makalah kelompok 3 kelas kim 3b p1

8/10/2019 Makalah Kelompok 3 Kelas KIM 3B P1

1/16

METODE ANALISIS BIOTIN, ASAM PANTOTENAT, ASAM

FOLAT, DAN VITAMIN B12SERTA KETERSEDIAAN

HAYATI FOLAT

Diana Agustini Raharja J3L112168

Dwi Rakhmawati J3L112143

Feni Ayudia J3L212192Ismail Maqqi J3L112044

Regina Bhakti J3L112161

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGRAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014


2/16


3/16

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI i

1 STRUKTUR DAN SIFAT UMUM 12 ANALISIS KUANTITATIF SENYAWA MIRIP VITAMIN DAN

KETERSEDIAAN HAYATI FOLAT 3

2.1 Analisis Kuantitatif Berdasarkan Metode Biospesifik 3

2.1.1 Analisis Biotin 3

2.1.2 Asam Pantotenat 5

2.1.3 Analisis Asam Folat 6

2.1.3.1 Perbandingan Metode Analisis Asam Folat 6

2.1.3.2 Ketersediaan Hayati Folat 7

2.1.4 Vitamin B12 9

2.2 Analisis Kuantitatif Berdasarkan Metode Biosensor 10

3 SIMPULAN 124 DAFTAR PUSTAKA 12

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Struktur asam folat 1

Gambar 2 Struktur asam pantotenat 2

Gambar 3 Struktur vitamin B12 2Gambar 4 Struktur biotin 3

Gambar 5 Mekanisme metode ELISA 4

Gambar 6 Mekanisme metode EPBA 4

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Perbedaan format ELISA dalam penentuan analog asam pantotenat 5

Tabel 2 Hasil kandungan asam pantotenat dalam makanan 6Tabel 3 Perbandingan metode ELISA dan uji mikrobiologis 6

Tabel 4 Hasil analisis folat dalam kubis brussel 7


4/16


5/16

1

1 STRUKTUR DAN SIFAT UMUM

Bentuk alami utama folat (Gambar 1) dalam bahan-bahan dari sumber

tanaman, hewan, dan mikrob ialah spesies poliglutamil dari 5,6,7,8-tetrahidrofolat(folatH4). Sebagian besar folat yang terdapat secara alami dalam jaringan tanaman

dan hewan, serta dalam bahan pangan yang berasal dari sumber tanaman dan

hewan, memiliki sebuah rantai samping dari 5 sampai 7 residu glutamat dengan

tautan -peptida umumnya diasumsikan bahwa kira-kira 80% folat bahan pangan

berada dalam bentuk poliglutamin. Semua folat, terlepas dari tingkat organisasi

sistem cincin pteridina, substituen satu-karbon N5 atau N10, atau panjang rantai

poliglutaminnya, menambahkan aktivitas vitamin pada mamalia, termasuk

manusia. Analog folat dengan sebuat gugus 4-amino atau modifikasi lainnya

sering menjadi antagonis yang potensial untuk digunakan dalam kemoterapi,

untuk penyakit kanker dan penyakit autoimun.

N

N

N

N

N

OH

OH O

O

N

O

OH

H

H

H

Gambar 1 Struktur asam folat

Asam pantotenat (Gambar 2) termasuk ke dalam vitamin larut air yang

terdiri atas -alanina dalam tautan amida dengan asam 2,4-dihidroksi-3,3-

dimetilbutirat. Asam pantotenat umumnya terkandung dalam daging, bebijian,

telur, susu, dan berbagai sayuran segar. Asam pantotenat umumnya terdapat

dalam bahan pangan dan bahan hayati dalam bentuk koenzim A yang sebagian

besar berupa turunan tioester. Tioester yang terbentuk dari turunan koenzim A

dengan asam-asam organik akan mempermudah proses metabolik terutama dalam

proses penyingkiran dan penambahan gugus asil dalam reaksi biosintetik dan

katabolik. Asam pantotenat sebagai suatu komponen dari koenzim A dan sebagaisuatu gugus prostetik yang terikat secara kovalen dari protein pembawa asil dalam

sintetis asam lemak secara metabolik. Kalsium pantotenat merupakan kristal putih

yang lebih stabil dan kurang higroskopis daripada asam bebasnya dan merupakan

bentuk sintetik yang digunakan dalam fortifikasi bahan pangan dan suplemen

vitamin.

Asam pantotenat stabil dalam pH 5-7 dan menunjukkan stabilitas relatif

dalam bahan pangan yang penyimpanannya rendah air. Asam pantotenat dalam

bahan pangan berkurang kadarnya diakibatkan oleh proses termal dan pemasakan.

Hilangnya asam pantotenat umumnya disebabkan oleh pelepasan, bukan

destruksi. Asam pantotenat dapat diuji dengan berbagai metode seperti uji

mikrobiologis menggunakanLactobacillus plantarumatau radioimunologi (RIA).


6/16

2

Penentuan asam pantotenat sebagai vitamin larut air dapat pula dilakukan dengan

menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), metode reaksi enzim

dalam kapiler, analisis elektrokimia, dan enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA).

CH3

H

O

N

OH

O

OHOH

CH3H

H

Gambar 2 Struktur asam pantotenat

Vitamin B12 (Gambar 3) memiliki aktivitas vitamin serupa dengan

sianokobalamin. Sianokobalamin digunakan dalam fortifikasi bahan pangan dan

asupan nutrisi yang memiliki stabilitas tinggi dan mudah diperoleh secara

komersial. Mekanisme penguraian vitamin B12 belum seluruhnya ditentukan,sebagian dikarenakan komplesitas molekul dan konsentrasi yang sangat rendah

dalam bahan pangan. Penguraian fotokimia koenzim vitamin B12 menghasilkan

akuokobalamin. Reaksi ini berpengaruh terhadap metabolisme dan fungsi vitamin

B12, tetapi tidak berpengaruh pada aktivitas vitamin B12 total dari bahan pangan

karena akuokobalamin mempertahankan aktivitas vitamin B12. Stabilitas

keseluruhan vitamin B12paling tinggi pada pH 4-7.

N

Co+

N

N

N

NN

O

P

N

OO-

O O

NH

O

O

O

O

OH

O

O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

NH2

NH2

NH2

CH3

NH2

NH2

NH2

CH3

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

HH

H

H

Gambar 3 Struktur vitamin B12

Biotin (Gambar 4) merupakan vitamin bisiklik larut air yang berfungsi

secara koenzimatis pada reaksi karboksilasi dan transkarboksilasi. Bentuk alami

biotin ialah D-biotin bebas dan biositin. Biositin berfungsi sebagai bentuk

koenzim dan terdiri atas residu lisina terbiotinilasi yang tergabung secara kovalen

pada rantai protein dari berbagai karboksilase. Biotin bebas maupun biositin

terikat protein menunjukkan aktivitas vitamin ketika dikonsumsi dalam makanan.

Biotin stabil pada panas, cahaya dan oksigen. Nilai pH yang terlalu tinggi atau

rendah dapat menyebabkan penguraian karena biotin mendorong hidrolisis ikatan

amida dari sistem cincin biotin.


7/16

3

NH NH

S

O

(CH2)4-COOH

H

Gambar 4 Struktur biotin

Biotin dalam makanan nampaknya telah terpenuhi jumlahnya, sehingga

ketersedian hayati yang tidak sempurna biasanya tidak terlalu berpengaruh pada

nilai gizi. Sintesis biotin oleh bakteri pada usus halus memberikan sumber biotin

tambahan yang tersedia untuk manusia. Kebanyakan biotin dalam bahan pangan

berbentuk biositin terikat protein. Bentuk terikat ini akan dilepaskan olehbiotinidase dalam cairan pankreas dan dalam mukosa usus menjadi bentuk bebas

yang aktif secara fungsional.

2 ANALISIS KUANTITATIF SENYAWA MIRIP VITAMIN

DAN KETERSEDIAAN HAYATI FOLAT

2.1 Analisis Kuantitatif Berdasarkan Metode Biospesifik

2.1.1 Analisis Biotin

Penentuan biotin dalam makanan dan bahan hayati biasanya dilakukan

dengan uji mikrobiologis dengan Lactobacillus plantarum atau dengan metode

pengikatan ligan yang melibatkan avidin sebagai protein pengikat. Uji

mikrobiologis dan pengikatan ligan merespon biotin bebas dan biositin, tetapi

biositin tidak dapat ditentukan tanpa dilepaskan terlebih dahulu dari protein

dengan pembelahan ikatan peptida oleh hidrolisis asam atau enzimatik. Terdapat

uji enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) dan enzyme protein binding

assay (EPBA) yang telah dikembangkan untuk analisis biotin dalam makanan.

Metode ELISA menggunakan reagen yang stabil dan tak reaktif yang dapat

disimpan lama. Jenis uji seperti ini telah banyak digunakan untuk analisis

makanan. Uji ini dilakukan dengan peralatan yang murah. Jenis sistem ELISA

yang sering digunakan untuk vitamin ialah sistem tidak langsung, yang mana

konjugat protein-vitamin (hapten) yang bergerak ke permukaan. Dalam sistem

tidak langsung pertama-tama antibodi primer dan vitamin bebas ditambahkan ke

dalam sumur-sumur pada pelat mikrotitrasi. Antibodi akan terdistribusi diantara

vitamin dan vitamin termobilisasi. Kemudian sumur dibilas, antibodi ikatan

primer dideteksi dengan penambahan enzim antibodi kedua. Setelah diinkubasi

pada waktu tertentu molekul yang tidak berikatan dibilas dan substrat

ditambahkan. Enzim antibodi kedua akan mengubah substrat menjadi produk


8/16

4

yang kemudian diwarnai. Densitas optik akan ditentukan setelah beberapa waktu

dan sampel akan dikuantifikasi dengan merujuk pada kurva standar.

Penggunaan antibodi pada EPBA digantikan oleh enzim-protein, protein

pengikat ditandai langsung dengan manautkan secara kimia suatu enzim. Dengan

demikian metode EPBA dalam tahap inkubasi lebih sedikit dibandingkan denganmetode ELISA.

Gambar 5 Mekanisme metode ELISA

Gambar 6 Mekanisme metode EPBA

Hasil uji mikrobiologis pada pengujian biotin menggunakan Lactobacillus

plantarummenunjukkan respons yang baik, biotin D-sulfoksida (100%) dan D,L-

oksibiotin (50%). Meskipun metode RIA memberikan hasil yang dapat diterima

dengan uji mikrobiologis untuk penentuan kandungan biotin dalam sampel

makanan hewan, hasil yang diperoleh dari metode radioimunologi (RIA) 20-50%

lebih tinggi dibandingkan dengan uji mikrobiologis pada sampel gandum. Uji ini

sensitif untuk menganalisis 1-10 ng biotin, tetapi penerapannya untuk penentuan

biotin dalam makanan masih terbatas dan tidak pasti. Antibodi telah diproduksi

pada uji EPBA untuk biotin menggunakan sintetsis konjugat biotin-albumin


9/16

5

serum anak sapi (BSA) melalui gugus asam karboksilat pada sisi rantai..Antibodi

ini sangat spesifik untuk D-biotin, dan tidak menunjukkan reaktivitas-silang. Uji

EPBA lebih sensitif dibandingkan dengan uji ELISA. Uji EPBA menghasilkan

batas deteksi 10 g per sumur sedangkan uji ELISA hanya menghasilkan batas

deteksi 500 g per sumur. Uji EPBA memiliki spesifisitas yang luas danmengenali analog biotin lainnya dibandingkan dengan uji mikrobiologis

menggunakanL. plantarum. EPBA telah digunakan untuk menentukan kandungan

biotin dalam hati anak domba dan hasilnya baik.

2.1.2 Asam Pantotenat

Asam pantotenat dalam bahan pangan umumnya terdapat dalam bentuk

bebas dan sebagian besar berikatan sebagai koenzim A dan berbagai turunan

protein. Penentuan asam pantotenat dalam penelitian sebelumnya telah banyak

menggunakan metode mikrobiologis. Pengembangan metode dalam penentuanasam pantotenat yang lebih tepat dan spesifik dilakukan untuk menentukan kadar

asam pantotenat dalam makanan. Metode yang digunakan dalam penentuan kadar

asam pantotenat dalam bahan pangan antara lain ELISA, mikrobiologis, KCKT,

dan teknologi biosensor.

Metode ELISA-taklangsung dikembangkan untuk analisis bahan pangan.

Asam pantotenat dan imunogen albumin serum anak sapi (BSA) dikonjugasikan

melalui dua cara. Cara pertama, alkohol 1 diderivatisasi dengan menggunakan

bromoasetil bromida. Turunan bromoasetil dari asam pantotenat kemudian

direaksikan dengan protein tereduksi dan terdenaturasi. Cara kedua, asam

pantotenat ditautkan dengan BSA melalui gugus asam karboksilat dengan

manggunakan prosedur anhidrida campuran. Antiserum yang digunakan ialah

bromoasetil bromida (BA) dan anhidrida campuran (MA). Tabel 1 menunjukkan

perbedaan hasil dari kedua antiserum, serum bromoasetil spesifik untuk penentuan

asam pantotenat dengan reaktivitas silang rendah untuk komponen yang diuji.Berbeda dengan BA, antibodi meningkat dengan pemasangan pada molekul ujung

melalui asam karboksilat. Hasil menunjukkan penentuan yang baik untuk

panteteina dan pantotenol. Kedua antiserum gagal untuk mengindentifikasi

koenzim A, diperkirakan karena mengandung turunan asam pantotenat pada setiap

ujung molekul.

Tabel 1 Perbedaan format ELISA dalam penentuan analog asam pantotenatKomponen

Jenis

antiserum

Pengenceran

(v:v)

Fase padat (PA-KLH)

(g mL-1)

Limit deteksi

(g per sumur)

Asam

pantotenatBA 1:4000 0.1 500

Asam

pantotenatMA 1:10000 1.0 5000

Panteteina MA 1:10000 1.0 5

Pantenol MA 1:10000 1.0 50

Tabel 2 menunjukkan hasil penentuan asam pantotenat dengan metode

ELISA lebih baik dibandingkan dengan uji mikrobiologis. Uji ELISA


10/16

6

menghasilkan nilai yang mendekati hasil literatur dibandingkan dengan metode

mikrobiologis. Penentuan asam pantotenat dengan metode ELISA menggunakan

antobodi aktif yang spesifik untuk vitamin yang berikatan kovalen dengan enzim

fosfatase basa. Penetuan asam pantotenat dengan uji mikrobiologis menggunakan

L. plantarum. Hasil yang ditunjukkan dengan menggunakan metodemikrobiologis memiliki perbedaan yang signifikan dengan hasil yang ditunjukkan

oleh literatur sehingga hasil yang diperoleh kurang baik dibandingkan dengan

metode ELISA.

Tabel 2 Hasil kandungan asam pantotenat dalam makanan

MakananELISA

(mg per 100 g)

Uji mikrobiologis

(mg per 100 g)

Kandungan

pantotenat

literatur

(mg per 100 g)

Susu 0.36 0.28 0.35

Kentang 0.23 0.23 0.30Roti 0.23 0.23 0.30

Telur 1.74 1.46 1.80

Hati 8.25 8.65 8.20

Selada 0.18 0.07 0.20

Tabel 3 menunjukkan perbandingan antara metode ELISA dan metode

mikrobiologis dari berbagai segi. Metode ELISA lebih menguntungkan

dibandingkan uji mikrobiologis dengan hasil yang lebih teliti serta sensitivitas

dan akurasi yang baik.

Tabel 3 Perbandingan metode ELISA dan uji mikrobiologis

Metode ELISA Uji mikrobiologis

PeralatanInkubator, piring

mikrotitrasi

Autoklaf,

spektrofotometer,

inkubator

ReagenAntiserum (primer dan

sekunder)

Organisme, kultur, kaldu

mikroinokulum, media

Biaya Reagen lebih murahReagen lebih murah tetapi

biaya tenaga kerja mahal

Persiapan uji (jam) 2 7

Lamanya uji (jam) 4 24-36

2.1.3 Analisis Asam Folat

2.1.3.1 Perbandingan Metode Analisis Asam Folat

Analisis folat dapat dilakukan dengan berbagai metode, yaitu metode

KCKT, RIA, EPBA, dan uji mikrobiologis. Metode KCKT menggunakan deteksi

ultraviolet (UV)dan fluorometri untuk melakukan analisis folat yang terkandung

dalam makanan. Metode KCKT memiliki kekurangan, yaitu akan sulit untuk

mendeteksi kadar vitamin dalam konsentrasi rendah yang terdapat dalam


11/16

7

makanan, sehingga dapat pula dilakukan analisis dengan metode EPBA dengan

memanfaatkan protein pengikat folat berlabel enzim dari susu sapi. Asam folat

mewakili kelompok penting vitamin kelompok B. Prosedur yang paling banyak

digunakan dan diterima untuk mendeteksi folat dalam makanan ialah uji

mikrobiologis menggunakan Lactobaacillus rhamnosusdan Enterococcus hirae.Tingkat folat rendah yang ditemukan dalam sebagian besar makanan dapat

menyebabkan masalah dalam deteksi dan kuantifikasi vitamin menggunakan

metode KCKT UV dan deteksi fluorometrik. Uji mikrobiologis dalam analisis

folat menunjukkan hasil yang cukup memuaskan dibandingkan dengan metode

KCKT. Beberapa literatur dalam analisis folat menggunakan metode RIA yang

dibandingkan dengan uji mikrobiologis, didapatkan bahwa antara metode RIA dan

uji mikrobiologis sering bertentangan. Faktor yang mempengaruhi afinitas folat

pengikat protein ialah suhu, waktu inkubasi dan pH. Asam pteroilglutamat lebih

stabil dibandingkan dengan 5-metil tetrahidrofuran (THF), pada pH yang lebih

tinggi dari 9.3, PGA akan lebih stabil dibandingkan 5-metil tetrahidrofuran

(THF), sebagai alternatif EPBA dikembangkan untuk folat yang mengikat proteindari susu sapi.

Tabel 4 Hasil analisis folat dalam kubis brussel

Metode Enzim dekonjugasi

Rerata kandungan

Folat (g per 100

gram)

Uji mikrobiologisPlasma manusia

Plasma ayam

824

984

EPBAPlasma manusia

Plasma ayam

739

320

RPBAPlasma manusia

Plasma ayam

93

290

KCKTPlasma manusia

Plasma ayam

762

729

Berdasarkan data pada Tabel 4 menunjukkan bahwa metode yang paling

baik untuk analisis folat adalah metode uji mikrobiologis, karena dari keempat

metode tersebut kandungan folat yang paling besar ditunjukkan pada uji

mikrobiologis, yaitu sebesar 824 g per 100 gram pada plasma manusia dan 984

g per 100 gram pada plasma ayam.

2.1.3.2 Ketersediaan Hayati Folat

Nilai nutrisi vitamin dalam bahan pangan bergantung pada konsentrasi total

bentuk vitamin yang secara hayati aktif dan ketersediaannya untuk diserap dan

digunakan dalam jalur metabolisme. Metode penentuan ketersediaan vitamin folat

pada awalnya menggunakan hewan percobaan anak ayam, namun percobaan

dengan menggunakan hewan mamalia seperti tikus lebih cocok digunakan untuk

menentukan ketersediaan folat dalam makanan manusia. Akan tetapi, kedua

metode tersebut memiliki kekurangan, yaitu memerlukan banyak hewan uji dan

menggunakan teknik uji mikrobiologis yang lama. Ketersediaan hayati folat


12/16

8

dalam penelitian diukur dengan hewan uji tikus Wistar jantan yang pertama-tama

dimiskinkan terlebih dahulu folatnya dengan pemberian pakan semisintetik bebas-

folat (FFS) dan air secara ad libitum, yaitu pemberian air kepada tikus sampai

pada saat tikus dalam kondisi tidak mau lagi minum meski minuman di sekitarnya

masih ada. Sukrosa dan kasein merupakan 2 komponen utama dalam FFS.Tikus kemudian diberikan makan lagi dengan menggunakan suplemen folat

yang mengandung asam pteroilglutamat atau kubis yang dikering-bekukan yang

digabungkan ke dalam pakan semisintetik untuk mengukur peningkatan pada folat

jaringan. Semua pakan disimpan dalam kantong politena hitam pada suhu -40 C

tersebih dahulu sebelum digunakan, karena folat dalam pakan stabil pada suhu

tersebut, akan tetapi kandungan folat akan berkurang ketika berada di kandang

hewan percobaan. Oleh karena itu, pakan suplemen asam pteroilglutamat

dianalisis pada awal dan akhir waktu pemberian makanan selama 7 hari.

Uji mikrobiologis ketersediaan folat dalam makanan dilakukan dengan cara

sampel pakan dihomogenkan dengan bufer asam askorbat, dididihkan,

didinginkan, disentrifugasi, kemudian supernatan disimpan pada suhu -20 Csebelum digunakan untuk pengujian. Ekstrak ditambahkan dengan enzim

dekonjugase ginjal babi untuk memotong poliglutamat folat. Kandungan total

folat pada ekstrak pakan ditentukan berdasarkan respons pertumbuhan

Lactobacillus casei. Medium pertumbuhan kasein asam folat ditambahkan dengan

asam askorbat, kemudian diinkubasi. Kurva kalibrasi dibuat dari asam

pteroilglutamat dengan berbagai konsentrasi. PertumbuhanL. caseidiukur dengan

menggunakan nefelometer EEL.

Tikus yang telah memasuki waktu akhir pemberian makanan kembali

dengan suplemen folat dibius dengan injeksi pada rongga perut menggunakan

natrium barbiturat dan dibunuh dengan irisan pada bagian perut tengah, kemudiansampel darah diambil dari vena kava. Hati tikus dibilas dengan larutan salin

fisiologis beku-dingin, kemudian dipotong menjadi potongan kecil. Usus halus

diambil, dibilas dengan salin, celah usus dibuka dan mukosa digoreskan dari

bagian jejunum dengan menggunakan kaca preparat. Sampel hati dan mukosa

usus disimpan dalam cairan nitrogen. Sampel serum yang diperoleh dari

sentrifugasi disimpan pula dalam cairan nitrogen sebelum dianalisis. Ketersediaan

folat pada sumber makanan diukur dengan cara menghitung folat yang

dikonsumsi oleh tikus dan membandingkan kenaikan folat serumnya pada pakan

yang mengandung kubis mentah dengan pakan yang mengandung asam

pteroilglutamat.

Ekstraksi sampel jaringan dilakukan dengan cara bagian hati atau mukosajejunum dihomogenkan dengan larutan asam askorbat, dididihkan, didinginkan,

disentrifugasi, supernatan ditampung, kemudian pelet diekstraksi ulang.

Supernatan digabungkan, kemudian diencerkan seperlunya untuk dianalisis

dengan menggunakan radioimmunoassay(RIA).Pengujian folat serum dan folat

jaringan dilakukan dengan menggunakan kit RIA berdasarkan pengikatan protein

secara kompetitif. Sampel serum diencerkan dengan menggunakan larutan asam

askorbat, dipanaskan dalam kondisi gelap yang bertujuan menghancurkan

endogen folat-pengikat protein. Setelah didinginkan, folat-pengikat protein

berlabel-[125I] ditambahkan baik ke dalam sampel serum maupun standar asam

folat, kemudian larutan diinkubasi dalam larutan bufer pH 9.3 pada kondisi gelap

dan pada suhu ruangan. Folat terikat dan folat bebas dipisahkan dengan


13/16

9

menggunakan dekstran-berlapis arang dan diikuti dengan sentrifugasi. Supernatan

didekantasi dan dicacah dengan alat cacah kelipan gama Philips PW4750.

Hasil yang diperoleh ketika hewan diberi makan kembali dengan suplemen

folat, yaitu terjadinya peningkatan konsentrasi folat jaringan yang mencerminkan

jumlah folat dalam pakan. Peningkatan folat serum mencerminkan konsentrasiasam pteroilglutamat yang lebih tinggi dengan jumlah yang sama dengan pakan

yang dikonsumsi. Tikus yang sebelumnya dimiskinkan folatnya, kemudian diberi

makan kembali dengan suplemen kubis. Suplementasi kubis lebih rendah diterima

dengan baik oleh hewan uji dan tidak banyak berpengaruh pada asupan pakan atau

pertambahan bobot, sebaliknya pada pemberian kubis yang lebih tinggi, hewan uji

berkurang nafsu makannya. Akan tetapi, kedua kelompok perlakuan pakan kubis

tersebut sama-sama menghasilkan kadar folat serum yang lebih tinggi daripada

kontrol, kira-kira sebanding dengan kubis yang diberikan.

Respons cadangan folat tersebut pada pemberian pakan kembali dengan

jumlah folat tertentu digunakan sebagai cara mengukur pengambilan dan

pemanfaatan vitamin tersebut oleh hewan uji. Kisaran respons terlebar didapatpada folat serum, yang juga lebih mudah diukur dengan menggunakan RIA.

Pengujian jaringan padat terbukti lebih rumit antara lain karena lebih kompleks,

rentan memberikan hasil yang tidak akurat, proses pembedahan memerlukan

waktu yang banyak, serta hati dan mukosa usus memiliki kemungkinan besar

terkontaminasi dengan darah. Hal terakhir ini dapat berperan pada tidak

konsistennya respons folat hati pada asupan makanan.

Salah satu kesulitan utama dalam uji ketersediaan hayati vitamin ini ialah

penggabungan makanan manusia ke dalam pakan hewan pada jumlah yang tepat

dan memiliki nilai yang cukup tinggi agar dapat diukur. Pemberian pakan kubis

yang dikering-bekukan tampaknya mengatasi masalah ini. Kadar folat serummeningkat secara signifikan, bahkan pada penambahan yang relatif sedikit.

Aktivitas enzim asam pteroilglutamat (PGA) hidrolase dalam sitoplasma sel

mukosa usus halus hewan uji agaknya berperan dalam mengurai bentuk

poliglutamat dari folat dalam pakan tersebut sehingga menjadi bentuk yang

tersedia.

2.1.4 Vitamin B12

Vitamin B12 dalam bahan pangan ditentukan dengan uji pertumbuhan

mikrobiologis menggunakan Lactobacillus leichmannii atau Ochromonasmalhamensis. Bakteri tersebut digunakan karena memiliki spesivisitas yang lebih

besar untuk kobalamins dan memberikan penilaian yang lebih akurat dari aktivitas

biologis vitamin. Kelemahan dari bakteri O. malhamensis memerlukan waktu

inkubasi yang lebih lama, yaitu mencapai 34 hari dibandingkan dengan L.

leichmannii, sedangkan kelemahan bakteri L. leichmannii dapat mengalami

gangguan jika sampel mengandung deoksiribonukleosida.

Vitamin B12 dalam uji klinis menggunakan RIA berdasarkan persaingan

antara sianokobalamin bertanda 57Co dan vitamin bebas yang tidak bertanda

terhadap tapak pengikatan yang jumlahnya terbatas pada protein pengikat B12.

Jenis awal uji pengikatan ligan radioaktif untuk vitamin B12dalam spesimen klinis

sering tidak akurat, karena protein pengikat yang digunakan dapat mengikat


14/16

10

bentuk aktif vitamin B12 maupun analog inaktif secara hayati sehingga

menimbulkan galat positif, sedangkan penentuan vitamin B12 dalam makanan

dengan RIA diperoleh hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan uji

mikrobiologis. Hal ini disebabkan pada metode RIA bergantung pada ekstraksi.

Prosedur ekstraksi yang lebih hebat cenderung mendapatkan hasil lebih tinggidibandingkan dengan uji mikrobiologis. Sementara keberadaan sianida dalam

prosedur ekstraksi dilaporkan memberikan hasil yang hampir sama dengan uji

mikrobiologis.

Metode EPBA telah dikembangkan dalam pelat mikrotitrasi untuk analisis

vitamin B12dalam bahan pangan terfortifikasi. Protein-R ditandai dengan enzim

peroksidase horseradish (HRP), lalu konjugat enzim-protein dimurnikan dengan

fast protein liquid chromatography(FPLC). R-protein umumnya digunakan pada

metode EPBA karena harganya lebih murah. Fase terimobilisasi disiapkan dengan

menggabungkan sianokobalamin dengan keyhole limpet hemocyanin (KLH)

menggunakan prosedur bromoasetil bromida, yaitu melalui gugus alkohol primer.

Hal ini berbeda dengan penelitian sebelumnya yang mana konjugat disintesismenggunakan gugus karboksilamida pada cincin corrin. Peningkatan sensitivitas

uji ditemukan dengan menggunakan konjugat bromoasetil dibandingkan dengan

sebelumnya sehingga protein-R bertanda enzim dapat digunakan pada

pengenceran yang lebih tinggi. Pelapisan pelat mikrotitrasi dan larutan enzim

protein-R berlabel digunakan untuk menstabilkan selama beberapa bulan tanpa

kehilangan aktivitas yang cukup besar.

Batas deteksi uji ini ialah 9 pg per sumur dan terdapat sedikit pengikatan

latar-belakang yang tak-spesifik. Penggunaan EPBA untuk menentukan jumlah

sianokobalamin yang ditambahkan dalam sereal makan pagi memberikan hasil

yang sesuai dengan jumlah teoritis. Ekstrak sampel yang tidak dilakukanpenambahan diuji untuk mengetahui gangguan yang terdapat dalam uji dan

didapat hasil kurva yang tidak dapat diperkirakan yang dibandingkan dengan

larutan standar. Penelitian ini juga menunjukkan bahwa inkubasi dengan waktu

yang lebih cepat memberikan hasil yang sama dengan inkubasi yang dilakukan

sepanjang malam.

Metode EPBA lebih bagus dibandingkan dengan metode mikrobiologis dan

RIA. Metode ini lebih mudah dilakukan, memiliki potensi ketertiruan yang lebih

baik, dan waktu pengujian yang lebih singkat dibandingkan dengan prosedur

mikrobiologis (denganLactobacillus leichmanniidan Ochromonas malhamensis).

Akan tetapi, batas deteksi untuk EPBA baru dapat digunakan pada bahan pangan

yang difortifikasi. Metode EPBA digunakan untuk mengukur jumlah alami dalambahan pangan. Kepekaan pengujian masih harus ditingkatkan dengan

menggunakan sistem deteksi titik-akhir lain, dan prosedur ekstraksi atau clean-up

mungkin diperlukan, serta memiliki waktu yang lebih singkat dibandingkan

dengan uji mikrobiologis.

2.2 Analisis Kuantitatif Berdasarkan Metode Biosensor

Metode lain yang dapat digunakan dalam penentuan kandungan vitamin

larut air dalam makanan ialah dengan uji biosensor. Uji biosensor berbeda dengan

uji biospesifik, yaitu uji biosensor merupakan uji yang digunakan untuk menguji


15/16

11

seluruh vitamin larut air seperti biotin, asam pantotenat, asam folat, vitamin B12,

dan vitamin B6 yang lebih cepat dan praktis karena menggunakan kit yang

spesifik untuk senyawa tertentu dibandingkan dengan metode biospsifik yang

hanya digunakan untuk menguji satu senyawa atau satu vitamin yang larut air.

Metode biosensor optis surface plasmon resonance (SPR) menggunakan alat kitBiacore Qflex.

Komponen utama cip sensor pada biosensor komersial terdiri atas cahaya

dan permukaan cip sensor. Cahaya dipantulkan seluruhnya secara internal pada

suatu antarmuka kaca-film logam (biasanya emas), dan reflektans diamati sebagai

fungsi sudut, pada sudut tertentu (sudut SPR), intensitas sinar pantul teramati

minimum. Hal ini menunjukkan eksitasi plasmon permukaan pada antarmuka

logam-larutan. Posisi respons tersebut peka akan perubahan indeks bias di sekitar

permukaan logam. Permukaan cip sensor terdiri atas permukaan kaca yang

dilapisi dengan selapis tipis emas yang dapat menjadi dasar untuk aneka

permukaan khusus yang dirancang untuk mengoptimumkan pengikatan secara

kovalen dan imobilisasi berbagai biomolekul. Permukaan yang paling banyakdigunakan ialah matriks yang tersusun dari gugus karboksimetil (CM) yang

langsung terikat pada lapisan emas atau terikat secara kovalen melalui penaut

hidrogel dekstran dengan panjang bervariasi.

Permukaan cip sensor yang memiliki matriks dekstran CM, terdapat lapisan

penaut alkanatiol yang memungkinkan pengikatan secara kovalen ke matriks

dekstran CM dan meminimumkan pengikatan non-spesifik ke lapisan emas.

Lapisan hidrogel dekstran membentuk suatu lingkungan hidrofilik bagi

biomolekul yang terikat, sehingga mereka tetap dalam keadaan tidak terdenaturasi.

Gugus CM dapat berikatan kovalen dengan amina, tiol, aldehida, dan gugus lain

yang segera setelah berinteraksi dengan sampel yang diinjeksikan, indeks biaspada antarmuka antara permukaan sensor dan larutan tersebut berubah sebanding

dengan perubahan massa di permukaan. Akibatnya, ketika molekul dalam larutan

uji terikat pada suatu target yang diimobilisasikan pada permukaan cip, massa

molekul meningkat yang memperbesar indeks bias lokal. Sebaliknya, ketika

komponen terurai, indeks bias di dekat permukaan cip sensor akan menurun.

Perubahan real-time massa pada permukaan cip sensor dideteksi secara optis dan

dilaporkan dalam bentuk sensor gram (akur sudut resonans [dalam RU] terhadap

waktu).

Prinsip metode biosensor ialah molekul pendeteksi yang memiliki bobot

molekul tinggi seperti protein atau antibodi pengikat vitamin (VBP/A)

ditambahkan ke dalam sampel. Larutan sampel diinjeksikan pada cip sensor, makaVBP/A akan terikat ke analit (vitamin) dalam sampel sebanding dengan jumlah

analit (vitamin) dalam sampel terebut. Protein atau antibodi pengikat vitamin

VBP/A yang tidak terikat akan tetap di dalam larutan dan berinteraksi dengan

analit (vitamin atau turunan vitamin) pada permukaan sensor. Pengikatan ke

permukaaan ini berlangsung dalam suatu aliran yang kontinu, bebas pulsa, dan

terkendali, sehingga menjaga konsentrasi VBP/A yang konstan di permukaan cip.

Oleh karena itu, tingkat respons setara dengan waktu kontak antara sampel dan

permukaan, yaitu volume injeksi. Respons diukur sebagai perbedaan mutlak yang

diperoleh segera sebelum dan segera sesudah injeksi sampel. Semakin tinggi

konsentrasi vitamin dalam sampel, semakin bertingkat inkubasi dan semakin


16/16

12

rendah respons yang terdeteksi pada cip biosensor. Respons dari deret konsentrasi

standar digunakan untuk membuat kurva kalibrasi.

3 SIMPULAN

Berdasarkan analisis yang telah digunakan, biosensor merupakan teknologi

yang lebih baik dan lebih menguntungkan dibandingkan dengan metode

biospesifik seperti ELISA, EPBA, RIA, dan mikrobiologis. Keuntungan dari

teknologi biosensor ialah seluruh vitamin larut air dapat terdeteksi, sedangkan

metode biospesifik hanya dapat mendeteksi satu senyawa saja. Konsentrasi serum

diperoleh paling tinggi pada ketersediaan hayati folat, sedangkan konsentrasi

terendah terdapat pada mukosa usus.

4 DAFTAR PUSTAKA

Finglas PM, Morgan MRA. 1993. Application of biospecific methods to the

determination of B-group vitamins in food a review.Food Chem.49:191-

201.

Gao Y, Guo F, Gokavi S, Chow A, Sheng Q, Guo M. 2008. Quantification of

water-soluble vitamins in milk-based infant formulae using biosesor-basedassays.Food Chem. 110:769-776.

Gee JM, Bhabuta A, Johnson IT. 1989. A technique for assesing the biological

avaibility of folate in foods.Food Chem. 31:149-158.

Lindsay RC. 1996. Food Chemistry. Ed ke-3. Di dalam: Fennema OR, editor.

New York (US): Marcell Dekker.

makalah kelompok 3 kelas kim 3b p1

Documents