makalah kroma daun pegagan

31
MAKALAH JURNAL PENELITIAN SEBUAH METODE KCKT-UV DITINGKATKAN UNTUK MENGUKUR GLIKOSIDA TRITERPENIC DAN AGLIKON SECARA BERSAMAAN DALAM DAUN PEGAGAN (Centella asiatica L.) URB (APIACEAE) Ilham Eka Saputra J3L111040 Taufik Nur Rahman J3L110067

Upload: ilham-eka-saputra

Post on 25-Nov-2015

281 views

Category:

Documents


14 download

DESCRIPTION

LOLO POLI

TRANSCRIPT

MAKALAH JURNAL PENELITIAN

SEBUAH METODE KCKT-UV DITINGKATKAN UNTUK MENGUKUR GLIKOSIDA TRITERPENIC DAN AGLIKON SECARA BERSAMAAN DALAM DAUN PEGAGAN (Centella asiatica L.) URB (APIACEAE)

Ilham Eka SaputraJ3L111040Taufik Nur RahmanJ3L110067

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMAINSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR2013KATA PENGANTARAlhamdulillah, puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang tak henti-hentinya memberikan nikmat kepada kita sehingga selalu terbuka jalan untuk kita meraih apa yang kita cita-citakan. Shalawat serta salam tercurah kepada Rasululah Muhammad SAW sebagai teladan dan guru besar kita dalm menapaki kehidupan dunia. Alhamdulillah sekali lagi penulis ucapkan atas selesainya Makalah Jurnal Kromatografi yang berjudul Sebuah Metode HPLC-UV Ditingkatkan Untuk Mengukur Glikosida Triterpenic Dan Aglikon Secara Bersamaan Dalam Daun Pegagan (Centella asiatica L.) URB (APIACEAE) ini, semoga dapat memberikan manfaat bagi para pembacanya. Makalah ini merupakan rangkuman dari jurnal mengenai mikrobiologi.Maka dari itu, parapembaca hendaknya menjadikan makalah ini sebagai referensi dalam penelitian atau laporan. Tentu saja masihbanyak kekurangan dalam makalah ini, untuk itu penulis menerima kritik dan saran demi penyempurnaan makalah ini.

Bogor, Mei 2013

PenyusunDAFTAR ISIKATA PENGANTAR2DAFTAR ISI3BAB I5PENDAHULUAN51.1 Latar Belakang Masalah51.2 Tujuan Penulisan71.3 Manfaat Penelitian7BAB II8TINJAUAN PUSTAKA82.1 Klasifikasi Tanaman Pegagan82.2 Diskripsi Dan Morfologi Tanaman Pegagan92.1.2 Kandungan Kimia Daun Pegagan (Centella asiatica)92.3. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT )10BAB III11BAHAN DAN METODE113.1. Bahan kimia dan sampel tanaman113.2. Alat123.3. Larutan standar123.4. Evaluasi ekstraksi133.5. Validasi metode13BAB IV14HASIL DAN PEMBAHASAN143.1. Optimisasi pada ekstraksi143.2.Validasi metode173.3.Aplikasi untuk sampel daun pegagan19BAB V22SIMPULAN DAN DAFTAR PUSTAKA22Simpulan22Daftar Pustaka23

BAB IPENDAHULUAN1.1 Latar Belakang MasalahDaun pegagan (Centella asiatica) adalah spesies ethnomedicinal herba, berasal dari India yang tumbuh secara spontan di daerah subtropis: Cina, Malaysia, Australia, Amerika, Afrika Selatan dan Madagaskar. Di Madagaskar, tanaman ini sebagian besar digunakan oleh penduduk setempat sebagai obat dan merupakan spesies tanaman obat kedua yang diekspor. Daun pegagan diduga memiliki sejumlah sifat obat dan digunakan dalam pengobatan Ayurvedic untuk pengobatan kusta, TBC kulit, penyembuhan luka, sakit perut, arthritis, varises, tekanan darah tinggi dan sebagai penguat memori dalam otak. Baru-baru ini, beberapa penelitian menunjukkan bahwa ekstrak tanaman memiliki aktivitas antioksidan, memiliki efek antiproliferatif pada sel tumor, meningkatkan perubahan dinding vena pada hipertensi vena kronis dan melindungi pembuluh vena endotelium. Asiatikosida, salah satu molekul aktif, dilaporkan menyebabkan perubahan dalam ekspresi gen dan menginduksi sintesis kolagen tipe I pada fibroblast manusia. Madekassosida dilaporkan memiliki efek anti-arthritis dan sifat penyembuhan luka.Triterpenoid dari daun pegagan (Gambar 1) adalah komponen dari obat medis dan banyak digunakan dalam persiapan kosmetik untuk perawatan kulit. Pada sampel yang dikumpulkan selama sepanjang tahun, terdapat perbedaan yang cukup besar dari isi triterpenoid diamati menurut wilayah geografis, fenotip dan genotipe, sehingga diperlukan penilaian metode analisis yang telah divalidasi. Dengan mengetahui hal ini juga akan dapat membantu penduduk setempat untuk menentukan budidaya dan kondisi panen yang terbaik.Kebanyakan penelitian yang mengarah pada daun pegagan yang menyuguhkan kuantifikasi heterosida, asam dan heterosida tetapi dengan metode yang kurang divalidasi. Beberapa metode yang dilaporkan berbasis HPLC hanya berbeda dalam komposisi fase gerak atau dalam sistem deteksi. Xingyi dan kawan - kawan mengusulkan metode yang hanya didedikasikan untuk kuantifikasi madekassosida dan asiatikosida menggunakan asetonitril / air (29/17 v / v) dalam mode isokratik. Kuantifikasi hanya madekassosida, asiatikosida dan isomer yang telah dilaporkan oleh Zhang dkk menggunakan detektor ELSD. Penambahan -siklodekstrin dalam fase gerak digunakan untuk kuantifikasi asam madecassic tunggal. Metode yang ada untuk kuantifikasi simultan madekassosida, asiatikosida, asam madekassik dan asam asiatik dapat digunakan campuran asetonitril / air, acetonitril/air dengan TFA 0,1% atau asetonitril / air masing-masing berisi 0,05% dari H3PO4 sebagai fasa gerak, bersamaan dengan panjang gelombang deteksi pada 205 nm. Sebagian besar metode tidak memberikan resolusi yang baik atau tidak cocok untuk LC-MS dan semua kurang divalidasi. Monografi dari Farmakope Eropa yang mengkuantifikasi jumlah triterpenoid (Gambar 2a) tapi upaya untuk mereproduksi pemisahan tidak memungkinkan untuk mengukur secara tepat senyawa ini. Hanya puncak yang sesuai dengan madekassosida jelas telah teridentifikasi, asiatikosida dan dua aglikon dielusi selama bagian pencucian gradien dan tidak dibedakan dengan (Gambar 2b). Hal ini juga diamati oleh European Pharmacopeia kelompok ahli yang berada di bawah revisi monografi.

Gambar 1 Struktur triterpena daun pegagan (Glu: glukosa, Rha: rhamnose).1.2 Tujuan PenulisanTujuan utama dari penulisan ini ialah untuk meningkatkan metode yang ada berdasarkan HPLC-UV dan memvalidasi pengukuran secara bersamaan madekassosida, asiatikosida dan aglikon, asam madecassik dan asam asiatik yang terdapat dalam daun pegagan.1.3 Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memberi informasi kepada pembaca tentang kandungan yang terdapat dalam daun pegagan (Centella asiatica) agar pembaca mengetahui manfaat yang terdapat pada daun pegagan ini.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA2.1 Klasifikasi Tanaman PegaganPegagan (Centella asiatika L. Urban) termasuk salah saltu tumbuhan yang paling banyak dipakai sebagai bahan ramuan obat tradisional (Reniza 2003). Sesuai dengan klasifikasi dalam tata nama (sistematika) dari tanaman pegagan adalah sebagai berikut: Divisi: Spermatophyta Kelas: Dicotylodone Orda: Umbillales Familia: Umbilliferae Genus: Centella Spesies: Centella asiatica2.2 Diskripsi Dan Morfologi Tanaman Pegagan Pegagan (Centella asiatica) merupakan tanaman liar yang banyak tumbuh di perkebunan, tepi jalan, pematang sawah ataupun di ladang yang agak basah. Tanaman akan tumbuh subur bila tanah dan lingkungannya sesuai hingga dijadikan penutup tanah. Tanaman yang terdapat diseluruh Indonesia berasal dari Asia tropic dan dapat ditemukan sampai ketinggian 2.500m dpl. Pada tiap ruas akan tumbuh akar dan daun dengan tangkai daun panjang dan akar berwarna putih. Jika keadaan tanahnya bagus, tiap ruas yang menyentuh tanah akan tumbuh menjadi tanaman baru. Daun tunggal, tersusun dalam roset yang terdiri dari 2 sampai 10 daun, kadang-kadang agak berambut. Perbungaan berupa payung tunggal atau 3 sampai 5 bersama-sama keluar dari ketiak daun kelopak. Buah pipih, lebar lebih kurang 7 mm dan tinggi lebih kurang 3 mm, berlekuk 2 berwarna kuning kecoklatan dan berdinding agak tebal (Syifaiyah 2008).

Gambar 2 Tanaman Pegagan (Syifaiyah 2008).Pegagan atau Gotu Kola dengan nama latin Centella Asiatica atau Hydrocotyle asiatica, mempunyai banyak nama di Indonesia; Daun kaki kuda, Apapaga (Batak), Pegaga (Deli), Pagago (Minang), Pegaga (makasar); Antanan gede, Antanan rambat (Sunda), Dau tungke (Bugis); Pegagan, Gagan-gagan, Rendeng, Kerok batok (Jawa); Kos tekosan (Madura), Kori-kori (Halmahera) (Syifaiyah 2008).2.1.2 Kandungan Kimia Daun Pegagan (Centella asiatica) Pegagan mengandung berbagai zat kimia yang dinamakan triterpenoid glikosida diantaranya asiatikosida, madekassosida, asam asiatik, asam medakakossida serta garam mineral (seperi garam kalium, natrium, magnesium, kalsium, besi) zat pahit vellarine (Syifaiyah 2008). Pegagan juga mengandung vitamin E dan C yang berperan sebagai antioksidan alami dan juga sebagai perusak radikal bebas serta berperan membangun daya tahan tubuh terhadap infeksi berbagai jenis virus maupun bakteri.

Gambar 3 Struktur kimia kandungan pegagan (Reniza 2003).2.3. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT )Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur ( CaSO4 ). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom (Subani 2008).Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan system pemisahan dengan ketepatan dan efisiensi yang tinggi karena KCKT didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, system bertekanan tinggi dan detector yang sangat sensitif. KCKT mampu menganalisis sampel secara kualitatif maupun kuantitatif, baik pada campuran maupun komponen tunggal. Kelebihan menggunakan KCKT ialah mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, memiliki resolusi yang baik, kecepatan analisis dan kepekaan tinggi serta dapat meminimumkan dekomposisi bahan yang dianalisis (Braithwaite and Smith 1999)Prinsip kerja KCKT, dengan bantuan pompa fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom menuju detector. Sampel dimasukan ke dalam fase gerak dengan cara penyuntikan sehingga terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute terhadap fase diam (Harvey 2000). Gambar 4 Komponen-komponen penting dalam KCKT (Subani 2008).

BAB IIIBAHAN DAN METODE3.1. Bahan kimia dan sampel tanamanAsiatikosida (99,2%, HPLC), madekassosida (97,94%, HPLC), asam asiatik (99%, HPLC) dan asam madekassik (95%, HPLC) yang dibeli dari Extrasynthese (Genay, Prancis). Asetonitril dan metanol HPLC berasal dari Prolabo, VWR (Leuven, Bel-Gium).Daun pegagan yang dikumpulkan pada bulan Desember 2007 dan Januari 2008 di dataran tinggi daerah Timur Madagaskar. Daun dipisahkan dari batang, dikeringkan pada 40 C, digiling dan diayak dengan ayakan 355 m mesh. Bubuk daun disimpan pada suhu kamar dalam ruang gelap dan kering.Sebanyak 1 gram daun kering bubuk diekstraksi dengan Soxhlet selama 8 jam dengan 100 ml metanol. Ekstrak diuapkan sampai kering pada tekanan yang tereduksi. Ekstrak kering mentah dilarutkan dalam 10 ml metanol, disaring melalui filter 0,45 (Whatman, New Jersey, USA).3.2. AlatHPLC Waters 2690 modul pemisahan (Waters, Milford, MA, USA) digunakan terdiri dari pompa, auto-injektor, detektor spektrofotometri Kromaton UV (Angers, Prancis), semuanya dikontrol dengan perangkat lunak Borwin (Borwin, Rostock, Jerman).Untuk penentuan spektrum massa, digunakan perangkat lunak X - Calibur dengan LCQ Thermo Finnigan (Waltham, MA, USA).Table 1 Kondisi terprogram pada KCKTWaktu (menit)Pompa a, Air (%)Pompa b, Asetonitril (%)

08020

156535

303565

352080

402080

458020

558020

Pemisahan kromatografi dilakukan dengan fase terbalik menggunakan kolom RP-18 LiChroCART (250 mm x 4 mm ID; ukuran partikel: 5 m). Fase gerak gradien asetonitril / air (Tabel 1), laju alir 1 ml / menit dan deteksi pada panjang gelombang 206 nm.3.3. Larutan standarLarutan stok asiatikosida dan asam asiatik disiapkan dalam metanol sebesar 5,0 dan 2,5 mg / ml, masing-masing disimpan pada 0 C. Pengenceran dilakukan untuk setiap percobaan. Tiga konsentrasi digunakan (m = 3) asiaticoside (0,5, 2,5 dan 5,0 mg / ml) dan asam Asiatik (0,25, 1,0 dan 2,5 mg / ml). Setiap konsentrasi dianalisis dua kali (n = 2) selama 3 hari (k = 3).Larutan ekstrak diencerkan dengan metanol (1:5, v / v) untuk penyusunan standar validasi dan dibubuhi tiga konsentrasi yang diketahui dari campuran stok asiatikosida dan asam asiatik. Setiap standar validasi dianalisis tiga kali (n = 3) selama 3 hari (k = 3).3.4. Evaluasi ekstraksiPada kinetik ekstraksi dibentuk dengan mengevaluasi daerah puncak (analisis HPLC) dari masing-masing senyawa setelah 4, 6, 8 dan 10 jam (n = 3). Waktu ekstraksi Soxhlet paling tepat ditentukan dengan menggunakan data ini.3.5. Validasi metodeSemua referensi senyawa yang tersedia secara komersial, tetapi asam asiaticoside dan asiatic dipilih untuk mencapai validasi metode dan untuk mengukur madekassosida dan asam madekassik, karena untuk mengamati faktor respon yang identik dua aglikon di KCKT-UV (Tabel 2). Akibatnya, hanya memilih dua referensi dapat mengurangi biaya analisis.Sebagaimana matriks biologi yang terdapat pada daun pegagan, batas penerimaan yang diresepkan relatif besar. Validasi metode dilakukan selama 3 hari dengan menguji kriteria sebagai berikut: fungsi respon, linearitas, trueness, presisi (pengulangan dan presisi menengah), akurasi, batas deteksi (LOD) dan kuantifikasi (LOQ), dan jangkauan kuantifikasi. Analisis statistik data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak e-noval V2.0 (Arlenda-Lige).

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN3.1. Optimisasi pada ekstraksiBeberapa model ekstraksi telah disarankan seperti maserasi, sonikasi atau sokhletasi. Ekstraksi soklet dipilih sebagai yang paling mudah untuk dikendalikan. Pemilihan metode sokletasi didasarkan pada prosesnya yang lebih singkat dari metode maserasi. Pada metode sokletasi, ekstraksi dan distilasi dilakukan pada saat yang bersamaan (Bernad , dkk 2007). Seperti pada gambar 3, tidak ada perbedaan yang signifikan yang diamati setelah 8 dan 10 jam ekstraksi. Akibatnya, waktu ekstraksi selama 8 jam yang digunakan pada semua percobaan. Hasil yang menguatkan dari penemuan Farmakope Eropa menandakan pengamatan masalah dengan metode Farmakope Eropa digunakan untuk mengkondisikan kromatografi dan tidak ada gangguan pada ekstraksi.

Gambar 2. (a) kromatogram dari ekstrak mentah Centella asiatica (1: pelarut, 2: madekasosida (TR = 5.8), 3: asiatikosida (TR = 8.1), 4: asam madekasik (TR = 17.6), 5: asam asiatik (TR = 21.7)); (b) kromatogram dari ekstrak mentah Centella asiatica yang diperoleh menggunakan metode European Pharmacopoeia (1: madekasosida); (c) kromatogram standar referensi dengan metode yang dikembangkan (1: madekasosida and isomernya (asiatikosida B), 2: asiatikosida, 3: asam madekasik, 4: asam asiatik); (d) kromatogram ekstrak mentah Centella asiatica dengan metode yang dikembangkan.Pengembangan metode yang dilakukan untuk mendapatkan hasil pemisahan yang baik. Berdasarkan kromatogram yang ditunjukan pada gambar 2, pemisahan senyawa yang terdapat pada daun pegagan memiliki kromatogram dengan yang tidak saling bertumpung yang sesuai dengan kromarogram yang ditunjukan oleh standar (gambar 2c).Asiatikosida merupakan senyawa yang dapat menstimulasi sintesis collagen (pebaikan jaringan), sedangkan Medadekassodisa merupakan senyawa triterpenoid yang menstimulasi pembentukan protein dan lipid yang dibutuhkan oleh tubuh (Syifaiyah 2008).

Gambar 4 Struktur kimia Asiatikosida dan Madecassosida (Syifaiyah 2008)

2. Asam Asiatik Senyawa ini berperan sebagai anti septic meliputi anti bakteri dan berpotensi sebagai anti-fungi, senyawa ini juga dapat melindungi tubuhdari pengaruh radikal bebas, senyawa ini pada umumnya digunakan untuk menyembuhkan luka.

Gambar 5 Struktur kimia asam asiatik (Syifaiyah 2008).Table 2 rasio area puncak pada penentuan kandungan yang berbeda dengan asiatikosidaKandungan

madekasosidaasiatikosidaAsam madekasikAsam asiatik

Standar sebenarnya97.94%99.2%95%99%

Rasio area puncaka10.5b1.00.2b2.11.3b2.10.3b

a rasio area untuk beberapa kandungan yang telah dikalkulasikan menggunakan respon asiatikosida sebagai acuan.b RSD (%).3.2.Validasi metodeSelektivitas dan kemurnian puncak dianalisis dengan perbandingan waktu retensi dan spektrum massa dengan senyawa referensi.Spektrum massa dianalisis pada tiga tingkatan (awal, tengah dan akhir) dari masing-masing puncak diselidiki dan ditemukan sebanding (Gambar 2c-d dan 4a-d).Perbandingan kromatogram ekstrak C. asiatica dari metode Farmakope Eropa (Gambar 2a) dan kromatogram yang diperoleh dengan metode kami (Gambar 2d) menunjukkan resolusi yang baik dan kepentingan metode ini dikembangkan untuk kuantifikasi aglikon.Kami juga mengamati bahwa madekasosida dan isomernya (asiaticoside B juga disebut terminolosida) yang sedikit terpisah, tapi karena keduanya dianggap aktif dan biasanya tidak dipisahkan; kami menambahkan kedua daerah dan dianggap sebagai salah satu puncak kedua puncak madekasosida untuk memungkinkan perbandingandengan hasil yang lain.Profil Akurasi diplotkan untuk menentukan model regresi yang paling sesuai(Gambar.5a dan b) menunjukkan profil akurasi diperoleh dengan regresi kuadrat sebagai fungsi respon untuk kedua standar.Hal ini dipilih karena memiliki selang kepercayaan 95% yang termasuk ke dalam batas toleransi 20% untuk setiap tingkat konsentrasi standar untuk kedua analit.Teoritis dinyatakan dalam bias relatif (%) pada setiap tingkat konsentrasi dari standar.Bias relatif kurang dari 3% (Tabel 3) untuk asiatikosida dan 10% untuk asam asiatik menunjukkan ketepatan sangat baik dari metode ini. Bias relative merupakan tingkat kesalahan relative yang ditunjukkan pada suatu kelas atau tingkat signifikan yang disebabkan adanya pengambilan sampel secara acak dan perawatan yang berbeda-beda. Semakin kecil nilai bias maka ketepatan akan semakin baik (Bayona and Olsen 2004).

Gambar 3. Respon madekasosida, asiatikosida, asam madekasik dan asam asiatik setelah ekstraksi sokletasi dengan waktu yang berbeda pada daun pegagan.Presisi dievaluasi dalam hal standar deviasi (SD, mg / ml) dan standar deviasi relatif (RSD%) untuk nilai keterulangan dan presisi menengah. Seperti yang terlihat pada Tabel 3, RSD (%) untuk pengulangan dan presisi menengah tidak melebihi 4%. Standar deviasi dan standar deviasi relatif dapat menunjukkan tingkat ketelitian suatu pengerjaan, semakin kecil nilai standar deviasi dan standar deviasi relatif maka tingkat ketelitian akan semakin baik (Harvey 2000).Akurasi memungkinkan untuk mengevaluasi kesalahan total, jumlah kesalahan sistematis dan acak dari tes hasil. Untuk asiaticoside dan asiatic acid, profil akurasi yang ditunjukkan pada gambar 5a dan b, menunjukkan batas atas dan bawah pada selang kepercayaan 95% termasuk dalam batas toleransi yang ditetapkan sebesar 20%. Metode tersebut dapat dianggap akurat antara 1.0 dan 3.0 mg / ml untuk asiatikosida dan antara 0.5 dan 2.0 mg / ml untuk asam asiatik.Untuk asiaticoside dan asam Asiatik, LOD (jumlah terkecil dari analit yang dapat terdeteksi dalam sampel, tetapi tidak dapat diukur) adalah 0.0113 dan 0.0023 mg / ml. Hasil ini diperkirakan menggunakan intercept rata-rata model kalibrasi dan varians residual dari regresi. LOQ (jumlah terkecil diukur dalam sampel) ditentukan dengan profil akurasi, sehingga tingkat konsentrasi terkecil memiliki total kesalahan maksimum 20%. Seperti yang ditunjukkan pada gambar 5a dan b, LOQ adalah tingkat konsentrasi terkecil dari validasi standar-standar untuk asiatikosida dan asam asiatik yang masing-masing sebesar 1.0 dan 0.5 mg / ml.Gambar 5 Profil Akurasi asiatikosida (a) dan asam asiatik (b) diperoleh dengan regresi kuadrat. Batas toleransi bias relative (garis polos warna merah), nilai dugaan 95% (garis putus-putus warna biru) dan garis putus-putus mewakili batas penerimaan ( 20%). Titik-titik mewakili konsentrasi yang dihitung berdasarkan standar validasi relative sesuai dengan konsentrasi yang ditargetkan.Linearitas menunjukkan hubungan konsentrasi yang dihitung menggunakan pendekatan interval dugaan . Konsentrasi standar validasi dihitung untuk menentukan tingkat konsentrasi, bias relatif rata-rata serta interval batas atas dan bawah pada dugaan nilai . Batas penerimaan ditetapkan sebesar 20%. Nilai-nilai slope yang diperoleh untuk dua standar masing-masing sebesar 1.02 dan 1.023. 3.3.Aplikasi untuk sampel daun pegaganSampel daun pegagan sebanyak 3 buah dikumpulkan di Bagian Timur dan Dataran Tinggi Madagaskar. Senyawa heterosida terkandung lebih banyak daripada aglikon dan asiatikosida yang sering menjadi kandungan utama. Metode yang dilakukan menunjukkan nilai ketepatan yang dapat diandalkan karena memilliki nilai persen standar deviasi relative (%RSD) yang rendah. Hasil ini menekankan pentingnya metode kuantifikasi baik untuk menentukan budaya terbaik dan kondisi panen.Sebuah metode divalidasi untuk mengembangkan pengukuran asiatikosida, madekasosida, asam asiatik dan asam madekasik dalam sampel obat daun pegagan.Metode ini dapat mengukur secara bersamaan madekasosida, asiatikosida, asam madekasik dan asam asiatik.Sebagian besar metode lain yang divalidasi hanya mengukur atau menghitung beberapa molekul aktif.Selain itu, metode yang dijelaskan di Farmakope Eropa tidak memberikan sinyal yang baik pada rasio gangguan (noise) untuk kuantifikasi akurat aglikon.Table 3 hasil validasi pada ekstrak kasar daun pegaganKriteria validasiAsiatikosidaAsam asiatik

Fungsi tanggapanRentang kalibrasi regresi kuadrat (3 poin) 0.5-5 mg/mlRentang kalibrasi regresi kuadrat (3 poin) 0.25-2.5 mg/ml

TeoritisKonsentrasi (mg/ml)Bias relatif (%)Konsentrasi (mg/ml)Bias relatif (%)

12.60.519.7

20.71-5.8

32.223

PresisiKeterulangan (SD mg/ml)Presisi menengah (%RSD)Keterulangan (SD mg/ml)Presisi menengah (%RSD)

0.23132.90.24211.5

0.09872.50.14271.8

0.2521.50.19973.3

AkurasiBatas atas dan bawah nilai harapan pada galat relatif (%)Batas atas dan bawah nilai harapan pada galat relatif (%)

-11.5; 16.62.5; 3.1

-11.6; 13.0-14.6; 3.1

-5.0; 9.30-13.4; 19.3

Linearitas

Slope1.021.023

Intercept-0.005007-0.01017

r20.9980.9912

Tabel 4 Perkiraan ketidakpastian pengukuran yang berkaitan dengan asiatikosida dan asam asiatik pada setiap tingkat konsentrasi menggunakan regresi kuadrat.asiatikosidaKonsentrasi (mg/ml)Konsentrasi mean (mg/ml)Ketidakpastian bias (mg/ml)Ketidakpastian (mg/ml)Luas ketidakpastian (mg/ml)Luas ketidakpastian relatif (mg/ml)

1.01.0000.016440.032940.065886.6

2.02.0000.028600.057230.11455.7

3.03.0000.025540.051460.10293.4

Asam asiatikKonsentrasi (mg/ml)Konsentrasi mean (mg/ml)Ketidakpastian bias (mg/ml)Ketidakpastian (mg/ml)Luas ketidakpastian (mg/ml)Luas ketidakpastian relatif (mg/ml)

0.50.50000.0042860.0086280.017263.4

1.01.0000.010310.020650.041314.1

2.02.0000.038090.076250.15257.6

Tabel 5 Perbandingan isi triterpen dalam sampel daun pegagan yang dianalisis dengan metote sebelumnyaSampelMadekasosidaAsiatikosidaAsam MadekasikAsam Asiatik

Sampel 11.70.042.00.020.950.0390.980.03

Sampel 21.270.0131.630.04