MAKALAH ANALISIS PROTEOMIK

Kajian literatur

Methodology for Glutathione S-Transferase Purification and

Localization In Two-Dimensional Gel Electrophoresis Performed

on The Pollen Beetle, Meligethes aeneus (Coleoptera: Nitidulidae)

(Tomas Erban & Jitka Stara, 2014)

Dibuat untuk memenuhi salah satu tugas

Matakuliah Analisis Proteomik dan Genomik

Dosen Pengasuh :

Dr. Purkan, M.Si.

Disusun Oleh :

Sylvia Aulia Rahmah (081324253001)

UNIVERSITAS AIRLANGGA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOLOGI

PROGRAM MAGISTER KIMIA

2014

A. PENDAHULUAN

Glutathione S-transferase (GSTs, EC 2.5.1.18) adalah protein

multifungsi yang memiliki sejumlah peran fungsional termasuk detoksifikasi

sel, termasuk senyawa xenobiotic dan endobiotik. GSTs pada serangga sangat

penting terutama dalam hal resistensinya terhadap insektisida Peningkatan

aktivitas GSTs berhubungan dengan resistensi atau ketahanan terhadap

insektisida di banyak spesies serangga. GSTs pertama kali terlibat dalam

resistensi terhadap organofosfat (Ops) pada lalat, Musca domestica (Wei et al.,

2001) dan 1,1,1-trichloro-2,2-bis-(p-chlorophenyl)ethane (DDT) pada lalat

buah, Drosophila melanogaster (Tang dan Tu, 1994). Baru-baru ini, dilaporkan

adanya peningkatan kadar GSTs dalam kaitannya dengan resistensi pyrethroid

(PYR) pada wereng, Nilaparvata lugens (Vontas et al, 2001.; Vontas et al.,

2002), ulat kubis, Plutella xylostella (Dukre et al., 2009), hama gudang,

Sitophilus zeamais (Fragoso et al., 2007), tungau pada jeruk, Panonychus ulmi

( Kumral et al., 2009), nyamuk demam berdarah Aedes aegypti ( Pimsamarn et

al., 2009) dan kutu keras, Rhipicephalus bursa ( Enayat i et al., 2010). Baru-

baru ini GSTs juga dikarakterisasi dari Panonychus citri yang terpapar

fenpropathrin, hasilnya menunjukkan bahwa enam transkrip gen GSTs

meningkat sebanding dengan waktu (Liao et al., 2013).

Di Eropa, kumbang serbuk sari Meligethes aeneus, (Coleoptera:

Nitidulidae) adalah hama penting pada tumbuhan penghasil minyak yaitu rapa

atau kanola., Brassica napus L. Selama lebih dari dua puluh tahun, kumbang

serbuk sari secara efektif dapat dikendalikan dengan insektisida pyrethroid.

Namun demikian, penggunaan insektisida pyrethroid secara terus menerus

dapat menyebabkan timbulnya resistensi. Laporan tentang resistensi kumbang

serbuk sari terhadap pyrethroid pertama kali terjadi di Perancis pada tahun

1999 ( Ballanger dan Detourne , 2011). Sejak itu resistensi juga telah diamati

di bagian lain Eropa ( Hansen, 2003; Derron et al, 2004.; Heimbach et al, 2006.

; Tiilikainen dan Hokkanen, 2008). Menurut penelitian Li et all detoksifikasi

pada serangga disebabkan oleh tiga sistem enzim, yaitu sitokrom P450s,

esterase, dan GSTs ( Li et al., 2013). Keterlibatan GSTs pada resistensi

pyrethroid M. aeneus belum banyak dilaporkan, oleh karena itu dilakukan

penelitian tentang GSTs pada tingkat proteomik. Dalam penelitian ini

dilakukan pemurnian dan karakterisasi dari GSTs dari M. aeneus., serta

identifikasi GSTs dengan elektroforesis dua dimensi (2D-E).

B. KAJIAN TEORI

Glutathione S-transferase

Glutathione S-transferase (GSTs), sebelumnya dikenal sebagai ligan,

merupakan enzim yang diketahui bagus untuk reaksi katalitik dalam konjugasi

glutathione (GSH) dalam kaitannya dengan tujuan detoksifikasi. GSTs terdapat

hingga 10% dalam sitosol protein pada beberapa organ mamalia. GSTs

mengkatalisis konjugasi GSH melalui sulfhydryl grup ke pusat-pusat

elektrofilik pada berbagai substrat untuk membuat senyawa lebih larut.

Urutan protein dan struktur yang penting

dalam klasifikasi untuk tiga superfamilies

(sitosol, mitokondria, dan MAPEG): pada

sitosol GSTs memiliki lebih dari 40%

urutan yang homolog, sedagkan yang lain

hanya kurang dari 25%. Pada sitosol,

GSTs dibagi menjadi 13 kelas

berdasarkan struktur mereka: alpha, beta,

delta, epsilon, zeta, theta, mu, nu, pi, sigma, tau, phi, dan omega. Mitokondria

GSTs berada di kelas kappa. Superfamili MAPEG dari microsomal GSTs

terdiri dari subgrup I-IV, dimana urutan asam amino kurang dari 20% identitas.

Sitosol GSTs pada manusia memiliki kelas alpha, zeta, theta, mu, pi, sigma dan

omega, sementara enam isozymes kelas I, II, dan IV dari superfamili MAPEG

juga diketahui ada.

Kromatografi

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan

perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan

komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut

dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul

yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih

lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam

tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.

Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat

dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk

analisis lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan

metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti:

penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair

(liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS),

Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-

VIS (HPLC-UV-VIS).

Pemurnian dengan teknik kromatografi afinitas disebut juga dengan

pemurnian satu tahap (one step purification). Prinsip kromatografi afinitas

adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi, dalam kromatografi

afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik. Dalam

proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas diperlukan

interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan. Keterbatasan

metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi

secara spesifik dengan suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat

berinteraksi secara spesifik maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap.

Keterbatasan ini sekarang dapat diatasi dengan adanya teknologi fusi protein.

Idenya adalah membuat suatu protein fusi yang terdiri dari protein yang akan

dimurnikan dengan protein yang diketahui dapat berikatan spesifik dengan

ligan tertentu.

Elektroforesis Dua Dimensi (2D-E)

2D-E adalah suatu teknik analisis protein dengan melakukan pemisahan

protein menggunakan dua dimensi. Teknik ini sering digunakan untuk studi

proteomika (analisis molekular terhadap keseluruhan protein yang dihasilkan

dari ekspresi gen dalam sel), deteksi marker penyakit, penelitian kanker dan

obat, pemeriksaan kemurnian, dan juga purifikasi (pemurnian) protein skala

mikro. Hal ini dikarenakan, elektroforesis 2-D mampu memisahkan hingga

ribuan protein secara bersamaan.

Dalam elektroforesis 2-D, dimensi pertama dalam pemisahan protein

dilakukan berdasarkan titik isoelektrik protein tersebut. Sedangkan, pada

dimensi kedua, protein akan dipisahkan berdasarkan berat molekulernya.

Pemisahan protein dengan teknik ini dilakukan dalam kondisi terdenaturasi.

Pada dimensi pertama, protein yang akan dianalisis dilarutkan dalam urea

untuk memutuskan ikatan hidrogen pada protein (agen pendenaturasi). Urea

umum digunakan karena senyawa ini tidak mengubah dalam muatan protein

sehingga pemisahan protein dapat dilakukan berdasarkan muatannya. Dengan

menggunakan medan listrik, protein dipisahkan melalui gel yang memiliki

gradien pH. Protein akan bergerak hingga berhenti pada titik (pH) dimana

muatan protein tersebut netral (titik isoelektriknya). Setelah melalui dimensi

pertama, protein dipisahkan kembali melalui dimensi kedua. Biasanya tahap ini

dilakukan dengan gel poliakrilamida dan sodium dodesil sulfat (SDS). SDS

akan membuat seluruh protein bermuatan negatif sehingga pemisahan bisa

dilakukan hanya berdasarkan bobot molekulernya. Teknik elektroforesis 2-D

yang sering digunakan adalah: untuk dimensi pertama dapat menggunakan

elektroforesis pemfokusan isoelektrik (isoelectric focusing, IEF) dan

nonequilibrium pH gradient electrophoresis (NEPHGE). Sedangkan untuk

dimensi kedua, biasanya digunakan elektroforesis gel poliakrilamida SDS

(SDS-PAGE).

Untuk melihat hasil pemisahan protein menggunakan elektroforesis 2-

D, dapat dilakukan pewarnaan gel dengan coomasie atau pewarnaan perak.

Teknik visualisasi lain yang dapat digunakan adalah fluorografi dan

autoradiografi (penggunaan radioaktif). Di dalam satu gel, bisa terdapat ribuan

titik protein yang dapat dianalisis atau diambil (dipisahkan) menggunakan

perangkat lunak tertentu. Setelah dilakukan pemilihan dan pemisahan protein

(berupa titik pada gel), analisis lebih lanjut biasanya dilakukan dengan

melakukan digesti protein dan kemudian melalui tahap analisis menggunakan

spektofotometer massa (MALDI-TOF).

Meligethes aeneus

Meligethes aeneus adalah salah satu kumbang serbuk sari yang

populasinya sangat banyak di dunia. Merupakan hama yang juga memberikan

kontribusi untuk penyerbukan dari tanaman. Panjang kumbang dewasa sekitar

2-3 mm, sedangkan pada Larva sekitar 3 mm. Larva kumbang dapat

berkembang dalam bunga dan hal ini dapat merusak bunga tersebut.

Kalsifikasi :

Scientific classificationKingdom: AnimaliaPhylum: ArthropodaClass: InsectaOrder: ColeopteraSuperfamily: CucujoideaFamily: NitidulidaeGenus: MeligethesSpecies: M. aeneus

Binomial nameMeligethes aeneus

(Fabricius, 1775)

C. BAHAN DAN METODE

Serangga

Populasi M. aeneus yang berada di tanaman yang sudah masak

digunakan sebagai sampel dan dimbil dengan metode sweeping. Metode ini

dilakukan dengan prinsip menangkap serangga yang terbang atau beraktivitas

di udara menggunakan jaring dengan panjang dan lebar tertentu.

  Ekstraksi Protein  

Homogenisasi M. aeneus yang sudah dewasa dilakukan dalam

homogenizer kaca Potter-Elvehjem (Art. No. 6305; Kartell Labware

division). yang telah disterilkan. Dengan cepat 100 mg sampel dari seluruh

tubuh kumbang yang sudah homogen diekstraksi menggunakan buffer yang

terdiri dari 0,2 μL phosphate buffered saline (PBS) yang telah disaring (pH

7,4), 0,1% (m/v) serta campuran deterjen zwiterionik nondenaturing CHAPS

(Cat No. C9426; Sigma-Aldrich) dan 10 μL inhibitor protease (Cat.

No. 80-6501-23; GE Healthcare Life Sciences). Sampel yang telah

dihomogenkan 3 kali selama 2 menit, kemudian didiamkan selama 20 menit

dalam es. Supernatan dipindahkan ke tabung sentrifuge 15 mL (Orange

Scientific; Brainel'Alleud; Belgium) kemudian dibilas dengan PBS

(menghasilkan pengenceran homogenat 1:1), selanjutnya disentrifugasi pada

10.000 g selama 15 menit pada suhu 4°C dalam centrifuge MR23i (Jouan

Industries; France). Setelah sentrifugasi selesai, supernatan dipindahkan ke

jarum suntik kaca Luer-lock dan disaring dengan 0,45 μm regenerated cellulosa

filter (RC) (OmniPeak; Teknokroma). Satu mililiter supernatan disimpan

untuk analisis lebih lanjut sebagai "sample protein sebelum pemurnian (i)".

 Pemurnian GSTs  

Pemurnian GSTs menggunakan kolom GSTrap 4B (Cat. No. 28-

4017-47; GE Healthcare Life Sciences) dengan sampling pelarut

menggunakan jarum suntik kaca Luer-lock. Kolom ini dikalibrasi dengan PBS

(10 column volume) kemudian 10 mL supernatan, dialirkan setetes demi

setetes pada kolom GSTrap 4B. Fraksi yang tidak terikat disimpan untuk

analisis lebih lanjut. Kolom dicuci dengan PBS (15 column volume) dan

protein yang terikat dielusi dengan 10 mL buffer pengelusi yang terdiri dari 50

mM Tris-HCl dan 10 mM L-glutathione yang tereduksi (Cat. No. G6529;

Sigma-Aldrich) (pH 8,0).

 Pengolahan sampel (Sample processing)

Tiga sampel yang diperoleh setelah ekstraksi dan pemurnian, yaitu (i)

supernatan dari ekstrak kasar (supernatan sebelum pemurnian); (ii) fraksi yang

tidak terikat (supernatan setelah pemurnian); dan (iii) protein yang terikat pada

matriks kolom GSTrap 4B (protein murni). Sampel yang didapat kemudian

dicampurkan, 1 mL supernatan sebelum pemurnian (i), 1 mL fraksi yang tidak

terikat (ii) dan 10 mL protein murni kemudian dihilangkan garamnya

menggunakan PD MidiTrap™ G-25 (Item No 28-9180-08; GE Healthcare Life

Sciences) dan konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan uji

Bradford (Cat. No B6916, Sigma-Aldrich). Produk tersebut kemudian

dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge, dibekukan dan dikeringkan dalam

PowerDry LL3000 (Thermo). Sampel kemudian disimpan dalam freezer pada

(-28°C) sampai digunakan untuk proses selanjutnya.

 Elektroforesis dua-dimensi (2D-E)

Untuk pemisahan dua dimensi, digunakan 50 μg dari total protein

sebelum pemurnian dan fraksi yang tidak terikat. Seluruh hasil protein murni

dibagi menjadi dua bagian untuk proses 2D-E. Iso electrofocusing (IEF)

dijalankan pada strip 13 cm Ettan IPG Phor 3 (GE Healthcare Bio-Science

AB). Pemisahan ini dilakukan di ceramic strip holder 13 cm menggunakan

Immobiline DryStrip dengan kisaran pH 3-10 (Cat. No. 17-6001-14, GE

Healthcare Life Sciences). DeStreak Larutan Rehidrasi (Cat. No. 18-1168-31,

GE Healthcare Life Sciences) mengandung buffer IPG 0,5%, pH 3-10 (Cat.

No. 17-6000-87, GE Healthcare Life Sciences). Proses pemisahan adalah

sebagai berikut: Langkah 1-30 V, 10 Vh; Langkah 2-500 V, 500 Vh; Langkah

3-Grad 1000 V, 800 Vh; Langkah 4-Grad 6000 V, 15.000 Vh; dan Langkah 5-

6000 V, 16.000 Vh. Isoelectrofocusing dilakukan selama 19 jam. Setelah IEF

selesai, strip didiamkan selama 15 menit dalam buffer yang mengandung

dithiothreitol (Item No 43817, Sigma-Aldrich), selanjutnya 15 menit dalam

buffer yang mengandung Iodoacetamide (IAA) (Item No 57670, Sigma-

Aldrich ). Strip ditempatkan pada gel SDS-PAGE yang telah dicampur dengan

1% agarose (Item No A7431, Sigma-Aldrich). Gel ini disusun sesuai dengan

petunjuk penggunaanya 37.5:1 akrilamida/bisacrylamide (Item No A3699,

Sigma-Aldrich). Nanopure water (0,2 μ m-fi disaring) (Barnstead, Thermo)

digunakan selama penelitian. Sepuluh mikroliter Full Range Rainbow™

protein marker (Item No RPN800E, GE Healthcare, Life Sciences) digunakan

untuk memperkirakan berat molekul dari protein murni. Elektroforesis

dijalankan pada tegangan konstan 100V selama 30 menit dalam SE 600 Ruby

elektroforesis instrument (GE Healthcare Life Sciences). Setelah itu protein

dipisahkan pada tegangan konstan 350V dalam kondisi dingin.

 Prosedur Pewarnaan Gel

Untuk Coomassie staining, gel tersebut dilarutkan dalam larutan

campuran (40% LC-MS grade metanol, 10% asam asetat dingin, nanopure

water 50%) dibiarkan selama satu malam dan diwarnai dengan 0,02%

PhastGel™ Blue R (Item No 17-0518-01, GE Healthcare Life Sciences). Hasil

pewarnaan ini nantinya dapat diarsipkan dengan scanner (CanoScan 8800F,

Canon).

Untuk fluorescence staining, gel tersebut dilarutkan dalam larutan

campuran (50% LC-MS grade metanol, 7% asam asetat dingin, nanopure water

43%) dibiarkan selama satu malam dan dengan Sypro ruby (Item No S21900;

Invitrogen). Gel dihilangkan warnanya (destained) selama 30 menit

menggunakan larutan destaining (10% LC-MS kelas metanol, 7% asam asetat

dingin, nanopure water 80%) dan difoto menggunakan sistem dokumentasi

ingenius (Syngene). Sebuah Transilluminator (Syngene) 300 nm digunakan

dalam dokumentasi ini.

   NanoLC-ESI-QUAD-TOF-MS/MS protein identification

Untuk identifikasi menggunakan spektrometri massa (MS), spots secara

manual dipotong pada gel Coomassie yang bernoda biru dan ditempatkan

dalam 0,5 mL Eppendorf Protein LoBind Tube (Kat. No Z666491, Sigma-

Aldrich). Penguraian protein menjadi asam amino oleh tripsin dianalisis

dengan menggunakan NanoLC-ESI-QUAD-TOF-MS/MS. Spektrum

dicocokan dengan database NCBI (NCBInr) menggunakan MASCOT (Matrix-

SCIENCE) (11112683 urutan; 3786819628 residu).

 

D. Hasil  

Perbandingan 2D-E sebelum dan sesudah pemurnian 

Gambar. 1 menunjukkan tahapan yang digunakan untuk memurnikan,

identifikasi dan lokalisasi protein murni di 2D-E. Protein murni yang telah

dipisahkan menggunakan kolom GSTrap 4B yang ditunjukkan pada Gambar.

2, serta supernatan sebelum pemurnian yang ditunjukkan Gambar. 3A dan

fraksi yang tidak terikat yang ditunjukkan pada Gambar. 3B telah berhasil

dipisahkan menggunakan 2D-E. Setelah dibandingkan dengan noda Sypro ruby

2D-E yang dihasilkan dari supernatan sebelum pemurnian (Gambar. 3A) dan

fraksi tidak terikat (Gambar. 3B), maka dapat diidentifikasi spot 5 intensitasnya

meningkat setelah proses pemurnian protein. Posisi yang teridentifikasi di 2D-

E dari supernatan sebelum pemurnian (Gambar. 3A) berhubungan dengan pola

spot di 2D-E dari protein murni ( Gambar. 2).

Gambar 1. Skema pemurnian, identifikasi dan lokalisasi GSTs pada 2D-E.

Gambar 2. Hasil pemurnian protein dengan kromatograsi afinitas (kolom

GSTrap 4B. Spot 2a dan 4a diidentifikasi sebagai GSTs dengan klas sub

family Delta dan Epsilon, namun spot 1a; 3a dan 5 tidak teridentifikasi

dalam database NCBInr.

Gambar 3. Hasil 2D-E dari supernatant sebelum pemurnian (A) dan fraksi

yang tidak terikat (B). Peningkatan intensitas spot mengindikasi protein

murni dari hasil pemurnian dengan kromatografi afinitas (kolom GSTrap

4B). Spot 2a dan 4b diidentifikasi sebagai GSTs dengan klas sub family

Delta dan Epsilon, namun spot 5 tidak terdeteksi dalam data base NCBInr.

   

Analisis NanoLC-ESI-QUAD-TOF-MS/MS protein purification

Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2, lima spot protein yang

menunjukkan kelimpahan tertinggi ternyata sesuai dengan fraksi 2D-E protein

murni. Namun analisis NanoLC-ESI-QUAD-TOF-MS/MS mengidentifikasi

hanya dua dari lima spot tersebut (Spots 2a dan 4a di Gambar. 2, Tabel 1).

Pencarian Database NCBInr menggunakan MASCOT mengungkapkan bahwa

dua spot protein ini paling homolog dengan GSTs dari serangga Cydia

pomonella glutathi-satu S-transferase 1 (gi|196052743) (Spot 2a) dan hipotetis

protein Tribolium castaneum TcasGA2_TC007571 (gi|270005507) (Spot 4a)

baik dengan daerah untuk kelas Delta dan Epsilon subfamilies ( Marchler-

Bauer et al, 2013). Sesuai dengan data dari protein murni, hasil analisis protein

dari supernatan sebelum dimurnikan dengan MS juga teridentifikasi masuk ke

dalam kelas GST Delta dan Epsilon subfamilies (Marchler-Bauer et al., 201 3)

(Spots 2b dan 4b di Gambar. 3, Tabel 1). Meskipun identitas dua spot protein

tersebut sesuai, pencarian NCBInr menunjukkan ketidakcocokan tiga spot yang

dianalisis dari kedua fraksi protein murni dan supernatan sebelum pemurnian.

E. Diskusi

Tujuan penelitian ini adalah untuk memurnikan dan melokalisasi GSTs

dari M. aeneus dan untuk menunjukkan metodologi untuk identifikasi GSTs

pada elektroforesis dua dimensi. Pertama, pemurnian GSTs dari M. aeneus

melalui kromatografi afinitas glutathione (GSTrap 4B) kemudian

membandingkan 2D-E dari supernatan sebelum pemurnian dengan fraksi yang

tidak terikat. Strategi ini untuk lokalisasi yang spesifik untuk spot protein

murni dalam 2D-E, juga dapat digunakan untuk kuantifikasi ekspresi GSTs

dalam penelitian di masa yang akan datang dan untuk analisis serupa namun

pada organisme lain.

Ada beberapa metode yang digunakan untuk menganalisis aktivitas

GSTs melalui analisis substrat. Yang paling umum adalah uji kolorimetri yang

memanfaatkan substrat sintetik 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) dan 1,2-

dichloro-4-nitrobenzene (DCNB). Selain substrat kolorimetri, serangkaian

fluorescence telah dikembangkan dengan peningkatan sensitivitas ( Huang et

al., 2012). Baru-baru ini, sebuah substrat fluorescent seperti pyrethroid telah

dikembangkan untuk mendeteksi dengan cepat dan sangat sensitive terhadap

aktivitas GSTs yang tinggi, yang berhubungan dengan resistensinya terhadap

pyrethroid ( Huang et al., 2012). Selain metode analisis substrat ini, metode

lain yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur GSTs adalah

menggunakan analisis MS ( Burns et al, 2004.; Zhang et al., 2004). Level yang

tinggi dari GSTs serta protein lain dapat diukur dengan menggunakan

gabungan 2D-E dengan MS untuk menyediakan metode yang lebih kuat untuk

analisis kuantitatif dan kualitatif dari enzim ( Alias dan Clark, 2010). Untuk

mengkarakterisasi GSTs lebih lanjut, digunakan isolasi protein berdasarkan

afinitasnya menggunakan kolom GSTrap 4B untuk memurnikan dan

mengkarakterisasi GSTs dari M. aeneus dewasa.  

F. KESIMPULAN

Kesimpulan yang dapat diberikan dari studi litelatur ini adalah :

1. Metode elektroforesis gel dua dimensi dapat digunakan untuk memurnikan

dan melokalisasi glutathione S-transferase dari Meligethes aeneus.

2. GSTs dari Meligethes aeneus dapat diidentifikasi dengan 2D-E, ditandai

dengan terdapatnya 2 spot pada yang teridentifikasi dalam sub familis Delta

dan Epsilon.

G. DAFTAR PUSTAKA

Anonim. Elektroforesis Dua Dimensi, (Online), (http://id.wikipedia.org/wiki /Elektroforesis_dua_dimensi), diakses 20 April 2014.

Anonim. Glutathione S-transferase, (Online), (http://en.wikipedia.org/wiki/ Glutathione_S-transferase), diakses 20 April 2014.

Anonim. Kromatografi, (Online), (http://id.wikipedia.org/wiki/Kromatografi), diakses 20 April 2014.

Anonim. Meligethes aeneus, (Online), (http://en.wikipedia.org/wiki/ Meligethes_aeneus), diakses 20 April 2014.

Anonim. 2007. Instructions 28-9225-30 AB: PD MidiTrap G-25 (www.gelifesciences.com/trap, diakses 20 April 2014.

Anonim. 2009. Data fi le 28-9488-45 AA: Improved Immobiline™ DryStrip gelsand IPG Buffer, (www.gelifesciences.com/2DE), diakses 20 April 2014.

Erban, Tomas. dan Stara, Jitka. 2014. Methodology for Glutathione S-Transferase Purification and Localization In Two-Dimensional Gel Electrophoresis Performed on The Pollen Beetle, Meligethes aeneus (Coleoptera: Nitidulidae). Journal of Asia-Pasific Entomology, (Online), 17: 369-373, (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1226861514000351),diakses 10 April 2014.

Liao, C.Y., Zhang, K., Niu, J.Z., Ding, T.B., Zhong, Rui., Xia, W.K., Dou, Wei dan Wang, J.J. 2013. Identification and Characterization of Seven Glutathione S-Transferase Genes from Citrus Red Mite, Panonychus citri

(McGregor). International Journal of Molecular Sciences, (Online), 14: 24255-24270, (http://www.mdpi.com/1422-0067/14/12/24255), diakses 16 April 2014.

H. LAMPIRAN

Alat Nama Keterangan

homogenizer kaca

Potter-Elvehjem

Digunakan untuk

menghomogenasi

serangga.

Centrifuge MR23i

Sentrifuge multifungsi

yang didukung dengan

RCF yang tinggi

hingga 30.000 g

dengan 48 rotor.

Jarum suntik kaca

Luer-lock

Untuk mengambil

supernatant saat

ekstraksi protein.

Regenerated Cellulose

0,45 μm

Untuk menyaring

protein.

Kolom GSTrap 4BUntuk pemurnian

protein

PD MidiTrap™ G-25Untuk menghilangkan

garam pada protein

PowerDry LL3000

Merupakan model

standart dalam hal dry

freeze yang mudah

Ettan IPGphor 3

Merupakan rangkaian

tahapan pertama dalam

2D-E

Immobiline DryStrip

Digunakan untuk

isoelectricfocusing

(IEF), dijalankan pada

proses 2D-E

Sistem Dokumentasi

Ingenius (Syngene).

Untuk

mendokumentasikan

hasil analisis dengan

pewarnaan gel dan

2D-E

Transilluminator

(Syngene)

Salah satu bagian

dalam system

dokumentasi Ingenius

NanoLC-ESI-QUAD-

TOF-MS/MS

Untuk memurnikan

protein dengan lebih

akurat.