące podstawę habilitacji
wynikające z art. 16, ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule
naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65, poz. 595, z późn. zm.).
3.1. Tytuł osiągnięcia naukowego
Przedstawiony do oceny w postępowaniu habilitacyjnym monotematyczny cykl publikacji
składa się z 13 opublikowanych oryginalnych prac naukowych na temat „Zastosowanie
chromatografii cienkowarstwowej z densytometrią do analizy steroidów o różnym
działaniu farmakologicznym”.
Prezentowane osiągnięcia naukowe stanowią cykl badań obejmujących następujące kierunki:
przeprowadzenie procesu optymalizacji warunków rozdziału oraz detekcji wybranych
steroidów o różnym działaniu farmakologicznym techniką chromatografii
cienkowarstwowej w normalnym i odwróconym układzie faz,
walidacja opracowanych metod chromatografii cienkowarstwowej w połączeniu z
densytometrią do oznaczania wybranych steroidów w ich preparatach farmaceutycznych,
ocena przydatności chromatografii cienkowarstwowej oraz algorytmów obliczeniowych
do wyznaczania lipofilowości badanych związków.
3.2. Wykaz publikacji stanowiących podstawę habilitacji
Pracę habilitacyjną stanowi cykl trzynastu oryginalnych prac naukowych opublikowanych w
latach 2009-2016. Zgodnie z analizą bibliometryczną (Załącznik 6) sumaryczny wskaźnik
Impact Factor (IF) prezentowanego cyklu wynosi 10,013 a punktacja MNiSW 220 (wg
odpowiednio ISI Journal Citation Report oraz Ujednoliconego Wykazu Czasopism
naukowych prowadzonego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego). We
wszystkich pracach jestem pierwszym autorem.
A-1. M. Dołowy, B. Bat, A. Niestrój
Application of NP-TLC with densitometric detection for separation and quantitative analysis
of unconjugated bile acids presented in human bile, Journal of Liquid Chromatography &
Related Technologies 32 (2009) 144-153
wskaźnik Impact Factor: 0,998, punktacja MNiSW: 15
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
5 | S t r o n a
A-2. M. Dołowy, A. Pyka
The effect of -cyclodextrin on the resolution of free and conjugated forms of deoxycholic
and chenodeoxycholic acids by TLC-densitometry, Acta Poloniae Pharmaceutica Drug
Research 72 (2015) 1141-1149
wskaźnik Impact Factor: 0,737, punktacja MNiSW: 15
A-3. M. Dołowy, A. Pyka
TLC-Densitometric method for qualitative analysis of betamethasone and its related
compounds in pharmaceutical preparations, Acta Poloniae Pharmaceutica Drug Research 71
(2014) 922-932
wskaźnik Impact Factor: 0,737, punktacja MNiSW: 15
A-4. M. Dołowy, A. Pyka
Evaluation of the stability of the chromatographic bands in the TLC-densitometric analysis of
selected pharmaceutical important phytosterols and α-tocopherols, Journal of Liquid
Chromatography & Related Technologies 38 (2015) 1131-1141
wskaźnik Impact Factor: 0.606, punktacja MNiSW: 15
A-5. M. Dołowy, A. Niestrój
Densitometric determination of ursodeoxycholic acid in pharmaceutical formulations in form
of tablets and capsules, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 33 (2010)
109-117
wskaźnik Impact Factor: 0,953, punktacja MNiSW: 20
A-6. M. Dołowy, J. Maryszczak, A. Pyka
Comparison of the detection and quantitative limits of hydrocortisone acetate in different
chromatographic conditions in TLC, Journal of Liquid Chromatography & Related
Technologies 37 (2014) 2929-2941
wskaźnik Impact Factor: 0,606, punktacja MNiSW: 15
A-7. M. Dołowy, K. Kulpińska-Kucia, A. Pyka
Validation of a thin-layer chromatography for the determination of hydrocortisone acetate and
lidocaine in a pharmaceutical preparation, The Scientific World Journal vol. 2014 (2014) 1-
10, ID 107879
wskaźnik Impact Factor2014: 0,000, wskaźnik Impact Factor 5-year = 0,895, punktacja MNiSW:
30
A-8. M. Dołowy, A. Kurowska, A. Pyka
Development and validation of a TLC-densitometry method for assay of estradiol
hemihydrate in tablets, Current Pharmaceutical Analysis 10 (2014) 112-121
wskaźnik Impact Factor: 0,719, punktacja MNiSW: 15
A-9. M. Dołowy, A. Pyka-Pająk
The comparison of LODs and LOQs of estradiol hemihydrate determined by TLC using
different chromatographic conditions (The comparison of limits of detection and
quantification of estradiol hemihydrate determined by TLC using different chromatographic
conditions), Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies (2016) 1-7 (praca w
druku) http://dx.doi.org/10.1080/10826076.2016.1163180
wskaźnik Impact Factor: 0,606, punktacja MNiSW: 15
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
6 | S t r o n a
A-10. M. Dołowy, A. Pyka-Pająk, K. Filip, J. Zagrodzka
A validated TLC-densitometric method for the determination of mesterolone in bulk material
and in tablets, BioMed Research International, vol. 2015 (2015) 1-8, ID 230104
wskaźnik Impact Factor: 1,579, punktacja MNiSW: 20
A-11. M. Dołowy Comparative study of the lipophilicity of selected tauro-conjugates bile acids determined with
use of RPTLC and RPHPTLC methods, Journal of Liquid Chromatography & Related
Technologies 32 (2009) 2281-2292
wskaźnik Impact Factor: 0,998, punktacja MNiSW: 15
A-12. M. Dołowy, A. Pyka
Evaluation of the lipophilic properties of betamethasone and its related compounds, Acta
Poloniae Pharmaceutica Drug Research 72 (2015) 671-681
wskaźnik Impact Factor: 0,737, punktacja MNiSW: 15
A-13. M. Dołowy, A. Pyka
Lipophilicity assessment of spironolactone by means of reversed phase liquid
chromatography and by newly developed calculation procedures, Acta Poloniae
Pharmaceutica Drug Research 72 (2015) 235-244
wskaźnik Impact Factor: 0,737, punktacja MNiSW: 15
Wymienione publikacje załączone zostały w Załączniku 5 i cytowane są w tekście z literą ‘A’
przed numerem odnośnika (np. [A1]).
Do wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego zostały dołączone oświadczenia
współautorów określające ich wkład w powstawanie każdej z nich (Załącznik 4).
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
7 | S t r o n a
3.3. Omówienie celu naukowego w/w prac i osiągniętych wyników
3.3.1. Wstęp
Steroidy to związki chemiczne zawierające w swojej strukturze układ steranu czyli 1,2-
cyklopentanoperhydrofenantrenu (Ryc.1), który może być zmodyfikowany na drodze
przyłączenia do powyższego rdzenia steroidowego lub do łańcucha bocznego różnych
podstawników o charakterze lipofilowym lub odpowiednio hydrofilowym.
Ryc. 1. Układ 1,2-cyklopentanoperhydrofenantrenu
Duże rozpowszechnienie steroidów w świecie roślin i zwierząt, a także obecność w
organizmie ludzkim (np. hormony płciowe) oraz ich różnorodne działanie farmakologiczne,
wskazuje na to, że to cenne związki o znaczeniu biomedycznym i farmaceutycznym. W
związku z tym istnieje potrzeba opracowania prostych w użyciu i szybkich procedur
analitycznych przydatnych w rutynowej analizie steroidów w różnych próbkach, w tym także
w preparatach farmaceutycznych i suplementach diety. Istnieje możliwość zastosowania
wielu nowoczesnych technik analitycznych z uwzględnieniem metod chromatograficznych,
które wydają się być bardzo atrakcyjne w analizie steroidów w różnych matrycach z uwagi na
ich dużą czułość i specyficzność. Jednakże duży koszt takiej aparatury sprawia, że w
obecnych czasach nadal nie są to jedyne metody rutynowo stosowane w kontroli preparatów
farmaceutycznych zawierających steroidy lub do oznaczania steroidów w próbkach
biologicznych np. w moczu czy odpowiednio we krwi ludzkiej. W praktyce klinicznej, w celu
oznaczania steroidów w próbkach biologicznych duże znaczenie nadal odgrywają metody
enzymatyczne i immunoenzymatyczne z wykorzystaniem spektrofotometrii UV-Vis. W
przypadku preparatów farmaceutycznych do kontroli czystości i zawartości oraz w testach
stabilności steroidów technikami zalecanymi przez Farmakopeę Polską[1]
oraz inne światowe
(np. Farmakopeę Amerykańską[2]
) są metody chromatograficzne, w tym nadal chromatografia
planarna. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) oraz wysokosprawna chromatografia
cienkowarstwowa (HPTLC) tworzą grupę technik chromatografii planarnej bardzo istotnych
w badaniach steroidów w próbkach różnego pochodzenia, w tym także farmaceutycznych.[3,4]
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
8 | S t r o n a
Główną ich zaletą jest przede wszystkim możliwość analizowania kilku próbek równocześnie,
niższy koszt aparatury oraz mniejsze zużycie rozpuszczalników w porównaniu z innymi
nowoczesnymi technikami chromatograficznymi. Ponadto, w przypadku chromatografii
planarnej wymagany jest mniejszy stopień oczyszczenia badanych próbek. Duży wybór
sorbentów czyli płytek chromatograficznych oferowanych na rynku chromatograficznym oraz
co bardzo istotne instrumentalizacja czyli nowoczesne systemy aplikacji próbek oraz detekcji
stosowane w połączeniu z chromatografią cienkowarstwową, jak na przykład TLC z
densytometrią czy TLC-MS sprawiają, że wyniki osiągane techniką chromatografii
cienkowarstwowej; TLC lub odpowiednio HPTLC uzyskuje się z precyzją porównywalną z
innymi technikami chromatograficznymi, jak na przykład z wysokosprawną chromatografią
cieczową (HPLC) lub chromatografią gazową (GC).[3,4]
3.3.2. Cel badań
Głównym celem przeprowadzonych przeze mnie badań było opracowanie nowych, prostych i
szybkich w użyciu procedur analitycznych z użyciem chromatografii cienkowarstwowej do
rozdziału, identyfikacji, potwierdzenia tożsamości oraz wyznaczania właściwości
lipofilowych wybranych steroidów o różnym działaniu farmakologicznym. Wybór
optymalnych warunków chromatograficznych do rozdziału i analizy badanych steroidów
dokonywano na podstawie wartości parametrów chromatograficznego rozdziału par badanych
związków (tj. par związków sąsiadujących na odpowiednim chromatogramie) techniką TLC
wyznaczonych dla różnych układów chromatograficznych tj. przy użyciu różnych nośników
chromatograficznych, faz ruchomych i sposobów detekcji z uwzględnieniem densytometrii po
uprzednim zastosowaniu odpowiedniego odczynnika wywołującego oraz bez jego użycia.
Ważniejsze opracowane procedury analityczne zostały zwalidowane zgodnie z wytycznymi
ICH (Międzynarodowej Konferencji ds. Harmonizacji Wymagań dla Leków) oraz zgodnie z
innymi przewodnikami poświęconymi walidacji metod analitycznych,[5-9]
a następnie
zastosowano je do ilościowego oznaczania badanych związków w ich prostych i złożonych
preparatach farmaceutycznych.
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
9 | S t r o n a
3.3.3. Prezentacja i omówienie wyników badań
Przeprowadzenie procesu optymalizacji warunków rozdziału oraz detekcji wybranych
steroidów o różnym działaniu farmakologicznym techniką chromatografii
cienkowarstwowej w normalnym i odwróconym układzie faz
Jedną z grup badanych steroidów były kwasy żółciowe. W żółci człowieka związki te
występują w postaci wolnej oraz sprzężonej z glicyną lub odpowiednio z tauryną.
Najważniejsze z nich różniące się ilością grup hydroksylowych w swojej strukturze to kwas
litocholowy (LC) należący do grupy pochodnych monohydroksylowych,
chenodeoksycholowy (CDC), deoksycholowy (DC) i ursodeoksycholowy (UDC) –
przedstawiciele pochodnych dihydroksylowych oraz kwas cholowy (C) jako pochodna
trihydroksylowa. Poziom tych kwasów w żółci może świadczyć o schorzeniach wątroby i
dróg żółciowych. Procedury kliniczne uwzględniają pomiar całkowitej puli wszystkich
kwasów w surowicy krwi ludzkiej metodą enzymatyczną.[10]
Dlatego ważne dla celów
diagnostycznych chorób wątroby byłoby opracowanie procedury pozwalającej na całkowity
rozdział i ilościowe oznaczanie tych kwasów oraz ich połączeń w mieszaninie odpowiadającej
składowi żółci ludzkiej. Dotychczasowe moje doświadczenia poświęcone były ocenie
przydatności techniki TLC w normalnym i odwróconym układzie faz do rozdziału oraz
badania lipofilowości mieszaniny zawierającej jedynie wolne kwasy żółciowe: kwas cholowy
(C), kwas deoksycholowy (DC), kwas litocholowy (LC) i kwas chenodeoksycholowy (CDC) i
ich połączenia z glicyną czyli kwas glikocholowy (GC), kwas glikolitocholowy (GLC) oraz
kwas glikochenodeoksycholowy (GDC).
W prezentowanych obecnie badaniach, które stanowią ich kontynuację więcej uwagi
poświęcono kwasom mającym największe znaczenie biomedyczne, czyli stanowiącym
główne składniki żółci ludzkiej, w tym nie badanym uprzednio ich połączeniom z tauryną
oraz kwasom żółciowym stosowanym jako leki w chorobach wątroby i dróg żółciowych, czyli
kwasu ursodeoksycholowemu. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach, które
pozwoliły określić warunki chromatograficzne umożliwiające efektywnie rozdzielić wybrane
wolne kwasy żółciowe (C, DC, CDC, LC) oraz związane z glicyną (GC, GDC, GLC) podjęto
działania zmierzające do opracowania metody TLC w normalnym układzie faz czyli NP-TLC
pozwalającej nie tylko na całkowity rozdział, ale również ilościowe oznaczanie kwasów
żółciowych reprezentujących skład żółci ludzkiej, co może mieć w przyszłości znaczenie w
analizie próbek biologicznych [A-1]. Badaną mieszaninę stanowiły kwasy: cholowy (C),
deoksycholowy (DC), chenodeoksycholowy (CDC), litocholowy (LC) i ursodeoksycholowy
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
10 | S t r o n a
(UDC), które rozdzielano na płytkach chromatograficznych pokrytych żelem
krzemionkowym 60 i 60F254 przy użyciu fazy ruchomej n-heksan-octan etylu-kwas octowy
(99,5%) w różnych stosunkach objętościowych. Detekcji densytometrycznej dokonano przy
=360 nm po uprzednim zastosowaniu 10% etanolowego roztworu H2SO4 i ogrzaniu
chromatogramów w temperaturze 120oC. Ocenę rozdziału pięciu badanych wolnych kwasów
żółciowych przeprowadzono na podstawie wartości parametrów chromatograficznego
rozdziału tj. ΔRF oraz RS.[11]
Wykazano, że zaproponowana faza ruchoma n-heksan-octan
etylu-kwas octowy (99,5%) w odpowiednich stosunkach objętościowych pozwala na
całkowity rozdział mieszaniny badanych kwasów: C, DC, CDC, LC oraz nie badanego
uprzednio UDC techniką NP-TLC z detekcją densytometryczną na żelu krzemionkowym 60 i
60F254. W drugim etapie badań zobrazowano przydatność NP-TLC w połączeniu z
densytometrią do identyfikacji i ilościowego oznaczania pięciu badanych kwasów żółciowych
stanowiących potencjalne składniki żółci ludzkiej. Udowodniono, że faza ruchoma n-heksan-
octan etylu-kwas octowy (99,5%) w stosunku objętościowym 22:22:5 i szklane płytki
chromatograficzne pokryte żelem krzemionkowym 60F254 pozwalają na całkowity rozdział i
ilościowe oznaczanie pięciu badanych kwasów żółciowych z ich mieszaniny na poziomie od
0,396 do 6,951 µg odpowiedniego kwasu na plamę. Najniższy poziom oznaczalności dla
zastosowanych warunków chromatograficznych uzyskano dla kwasu litocholowego (LC) tj.
0,396 µg/plamę. Najwyższą wartość LOQ (granicy oznaczalności) otrzymano dla kwasu
cholowego i wynosi ona 6,951 µg/plamę [A-1]. Opracowana metoda NP-TLC w połączeniu z
densytometrią jest prosta w użyciu, szybka i dokładna, może więc w przyszłości znaleźć
zastosowanie w analizie kwasów żółciowych w próbkach klinicznych lub farmaceutycznych
na poziomie kilku mikrogramów.
W kolejnym etapie badań podjęto działania w kierunku opracowania optymalnych
warunków chromatograficznych umożliwiających efektywny rozdział i identyfikację
mieszaniny taurynowych połączeń kwasów żółciowych, ze szczególnym uwzględnieniem
pary kwasów deoksycholowego i chenodeoksycholowego, które stanowią względem siebie
steroizomery, co sprawia największy problem analityczny jeśli chodzi o ich separację w
postaci wolnej oraz w formie związanej z glicyną lub odpowiednio tauryną [A-2]. Podejmując
problematykę optymalizacji warunków chromatograficznych pozwalających na efektywny
rozdział i analizę techniką TLC w połączeniu z densytometrią wolnych i związanych z
glicyną oraz z tauryną kwasów żółciowych, deoksycholowego (DC) oraz
chenodeoksycholowego (CDC) przetestowano różne układy chromatograficzne do RP-TLC i
RP-HPTLC, w skład których wchodziła β-cyklodekstryna (β-CD) jako selektor chiralny
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
11 | S t r o n a
badanych kwasów żółciowych [A-2]. Dane literaturowe wskazują na fakt, że β-CD to
rekomendowany dodatek do fazy ruchomej lub odpowiednio modyfikator fazy stacjonarnej,
skuteczny w rozdziale izomerów optycznych wielu substancji o znaczeniu farmaceutycznym,
jak na przykład epimerów cefakloru.[12]
Związek ten zastosowano w badaniach w postaci
wodnego roztworu w różnym stężeniu procentowym (0,5%÷5%) jako komponent użytej fazy
ruchomej metanol-woda oraz jako impregnat fazy stacjonarnej naniesiony na stosowane
płytki chromatograficzne do RP-TLC i RP-HPTLC: RP-8F254, RP-18F254 i RP-2F254. Detekcji
densytometrycznej badanych związków tj. kwasu deoksycholowego (DC),
chenodeoksycholowego (CDC), glikodeoksycholowego (GDC), glikochenodeoksycholowego
(GCDC), taurodeoksycholowego (TDC) i taurochenodeoksycholowego (TCDC) dokonano za
pomocą densytometru przy =400 nm po uprzednim użyciu odczynnika wywołującego czyli
10% etanolowego roztworu H2SO4. Określono wpływ stężenia β-CD w zastosowanej fazie
ruchomej metanol-woda-β-CD (40:10:5, v/v/v) na rozdział omawianych stereoizomerów w
postaci wolnej i związanej z glicyną oraz z tauryną [A-2]. Przeprowadzone badania wykazały,
że modyfikacja zastosowanych płytek chromatograficznych za pomocą β-CD nie umożliwia
całkowitego rozdziału badanych kwasów żółciowych, w tym w szczególności w ich postaci
wolnej czyli DC od CDC. Natomiast udowodniono, że dodatek wodnego roztworu β-
cyklodekstryny w stężeniu 1÷5% do mieszaniny metanol-woda znacznie polepsza rozdział
pary badanych kwasów tj. DC i CDC oraz ich połączeń z glicyną oraz z tauryną w
szczególności na płytkach RP-2F254. Wybrana za najlepszą spośród wszystkich przebadanych
procedura jednokierunkowego rozwijania (1D) przy użyciu fazy ruchomej metanol-woda-β-
CD (3%) w stosunku objętościowym 40:10:5 na płytkach chromatograficznych do RP-
HPTLC – RP-2F254 może być zastosowana w przyszłości w analizie medycznej lub
farmaceutycznej badanych kwasów żółciowych lub jako etap wstępnego przygotowania
próbek tych kwasów przed ich analizą przy użyciu bardziej zaawansowanych technik
chromatograficznych, jak HPLC czy GC. Zaletą opracowanej metody jest jej niski koszt w
porównaniu z HPLC lub GC oraz krótszy czas analizy (rozwijania) w odniesieniu do techniki
rozwijania dwukierunkowego opisanej dla tych związków przez autorów innych
wcześniejszych prac.[13-15]
W następnym etapie badań poświęconych optymalizacji warunków
chromatograficznych TLC i odpowiednio TLC w połączeniu z densytometrią pozwalających
na rozdział, a następnie identyfikację różnych steroidów, przebadano pod tym kątem
betametazon i jego substancje pokrewne tj. 17,21-dipropionian betametazonu (BP), 17-
walerianian betametazonu (BV17), 21-walerianian betametazonu (BV21) oraz fosforan (V)
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
12 | S t r o n a
betametazonu w postaci soli disodowej (BPh) czyli mieszaninę glikokortykosteroidów o
silnym działaniu przeciwzapalnym [A-3]. Związki te to składniki preparatów leczniczych
stosowanych w różnej postaci tj. jako tabletki, maści, żele lub roztwory do iniekcji w stanach
zapalnych i chorobach skóry w preparatach prostych i złożonych tzn. w połączeniu na
przykład z kwasem salicylowym jako czynnikiem przeciwbakteryjnym lub odpowiednio z
innymi steroidami. Do dnia dzisiejszego opracowana jest tylko jedna metoda TLC w
połączeniu z densytometrią do oznaczania 17,21-dipropionianu betametazonu w obecności
nipaginy oraz kwasu salicylowego w 2003 roku przez Wulandari i Indrayanto.[16]
Natomiast
brak jest oficjalnej procedury TLC w połączeniu z densytometrią w literaturze, jak również w
Farmakopei Polskiej i Amerykańskiej, która mogłaby być użyta do identyfikacji i oznaczania
drugiej pochodnej betametazonu o znaczeniu farmaceutycznymi jaką jest fosforan
betametazonu w postaci soli disodowej (BPh).[1,2]
Nie ma również danych dotyczących
warunków rozdziału i analizy techniką TLC/densytometria betametazonu w obecności
czterech jego substancji pokrewnych: BP, BV17, BV21 oraz BPh. W związku z tym, w
niniejszej pracy opracowano prostą i tanią w użyciu w stosunku do innych metod zalecanych
przez autorów prac poświęconych betametazonowi jak na przykład HPLC, procedurę
rozdziału i identyfikacji betametazonu i jego substancji pokrewnych techniką TLC w
połączeniu z densytometrią. Przebadano wiele faz ruchomych i płytek chromatograficznych
pokrytych żelem krzemionkowym 60 i 60F254 z fazą koncentracji oraz odpowiednio bez fazy
koncentracji. Detekcji densytometrycznej badanych steroidów dokonano przy długości fali
=246 nm, która okazała się optymalna. Natomiast kwas salicylowy identyfikowano stosując
=300 nm. Spośród przebadanych warunków chromatograficznych wybrano te, które
pozwalają całkowicie rozdzielić i zidentyfikować mieszaninę pięciu badanych steroidów
BPh/B, B/BV17, BV17/BV21 i BV21/BP. Stwierdzono, że fazami ruchomymi
rekomendowanymi do rozdziału mieszaniny BP, B i S odpowiadającej potencjalnemu
składowi preparatu handlowego w postaci lotionu na płytkach pokrytych żelem
krzemionkowy 60F254 może być mieszanina: chloroform-metanol-kwas octowy (99,5%) w
stosunku objętościowym 28:5:0,5 oraz acetonitryl-woda 80:20 (v/v). Natomiast faza ruchoma
n-heksan-octan etylu-kwas octowy (99,5%) w stosunku objętościowym 35:10:5 i płytki
pokryte żelem krzemionkowym 60F254 z fazą koncentracji stanowi dobrą alternatywę do
badania BP w jego preparatach farmaceutycznych w odniesieniu do procedury opracowanej
przez Wulandari i Indrayanto.[16]
W analizie preparatu farmaceutycznego fosforanu (V)
betametazonu w postaci soli disodowej (BPh) sprawdziły się z kolei chloroform-metanol-
woda w stosunku objętościowym 45:11:1, 38:11:1 i 38:11:2 oraz chloroform-metanol-kwas
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
13 | S t r o n a
octowy (99,5%) w stosunku objętościowym 28:5:0,5 i płytki pokryte żelem krzemionkowym
60F254.
Steroidy posiadające znaczenie biomedyczne i farmaceutyczne stanowią dużą grupę,
do których należą również fitosterole, jak na przykład β-sitosterol i stigmasterol. Znaczne
zainteresowanie tymi związkami w ostatnim czasie, podyktowane jest ich cennymi
właściwościami farmakologicznymi, do których należą m.in.: zdolność obniżania tzw. „złego
cholesterolu”, działanie przeciwnowotworowe oraz przeciwzapalne.[17]
Biorąc pod uwagę te
właściwości β-sitosterolu i stigmasterolu, ważne jest opracowanie szybkiej i skutecznej
procedury analitycznej pozwalającej kontrolować obecność tych związków w
rekomendowanych suplementach diety lub w ich preparatach farmaceutycznych. W związku z
tym, że nie ma oficjalnej, farmakopealnej metody TLC przeznaczonej do analizy fitosteroli, w
tym w szczególności β-sitosterolu i stigmasterolu, postanowiono opracować warunki
chromatograficzne tj. skład fazy ruchomej i sposób detekcji do badania obu fitosteroli na żelu
krzemionkowym 60. Szczegółowa analiza pasm densytometrycznych obu związków
uzyskanych w różnych warunkach detekcji pozwoliła nie tylko opracować optymalne warunki
niezbędne do identyfikacji tych substancji, ale umożliwiła również wstępnie ocenić na tej
podstawie ich trwałość chemiczną w obecności użytych w tym eksperymencie odczynników
wywołujących, czyli ocenić trwałość układu stigmasterol lub odpowiednio β-sitosterol w
postaci kompleksu z zastosowanym odczynnikiem wywołującym. Analizę chromatograficzną
przeprowadzono na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym 60 i przy użyciu fazy
ruchomej toluen-octan etylu 7:3 (v/v), które okazały się optymalne. W warunkach tych RF dla
β-sitosterolu wynosi 0,47±0,02 a dla stigmasterolu RF=0,44±0,02 [A-4]. Zastosowano różne
sposoby detekcji analizowanych związków tj. densytometryczną bez użycia odczynnika
wywołującego przy =200 nm dla obu związków oraz z zastosowaniem roztworów fioletu
metylenowego, zieleni metylowej oraz zieleni malachitowej. Po zanurzeniu przez 5 sekund w
odpowiednim odczynniku wywołującym chromatogramy badanych związków następnie
suszono i skanowano densytometrycznie przy optymalnej dla nich długości fali po upływie
czasu od 1 dnia aż do 3 tygodni od momentu ich wywołania. Potem dokonano pomiarów
powierzchni uzyskanych pasm chromatograficznych i analizy ich kształtu. Sporządzone na tej
podstawie zależności powierzchni pasma (A) od czasu, który upłynął od rozwinięcia
chromatogramu (w dniach) lub odpowiednio densytometrowania okazały się pomocne w
ocenie trwałości analizowanych pasm, a co za tym idzie trwałości badanych związków czyli
β-sitosterolu i stigmasterolu w postaci kompleksów z zastosowanymi odczynnikami
wywołującymi oraz odpowiednio bez użycia odczynnika wywołującego. Wyniki tych badań
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
14 | S t r o n a
wskazują na wpływ sposobu detekcji tj. upływu czasu od momentu wizualizacji lub
odpowiednio rozwinięcia chromatogramów dwóch badanych fitosteroli do momentu ich
analizy densytometrycznej na kształt i powierzchnię pasm chromatograficznych tych
związków, co związane jest z różną trwałością badanych kompleksów fitosteroli z
zastosowanymi odczynnikami wywołującymi. Najbardziej stabilne pasma uzyskuje się przy
użyciu zieleni metylowej i zieleni malachitowej. W związku z tym odczynniki te mogą być
zalecane do badań chromatograficznych obu fitosteroli w różnych próbkach. Ponadto, na
podstawie przeprowadzonej interpretacji pasm chromatograficznych uzyskanych w różnych
warunkach detekcji stwierdzono, że badany stigmasterol i β-sitosterol wykazują podobną
trwałość chemiczną podczas analizy TLC w połączeniu z densytometrią z użyciem fioletu
metylenowego, zieleni metylowej i zieleni malachitowej jako odczynników wywołujących.
Otrzymane wyniki wskazują na to, że analiza TLC w połączeniu z densytometrią obu
badanych fitosteroli może być pomocnym narzędziem nie tylko w rutynowej kontroli jakości
preparatów zawierających obydwa fitosterole, ale także we wstępnej ocenie ich chemicznej
trwałości, której spadek może niewątpliwie wpływać na jakość wyników oznaczeń
uzyskiwanych omawianą techniką TLC.
Walidacja opracowanych metod chromatografii cienkowarstwowej w połączeniu z
densytometrią do oznaczania wybranych steroidów w ich preparatach
farmaceutycznych
Jakość substancji leczniczych lub odpowiednio ich preparatów farmaceutycznych warunkuje
bezpieczeństwo stosowania leków przez pacjenta. Obserwowany w ostatnim czasie
intensywny rozwój przemysłu farmaceutycznego sprawia, że w związku z tym konieczne jest
opracowanie bardziej rygorystycznych metod analitycznych do kontroli jakości produktów
farmaceutycznych. W rutynowej kontroli jakości produktów leczniczych dostępnych na rynku
farmaceutycznym stosowane są różne metody analityczne, w tym również chromatografia
cienkowarstwowa. Zgodnie z przepisami znanymi jako GMP (Dobra Praktyka Wytwarzania)
oraz GLP (Dobra Praktyka Laboratoryjna) metody analityczne stosowane w analizie
farmaceutycznej powinny być walidowane. Celem walidacji jest wykazanie, że dana metoda
jest odpowiednia do osiągnięcia zamierzonego celu.
Wymagania dotyczące procedury walidacji zaprezentowane zostały w formie wielu
opracowań i poradników. Należą do nich m.in. wytyczne Międzynarodowej Konferencji ds.
Harmonizacji Wymagań dla Leków (ICH),[5]
publikacje Ferenczi-Fodor i Nagy-Turák[6-8]
oraz
praca Konieczki i Namieśnika.[9]
Z uwagi na fakt, że brak jest szczegółowych wytycznych
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
15 | S t r o n a
dotyczących walidacji techniki TLC w połączeniu z densytometrią wykorzystywanej w
jakościowym oraz w ilościowym oznaczaniu substancji aktywnych w różnej matrycy, w tym
także w preparatach farmaceutycznych, postanowiono sprawdzić przydatność
prezentowanych powyżej procedur walidacji w aspekcie możliwości ich zastosowania do
walidacji nowoopracowywanych lub modyfikacji istniejących już metod TLC sprzężonych z
densytometrią w analizie farmaceutycznej wybranych steroidów. Według zasad podanych w
ICH jednym z wielu parametrów, które powinny być uwzględniane w procesie walidacji
metody analitycznej jest m.in. granica wykrywalności (LOD) oraz granica oznaczalności
(LOQ).[5]
Oba parametry charakteryzują czułość danej metody analitycznej, która jest bardzo
istotna w przypadku wyboru określonej metody analitycznej do oznaczania zawartości danego
związku w różnych matrycach. Pozostałe parametry walidacji to: specyficzność i
selektywność, liniowość, dokładność, precyzja i odporność metody analitycznej.
Opierając się na wynikach poświęconych optymalizacji procesu chromatograficznego
rozdziału oraz oznaczania kwasu cholowego (C), deoksycholowego (DC),
chenodeoksycholowego (CDC), litocholowego (LC) i ursodeoksycholowego (UDC) w ich
mieszaninie techniką TLC przedstawionych w publikacji [A-1], w kolejnym etapie badań
postanowiono zastosować wybrane jako optymalne w analizie tych kwasów żółciowych
warunki chromatograficzne do opracowania metody TLC w połączeniu z densytometrią, która
mogłaby posłużyć do kontroli jakości preparatów farmaceutycznych zawierających kwas
ursodeoksycholowy jako substancję czynną [A-5]. Wśród niewielu procedur analitycznych
zaprezentowanych w literaturze, w ilościowym oznaczaniu kwasu ursodeoksycholowego
generalnie zastosowanie znalazły wysokosprawna chromatografia cieczowa oraz micelarna
elektroforeza kapilarna (MEK).[18,19]
Opracowana metoda TLC w połączeniu z densytometrią
(przy długości fali =360 nm) z uwagi na swoją uniwersalność i szybkość związaną z
pominięciem czasochłonnego etapu oczyszczania próbek przed ich analizą chromatograficzną
mogłaby stanowić obok opisanych metod HPLC i MEK cenne narzędzie w rutynowej kontroli
preparatów kwasu ursodeoksycholowego. Badaniom poddano preparaty zawierające kwas
ursodeoksycholowy w postaci tabletek i kapsułek w ilości 250 mg/tabletkę lub odpowiednio
kapsułkę. Densytogramy obu preparatów nie wskazują na wpływ substancji współobecnych w
obu preparatach na wyniki analizy chromatograficznej. Uzyskuje się tylko jeden pik o
wartości współczynnika opóźnienia RF=0,48 odpowiadający kwasu ursodeoksycholowemu
jako substancji czynnej w badanych preparatach (tabletki/kapsułki). Metoda ta wykazuje
liniowość w zakresie od 0,030 do 0,120 mg/plamę. Wyznaczona granica wykrywalności
(LOD) badanego kwasu żółciowego opracowaną metodą wynosi 0,014 mg/plamę, a granica
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
16 | S t r o n a
oznaczalności (LOQ) jest równa 0,041 mg/plamę. Oprócz omawianej specyficzności,
liniowości proponowana metoda TLC wykazuje dokładność mierzoną błędem względnym w
stosunku do wartości rzeczywistej i wynosi ona 95,3% i 97,2%, odpowiednio dla tabletek i
kapsułek. Natomiast precyzja metody wyrażona jako współczynnik zmienności CV mieści się
w zakresie 5,29-6,15% dla tabletek i kapsułek. Uzyskane parametry walidacji wskazują na
możliwość zastosowania opracowanej metody w kontroli czystości preparatów zawierających
kwas ursodeoksycholowy zarówno w postaci tabletek jak i kapsułek. Może więc ona być
metodą alternatywną również w stosunku do farmakopealnej metody miareczkowej.[1]
W następnej pracy poświęconej zastosowaniu TLC w normalnym i odwróconym
układzie faz w połączeniu z densytometrią do oznaczania octanu hydrokortyzonu [A-6]
wyznaczono wpływ warunków chromatograficznych tj. fazy ruchomej oraz nośnika na
granicę wykrywalności oraz oznaczalności tego związku. Te dwa parametry obliczono na
podstawie specjalnie skonstruowanych krzywych kalibracji typu AU=S×C+b, gdzie AU to
powierzchnia plamy (piku) zmierzona densytometrycznie przy optymalnej dla tego związku
długości fali (=250 nm), C - to ilość octanu hydrokortyzonu w µg/plamę. Zgodnie z sugestią
Konieczki i Namieśnika,[9]
w celu uzyskania skorygowanej wartości LOD i LOQ
wyznaczenie tych krzywych kalibracji dokonano na podstawie roztworów wzorcowych
spełniających warunek: 10×LOD>C oraz LOD<C. Ocenie poddano średnie wartości LOD i
LOQ, które obliczono w oparciu o parametry uzyskanych krzywych kalibracji wg
następujących wzorów: LOD=3,3×σ/S oraz odpowiednio LOQ=10×σ/S. Zastosowane w
powyższych wzorach odchylenie standardowe (σ) zostało obliczone dwoma sposobami tj.
jako wartość odchylenia standardowego wyrazu wolnego oraz odpowiednio jako odchylenie
szczątkowe krzywej kalibracji. Ze względu na obserwowane różnice w wartościach LOD i
LOQ obliczonych obydwiema metodami zaproponowano w powyższej pracy posługiwanie
się uśrednioną wartością zarówno LOD jak i LOQ. Generalnie, wyznaczona granica
wykrywalności (LOD) techniką NP-TLC/densytometria badanego octanu hydrokortyzonu
mieści się w zakresie 0,051÷0,137 µg/plamę, a granica oznaczalności 0,153÷0,418 µg/plamę
czyli odpowiednio 51÷137 i 153÷418 ng/plamę. Można wnioskować, że jest to czułość
metody wystarczająca do analizy ilościowej preparatów farmaceutycznych zawierających
octan hydrokortyzonu. Spośród wielu przebadanych warunków chromatograficznych, te
najbardziej optymalne czy pozwalające uzyskać najniższe wartości LOD i LOQ techniką NP-
TLC stanowią tlenek glinu 150F254 i żel krzemionkowy 60 oraz chloroform-aceton-amoniak
(25%) w stosunku objętościowym 8:2:0,1 (v/v/v) jako faza ruchoma. W przypadku RP-TLC
najlepsze okazały się płytki pokryte żelem krzemionkowym RP-8F254 i metanol-woda 6:4
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
17 | S t r o n a
(v/v). Metoda RP-TLC pozwala uzyskać LOD w zakresie 56÷80 ng/plamę i LOQ=171÷240
ng octanu hydrokortyzonu/plamę. Stwierdzono, że otrzymane średnie wartość LOD i LOQ
techniką NP-TLC i RP-TLC wskazują na fakt, że odpowiedni dobór warunków
chromatograficznych pozwala oznaczyć octan hydrokortyzonu na niskim poziomie
(nanogramy/plamę), dzięki czemu TLC/densytometria może być techniką alternatywną jeśli
chodzi o oznaczanie octanu hydrokortyzonu w stosunku do innych bardziej nowoczesnych
technik chromatograficznych jak na przykład HPLC.
Kontynuując tę pracę postanowiono sprawdzić przydatność opracowanej metody do
ilościowego oznaczania octanu hydrokortyzonu w jego preparatach złożonych jakim jest
komercyjny roztwór do iniekcji o składzie: octan hydrokortyzonu (125 mg/5 ml) oraz
chlorowodorek lidokainy (25 mg/5 ml) o działaniu przeciwzapalnym, przeciwbólowym i
przeciwobrzękowym [A-7]. Przegląd dostępnej literatury wskazuje na to, że dotychczas
opracowano kilka tylko metod oznaczania obu tych substancji w preparatach złożonych,
wśród których znalazła się RP-HPLC z detekcją elektrochemiczną, MEK i
spektrofotometria.[20-22]
Badane preparaty to przede wszystkim maści i czopki. Natomiast
jedyna dostępna metoda TLC pochodząca z 1977 roku dotyczy również tylko tych w/w
postaci leków. Dlatego postanowiono zweryfikować czy opracowana, nowa metoda
TLC/densytometria mogłaby być efektywna w oznaczaniu obu aktywnych substancji w ich
preparatach, ale w postaci roztworu do iniekcji [A-7]. Wyniki oznaczeń chlorowodorku
lidokainy i octanu hydrokortyzonu w badanym preparacie farmaceutycznym z użyciem żelu
krzemionkowego 60F254 oraz mieszaniny chloroform-aceton-amoniak (25%) w stosunku
objętościowym 8:2:0,1 (v/v/v) jako fazy ruchomej z detekcją densytometryczną (=250 nm i
200 nm) odpowiednio dla octanu hydrokortyzonu i chlorowodorku lidokainy były zbliżone do
tych deklarowanych przez producenta i wynosiły 95,0% oraz odpowiednio 98,4%, co jest
również zgodne z zaleceniami farmakopealnymi, które wskazują, że zawartość octanu
hydrokortyzonu w preparatach powinna się mieścić w zakresie od 90÷110%, a
chlorowodorku lidokainy 95÷115%.[1]
W celu dokonania oceny czy proponowana w
niniejszej pracy metoda TLC w połączeniu z densytometrią jest wiarygodna i może być
stosowana do oznaczania octanu hydrokortyzonu obok chlorowodorku lidokainy dokonano
walidacji tej metody analitycznej zgodnie z wytycznymi ICH oraz innych przewodników
poświęconych procedurom walidacji metod analitycznych.[5-9]
Na drodze przeprowadzonej
walidacji stwierdzono, że opracowana metoda jest specyficzna ponieważ pozwala oznaczyć
dwa badane związki octan hydrokortyzonu (HA) i chlorowodorek lidokainy (L) w obecności
ich potencjalnych zanieczyszczeń, które mogą stanowić substancje pokrewne do octanu
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
18 | S t r o n a
hydrokortyzonu (HA) tj. prednizolon (PR), hydrokortyzon (H) i octan kortyzonu (CRA).
Wartości współczynników opóźnienia dla tych wszystkich związków wynoszą odpowiednio:
RF(HA)=0,41±0,02; RF(L)=0,85±0,03; RF(CRA)=0,55±0,02, przy czym hydrokortyzon (H) i
prednizolon (PR) tworzą jedno zwarte pasmo o wartości RF=0,07±0,01. W przypadku analizy
preparatu farmaceutycznego nie stwierdzono żadnych dodatkowych plam wskazujących na
obecność w preparacie substancji pokrewnych tj. hydrokortyzonu, prednizolonu czy octanu
kortyzonu. Na densytogramie widoczna jest tylko plama pochodząca od octanu
hydrokortyzonu o wartości RF=0,41 oraz druga wywodząca się od chlorowodorku lidokainy o
wartości RF=0,85. Substancje konserwujące (CS) współistniejące w analizowanym preparacie
wraz z badanym octanem hydrokortyzonu i lidokainą obrazuje na densytogramie dobrze
rozdzielona od tych dwóch substancji plama o wartości RF równej 0,64±0,02. Nie wpływa to
na wynik oznaczeń substancji głównych. Wyznaczona liniowość opracowanej metody mieści
się w zakresie stężeń octanu hydrokortyzonu: 3,75÷12,50 µg/plamę a dla chlorowodorku
lidokainy: 1,00÷2,50 µg/plamę. Wartości LOD i LOQ wynoszące dla octanu hydrokortyzonu:
0,066 i 0,198 µg/plamę oraz dla chlorowodorku lidokainy: 0,090 i 0,270 µg/plamę wskazują
na zadawalającą czułość tej metody. Omawiana metoda jest ponadto dokładna, współczynnik
zmienności (CV) jest mniejszy od 3% oraz precyzyjna CV<2%. Szczegółowo
przeprowadzone badania odporności z uwzględnieniem wpływu m.in. typu sorbenta, rodzaju
komory chromatograficznej, temperatury aktywacji płytek do TLC, dystansu rozwijania
chromatogramów, czas wysycania komory chromatograficznej fazą ruchomą, zmiany
objętości składników w fazie ruchomej zgodnie z sugestią Ferenczi-Fodor i Nagy-Turák oraz
współpracowników[4-6]
potwierdzają odporność tej metody. Proponowana metoda spełnia
zatem kryteria walidacji dla metod analitycznych i może być stosowana w kontroli jakości i
zawartości octanu hydrokortyzonu i chlorowodorku lidokainy w preparacie farmaceutycznym
wyprodukowanym w postaci roztworu do iniekcji.
W kolejnym etapie badań opracowano procedurę oznaczania półwodnego estradiolu w
tabletkach [A-8]. To syntetyczny steroid stosowany w leczeniu m.in. symptomów
menopauzy, hipogonadyzmu oraz prostaty. Wśród metod stosowanych w analizie
farmaceutycznej różnych estrogenów, w tym także estradiolu znalazły się HPLC i GC, które
są bardzo czułe, ale czasochłonne bo wymagają z reguły wstępnego przygotowania próbek
tych związków na przykład na drodze ekstrakcji.[23-25]
Jak dotąd w literaturze opisana jest
jedna metoda TLC/densytometria do oznaczania estradiolu, ale w odniesieniu do preparatu
dostępnego w postaci plastrów transdermalnych.[26]
Stąd też postanowiono opracować prostą i
szybką w użyciu procedurę TLC w połączeniu z densytometrią do oznaczania estradiolu w
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
19 | S t r o n a
postaci tabletek. Analiza estradiolu techniką TLC na płytkach pokrytych żelem
krzemionkowym 60F254 przy użyciu fazy ruchomej benzen-metanol (9:1, v/v) z detekcją
densytometryczną (=200 nm) pozwoliła oznaczyć badany związek w preparacie
farmaceutycznym zawierającym 2,070 mg półwodnego estradiolu/tabletkę (odpowiada to 2
mg estradiolu/tabletkę) w ilości stanowiącej 92,4% w stosunku do wartości deklarowanej
przez producenta, co spełnia jednocześnie wytyczne farmakopealne, które wynoszą
90÷115%.[1]
Densytogram analizowanego preparatu uzyskany w zastosowanych warunkach
chromatograficznych wskazuje na to, że brak jest wpływu substancji współobecnych w
preparacie, którą mógłby być na przykład estron. Na otrzymanym densytogramie uzyskano
jedynie jeden pik obrazujący główny składnik badanego preparatu czyli pochodzący od
estradiolu (EL) o wartości RF(EL)=0,21±0,01. Nie obserwuje się żadnego dodatkowego piku
pochodzącego od estronu dla którego współczynnik opóźnienia powinien wynosić w tych
warunkach 0,38±0,02. Wykazano, że opracowana metoda spełnia kryteria walidacji dla metod
analitycznych. Obok specyficzności i selektywności, jest również dokładna i precyzyjna.
Współczynnik zmienności CV<2%, a precyzja (CV<3%). Charakteryzuje się również
odpornością, która została przebadana w odniesieniu do siedmiu różnych parametrów, w tym
m.in. zmiany sorbenta, rodzaju komory chromatograficznej, temperatury aktywacji płytek,
czasu ekstrakcji tabletek, dystansu rozwijania oraz zmiany objętości składników w fazie
ruchomej czyli benzenu i metanolu. Sporządzona zgodnie z zaleceniami Ferenczi-Fodor i
Nagy-Turák oraz współpracowników[6-8]
macierz korelacji uzyskanych wartości oznaczanego
półwodnego estradiolu w zależności od siedmiu poddawanych zmianom parametrów
wskazują na niewielki wpływ tych czynników na wynik oznaczenia estradiolu w preparacie,
co potwierdza odporność opracowanej metody. Liniowość proponowanej metody mieści się w
zakresie stężeń 0,50÷1,50 µg półwodnego estradiolu/plamę. Natomiast wyznaczona granica
wykrywalności i oznaczalności omawianego związku wynosi odpowiednio: LOD=0,14 i
LOQ=0,41 µg/plamę. Stwierdzono ponadto, że opracowana metoda jest prosta w użyciu,
szybka i tania, w związku z czym może być z powodzeniem zastosowana w kontroli jakości
preparatów (tabletek) jako alternatywna do zalecanej przez Farmakopeę Polską metody
HPLC, w przypadku gdy brak jest w danym laboratorium dostępu do takiej aparatury.[1]
Kontynuując badania chromatograficzne półwodnego estradiolu techniką TLC w
połączeniu z densytometrią, w drugim etapie tych badań postanowiono dokładniej sprawdzić
czułość tej metody w aspekcie możliwości dalszego jej zastosowania do identyfikacji i
ilościowego oznaczania estradiolu w preparatach farmaceutycznych zawierających ten
związek jako substancję czynną w znacznie mniejszej ilości czyli na poziomie niższym niż
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
20 | S t r o n a
uprzednio uzyskany tj. 0,14 i 0,41 µg/plamę w zaprezentowanej powyżej publikacji [A-9].
Badania przeprowadzono w układzie NP-TLC z zastosowaniem tym razem dwóch faz
ruchomych benzen-metanol (9:1, v/v) oraz dichlorometan-octan etylu (8:2, v/v) i płytek
chromatograficznych pokrytych różnymi sorbentami: żelem krzemionkowym 60F254, żelem
krzemionkowym 60, mieszaniną żelu krzemionkowego 60F254 i ziemi okrzemkowej F254, a
także tlenkiem glinu 60F254 oraz 150F254. Dodatkowo eksperyment ten rozszerzono o analizę
chromatograficzną estradiolu w odwróconym układzie faz tj. RP-TLC/RP-HPTLC przy
użyciu mieszaniny metanol-woda w stosunku objętościowym 7:3 oraz 9:1 na płytkach
pokrytych żelem krzemionkowym RP-18F254 i RP-8F254 z detekcją densytometryczną przy
długości fali 200 nm [A-9]. Porównanie granicy wykrywalności i oznaczalności badanego
estradiolu w zastosowanych warunkach chromatograficznych dokonano podobnie jak w
omówionym szczegółowo octanie hydrokortyzonu na podstawie średniej ich wartości LOD i
odpowiednio LOQ obliczonej w oparciu o parametry specjalnie sporządzonych krzywych
kalibracji standardowego roztworu estradiolu zgodnie z zaleceniami Konieczki i
Namieśnika.[9]
Otrzymane wyniki wskazują na to, że dobór właściwych warunków
chromatograficznych w proponowanej metodzie TLC w normalnym i odwróconym układzie
faz tj. odpowiedniego sorbenta i składu fazy ruchomej może polepszyć czułość oznaczania
estradiolu techniką TLC. Zastosowana w układzie NP-TLC faza ruchoma dichlorometan-
octan etylu pozwala uzyskać nieco lepsze rezultaty ilościowego oznaczania badanego
estradiolu na żelu krzemionkowym 60F254 niż benzen-metanol (9:1, v/v). Ponadto, co ważne
jest bezpieczniejsza w użyciu (tj. mniej toksyczna) z uwagi na swój skład niż benzen-metanol.
Wykazano, że zastosowanie TLC w odwróconym układzie faz tzn. płytek pokrytych żelem
krzemionkowym RP-8F254 i mieszaniny metanol-woda w stosunku objętościowym 9:1 jest
najbardziej efektywne, bo pozwala wykryć i oznaczyć estradiol na najniższym poziomie,
LOD=0,030 µg/plamę i LOQ=0,093 µg/plamę. Uzyskane wyniki wskazują na przydatność
chromatografii cienkowarstwowej sprzężonej z densytometrią do oznaczania estradiolu na
niskim poziomie tj. w zakresie od 0,093 do 3,930 µg/plamę.
Następny etap badań poświęcony był opracowaniu i walidacji metody TLC w
połączeniu z densytometrią do ilościowego oznaczania mesterolonu [A-10]. To syntetyczny
steroid wykazujący słabe działanie anaboliczne, który stosowany jest przez sportowców w
celu zwiększenia ich wydajności. Należy on do grupy środków zabronionych do stosowania w
sporcie przez WADA (Światową Agencję Antydopingową). Dane literaturowe dotyczące
zastosowania techniki TLC/densytometria do oznaczania mesterolonu w formie tabletek oraz
w postaci substancji czystej nie są zbyt obszerne. Dlatego opracowanie nowej, prostej w
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
21 | S t r o n a
użyciu oraz ekonomicznej metody TLC może być przydatne w aspekcie możliwości dalszego
jej zastosowania w kontroli jakości nie tylko preparatów farmaceutycznych zawierających
mesterolon, ale także produktów nielegalnego pochodzenia stosowanych jako suplementy
diety wśród sportowców. Opracowana metoda została w pełni zwalidowana zgodnie z
wytycznymi ICH oraz innych przewodników walidacji metod analitycznych mających
zastosowanie w analizie farmaceutycznej. Spośród przebadanych wielu warunków
chromatograficznych najbardziej optymalne okazały się: płytki pokryte żelem
krzemionkowym 60F254 do NP-TLC oraz mieszanina chloroform-aceton (40:10, v/v) jako faza
ruchoma. Detekcji densytometrycznej dokonano przy długości fali =745 nm po uprzednim
zastosowaniu 10% etanolowego roztworu kwasu fosforomolibdenowego jako odczynnika
wywołującego i ogrzaniu płytek przez 15 minut w temperaturze 120oC. W warunkach tych
możliwa jest identyfikacja i całkowity rozdział mesterolonu od jego substancji pokrewnej
mogącej stanowić jego zanieczyszczenie (tj. wg Farmakopei Amerykańskiej zanieczyszczenia
A).[2]
Uzyskane plamy pochodzące od mesterolonu oraz jego zanieczyszczenia są zwarte.
Współczynniki opóźnienia wynoszą dla mesterolonu 0,75±0,02 a dla jego zanieczyszczenia
RF=0,66±0,02. Opracowana metoda jest zatem specyficzna i selektywna. Jej liniowość mieści
się w zakresie 100÷1200 ng/plamę. Granica wykrywalności wynosi LOD=61 ng/plamę a
granica oznaczalności (LOQ)=184 ng/plamę, co jest wystarczające do oznaczania przy jej
użyciu mesterolonu w preparatach farmaceutycznych zawierających od 25 do 50 mg
mesterolonu/tabletkę. Metoda ta jest ponadto dokładna i precyzyjna. W obu przypadkach
uzyskano wartości współczynnika zmienności CV<2%. Nie zaobserwowano w badanym
preparacie wpływu substancji współistniejących na wyniki analizy. Na densytogramie obecny
jest tylko jeden pik pochodzący od mesterolonu jako głównego składnika powyższego
preparatu. Wykazano również odporność tej metody w odniesieniu do zastosowanej zmiany
warunków chromatograficznych, takich jak objętości stosowanej fazy ruchomej, czasu
wysycania komory fazą ruchomą, dystansu rozwijania, czasu aktywacji płytek oraz czasu jaki
upłynął od momentu rozwinięcia chromatogramu do wykonania analizy densytometrycznej.
Prezentowana metoda może być skuteczna w rutynowej kontroli preparatów mesterolonu.
Wyznaczona za pomocą tej metody zawartość mesterolonu w badanym preparacie wynosi
99,40% w stosunku do ilości deklarowanej przez producenta preparatu, co jest zgodne z
wymaganiami farmakopealnymi.[1,2]
Podsumowując, można stwierdzić, że chromatografia cienkowarstwowa w połączeniu z
densytometrią może być przydatnym narzędziem w rutynowej kontroli preparatów
zawierających mesterolon jako substancję czynną.
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
22 | S t r o n a
Ocena przydatności chromatografii cienkowarstwowej oraz algorytmów obliczeniowych
do wyznaczania lipofilowości badanych związków
Do parametrów fizykochemicznych wpływających na aktywność farmaceutyczną i
biomedyczną związków organicznych, w tym również badanych steroidów należy
lipofilowość (hydrofobowość). Najczęściej wyrażana jest w postaci współczynnika podziału
lub jego logarytmu (logP). Wartość tego współczynnika określa powinowactwo danej
cząsteczki do fazy lipidowej i wodnej czyli decyduje o określonej zdolności danego związku
chemicznego, w tym leku do jego przenikania przez lipidowe błony komórkowe. Do metod
eksperymentalnych stosowanych do wyznaczania parametru lipofilowości należy klasyczna
ekstrakcja w układzie n-oktanol-woda, która obecnie ze względu na swoje ograniczenia tj.
możliwość wyznaczenia logP tylko w zakresie od -3,0 do +3,0 oraz czasochłonność jest
zastępowana przez metody chromatograficzne, takie jak chromatografia cienkowarstwowa i
wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RP-TLC i RP-
HPLC). Chromatograficzny parametr lipofilowości wyrażany jest w postaci RMW (w
przypadku TLC) oraz odpowiednio w postaci logkw przy zastosowaniu techniki HPLC.[27,28]
Najnowsze doniesienia literaturowe wskazują na przydatność również elektroforezy do
wyznaczania lipofilowości biomolekuł w szerokim zakresie wartości logP.[29]
Obok przedstawionych powyżej metod eksperymentalnych, w badaniach lipofilowości
związków biologicznie aktywnych stosuje się metody teoretyczne czyli oparte na
wyznaczeniu teoretycznej wartości logP w oparciu o odpowiednie algorytmy obliczeniowe
dostępne najczęściej w postaci różnych programów komputerowych.[30,31]
W praktyce, w celu
uzyskania miarodajnego logP, wartości uzyskane metodami obliczeniowymi porównuje się z
doświadczalnymi. Mając na uwadze znaczenie parametru lipofilowości wyznaczonego za
pomocą omówionych metod eksperymentalnych lub odpowiednio obliczeniowych w
przewidywaniu aktywności biologicznej i działania farmakologicznego oraz toksyczności
związków organicznych, w dalszym etapie badań zastosowano chromatografię
cienkowarstwową w odwróconym układzie faz (RP-TLC i RP-HPTLC) do wyznaczania
chromatograficznego parametru lipofilowości badanych steroidów. Chromatograficzny
parametr lipofilowości (RMW) określono na podstawie wartości RF uzyskanych na różnych
nośnikach chromatograficznych tj. na płytkach chromatograficznych pokrytych żelem
krzemionkowym RP-18F254, RP-18WF254, RP-2F254 lub na żelu modyfikowanym DiolF254
przy użyciu faz ruchomych, w skład których wchodziła woda oraz odpowiedni modyfikator
organiczny (m.in. metanol, dioksan, aceton, acetonitryl). Wyznaczone wartości RF
przeliczano zgodnie ze wzorem RM=log[(1/RF)-1] na parametr RM. Uzyskana następnie
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
23 | S t r o n a
liniowa zależność wartości RM od ułamka objętościowego modyfikatora organicznego w fazie
ruchomej () pozwoliła na otrzymanie chromatograficznego parametru lipofilowości RMW wg
równania Soczewińskiego-Wachtmeistera RM = RMW - S×.[27,32]
Ze względu na brak dokładnych danych dotyczących wartości współczynnika podziału
dla taurynowych połączeń badanych kwasów żółciowych (taurocholowego TC,
taurodeoksycholowego TDC, taurochenodeoksycholowego TCDC, oraz taurolitocholowego
TLC), kwasy te poddano badaniom lipofilowości przy użyciu RP-TLC i RP-HPTLC w
różnych warunkach chromatograficznych [A-11]. Wyznaczone wartości RMW oraz dodatkowo
parametru 0 (obliczonego wg wzoru 0=RMW/S) i stanowiącego również miarę lipofilowości
dla związków kongenerycznych wskazują na fakt, że bez względu na zastosowane warunki
chromatograficzne tj. płytki chromatograficzne oraz skład fazy ruchomej lipofilowość
taurynowych połączeń czterech badanych kwasów żółciowych maleje w szeregu:
TLC>TCDCTDC>TC. Obydwa wyznaczone parametry lipofilowości tj. RMW i 0 mogą
posłużyć do oceny lipofilowości badanych związków. Porównanie uzyskanych parametrów
lipofilowości (RMW) z wyznaczonymi teoretycznie za pomocą programu obliczeniowego
(Vega ZZ) współczynnikami podziału (logPvirtual) dla tych związków wskazuje na to, że
największą zgodność z logPvirtual uzyskuje się dla wartości RMW wyznaczonych przy użyciu
fazy ruchomej metanol-woda i zastosowanych płytek chromatograficznych (RP-2F254, RP-
18F254, RP-18WF254). Wyniki powyższych badań potwierdzają przydatność TLC do
wyznaczania lipofilowości mających znaczenie biomedyczne taurynowych połączeń kwasów
żółciowych.
Przedmiotem kolejnego etapu badań poświęconych zastosowaniu techniki TLC w
ocenie lipofilowości różnych steroidów był betametazon (B) oraz jego pochodne tj. 17,21-
dipropionian betametazonu (BP), 17-walerianian betametazonu (BV17), 21-walerianian
betametazonu (BV21) oraz fosforan betametazonu w postaci soli disodowej (BPh) [A-12].
Dane literaturowe wskazują na brak chromatograficznego parametru lipofilowości dla tych
pięciu związków wyznaczonych techniką TLC w odwróconym układzie faz. Ponadto nie ma
dostępnej eksperymentalnej wartości współczynnika podziału (logPexp) dla badanego 17,21-
dipropionianu betametazonu oraz fosforanu (V) betametazonu w postaci soli disodowej. W
toku przeprowadzonych badań lipofilowości zaobserwowano wpływ fazy ruchomej i sorbenta
na wyznaczone wartości RMW. Porównanie uzyskanych wyników RMW dla badanych
glikokortykosteroidów w różnych warunkach chromatograficznych tzn. na płytkach RP-8F254,
RP-18WF254 oraz RP-8F254 przy użyciu faz ruchomych: metanol-woda, dioksan-woda oraz
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
24 | S t r o n a
acetonitryl-woda za pomocą analizy podobieństwa wskazuje na zbliżony charakter lipofilowy
BP, BV17 oraz BV21 wyrażony za pomocą RMW we wszystkich zastosowanych warunkach
chromatograficznych. Fazą rekomendowaną do dalszych badań nad lipofilowością tej grupy
związków może być metanol-woda, dzięki której wartości RMW są najbardziej miarodajne tj.
zbliżone do eksperymentalnych współczynników podziału, jak również do teoretycznych logP
wyznaczonych za pomocą programu ChemDraw oraz innych algorytmów obliczeniowych:
AlogPs, xlogP2, xlogP3, AClogP, AlogP, logPKOWWIN, MlogP oraz ich wartości średniej
logPśrednie.[33]
Podobne obserwacje uzyskano dla fazy ruchomej dioksan-woda. Z kolei B i BPh
wykazują podobieństwo do siebie jedynie w wartościach logP otrzymanych za pomocą
algorytmów obliczeniowych: AlogPs, xlogP2, logPChemDraw i logPśrednie. Wyniki tych badań
potwierdzają ważną rolę chromatograficznego parametru lipofilowości RMW w ocenie
lipofilowości badanych glikokortykosteroidów w odniesieniu do teoretycznych wartości logP,
które w ich przypadku obarczone są dużym błędem obliczeniowym, co znacznie wpływa na
wartość średnią logP i powoduje różnice w interpretacji tego parametru.
W kolejnej pracy poświęconej chromatograficznym badaniom lipofilowości
wybranych steroidów, wyznaczono parametr lipofilowości (RMW) techniką RP-TLC i RP-
HPTLC w różnych warunkach chromatograficznych dla steroidu o działaniu moczopędnym
czyli spironolaktonu [A-13]. Stwierdzono podobieństwo pomiędzy wartościami RMW
otrzymanymi na płytkach RP-2F254, RP-18F254 oraz RP-18WF254 przy użyciu faz ruchomych
dioksan-woda i aceton-woda. Parametry te tworzą na dendrogramie podobieństwa jedno
wyraźne skupienie. Wśród uzyskanych wyników największą zgodność z eksperymentalnym
współczynnikiem podziału (logPexp) wykazuje RMW wyznaczony na płytkach RP-2F254 i RP-
18F254 z zastosowaniem fazy ruchomej dioksan-woda. Otrzymane techniką TLC wartości
chromatograficznego parametru lipofilowości porównano z uzyskanymi w podobnych
warunkach czyli przy użyciu tych samych faz ruchomych: metanol-woda oraz dioksan-woda
wartościami logkw czyli parametru lipofilowości wyznaczonego techniką RP-HPLC z
zastosowaniem kolumny RP-18. W tym przypadku najbardziej optymalna do wyznaczenia
chromatograficznego parametru lipofilowości okazała się również mieszanina metanol-woda
jako faza ruchoma, która pozwala uzyskać wartości logkw zbliżone do logPexp. Oprócz
chromatograficznego parametru lipofilowości, w pracy tej dokonano oceny przydatności
współczynników podziału logP wyznaczonych za pomocą różnych algorytmów
obliczeniowych: AlogPs, AlogP, AClogP, MlogP, logPKOWWIN, xlogP2, xlogP3 oraz trzech
nowych parametrów lipofilowości wyrażonych jako współczynniki podziału logP1, logP2 i
logP3, które obliczono na podstawie odpowiednich indeksów topologicznych opartych na
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
25 | S t r o n a
macierzy sąsiadowania Gutmana M, Randica
0 oraz macierzy odległości Pyki
0B,
1B,
Wienera W i Balabana IB dla badanego spironolaktonu.[33-37]
Spośród teoretycznych
współczynników podziału najbardziej zbliżone do logPexp okazały się logPKOWWIN, xlogP3
oraz nowy, oparty na indeksie Pyki tj. 0B współczynnik podziału logP1.
Powyższe wyniki wskazują na przydatność chromatografii cieczowej, cienkowarstwowej i
wysokosprawnej w odwróconym układzie faz oraz nowych, opartych na indeksach
topologicznych współczynników podziału do oceny lipofilowości spironolaktonu.
3.3.4. Podsumowanie wyników badań stanowiących podstawę habilitacji i wnioski
Przeprowadzone badania pozwoliły sformułować następujące wnioski:
opracowane, zoptymalizowane procedury TLC w normalnym i odwróconym układzie faz
pozwalają w sposób prosty i efektywny na rozdział i badanie tożsamości oraz czystości
steroidów mających znaczenie biomedyczne, w tym wybranych fitosteroli, wolnych
kwasów żółciowych oraz ich połączeń z tauryną i glicyną, a także mających znaczenie
farmaceutyczne: kwasu ursodeoksycholowego, betametazonu i jego pochodnych w
preparatach farmaceutycznych w obecności innych substancji współobecnych w tych
preparatach,
analiza pasm chromatograficznych wybranych fitosteroli badanych techniką TLC w
połączeniu z densytometrią z użyciem różnych warunków detekcji, w tym różnych
odczynników wywołujących oraz czasu skanowania densymetrycznego od momentu ich
wizualizacji jest pomocna nie tylko w badaniu tożsamości, ale również w ocenie trwałości
chemicznej tych związków,
zwalidowane procedury TLC w połączeniu z densytometrią są szybkie w wykonaniu,
dokładne i spełniają wymagania stawiane metodom analitycznym mającym zastosowanie
w rutynowej kontroli laboratoryjnej preparatów farmaceutycznych zawierających w
swoim składzie: kwas ursodeoksycholowy, octan hydrokortyzonu, estradiol oraz
mesterolon,
analiza retencji chromatograficznej w odwróconym układzie faz (RP-TLC i RP-HPTLC)
wybranych taurynowych połączeń kwasów żółciowych, betametazonu i jego substancji
pokrewnych oraz spironolaktonu pozwala na wyznaczenie właściwości lipofilowych tych
związków,
porównanie chromatograficznego parametru lipofilowości (RMW) wyznaczonego w
różnych warunkach z teoretyczną wartością logP dostępną w bazach danych czyli ze
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
26 | S t r o n a
współczynnikami podziału wyznaczonymi za pomocą odpowiednich algorytmów
obliczeniowych pozwala uzyskać miarodajne wyniki lipofilowości badanych steroidów,
metody chemometryczne, do których należy analiza podobieństwa (metoda pojedynczego
wiązania, odległość Euklidesowa) są pomocne w interpretacji różnych wyników
uzyskiwanych podczas analizy steroidów techniką TLC.
Reasumując, przeprowadzone badania i wynikające z nich wnioski mogę stwierdzić, że do
najważniejszych osiągnięć i nowości naukowej wynikających z przeprowadzonych badań
należy:
opracowanie i zoptymalizowanie nowych procedur analitycznych z użyciem TLC w
normalnym i odwróconym układzie faz do rozdziału i badania tożsamości wybranych
steroidów o różnym działaniu farmakologicznym w postaci substancji czystej oraz w
preparatach farmaceutycznych,
wykazanie, że analiza TLC w połączeniu z densytometrią badanych fitosteroli tj. β-
sitosterolu i stigmasterolu może być pomocnym narzędziem nie tylko w rutynowej
kontroli jakości preparatów zawierających powyższe fitosterole, ale także we wstępnej
ocenie ich chemicznej trwałości,
przeprowadzenie walidacji nowoopracowanych procedur TLC w połączeniu z
densytometrią do oznaczania kwasu ursodeoksycholowego, octanu hydrokortyzonu,
estradiolu oraz mesterolonu w ich preparatach farmaceutycznych,
wykazanie, że opracowane i zwalidowane metody identyfikacji i ilościowego oznaczania
wybranych steroidów spełniają wymagania jakie stawiane są metodom analitycznym
mającym zastosowanie w analizie farmaceutycznej i z powodzeniem mogą być
wykorzystane jako metody alternatywne do tych zalecanych przez Farmakopeę,
wykazanie przydatności TLC w odwróconym układzie faz oraz metod obliczeniowych do
wyznaczenia lipofilowości badanych steroidów, w szczególności tych, dla których brak
jest informacji na temat eksperymentalnego logP,
wykazanie przydatności wybranych indeksów topologicznych do wyznaczania wartości
logP dla spironolaktonu,
wykazanie przydatności analizy podobieństwa do optymalizacji warunków rozdziału i
identyfikacji badanych steroidów techniką TLC oraz do oceny ich lipofilowości.
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
27 | S t r o n a
4. Pozostałe osiągnięcia naukowo - badawcze
4.1. Działalność naukowo-badawcza przed uzyskaniem stopnia naukowego
doktora
Swoje zainteresowania naukami przyrodniczymi rozwijałam od najmłodszych lat. Po
ukończeniu Liceum Ogólnokształcącego im. Mikołaja Kopernika w Tarnobrzegu (profil
biologiczno-chemiczny) w 1994 podjęłam studia na Wydziale Chemicznym Politechniki
Śląskiej w Gliwicach na kierunku technologia chemiczna, podczas których poszerzałam swoją
wiedzę nie tylko z dziedziny chemii, ale także biotechnologii i ochrony środowiska.
Natomiast kwalifikacje pedagogiczne uprawniające mnie do nauczania przedmiotu chemia
nabyłam jeszcze podczas studiów w Studium Pedagogicznym przy Politechnice Śląskiej w
Gliwicach. Praca magisterska pt. „Badania dynamiki procesu adsorpcji mocznika na węglach
aktywnych i zeolitach” wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. inż. Jerzego Piotrowskiego w
Instytucie Chemii, Technologii Nieorganicznej i Elektrochemii prezentowała wyniki badań,
których celem było porównanie zdolności adsorpcji mocznika na różnych sorbentach
węglowych i mineralnych w zakresie stężeń odpowiadających warunkom przemysłowym. Po
ukończeniu studiów, od 1 października 1999 podjęłam pracę w Śląskim Uniwersytecie
Medycznym (dawniej w Śląskiej Akademii Medycznej) na stanowisku asystenta w Katedrze i
Zakładzie Chemii Ogólnej i Analitycznej Wydziału Farmaceutycznego w Sosnowcu, gdzie
oprócz pracy dydaktycznej prowadziłam prace badawcze z zakresu chemii analitycznej. W
ramach pracy naukowej początkowo realizowałam temat badawczy związany z adsorpcją
barwników stosowanych w przemyśle włókienniczym i w kosmetyce na alkalitioligninie.
Temat ten realizowałam pod kierunkiem prof. dr hab. n. tech. Władysława Wardasa,
ówczesnego kierownika Katedry i Zakładu Chemii Ogólnej i Analitycznej we współpracy z
Zakładem Biochemii Uniwersytetu M. Curie-Skłodowskiej w Lublinie, kierowanym przez
prof. dr hab. Elżbietę Malarczyk. Z kolei w ramach współpracy z Katedrą i Zakładem
Żywności i Żywienia Wydziału Farmaceutycznego SUM (wówczas ŚAM) uczestniczyłam w
badaniach w zespole kierowanym przez prof. dr hab. n. med. Marię Wardas, dotyczących
wpływu jonów magnezu i fluorkowych oraz etanolu na metabolizm oksydacyjno-redukcyjny
w izolowanych hepatocytach szczura. Wyniki badań poświęconych procesowi adsorpcji
barwników włókienniczych oraz tych przeprowadzonych na hepatocytach szczura były
zaprezentowane na kilku konferencjach o zasięgu międzynarodowym i krajowym, jak
również zostały opublikowane w punktowanych czasopismach naukowych, w których jestem
współautorem. Później, głównym obszarem moich zainteresowań badawczych realizowanych
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
28 | S t r o n a
pod opieką prof. dr hab. Aliny Pyki-Pająk, prof. zw. SUM, kierownika Zakładu Chemii
Analitycznej Wydziału Farmaceutycznego SUM była optymalizacja warunków rozdziału i
identyfikacji wybranych kwasów żółciowych techniką chromatografii cieczowej oraz
zastosowanie zarówno chromatografii cieczowej jak i niektórych deskryptorów strukturalnych
w analizie QSRR, QSAR i QSPR kwasów żółciowych ze szczególnym uwzględnieniem
badań lipofilowości tych związków. Rezultaty badań nad kwasami żółciowymi
przeprowadzone z użyciem techniki HPLC oraz wyniki badań techniką GC wykorzystaną
przeze mnie w analizie również innych związków biologicznie aktywnych, w tym na przykład
olejków eterycznych powstały we współpracy z Instytutem Chemii Uniwersytetu Śląskiego w
Katowicach. Efektem w/w badań chromatograficznych są publikacje naukowe i doniesienia
konferencyjne. Ponadto część z nich stanowiła podstawę rozprawy doktorskiej pt.
„Porównanie rozdziału oraz właściwości lipofilowych wybranych kwasów żółciowych
badanych chromatografią cieczową”.
Mój dorobek naukowy przed uzyskaniem stopnia naukowego doktora obejmuje 11
artykułów, w tym 7 oryginalnych publikacji naukowych o sumarycznym wskaźniku Impact
Factor 2,254 i punktacji MNiSW 59 oraz 6 opublikowanych streszczeń pokonferencyjnych
(Załącznik 3a).
4.1.1. Wykaz oryginalnych publikacji naukowych opublikowanych przed
uzyskaniem stopnia naukowego doktora
oryginalne prace badawcze opublikowane w czasopismach posiadających punktację
Impact Factor
B-1. A. Pyka, M. Dołowy
Lipophilicity of selected bile acids as determined by TLC. I, Journal of Liquid
Chromatography & Related Technologies 26 (2003) 2741-2750
wskaźnik Impact Factor: 0,709, punktacja MNiSW: 15
B-2. A. Pyka, M. Dołowy
Separation of selected bile acids by TLC. I, Journal of Liquid Chromatography & Related
Technologies 26 (2003) 1095-1108
wskaźnik Impact Factor: 0,709, punktacja MNiSW: 15
B-3. A. Pyka, M. Dołowy Separation of selected bile acids by TLC. II. One-dimensional and two-dimensional TLC.
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 27 (2004) 2031-2038
wskaźnik Impact Factor: 0,836, punktacja MNiSW: 15
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
29 | S t r o n a
oryginalne prace badawcze opublikowane w czasopismach krajowych i
międzynarodowych bez punktacji Impact Factor
G-1. E. Malarczyk, A. Jarosz-Wilkołazka, J. Kochmańska-Rdest, W. Wardas, M. Dołowy, A.
Leonowicz
Decolorization of basic blue 22 dye, adsorbed or not on AT-lignin, by fungal mycelium,
Biotechnology 3 (2000) 418-420
punktacja MNiSW: 3
G-2. W. Wardas, A. Makowski, W. Baran, M. Dołowy
Fotokatalityczna degradacja tekstylnych barwników azotowych: oranżu II, oranżu I, czerwieni
Kongo i błękitu anilanowego GRL, Chemia i Inżynieria Ekologiczna 9 (2002) 789-799
punktacja MNiSW: 4
G-3. E. Niedworok, M. Wardas, M. Stec, M. Dołowy
Ocena procesu peroksydacji lipidów modyfikowanego jonami magnezu i etanolem w
izolowanych hepatocytów szczura, Nowiny Lekarskie 71 (2002) 295-298
punktacja MNiSW: 3
G-4. W. Wardas, M. Dołowy, W. Baran, A. Makowski, E. Malarczyk, A. Jarosz-Wilkołazka
Adsorpcja wybranych barwników stosowanych w kosmetyce i przemyśle włókienniczym na
alkalitioligninie, Chemia i Inżynieria Ekologiczna 10 (2003) 153-160
punktacja MNiSW: 4
4.2. Działalność naukowo-badawcza po uzyskaniu stopnia naukowego doktora
Pracę doktorską obroniłam w 2004 w Instytucie Chemii, Wydziału Matematyki, Fizyki i
Chemii, Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach. Promotorem rozprawy doktorskiej była prof.
dr hab. Alina Pyka-Pająk, prof. zw. SUM, a recenzentami prof. zw. dr hab. Jan Różyło oraz
prof. zw. dr hab. Józef Śliwiok. Na podstawie rozprawy doktorskiej opublikowałam kolejne
prace dotyczące analizy wolnych i związanych z glicyną kwasów żółciowych techniką
chromatografii cieczowej. Po otrzymaniu stopnia doktora nauk chemicznych swoje
zainteresowania koncentrowałam nadal nad oceną przydatności różnych technik
analitycznych, w tym w szczególności chromatografii cienkowarstwowej (TLC) oraz
TLC/densytometrii w analizie farmaceutycznej tj. badaniu tożsamości, trwałości oraz
zawartości wybranych steroidów nie tylko o działaniu żółciotwórczym czyli kwasów
żółciowych wolnych i związanych z tauryną, ale rozszerzyłam je o inne badane związki
należące do grupy steroidów, wykazujące m.in. działanie przeciwzapalne, diuretyczne i
anaboliczno-androgenne. Opracowałam optymalne warunki chromatograficzne TLC w
połączeniu z densytometrią w normalnym i odwróconym układzie faz do potwierdzenia
tożsamości oraz oznaczania zawartości różnych steroidów jako aktywnych składników w ich
preparatach farmaceutycznych, prostych lub odpowiednio złożonych oraz w postaci
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
30 | S t r o n a
substancji czystej w obecności ich substancji pokrewnych (tj. potencjalnych zanieczyszczeń).
Opracowane procedury ilościowego oznaczania badanych steroidów z użyciem
TLC/densytometrii zostały poddane walidacji zgodnie z zaleceniami przewodników walidacji.
Wykazałam również przydatność chromatografii cienkowarstwowej sprzężonej z
densytometrią oraz spektroskopii EPR w ocenie trwałości wybranych steroidów z grupy
kwasów żółciowych oraz fitosteroli. Innym nurtem prowadzonych przeze mnie badań było
ocena przydatności chromatografii cieczowej (TLC i HPLC) oraz algorytmów
obliczeniowych do wyznaczania wybranych właściwości fizykochemicznych analizowanych
steroidów, w tym w szczególności ich charakteru lipofilowego. Wykorzystałam również
modelowanie komputerowe do określenia miejsca i siły wiązania się przedstawicieli
analizowanych steroidów z grupy związków o charakterze anaboliczno-androgennym z
białkiem na drodze tzw. dokowania molekularnego. Wyniki otrzymane na drodze procesu
dokowania porównałam z ich właściwościami lipofilowymi wyznaczonymi różnymi
metodami tj. chromatograficzną i obliczeniową. W przeprowadzonych badaniach wykazałam
również przydatność prostych technik chemometrycznych tj. analizy podobieństwa (metoda
pojedynczego wiązania, odległość Euklidesowa) jako narzędzia przydatnego do oceny
rozdziału i porównania właściwości lipofilowych badanych steroidów uzyskanych techniką
chromatografii cieczowej (TLC lub HPLC) oraz metodami teoretycznymi tzn.
obliczeniowymi. Część wyników tych badań przedstawiłam w postaci cyklu publikacji
stanowiących podstawę postępowania habilitacyjnego.
Obecnie kontynuuję badania w zakresie opracowania nowych procedur analitycznych
pozwalających w sposób prosty w użyciu, szybki i skuteczny jakościowo i ilościowo
oznaczać kolejne steroidy w ich preparatach handlowych, jak na przykład finasteryd –
składnik preparatów farmaceutycznych stosowanych w leczeniu raka gruczołu krokowego
oraz nie przebadane jeszcze przeze mnie inne steroidy o charakterze anaboliczno-
androgennym z użyciem chromatografii cieczowej TLC/densytometrii, jak również ultra
wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UHPLC) sprzężonej z detektorem wyładowań
koronowych Corona CAD.
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
31 | S t r o n a
4.2.1. Wykaz oryginalnych publikacji naukowych opublikowanych po uzyskaniu
stopnia naukowego doktora (niezwiązanych z habilitacją)
oryginalne prace badawcze opublikowane w czasopismach posiadających punktację
Impact Factor
D-1. A. Pyka, M. Dołowy
Separation of selected bile acids by TLC. III. Separation on various stationary phases, Journal
of Liquid Chromatography & Related Technologies 27 (2004) 2613-2623
wskaźnik Impact Factor: 0,836, punktacja MNiSW: 15
D-2. A. Pyka, M. Dołowy
Separation of selected bile acids by TLC. IV. Comparison of separation of studied bile acids
by the use of cluster analysis, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 27
(2004) 2987-2995
wskaźnik Impact Factor: 0,836, punktacja MNiSW: 15
D-3. A. Pyka, M. Dołowy
Lipophilicity of selected bile acids as determination by TLC. II. Investigations on RP18W
stationary phase, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 28 (2005) 297-
311
wskaźnik Impact Factor: 0,814, punktacja MNiSW: 20
D-4. A. Pyka, M. Dołowy
Lipophilicity of selected bile acids as determined by TLC. III. Investigations on RP2
stationary phase, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 28 (2005) 1765-
1775
wskaźnik Impact Factor: 0,814, punktacja MNiSW: 20
D-5. A. Pyka, M. Dołowy, D. Gurak
Lipophilicity of selected bile acids, as determined by TLC. IV. Investigations on CNF254
stationary phase, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 17 (2005) 2705-
2717
wskaźnik Impact Factor: 0.814, punktacja MNiSW: 20
D-6. A. Pyka, M. Dołowy, D. Gurak
Separation of selected bile acids by TLC. V. Influence of temperature on the separation,
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 28 (2005) 631-640
wskaźnik Impact Factor: 0,814, punktacja MNiSW: 20
D-7. A. Pyka, M. Dołowy
Separation of selected bile acids by TLC. VI. Separation on cyano- and diol-modified silica
layers, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 28 (2005) 1383-1392
wskaźnik Impact Factor: 0,814, punktacja MNiSW: 20
D-8. A. Pyka, M. Dołowy
Separation of selected bile acids by TLC. VII. Separation by reversed partition HPTLC,
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 28 (2005) 1573-1581
wskaźnik Impact Factor: 0,814, punktacja MNiSW: 20
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
32 | S t r o n a
D-9. A. Pyka, M. Dołowy, D. Gurak
Separation of selected bile acids by TLC. VIII. Separation on silica gel 60F254 glass plates
impregnated with Cu(II), Ni(II), Fe(II), and Mn(II) cations, Journal of Liquid
Chromatography & Related Technologies 28 (2005) 2273-2285
wskaźnik Impact Factor: 0,814, punktacja MNiSW: 20
D-10. A. Pyka, M. Dołowy, D. Gurak
Use of selected structural descriptors for evaluation of the lipophilicity of bile acids
investigated by RP HPTLC, Journal of Planar Chromatography - Modern TLC 18 (2005) 465-
470
wskaźnik Impact Factor: 0,667, punktacja MNiSW: 20
D-11. M. Dołowy
Separation of selected bile acids by TLC. IX. Separation on silica gel 60 and on silica gel
60F254 aluminum plates impregnated with Cu(II), Ni(II), Fe(II), and Mn(II) cations, Journal of
Liquid Chromatography & Related Technologies 30 (2007) 405-418
wskaźnik Impact Factor: 0,977, punktacja MNiSW: 20
D-12. A. Pyka, D. Nabiałkowska, K. Bober, M. Dołowy
Comparison of NP-TLC and RP-TLC with densitometry to quantitative analysis of tocopherol
acetate in pharmaceutical preparation, Journal of Liquid Chromatography & Related
Technologies 34 (2011) 2548-2564
wskaźnik Impact Factor: 0,706, punktacja MNiSW: 20
D-13. A. Pyka, M. Budzisz, M. Dołowy
Validation thin layer chromatography for the determination of acetaminophen in tablets and
comparison with a pharmacopeial method, BioMed Research International vol. 2013 (2013)
1-10, ID 545703
wskaźnik Impact Factor: 2,706 punktacja MNiSW: 30
D-14. M. Dołowy, M. Miszczyk, A. Pyka
Application of various methods to determine the lipophilicity parameters of the selected urea
pesticides as predictors of their bioaccumulation, Journal of Environmental Science and
Health, Part B: Pesticides, Food Contaminants, and Agricultural Wastes 49 (2014) 730-737
wskaźnik Impact Factor: 1,202, punktacja MNiSW: 20
D-15. M. Dołowy, P. Ramos, B. Pilawa
Effect of UV irradiation and temperature on free radical properties in dehydrocholic and
ursodeoxycholic acids: an EPR study, International Journal of Photoenergy vol. 2014 (2014)
1-7, ID 953619
wskaźnik Impact Factor: 1.563, punktacja MNiSW: 10
D-16. M. Miszczyk, M. Płonka, K. Bober, M. Dołowy, A. Pyka, K. Pszczolińska
Application of chemometric analysis based on physicochemical and chromatographic data for
the differentiation origin of plant protection products containing chlorpyrifos, Journal of
Environmental Science and Health, Part B: Pesticides, Food Contaminants, and Agricultural
Wastes 50 (2015) 744-751
wskaźnik Impact Factor: 1,202, punktacja MNiSW: 20
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
33 | S t r o n a
D-17. M. Dołowy, A. Pyka
Validation of an RPHPTLC-densitometric method using silica gel 60 RP18WF254 for
simultaneous determination of nicotinamide in selected pharmaceutical formulations, Journal
of Analytical Methods in Chemistry vol. 2015 (2015) 1-9, ID 631025
wskaźnik Impact Factor: 0,792, punktacja MNiSW: 25
D-18. M. Dołowy, A. Pyka
Lipophilicity study of salicylic and acetylsalicylic acids using both experimental and
calculations methods, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 38 (2015)
485-491
wskaźnik Impact Factor: 0,606, punktacja MNiSW: 15
prace poglądowe opublikowane w czasopismach posiadających punktację Impact
Factor
F-1. M. Dołowy, A. Pyka
Application of TLC, HPLC and GC methods to the study of amino acid and peptide
enantiomers: a review, Biomedical Chromatography 28 (2014) 84-101
wskaźnik Impact Factor: 1,723, punktacja MNiSW: 20
F-2. M. Dołowy, A. Pyka
Chromatographic methods in the separation of long-chain mono- and polyunsaturated fatty
acids, Journal of Chemistry vol. 2015 (2015) 1-20, ID 120830
wskaźnik Impact Factor: 0,696, punktacja MNiSW: 15
oryginalne prace badawcze opublikowane w czasopismach krajowych i
międzynarodowych bez punktacji Impact Factor
H-1. A. Pyka, M. Dołowy
Application of structural descriptors for the evaluation of some physicochemical properties of
selected bile acids, Acta Poloniae Pharmaceutica Drug Research 61 (2004) 407-413
punktacja MNiSW: 6
H-2. M. Ł. Goniewicz, M. Dołowy, A. Smętek, B. Koszowski
Ocena trendów sprzedaży preparatów nikotynowej terapii zastępczej (NTZ) w
ogólnodostępnych aptekach na terenie województwa śląskiego i małopolskiego
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy 5 (2008) 45-47
punktacja MNiSW: 6
H-3. M. Dołowy Application of selected topological indices to predict retention parameters of selected bile
acids separated on modified TLC plates
Acta Poloniae Pharmaceutica Drug Research 65 (2008) 51-57
punktacja MNiSW: 9
H-4. M. Dołowy Rozdział mieszaniny wybranych kwasów żółciowych techniką TLC na płytkach
aluminiowych pokrytych mieszaniną żelu krzemionkowego 60 i ziemi okrzemkowej F254
impregnowanych kationami Cu(II), Ni(II), Fe(II) oraz Mn(II), Farmaceutyczny Przegląd
Naukowy 5 (2008) 34-37
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
34 | S t r o n a
punktacja MNiSW: 6
H-5. M. Dołowy Badanie tożsamości kwasu ursodeoksycholowego w wybranych preparatach
farmaceutycznych techniką NP-TLC, Farmacja Polska 64 (2008) 753-758
punktacja MNiSW: 6
H-6. M. Dołowy
Chromatograficzny rozdział i identyfikacja taurynowych połączeń wybranych kwasów
żółciowych w ich mieszaninie, Farmaceutyczny Przegląd Naukowy 6 (2009) 21-25
punktacja MNiSW: 4
H-7. M. Dołowy
Investigation of identity of dehydrocholic acid in selected pharmaceutical formulations with
the use of NP-TLC method, Annales Universitatis Mariae Curie Skłodowska Sectio DDD
Pharmacia 22 (2009) 67-73
punktacja MNiSW: 6
H-8. M. Dołowy
Wyznaczanie lipofilowości acidum dehydrocholicum różnymi metodami, Farmacja Polska 65
(2009) 689-693
punktacja MNiSW: 4
H-9. M. Dołowy
Zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej do identyfikacji spironolaktonu w
wybranych preparatach farmaceutycznych, Farmacja Polska 66 (2010) 313-317
punktacja MNiSW: 6
H-10. M. Babuśka-Roczniak, M. Dołowy, G. Janikowska, A. Pyka
Influence of impregnation of silica gel with copper (II) sulfate on the RF values and profile
change of the spectrodensitograms of selected steroid compounds, Current Topics in Steroid
Research 9 (2012) 73-82
punktacja MNiSW: 0
H-11. M. Dołowy
Qualitative and quantitative analysis of diosgenin in pure substance by TLC-densitometry,
Current Issues in Pharmacy and Medical Sciences (formalnie Annales Universitatis Mariae
Curie Skłodowska Sectio DDD Pharmacia) 25 (2012) 310-316
punktacja MNiSW: 7
H-12. A. Pyka, M. Porwoł, M. Dołowy
Porównanie wartości parametrów lipofilowości paracetamolu uzyskane różnymi sposobami,
Farmacja Polska 68 (2012) 563-568
punktacja MNiSW: 3
H-13. A. Pyka, M. Dołowy, K. Bober
Zastosowanie metody spektrofotometrii do oznaczania paracetamolu w tabletkach, Farmacja
Polska 68 (2012) 13-17
punktacja MNiSW: 3
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
35 | S t r o n a
H-14. M. Dołowy
Lipophilicity study of ursodeoxycholic acid, Current Issues in Pharmacy and Medical
Sciences (formalnie Annales Universitatis Mariae Curie Skłodowska Sectio DDD Pharmacia),
25 (2012) 29-33
punktacja MNiSW: 7
H-15. M. Dołowy, A. Pyka-Pająk, K. Filip, J. Zagrodzka
TLC-densitometric analysis of α-escin in bulk drug substance and in pharmaceutical dosage
forms, Current Issues in Pharmacy and Medical Sciences (formalnie Annales Universitatis
Mariae Curie Skłodowska Sectio DDD Pharmacia) 28 (2015) 186-191
punktacja MNiSW: 7
H-16. M. Dołowy, A. Pyka-Pająk, Jakub Cholewa, Denis Swolana, Mateusz Chyłka.
Wyznaczenie lipofilowości propionianu klobetazolu oraz klobetazolu przy użyciu TLC oraz
metod obliczeniowych, Farmacja Polska 71 (2015) 603-608
punktacja MNiSW: 8
rozdziały w podręcznikach
I-1. A. Pyka, M. Budzisz, M. Dołowy
Zastosowanie TLC i densytometrii do ilościowego oznaczania paracetamolu w wybranych
preparatach farmaceutycznych, Chromatografia w praktyce/Praca zbiorowa pod red.: A.
Voelkela, W. Wasiaka/ Wydaw. Politechniki Poznańskiej (2011) 137-147, ISBN: 978-83-
7775-084-1
punktacja MNiSW: 4
I-2. M. Dołowy
Porównanie lipofilowości wybranych substancji o działaniu anabolicznym wyznaczonej
techniką TLC oraz przy użyciu metod obliczeniowych, W: Chromatografia w praktyce/Praca
zbiorowa pod red.: A. Voelkela, W. Wasiaka/Wydaw. Politechniki Poznańskiej (2011) 125-
135, ISBN: 978-83-7775-084-1
punktacja MNiSW: 4
I-3. M. Dołowy, M. Pacholczyk
Ocena procesu wiązania się wybranych anabolików z białkami krwi z wykorzystaniem
dokowania molekularnego, W: Chemometria w rozwiązywaniu problemów nauki i praktyki/
Praca zbiorowa pod red.: G. Zadory, D. Zuby, A. Parczewskiego/ Wydawnictwo Instytutu
Ekspertyz Sądowych (2014) 223-229, ISBN: 978-83-87425-04-3
punktacja MNiSW: 4
I-4. M. Dołowy, M. Miszczyk, A. Pyka.
Zastosowanie analizy podobieństw do oceny właściwości lipofilowych wybranych
pestycydów, Chemometria w rozwiązywaniu problemów nauki i praktyki/Praca zbiorowa pod
red.: G. Zadory, D. Zuby, A. Parczewskiego/ Wydawnictwo Instytutu Ekspertyz Sądowych
(2014) 247-252, ISBN: 978-83-87425-04-3
punktacja MNiSW: 4
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
36 | S t r o n a
Poza tym, jestem również współautorem 23 artykułów dokumentujących działalność
naukowo-szkoleniową oraz organizacyjną katowickiego oddziału PTFarm na rzecz lokalnego
środowiska farmaceutycznego (Załącznik 3a).
4.2.2. Współpraca z jednostkami naukowymi
W toku prowadzonych przeze mnie badań naukowych związanych z analizą farmaceutyczną
wybranych steroidów wykazujących różną aktywność biologiczną i działanie lecznicze
kontynuowałam w początkowym okresie współpracę w zakresie analizy chromatograficznej
TLC i HPLC z Instytutem Chemii, Wydziału Matematyki, Fizyki i Chemii Uniwersytetu
Śląskiego w Katowicach. Aktualnie współpracuję w tym obszarze, mianowicie w kierunku
wykorzystania techniki UHPLC-CAD do analizy farmaceutycznej steroidów anaboliczno-
androgennych z Zakładem Analityki Badawczej, Instytutu Farmaceutycznego w Warszawie.
Natomiast dokowanie molekularne wykorzystywane w ocenie procesu wiązania się z
białkami krwi badanych przeze mnie anabolików oraz wybranych steroli wykonałam dzięki
współpracy z Instytutem Automatyki, Wydziału Automatyki, Elektroniki i Informatyki
Politechniki Śląskiej w Gliwicach. Z kolei część badań poświęconych zastosowaniu
spektroskopii EPR do oceny trwałości wybranych steroidów należących do grupy kwasów
żółciowych przeprowadziłam dzięki współpracy z Katedrą i Zakładem Biofizyki, Wydziału
Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM w Sosnowcu. Od kilku lat
współpracuję również z Laboratorium Badania Jakości Środków Ochrony Roślin, Instytutu
Ochrony Roślin, Państwowego Instytutu Badawczego, Oddziału w Sośnicowicach w zakresie
zastosowania technik chromatograficznych oraz chemometrii do oceny wybranych
właściwości fizykochemicznych środków ochrony roślin z grupy pestycydów stanowiących
pochodne mocznika. Obecnie jestem zaangażowana w realizację projektu związanego z
poszukiwaniem metod, w tym chemometrycznych, które okazałyby się cennym narzędziem w
kontroli jakości środków ochrony roślin narażonych na fałszowanie.
Podsumowując, efektem mojej działalności naukowo-badawczej po uzyskaniu stopnia
doktora nauk chemicznych jest autorstwo i współautorstwo prac o sumarycznym wskaźniku
Impact Factor 30,223 i punktacji MNiSW 708, w tym 49 oryginalnych publikacji naukowych,
dwóch prac poglądowych w czasopismach posiadających wskaźnik IF 2,419 (MNiSW 35), 4
rozdziałów w podręcznikach krajowych oraz 48 streszczeń pokonferencyjnych. Ponadto
jestem współautorem 23 artykułów dokumentujących działalność naukowo-szkoleniową oraz
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
37 | S t r o n a
organizacyjną katowickiego oddziału PTFarm na rzecz lokalnego środowiska
farmaceutycznego (Załącznik 3a).
4.2.3. Nagrody i wyróżnienia za działalność naukowo-badawczą
1. Zespołowa Nagroda I Stopnia Rektora Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach w
zakresie działalności naukowej za cykl prac dotyczących: „Rozdziału, oceny lipofilowości
oraz przewidywania parametrów retencji i aktywności biologicznej wybranych kwasów
żółciowych, alkoksyfenoli, barbituranów, anilidów oraz kwasów i witamin tłuszczowych”
(2004).
2. Zespołowa Nagroda I Stopnia Rektora Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach w
zakresie działalności naukowej za cykl prac na temat: ”Opracowanie warunków rozdziału
chromatograficznego oraz ocena właściwości lipofilowych wybranych związków
biologicznie aktywnych” (2006).
3. Zespołowa Nagroda I Stopnia Rektora Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w
Katowicach w zakresie działalności naukowej w zakresie problemu badawczego:
„Zastosowanie TLC i densytometrii w analizie związków biologicznie aktywnych” (2008).
4. Zespołowa Nagroda I Stopnia Rektora Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w
Katowicach w zakresie działalności naukowej za cykl publikacji dotyczących
„Zastosowania TLC w połączeniu z densytometrią do oceny właściwości lipofilowych
oraz ilościowego oznaczania substancji biologicznie aktywnych w preparatach
farmaceutycznych” (2011).
5. Zespołowa Nagroda I Stopnia Rektora Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w
Katowicach w zakresie działalności naukowej za prace pt. „Zastosowanie TLC w
połączeniu z densytometrią, indeksów topologicznych oraz QSRR do analizy leków”
(2014).
6. Zespołowa Nagroda I Stopnia Rektora Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w
Katowicach w zakresie działalności naukowej za „Zastosowanie technik
chromatograficznych i EPR w badaniach związków biologicznie aktywnych” (2015).
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
38 | S t r o n a
4.2.4. Odbyte kursy i szkolenia
23.10-26.10.2008 - warsztaty komputerowe organizowane przez firmę StatSoft Polska w
ramach „IV Konferencji Chemometria – metody i zastosowania”, Zakopane, celem
warsztatów było zapoznanie się z programem STATISTICA oraz podstawowymi
zastosowaniami tego programu w opracowywaniu danych pomiarowych,
10.09.2014 - warsztaty nt. „Nowoczesne rozwiązania w zakresie analizy zanieczyszczeń z
zastosowaniem systemu SHIMADZU UHPLC NEXERA X2 z detektorem z matrycą
diodową SPD-M30A” zorganizowane podczas konferencji "Nowoczesne techniki
badawcze stosowane w analizie farmaceutycznej i biomedycznej", Wydział
Farmaceutyczny Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy,
29.09-30.09.2015 - szkolenie z zakresu obsługi i wykorzystania ultra wysokosprawnego
chromatografu cieczowego (UHPLC) wyposażonego w detektor UV-Vis z matrycą
diodową (DAD) oraz detektor wyładowań koronowych Corona CAD organizowane przez
firmę Polygen, Centrum Dydaktyki Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny
Laboratoryjnej SUM w Sosnowcu.
4.2.5. Działalność dydaktyczna i opieka nad studentami
Od 1999 roku do nadal, czyli od chwili zatrudnienia na etacie asystenta w Katedra Chemii
Ogólnej i Analitycznej, a następnie w Zakładzie Chemii Analitycznej tej katedry Wydziału
Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM w Sosnowcu realizuję
zajęcia laboratoryjne oraz seminaryjne początkowo z przedmiotu chemia ogólna i
nieorganiczna, a od 2002 roku z „Chemii Analitycznej” i „Chemii Analitycznej I” dla
studentów pierwszego roku na kierunku analityka medyczna oraz farmacja. Zajęcia te
obejmują elementy analizy jakościowej wybranych kationów i anionów, a także analizę
ilościową klasyczną (miereczkową i wagową) oraz wybrane działy analizy instrumentalnej tj.
potencjometrię i konduktometrię. Biorę udział w aktualizowaniu materiałów dydaktycznych
do zajęć seminaryjnych i laboratoryjnych dla studentów na kierunku farmacja z zakresu
chemii analitycznej. Pełnię również funkcję kierownika ćwiczeń seminaryjnych i
labortoryjnych z tego przedmiotu na kierunku farmacja. Ponadto sprawowałam klikakrotnie
opiekę na studentami realizującymi pracę magisterską na kierunku farmacja w Zakładzie
Chemii Analitycznej.
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
39 | S t r o n a
Byłam/jestem promotorem następujących prac magisterskich:
1. Anna Ludew, „Zastosowanie chromatografii cieczowej do jakościowego i ilościowego
oznaczania kwasów żółciowych w preparatach farmaceutycznych”, Wydział
Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM, Sosnowiec, 2008.
2. Agata Grządziel, „Analiza chromatograficzna kwasu dehydrocholowego i jego preparatów
farmaceutycznych”, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
SUM, Sosnowiec, 2009.
3. Monika Stec, „Chromatograficzne badania spironolaktonu jako substancji czynnej w
wybranych preparatach farmaceutycznych”, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem
Medycyny Laboratoryjnej SUM, Sosnowiec, 2009.
4. Grażyna Kubas, „Zastosowanie chromatografii cieczowej do oceny aktywności
biologicznej kwasu ursodeoksycholowego”, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem
Medycyny Laboratoryjnej SUM, Sosnowiec, 2010.
5. Anna Gajewska, „Chromatograficzne badania wybranych związków o działaniu
anabolicznym”, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM,
Sosnowiec, 2011.
6. Wojciech Wohn, „Porównanie granicy wykrywalności i oznaczalności ibuprofenu na
różnych nośnikach chromatograficznych w TLC”, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem
Medycyny Laboratoryjnej SUM, Sosnowiec, 2015.
7. Katarzyna Nowak, „Zastosowanie TLC i densytometrii do ilościowego oznaczania
ibuprofenu i paracetamolu w preparacie Metafen”, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem
Medycyny Laboratoryjnej SUM, Sosnowiec, 2015.
8. Joanna Ciesielska, „Zastosowanie TLC i densytometrii do ilościowego oznaczania
kofeiny i paracetamolu w preparacie Panadol Extra”, Wydział Farmaceutyczny z
Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM, Sosnowiec, 2015.
9. Katarzyna Pala, „Zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania
propionianu klobetazolu w preparatach farmaceutycznych”, Wydział Farmaceutyczny z
Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM, Sosnowiec, 2016 (w trakcie realizacji).
10. Agata Piontek, „Analiza finasterydu w wybranych preparatach farmaceutycznych techniką
TLC w połączeniu z densytometrią”, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny
Laboratoryjnej SUM, Sosnowiec, 2016 (w trakcie realizacji).
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
40 | S t r o n a
Większość z przedstawionych tematów prac magisterskich została zaprezentowana na
konferencjach i sympozjach naukowych o zasięgu krajowym, a także opublikowana w
punktowanych czasopismach naukowych.
Od 2002 roku prowadzę zajęcia w postaci wykładów oraz seminariów w języku
angielskim z przedmiotu „Introduction to Medical Analyses” dla studentów II roku kierunku
lekarskiego w języku angielskim na Wydziale Lekarskim SUM w Katowicach. Celem tych
zajęć jest zapoznanie studentów z tradycyjnymi oraz nowoczesnymi technikami
analitycznymi wykorzystywanymi do separacji i analizy materiału biologicznego. Pełnię rolę
koordynatora tego przedmiotu. Przygotowuję syllabus oraz materiały dydaktyczne
wykorzystywane podczas zajęć seminaryjnych przez studentów.
Od roku akademickiego 2012/13 pełnię funkcję opiekuna Studenckiego Koła Nukowego
STN SUM w Katowicach działającego przy Zakładzie Chemii Analitycznej Wydziału
Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM w Sosnowcu. Staram się,
aby wyniki prac eksperymentalnych wykonywanch przez studentów w ramach działalności
Koła Naukowego miały wartość naukową, by były regularnie prezentowane przez studentów
na konferencjach przeznaczonych dla członków Studenckich Kół Naukowych i innych.
Organizowałam i współorganizowałam przedsięwzięcia mające na celu popularyzację nauki
w ramach zajęć laboratoryjnych i prelekcji z chemii ogólnej i analitycznej przeprowadzanych
przez mnie dla grupy uczniów z I i II klasy liceum Ogólnokształcącego im. E. Plater w
Sosnowcu oraz Zespołu Szkół Stowarzyszenia Rodzin Katolickich Archidiecezji Katowickiej
im. A. Hlonda w Chorzowie. Powadziłam również pokazy chemiczne w ramach Dni
Otwartych WFzOML w Sosnowcu mające na celu promocję wydziału, a w kwietniu
minionego roku (2015) wraz z członkami Koła Naukowego uczestniczyłam w popularyzacji
nauki poza wydziałem tj. na Festiwalu Nauki organizowanym przez Uniwersytet Śląski w
centrum Katowic.
W 2013 zostałam wyróżniona Nagrodą Zespołową I Stopnia przez Rektora Śląskiego
Uniwersytetu Medycznego w Katowicach za osiągnięcia dydaktyczne w zakresie
„Zastosowanie nowoczesnych narzędzi informatycznych (platformy e-learningowej) w
kształceniu indywidualnym studentów I roku kierunku farmacja z przedmiotu „Chemia
Analityczna I” oraz studentów I roku kierunku analityka medyczna z przedmiotu „Chemia
Analityczna”.
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
41 | S t r o n a
4.2.6. Działalność organizacyjna
W ramach działalności organizacyjnej na rzecz macierzystej uczelni pełniłam/pełnię
następujące funkcje:
członka Komisji Egzaminacyjnej Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny
Laboratoryjnej SUM w Sosnowcu na kierunku kosmetologia, 2004,
członka Wydziałowej Komisji Wyborczej Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem
Medycyny Laboratoryjnej SUM w Sosnowcu, 2008-2012,
członka Rady Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM
w Sosnowcu, 2010 do nadal,
członka Uczelnianej Okręgowej Komisji Wyborczej Wydziału Farmaceutycznego z
Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego
w Katowicach w kadencji 2012-2016; 2016-2020,
członka Komisji Rekrutacyjnej Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny
Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego na kierunku farmacja w
języku angielskim, 2014-2015.
W 2007 otrzymałam Zespołową Nagrodę I Stopnia Rektora Śląskiego Uniwersytetu
Medycznego w Katowicach za działalność organizacyjną.
4.2.7. Recenzje prac dla czasopism
Zrecenzowałam 14 prac nadesłanych do czasopism anglojęzycznych, takich jak:
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies od 2015 (1 publikacja),
Analytical Methods od 2015 (2 publikacje),
Analytical Letters od 2013 (2 publikacje),
Current Analytical Chemistry od 2015 (1 publikacje),
Current Pharmaceutical Analysis od 2016 (1 publikacja),
International Research Journal of Pure and Applied Chemistry od 2015 (2 publikacje),
European Journal of Medicinal Plants od 2015 (2 publikacje),
Journal of International Research in Medical and Pharmaceutical Sciences od 2015
(1 publikacja),
Journal of Basic Applied Research International od 2015 (1 publikacja),
British Journal of Pharmaceutical Research od 2015 (1 publikacja).
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
42 | S t r o n a
4.2.8. Udział i kierowanie projektami badawczymi
W latach 2007-2010 byłam kierownikiem i jedynym wykonawcą 4 grantów indywidualnych,
przyznanych przez Wydziałową Komisję ds. Nauki WFzOML Śląskiego Uniwersytetu
Medycznego w Katowicach SUM na badania własne pt.:
„Oznaczania poziomu kwasów żółciowych w mieszaninie kwasów żółciowych
odpowiadającej składowi żółci ludzkiej oraz w żółci pacjentów cierpiących na schorzenia
wątroby i dróg żółciowych metodą chromatografii cieczowej.” Numer projektu: NN-2-
035/07 (2007),
„Oznaczanie poziomu kwasów żółciowych w żółci pacjentów cierpiących na schorzenia
wątroby i dróg żółciowych metodą chromatografii cieczowej.” Numer projektu: KNW-2-
078/08 (2008),
„Chromatograficzna analiza kwasów żółciowych obecnych w wybranych preparatach
farmaceutycznych”. Numer projektu: KNW-2-023/09 (2009)
”Zastosowanie chromatografii cieczowej do identyfikacji i oznaczania substancji o
działaniu anabolicznym w wybranych preparatach farmaceutycznych”. Numer projektu
KNW-2-092/10 (2010).
W latach 2011-2015 byłam współwykonawcą 5 grantów przyznanych przez Wydziałową
Komisję ds. Nauki WFzOML Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach na badania
statutowe pt.:
„Nowe aspekty analityczne i fizykochemiczne w badaniu paracetamolu”. Numer projektu
KNW-1-004/P/1/0 (2011),
„Nowe aspekty analityczne i fizykochemiczne w badaniu estradiolu, triprolidyny,
difenhydraminy oraz wybranych glikozydów nasercowych”. Numer projektu KNW-1-
001/P/2/0 (2012),
„Nowe aspekty analityczne i fizykochemiczne w badaniu octanu hydrokortyzonu,
lidokainy, lewocetyryzyny i desloratadyny oraz wybranych steroidowych związków
przeciwzapalnych”. Numer projektu KNW-1-013/N/3/0 (2013),
„Nowe aspekty analityczne i fizykochemiczne w badaniu nikotynamidu, wybranych
leków antyhistaminowych, izomerycznych form wolnych i związanych z glicyną oraz
tauryną kwasów żółciowych oraz ocena interakcji benzo(a)pirenu z glonami Chlorella
vulgaris”. Numer projektu KNW-1-006/N/4/0 (2014),
„Nowe aspekty analityczne i fizykochemiczne w badaniu wybranych substancji
leczniczych”. Numer projektu KNW-1-024/N/5/0 (2015).
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
43 | S t r o n a
Wszystkie granty zostały rozliczone w postaci publikacji o zasięgu międzynarodowym i
krajowym powstałych na podstawie uzyskanych wyników (Załącznik 3a).
4.2.9. Członkostwo w towarzystwach naukowych
2001 do nadal: członek Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego (PTFarm),
2007 do nadal: sekretarz katowickiego oddziału PTFarm,
2007: sekretarz XX Naukowego Zjazdu Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego –
„Farmacja XXI wieku - wyzwania i nadzieje", który odbył się w dniach 25-28.09.2007
roku w Katowicach, brałam udział w przygotowywaniu dwutomowych materiałów
zjazdowych wydanych w ramach tego zjazdu.
Zostałam wyróżniona za pracę na rzecz Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego przez
Zarząd Główny PTFarm medalem im. Jana Szastera oraz Odznaką Honorową PTFarm.
5. Podsumowanie osiągnięć naukowych na dzień 31.03.2016 według
bazy Web of Science (WoS)
Zgodnie z analizą bibliometryczną (Załącznik 6) jestem autorem i współautorem 54
oryginalnych prac naukowych, 2 prac poglądowych, 4 rozdziałów w podręcznikach, 27
artykułów, w tym 23 dokumentujących działalność naukowo-szkoleniową oraz organizacyjną
katowickiego oddziału PTFarm oraz 54 opublikowanych streszczeń pokonferencyjnych.
Sumaryczny Impact Factor zgodny z rokiem opublikowania według listy Journal Citation
Reports (JCR) wynosi 32,477, punktacja MNiSW 767. Liczba cytowań publikacji według
bazy Web of Science (WoS) wynosi 137 a według Scopus 163. Natomiast H-indeks według
bazy Web of Science (WoS) to 7 a według Scopus 9.
6. Literatura
1. Farmakopea Polska, wyd. X, Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne, Warszawa, 2014.
2. Farmakopea Amerykańska, Twinbrook Parkway. Rockville, USA, 2011.
3. J. Sherma, J. AOAC Int. 93 (2010) 754-764.
4. S. A. Bhawani, O. Suleiman, R. Hashim, M. N. Mohamad, Trop. J. Pharm. Res. 9 (2010)
301-313.
5. ICH Harmonized Tripartite Guideline: Validation of Analytical Procedures: Text and
Methodology, Q2(R1), ICH, Geneva, Switzerland, 2005,
http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1
/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf.
6. K. Ferenczi-Fodor, B. Renger, Z. Végh, J. Planar Chromatogr. – Modern TLC 23 (2010)
173-179.
Małgorzata Dołowy Autoreferat Załącznik 2a
7. A. Nagy-Tunik, Z. Vegh, K. Ferenczi-Fodor, 1. Planar Chromatogr. - Modem TLC 8 (1995) 188-193.
8. K. Ferenczi-Fodor, A. Nagy-Tunik, Z. Vegh, J. Planar Chromatogr. - Modem TLC 8 (1995) 349-356.
9. P. Konieczka, J. Namieśnik, Walidacja procedur analitycznych, [W] P. Konieczka, 1. Namieśnik(red.), Ocena i kontrola jakości wyników pomiarów analitycznych, Warszawa, WNT 2007, 225-227, 269-289.
10. J. Lorenc, Diagn. Lab. 32 (1996) 285-295. 11. A. Pyka, M. Dołowy, J. Liq. Chromatogr. &Rel. Technol. 27 (2004) 2613-2623. 12. M. Dąbrowska, J. Krzek, J. Planar Chromatogr.-Mod. TLC 23 (2010) 265-269. 13. T. Momose, M. Mure, T. lida, J. Goto, T. Nambara, J. Chromatogr. 811 (1998) 171-180. 14. C. L Dax, S. Mlillner, Chromatographia 48 (1998) 681-689. 15. T. Sasaki, M. Wakabayashi, T. Yamaguchi, Y. Kasuga, M. Nagatsuma, T. lida, T.
Nambara, Chromatographia 49 (1999) 681-685. 16. L. Wulandari, G. Indrayanto, J. Planar Chromatogr. Modem TLC 16 (2003) 438-441. 17. M. 1. Tikkanen Handb. Exp. Pharm. 170 (2005) 215-230. 18. H. Y. Chang, C. H. Kuo, S. W. Sun, J. Pharm. Biomed. Anal. 32 (2003) 949-956. 19. D. L. Lin, H.G. Chang, C.P. Chang, C.Y. Chen, J. Forensic Sci. 42 (1997) 817-823. 20. A. H. M. Sarrafi, M. Bahmaei, A. Z. Mousavi, J. Iran Chem. Res. 3 (2010) 31-36. 21. 1. M. Lemus Gallego, A. Perez, J. Anal. Bioanal. Chem. 374 (2002) 282-288. 22 . Z. T. Cao, T. A. Swift, C. A. West, T. G. Rosano, R. Rej , Clin. Chem. 50 (2004) 160-165. 23. B. Jancic-Stojanović, A. Malenović, S. Marković, D. Ivanović, M. Medenica, J. AOAC
Int. 93 (2010) 102-107. 24. L. Wang, y. Q. Cai, B. He, C. G. Yuan, D. Z. Shen, J. Shao, G. B. Jiang, Talanta 70
(2006) 47-51. 25. R. Gatti, M. G. Gioia, A.M. Di Pietra, V. Cavrini, J. Pharm. Biomed. Anal. 9 (1999) 803-
808. 26. P. N. Kotiyan, P. R. Vavia, J. Pharm. Biomed. Anal. 22 (2000) 667-671. 27. K. Jóźwiak, H. Szumiło, E. Soczewiński, Wiad. Chem. 55 (2001)1047-1075. 28. E. Rutkowska, K. Pająk, K. Jóźwiak, Acta Pol. Pharm. Drug. Res. 70 (2013) 3-18. 29. M. Janicka, K. Stępnik, A. Pachuta-Stec, Chromatographia 75 (2012) 449-456. 30. L V. Tetko, V. Yu. Tanchuk, J. Chem. Inf. Comput. Sci. 42 (2002) 1136-1145. 31. Tetko LV, Tanchuk V.Y, Villa A.E. 1. Chem InfComput Sci. 41 (2001) 1407-1421. 32. E. Soczewiński, C. A. Wachtmeister, 1. Chromatogr. 7 (1962) 311-320. 33 . VCCLAB, Virtual Computational Chemistry Laboratory, www.vcclab.org/lab/alogPs. 34. O. Trott, A. J. Olson, J. Comp. Chem. 31 (2010) 455-461. 35. J. Devillers, A. T. Balaban, Topological indices and related descriptors in QSAR and
QSPR, Gordon and Breach Science Publishers, The Netherlands, 1999. 36. A. Pyka Wiad. Chem. 51 (1997) 783-802. 37. A. Pyka Wiad. Chem. 52 (1998) 727-754.
441 S t r o n a