MAKALAH ANALISIS FARMASI

Penggunaan Kromatografi Kolom Silica Gel sebagai Pemurnian Resveratrol dari Ekstrak Daun Morus alba L.

Disusun Oleh:Angky Glori(118114005)Henra(118114045)Carolina Dea Sekar(118114046)FST-A 2011

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMAYOGYAKARTA2013I. PendahuluanEkstraksi cair-cair merupakan cara untuk praperlakuan sampel untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit, ekstraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi yang menyatakan bahwa pada konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan terdistribusi dalam proporsi yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak campur. Perbandingan konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam 2 fase disebut koefisien distribusi atau koefisien partisi. Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang menggunakan fase diam(stationary phase) dan fase gerak ( mobile phase).Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaan saja yang melibat kan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hydrogen, penarikan dipole-dipol, dan penarikan yang diinduksi oleh dipole. Solute akan bersaing dengan fase gerak untuk berikatan dengan sisi polar pada permukaan adsorben. Silica gel merupakan jenis adsorben ( fase diam) yang penggunaannya paling luas. Permukaan silica gel terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini mampu membentuk ikatan hydrogen dengan solute-solut yang agak polar sampai sangat polar. Fase diam yang digunakan biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silica gel dan alumina, dan fase gerak yang digunakan untuk fase diam silica gel adalah berupa pelarut non polar yang ditambahkan dengan pelarut polar seperti air atau alkohol rantai pendek untuk meningkatkan kemampuan elusinya sehingga tidak timbul pengekoran puncak. HPLC merupakan teknik pemisahan dan teknik pemurnian senyawa menggunakan tekanan yang tinggi.Resveratrol adalah salah satu senyawa polifenol yang salah satunya terkandung dalam daun mulberry yang termasuk dalam keluarga moraceae, salah satunya terdapat di china. Daun mulberry terdapat beberapa senyawa aktif seperti polisakarida, alkaloids, peptide, flavonoids, dan polifenols. Kegunaannya biasanya digunakan untuk mengobati diabetes, stroke, penyakit jantung dan beri-beri, pencegah obesitas, dan meningkatan penglihatan mata. Pada tamanan mulberry resveratrol yang paling banyak adalah bagian isomer trans-resveratrol. Selain pada mulberry, resveratrol terdapat di ekstrak dari Rhizoma Polygoni cuspidate (polygonaceae) dan kulit anggur ( Vitaceae ). Penggunaan daun mulberry biasanya sebagai makanan dari ulat buluII. IsiPersiapan preparasi adsorbent dan kolom dengan cara timbang 40 g dari silica gel G dan panaskan pada 105C selama 30 menit, dipanaskan dilakukan untuk mendeaktifkan permukaan silica gel mencegah air yang akan menutup sisi aktif silica gel. lalu dilakukan hydrophobized dengan menambahkan 100 ml kloroform, kemudian di lanjutkan dengan pemanasan selama 20 menit dengan suhu 180C dalam oven vacuum drying. Kemudian memasukkan atau melapisi kolom dengan silica gel G ( dalam diameter/panjang = 15/20) dengan metode wet packing. Perlakuan untuk kolom dimasukkan 40 ml ekstrak dalam kolom, kolom di cuci dengan 600 ml eluen ( kloroform : methanol = 10:1) dengan kecepatan 2 ml/min, kumpulkan eluen 10 ml/botol. Setelah diuapkan eluate, di larutkan ke dalam 10 ml methanol dengan konsentrasi 50%, setelah itu sampel di injeksikan ke dalam HPLC. Pada akhirnya 80 sampel yang telah di kumpulkan bersama-sama dan di tandai 1 sampai 60 sampel.Metode yang digunakan dalam jurnal adalah metode HPLC dengan kolom silika gel. Dilakukan ekstraksi sampel ekstrak mulberry menggunakan rotary evaporator. Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi dan analisis adalah etanol, etil asetat, aseton, metanol, air murni dan standar resveratrol sebagai standar eksternal. Pemisahan menggunakan kromatografi menggunakan kolom kromatografi ODS ( 4,6 x 250 mm, 5 mm, hypersil ) dioperasikan pada suhu 35C dan panjang gelombang 298 nm. Fase gerak menggunakan methanol : air , 6,4:3,6 (v/v) pada flow rate 1 ml/menit, dan volume injeksi 20l.Tahap pertama dibuat kurva standar. Untuk membuat kurva standar, sebanyak 0,02 g dari sampel standar resveratrol ditimbang dan dipindahkan ke 50 ml labu alas bulat berwarna coklat, larutan metanol ditambahkan sampai batas skala, sambil digojog, kemudian didapatkan larutan stok 400 mg/L. Lalu, dibuat pengenceran larutan stok pada 200, 100, 300, 400 mg/L larutan standar secara terpisah. Sebanyak 20 l sampel diambil untuk melihat peak area. Kurva standar digambar pada titik koordinat dari peak area yang ada, absis mempresentasikan konsentrasi massa dari resveratrol. Untuk mendeterminasi sampel resveratrol, 20l larutan ekstrak dan disentrifugasi terlebih dahulu kemudian diinjeksikan ke HPLC. Identifikasi Resveratrol dilakukan dengan membandingkan waktu retensi relatif dari peak sampel dengan standar. Kromatografi dari sampel yang telah diekstraksi ditunjukkan pada gambar 3.

Gambar.3 Kromatogram HPLC ekstrak mulberryKonsentrasi etanol yang digunakan adalah 80%, rasio padatan dalam liquid adalah 1:15, suhu 60C dan waktu ekstraksi 90 menit. Untuk pengujian kestabilan dan presisi dari metode HPLC, replikasi lima sampel standar dari resveratrol diinjeksikan per hari secara terus-menerus. Sampel standar yang diinjeksikan pada 5 waktu yang berbeda yaitu 0, 2, 4, 6, dan 8 jam, didapatkan standar deviasi relatif (RSD) yang dikalkulasi sesuai dengan peak area. Untuk uji keterulang (repeatability), 10 g sampel serbuk mulberry dimasukkan ke labu alas bulat dan ditambahkan 100 ml 80% etanol yang telah didihkan di penangas air pada suhu 55C untuk dilakukan ekstraksi refluks selama 90 menit.Hasil ekstraksi dipindahkan ke rotary evaporator untuk menguapkan pelarut sehingga didapatkan konsentrasi ekstrak yang pekat. Dalam ekstrak yang pekat ini masih terdapat resveratrol dan kandungan pengotor lainnya. Setelah didapatkan ekstrak yang pekat, kemudian dilarutkan dalam 10 ml larutan methanol, lalu diultrasonik selama 10 menit, dan disimpan didalam lemari pendingin selama 2 hari. Lalu larutan ekstraksi akan terkumpul setelah 10 menit setelah dilakukan sentrifugasi. Untuk tes recovery sampel, sampel standar yang memiliki jumlah yang sama dengan larutan sampel akan diketahui konsentrasinya. Kemudian resveratrol dideterminasi dengan HPLC.Ada beberapa pengaruh faktor-faktor dalam laju ekstraksi. Faktor-faktor tersebut adalah: perbedaan jenis pelarut, perbedaan konsentrasi etanol, perbedaan volume etanol, perbedaan suhu, dan perbedaan waktu yang dibutuhkan dalam ekstrasi. Cara kerja dari masing-masing faktor adalah: Efek dari adanya perbedaan pelarut ekstraksi terhadap laju ekstraksi: Sebanyak 10 gram dari daun mulberry ditimbang dan ditambahkan pada 4 labu alas bulat dengan 150 ml pelarut yang berbeda yaitu: etanol, metanol, etil asetat, dan aseton dengan konsentrasi 80% berturut-turut. Larutan diekstraksi pertama kali di penangas air pada suhu 60C dan dengan waktu ekstraksi 90 menit. Hasil ekstraksi didapatkan setelah ekstraksi kasar disaring dan disentrifugasi. Hasil ekstraksi disimpan dalam kulkas setelah dicampurkan dengan 10 ml larutan metanol. HPLC digunakan untuk penentuan resveratrol.Hasil dari adanya perbedaan pelarut ekstraksi terhadap laju ekstraksi ditunjukkan dalam tabel di bawah ini.

Dari tabel di atas, ditunjukkan bahwa pelarut yang memberikan peak area tertinggi adalah aseton. Tetapi dalam penelitian ini digunakan pelarut etanol karena mempertimbangkan keamanan dan recovery-nya. Penggunaan etanol dinilai lebih aman daripada aseton dilihat dari toksisitasnya. Efek dari perbedaan konsentrasi etanol dalam laju ekstraksi:Sebanyak 10 gram dari serbuk daun mulberry ditimbang dan ditambahkan ke 5 labu alas bulat. Ekstraksi pertama kali pada waktu ekstraksi selama 90 menit, dan suhu 60C. Variasi konsentrasi etanol yang digunakan adalah 50 , 60, 70, 80, dan 90 %. Setelah ekstraksi selesai lalu divakumfilter menggunakan corong Buchner dan dilarutkan ke dalam 10 ml metanol kemudian disentrifugasi.Hasil dari adanya perbedaan konsentrasi etanol dalam laju ekstraksi ditunjukkan dalam tabel di bawah ini.

Dari tabel di atas, ditunjukkan bahwa konsentrasi etanol yang memberikan peak area paling tinggi adalah etanol 90% karena jika menggunakan konsentrasi di atas 90%, sudah tidak memberikan perubahan peak area yang signifikan. Efek dari perbedaan volume etanol terhadap laju ekstraksi:Sebanyak 10 gram dari serbuk daun mulberry ditimbang dan dimasukkan ke 5 labu alas bulat. Kondisi ekstraksi dilakukan pada waktu ekstraksi 90 menit, dan suhu 60C. Konsentrasi etanol yang digunakan 80%. Diberikan variasi volume etanol yaitu : 90, 110, 130, 150, dan 170 ml. Setelah diekstraksi kemudian larutan divakumfilter, setelah itu dilarutkan dalam 10 ml metanol dan disentrifugasi.Hasil dari adanya perbedaan volume etanol dalam laju ekstraksi ditunjukkan dalam tabel di bawah ini.

Dari tabel di atas, ditunjukkan bahwa volume etanol yang memberikan peak area paling tinggi adalah rasio 1:17 (solid:liquid) karena tingkat ekstraksi resveratrol meningkat dengan peningkatan rasio solid menjadi liquid. Pengaruh perbedaan temperatur terhadap laju ekstraksi:Sebanyak 10 gram dari serbuk daun mulberry ditimbang dan ditambahkan ke 5 labu alas bulat, masing-masing ditambahkan 150 ml etanol. Konsentrasi etanol yang diberikan 80%, waktu ekstraksi yang dilakukan 90 menit, dan dibuat variasi suhu yaitu 40, 50, 60, 70 dan 80C. Setelah itu ekstraknya divakumfilterkan, dan dilarutkan ke dalam 10 ml etanol dan disentrifugasikan.Hasil dari adanya perbedaan konsentrasi etanol dalam laju ekstraksi ditunjukkan dalam tabel di bawah ini.

Dari tabel di atas, ditunjukkan bahwa suhu yang memberikan peak area paling tinggi adalah 80C karena tingkat ekstraksi resveratrol meningkat seiring dengan peningkatan suhu. Namun, efeknya tidak terlalu signifikan ketika suhu lebih tinggi dari 70C. Melihat pengaruh perbedaan waktu ekstraksi dengan laju ekstraksi:Diukur pada waktu 30 ,45 ,60 ,75 , dan 90 menit. Suhu saat melakukan ekstraksi yaitu 60C, dan volume alkohol yang digunakan adalah 150 ml. Setelah itu ekstrak divakum filterkan, dan dilarutkan dengan 10 ml methanol dan di kemudian di sentrifugasi.Hasil dari adanya perbedaan konsentrasi etanol dalam laju ekstraksi ditunjukkan dalam tabel di bawah ini.

Dari tabel di atas, ditunjukkan bahwa waktu ekstraksi yang memberikan peak area paling tinggi adalah 105 menit. Tingkat ekstraksi resveratrol meningkat seiring dengan peningkatan waktu ekstraksi. Namun, ketika waktu ekstraksi lebih besar dari 90 menit, kenaikan itu tidak menunjukkan hasil yang signifikan.Setelah itu dilakukan percobaan orthogonal yaitu untuk memastikan keakuratan dan kegunaan dari percobaan. Kemudian empat faktor tes ortogonal tingkat tiga dilakukan dengan menggunakan empat faktor menurut L9 (34) tabel (Tabel 9), tingkat tabel adalah sebagai berikut: konsentrasi etanol (A) adalah 70, 80, dan 90%; rasio bahan (B) adalah 1:13, 1:15, dan 1:17; suhu (C) adalah 50, 60, dan 70C, dan waktu ekstraksi (D) adalah 75, 90, dan 105 menit. Dalam kondisi eksperimental yang sesuai, 10 g bubuk daun murbei ditimbang untuk ekstraksi, dan kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator setelah penyaringan dan mengumpulkan larutan yang diekstraksi. Akhirnya, larutan pekat dilarutkan dengan 10 ml metanol dan disimpan dalam lemari es sebelum menggunakan HPLC untuk menentukan resveratrol. Hasil uji ortogonal ditunjukkan pada Tabel 10. Dari Tabel 10, dalam ekstraksi refluks murbei daun, faktor yang paling signifikan dari isi resveratrol adalah konsentrasi etanol, diikuti dengan waktu ekstraksi dan suhu, sedangkan rasio padat menjadi cair tidak signifikan. kondisi ekstraksi optimum dapat diatur menjadi A3B1C3D2. Namun, dengan mempertimbangkan efek etanol 80 dan 90%, kami memilih untuk menggunakan A2B1C2D3 di mana konsentrasi etanol 80%, yang solid untuk rasio cair 01:13, ekstraksi suhu 60C, dan waktu ekstraksi 105 menit. Dengan kondisi tersebut, ekstrak dari ekstraksi resveratrol sebanyak 0,0225% dari daun kering.

Selanjutnya adalah dilakukan pruifikasi, yaitu dengan kromatografi yang menggunakan silica adalah metode pemisahan secara konvensional untuk senyawa resveratrol dan polidatin. Dari gambar 3 dapat kita lihat bahwa pemisahan resveratrol sangat baik, dan memberikan sensitivitas yang tinggi dibandingkan dengan fulvio. Meskipun menerapkan kromatografi silica gel, purifikasi polifenol merupakan pilihan yang terbaik, akan tetapi sejauh tidak terlihat pada pemisahan eksrtak murberi. Pada gambar 3 memberikan contoh yang baik, kita mendapatkan kemurnian resveratrol yang tinggi dengan menggunakan silica gel kromatografi. Melalui analisis 60 sampel dengan HPLC , sampel 1-33 tidak menunjukan adanya resveratrol. Namun setelah sampel 33 resveratrol kemudian dapat ditemukan. Tidak adanya resveratrol pada 15 sampel terakhir mengindikasikan bahwa resveratrol telah tercuci. Representatif resveratrol dari sampel dapat ditunjukan dengan hasil kromatogram HPLC pada gambar 4 dan gambar 5. Kadar resveratrol dihitung melalui kalibrasi standar. Hasil menunjukan bahwa 41,5 mg senyawa resveratrol terdapat dalam 200 g daun Morus alba.L dan ini terjadi peningkatan dari 0,8 99,03 %. Dibandingkan dengan jurnal yang telah diterbitkan, Gu melaporkan bahwa absorpsi pada kromatografi dengan superose 12, cross-linked agrosa gel 12% berhasil untuk penggunaan purifikasi polifenol resveratrol dan glikosida (polidatin) dapat secara langsung didapatkan hanya dengan 1 langkah dari ekstrak herbal akar P.cuspidatum. Dalam penelitian Delaunays, kemurnian tinggi resveratrol diperoleh dengan menggunakan kromatografi centrifugal partisi (CPC) dengan sistem pelarut tersier 2 fase dan high speed countercurrent chromatography (HSCCC) telah digunakan untuk pemisahan dan purifikasi resveratrol dan polidatin. Penggunaan alat High performance thin layer chromatography (HPTLC) telah diterapkan untuk analisis kuantitatif emodin, resveratrol, dan polidatin dalam ekstrak rhizome P.cuspidatum. Kerugian dalam penggunaan CPC, HSCCC dan HPTLC, adalah lebih sulit untuk melakukan proses pengskalaan jika dibandingkan dengan kolom kromagrafi cair.

III. KesimpulanEkstraksi yang paling baik pada konsentrasi rasio padat dengan cair 1:13, pada suhu 60C, waktu ekstraksi 105 menit, dan konsentrasi etanol 80%. Yield yang di dapat adalah 0,0225%. Untuk tes purifikasi digunakan campuran kloroform dan methanol dengan rasio 10 : 1 sebagai solven pengelusi. Fase gerak yang digunakan untuk mendeterminasi resveratrol adalah campuran methanol dan air 6,4 : 3,6 (v/v). Resveratrol yang dimurnikan dengan kromatografi kolom silika gel dapat ditingkatkan dari 0,8 99,3 %.

DAFTAR PUSTAKA

Rohman, A., 2012, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal. 329-331.Sastrohamidjojo, 2007, Kromatografi, Liberty, Yogyakarta, hal. 28-29.