makrofágů v tukové tkáni · 2014. 7. 24. · 1 . identifikace subpopulací makrofágů v...

1

Identifikace subpopulací makrofágů v tukové tkáni

Centrum pro kardiovaskulární výzkum Laboratoř imunologické diagnostiky

IKEM Praha

ve spolupráci s firmou Beckman Coulter, Praha

Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

Dyslipoproteinémie FFA uvolňování (postprandiálně– VLDL1 – small dense LDL) Leptin, adiponektin Interleukin 6, MCP-1, TNFα, VCAM, ICAM Zvýšená infiltrace imunitních buněk, zejména makrofágů a změna jejich fenotypu „metabolic inflammation“

Akumulace tukové tkáně

2 Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

Imunologické komplikace obezity

dané chronickým zánětem tukové tkáni ale i lipogenezí v primárních i sekundárních lymfatických orgánech – thymus, kostní dřeň či lymfatické uzliny

Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha 3

Podkožní tuková tkáň - břicho, trup, končetiny

Nitrobřišní tuková tkáň - viscerální (mesenterická and omentalní) - retroperitoneální (perirenální a perigonadální)

Další lokalizace - Perivaskulární / epikardiální -intramuskulární, intermuskulární - ………

Anatomické rozložení tukové tkáně

4 Konference DNA analýza XI, 10.6.

2014 Praha

Pulmonary disease abnormal function obstructive sleep apnea hypoventilation syndrome

Nonalcoholic fatty liver disease steatosis steatohepatitis cirrhosis

Coronary heart disease Diabetes Dyslipidemia Hypertension

Gynecologic abnormalities abnormal menses infertility polycystic ovarian syndrome

Osteoarthritis

Skin

Gall bladder disease

Cancer breast, uterus, cervix colon, esophagus, pancreas kidney, prostate

Phlebitis venous stasis

Gout

Komplikace obezity

Idiopathic intracranial hypertension

Stroke Cataracts

Severe pancreatitis

5

Příklady látek, uvolňovaných tukovou tkání


Příklady receptorů, exprimovaných v tukové tkáni


7

Makrofágy

Adipocyty

Preadipocyty Endotheliální buňky

Monocyty Lymfocyty

Typy buněk v bílé tukové tkáni - adipocyty 30-60% - preadipocyty, fibroblasty a kmenové buňky - matrix kolagenových vláken - cévy (myocyty/endotheliální buňky) - imunitní buňky (monocyty/makrofágy, lymfocyty) - a další …..


Adipocytokiny – zdroj

Adipocyty IL1β, IL-8, IL-10, TNF-α,

resistin, VEGR ….

SVF

MCP-1, macrophage migration inhibitory factor, IL-6, leptin, adiponektin,…


Molecular mechanism underlying adipose tissue inflammation.

Suganami T , Ogawa Y J Leukoc Biol 2010;88:33-39

©2010 by Society for Leukocyte Biology 10 Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014 Praha

DAMP signály při excesivní obezitě

J. Clin. Invest. 2006;116:33-35 J. Intern. Med. 2007;262:422-430 11



…. je ale makrofág v tukové tkáni skutečně statickou buňkou…?

Netrin -1 - protein, který byl dosud sledován zejména vzhledem k jeho roli ve vývoji nervového systému a při regulaci růstu nádorů. * zřejmě reguluje migraci buněk v širším kontextu 2014 -Netrin-1 promotes adipose tissue macrophage retention and insulin resistance in obesity. Ramkhelawon B et al., Nat Med. 2014 Apr;20(4):377-84 * Exprimován pouze v tukové tkáni obézních myší * Exprese v makrofázích je aktivována saturovanými mastnými kyselinami (palmitát) a přes receptor Unc5B blokuje migraci makrofágů, tj. efflux z tkání.

Experiment

Detekce rozdílů v zastoupení jednotlivých subtypů makrofágů v subkutánní, perirenální a perivaskulární (podél a. renalis) tukové tkáni u pacientů s pokročilou aterosklerózou vs. zdravým jedincům

Zjištění korelace mezi rizikovými faktory aterosklerózy a zastoupením jednotlivých subpopulací makrofágů

13 Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014

Praha

Subjekty

pacienti indikovaní k rekonstrukční operaci tepen pánve a dolních končetin – tj. pacienti s pokročilou aterosklerózou

Kde ale vzít vzorky nitrobřišní tukové tkáně od zdravých jedinců? kontrolní soubor zdravých jedinců – program transplantace ledvin od živých dárců


Dárci ledvin

• jsou ochotni účastnit se studie • jsou velmi dobře vyšetřeni • budou sledováni po celý život (sběr dat i po delší době)


Metody 1. Analýza subpopulací pomocí

průtokové cytometrie 2. Určení genové exprese

cytokinů a adipokinů 3. Zjištění zastoupení jednotlivých

typů mastných kyselin v tukové tkáni – tj. dieta

4. Odběry séra – zaměření na rozvoj inzulinové rezistence,

cytokiny v séru 16

ADIPOSE TISSUE

Flow cytometry

WHITE ADIPOSE TISSUE

COLLAGENASE DIGESTION

FILTER 250 μm MESH

CENTRIFUGE FILTRATE

ADIPOCYTES

STROMAL VASCULAR CELLS (MONOCYTES/MACROPHAGES/PREADIPOCYTES, ENDOTHELIAL CELLS)

ADIPOSE – TISSUE MATRIX. FIBERS


FILTER 50 μm MESH

FILTER 50 μm MESH

Postup - pokračování

Ochlazení vzorku, filtrace (150 µm) Opakované promytí, cetrifugace 1200m rpm Označení monoklonálními protilátkami s navázanými fluorochromy (CD 14 (PC7)

(Beckman Coulter), CD16 (ECD) (Beckman Coulter), CD 36 (FITC) (Beckman Coulter),

a CD 163 (PE) (Biolegenda) a kalprotectin (PC7)(Acris antibodies)), následně analyzována metodou průtokové cytometrie.

Izotypové kontroly - IgG1 FITC, PE, ECD


CD 16 Výskyt-2 formy první je exprimovaná na NK buňkách, monocytech,

makrofách a některých T lymfocytech. Jedná se o transmembránovou formu. Molekulová hmotnost-

50-65kDa (FcγRIII-A) druhá je exprimovaná na neutrofilech a je

glykosilphosphatidylinositolem kotvená forma. Molekulová hmotnost-48kDa (FcγRIII-B). Spoluzodpovídá za jejich aktivaci a expresi adhesivních molekul.

Znak aktivních, proinflamačních monocytů/makrofágů


CD 36

Scavenger receptor Funkce - fagocytoza apoptotických neutrofilů a

modifikovaných nízko densitních lipoproteinů Norma 90-100% Molekulová hmotnost -78-88 kDa Výskyt na buňkách - monocyty, makrofágy,

krevní destičky, endoteliální buňky


CD 163 scavenger receptor pro hemoglobin-haptoglobinový komplex

Funkce - monocyty/makrofágy protizánětlivého

charakteru - odstraňování hemoglobin-haptoglobinového komplexu

Výskyt na buňkách-makrofágy, Kupferovy buňky jater, monocyty, část dendritických buněk, část progenitorových buněk

Exprese na povrchu buněk je indukovaná glukokortikoidy (nezávisle na IL10) a IL10 asociované s ateroprotektivní aktivitou, klíčová role v pooperačním hojení

Vazba hemoglobin-haptoglobinového komplexu na CD163 vede k zvýšené syntéze IL10

Exprese znaku CD163 roste při diferenciaci monocytu na makrofág

21


Kalprotektin (calprotectin) MRP8/14 protein, calgranulin,

L1 protein, 27E10 antigen cytosolový protein, který se uvolňuje z leukocytů po

jejich aktivaci nebo lýze.Jedná se o kalcium a zinek vazebný protein s antimikrobiální aktivitou o molekulové hmotnosti 36,5 kDa. Skládá se ze dvou těžkých řetězců a jednoho lehkého řetězce. Tvoří jej především monocyty a neutrofily

membránová forma kalprotektinu je pouze na nezralých makrofázích a je ukazatelem influxu do místa zánětu.


Životnost buněk – renální tuková tkáň

První výsledky….


CD14+ CD14+CD16+

CD14+CD16+CD36+++CD163-

*

***

Korelace s BMI

25

Prezentované výsledky a postupy jsou výsledkem pracovní skupiny pod vedením

Rudolfa Poledneho

Pavel Kružík


Anna Králová Alena Sekerková

Jiří Froněk Jana Ždychová

Ilja Stříž

Děkuji Evě Fáberové a Adéle Sajdlové za velmi významnou pomoc s realizací

experimentu.

Na druhou stranu…….

…….fat, fit and healthy fenomen …….

Obézní jedinci, kteří ale vykazují normální,

metabolické parametry – lipoproteinové parametry, glykémie, IR

Nemají zvýšený krevní tlak Jsou v dobré fyzické kondici

Konference DNA analýza XI, 10.6. 2014

Praha 27

…možné vysvětlení….


30

Děkuji za pozornost a přeji Vám dobrou chuť!

[email protected]


Izotypové kontroly

makrofágů v tukové tkáni · 2014. 7. 24. · 1 . identifikace subpopulací makrofágů v...

Documents