César Sánchez*, Aaroa Pérez, Alfredo F. Braña, Carmen Méndez y José A. Salas

Departamento de Biología Funcionale Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias (IUOPA)

Universidad de Oviedo

Manipulación genética de microorganismos para la obtención

de nuevos fármacos de tipo indolocarbazol

Universidad de Oviedo

Un microorganismo produce un compuestocon actividad biológica reconocida

Identificación de los genes responsables de su biosíntesis

Manipulaciones genéticas

Obtención de nuevos productos derivados

Ensayos de actividad biológica

Generación de nuevos compuestos bioactivos mediante manipulación genética de microorganismos

O

NH

N NH

O O

Cl ClOH

OHOMe

OH

NH

N N

O

OH

NHCH3

MeO

O

O

OH OH

O

O

OH

O

OHCH3

NC

COOH

O

OHCH3CH3CH3

MITRAMICINA(inhibidor de replicación y transcripción de ADN)

Streptomyces argillaceus OVIEDOMICINA(inductor de apoptosis)

Streptomyces antibioticus

BORRELIDINA(inhibidor de angiogénesis)

Streptomyces parvulus

REBECAMICINA(inhibidor de ADN topoisomerasa I)

Lechevalieria aerocolonigenes

ESTAUROSPORINA(inhibidor de quinasas)

Streptomyces longisporoflavus

CROMOMICINA(inhibidor de replicación y transcripción de ADN)

Streptomyces griseus

OH OOH

H3CO

O

CH3

OHO

OH

HCH3

OOO

OOOHOH

CH3

CH3CH3CH3

OH

HO

OOO

CH3OH

O

CH3

OHOH

OH OH OH3C

O CH3

O

HOCH3 OH

OHO

OH3C

HOO

OH3C

HOO

OCH3

HOH3CCOO

H3C

OCH3

OOCCH3

O

OCH3

OCH3

HO

Compuestos antitumorales en estudio

Indolocarbazoles: nuevos agentes antitumorales

NH

N NO

CH3 H

NHCH3

H3CO

O

ESTAUROSPORINA

O OH

OH

OCH3

OH

NH

NH

N

OO

Cl Cl

REBECAMICINADerivados en ensayos clínicos:

NSC655649 (“rebeccamycin analog”),NB-506, J-107088

Derivados en ensayos clínicos:PKC412, CEP-751,

UCN-01 (7-hidroxi-estaurosporina)

Aislamiento de genes biosintéticos de rebecamicina

Genoteca del ADN cromosómico de Lechevalieria aerocolonigenes ATCC 39243(cósmido pKC505: bifuncional E. coli - Streptomyces)

Hibridación en colonia (sonda: fragmento interno del gen ngt)

Cósmidos positivos

Transformación de protoplastos de Streptomyces albus

¿ Producción de rebecamicina ?

min6.0 12.0

1400 *

Streptomyces albus / cósmido 14E8

Extracción y purificación

Caracterización estructural

O OH

OH

OCH3

OH

NH

NH

N

OO

Cl Cl

Rebecamicina

Streptomyces albus conteniendo cósmidos “reb”

Los genes biosintéticos de rebecamicina

1 kb

G O D C P M R F U H T

Formación de indolocarbazol

Glicosilación

Halogenación

Metilación del azúcar

Secreción

Regulación

NH

HOOCNH2

ClNH

HOOCNH2

NH

HN

NH

OO

Cl Cl

RebHRebORebD

RebCRebP

L-triptófano

x 2

aglicón

Biosíntesis de rebecamicina: ruta propuesta (I-III)

I. Modificación del triptófano II. DimerizaciónIII. Cierre del sistema de anillos

RebHRebORebD

RebCRebP

Biosíntesis de rebecamicina: ruta propuesta (IV-V)

NH

HN

NH

OO

Cl ClO

OH

OHOH

HO

N

HN

NH

OO

Cl Cl

OOH

OH

O

HO

N

HN

NH

OO

Cl Cl

CH3

RebG RebM

aglicón

rebecamicina

IV. Glicosilación V. Modificación del azúcar

RebG RebM

pREB6

pREB7

Expresión heteróloga de genes biosintéticos de rebecamicina

O D C P Mp

G O D C P M R F U

1 kb

G O D C P M R F U H T

pREB6

Análisis HPLC

min10.0 20.0

6001mAU

NH

NH

(Compuesto esperado: aglicón de descloro-rebecamicina)

NH

OO

Aglicón de descloro-rebecamicina

Streptomyces albus / pREB6

O D C P Mp

(Compuesto esperado: descloro-rebecamicina)

pREB7

Análisis HPLC

150

min10.0 20.0

3

2mAU

O OH

OH

O

OH

NH

NH

N

OO

R

2 (R=CH3)Descloro-rebecamicina

3 (R=H)4’-Desmetil-descloro-

rebecamicina

Streptomyces albus / pREB7

G O D C P M R F U

Biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles (I)

O

H2NCH3

O

O

O

NHNH

Cl

O

CH3

OHH3C

O

O

CH3

OCH3

OH

CH3

HN OH

OO

CH3H3C

COOH

NH

HOHN

NHO

O

NH

S

Cl

NH2

O

NH

N

HN OO

O

OCH3

OH

OH

HO

Cl Cl

rebecamicina(Lechevalieria aerocolonigenes)

tienodolina(Streptomyces albogriseolus)

pirroindomicina β(Streptomyces rugosporus)

estaurosporina(Streptomyces longisporoflavus)

violaceína(Chromobacterium violaceum)

R1= CO, CHOH, CH2R2 , R3= H, Cl, BrR4 , R5= H, Cl, BrR6 , R7= H, Cl, Br, OH

N N

HN O

OHH3C

H3CONHCH3

NH

NH

HN

R1O

R2 R3

R5

R7

R4

R6

Biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles (II)

L. aerocolonigenes rebecamicina

genes biosintéticosG O D C P M R F U H T

estaurosporinaS. longisporoflavus

S. albogriseolus tienodolina

C. violaceum violaceína

S. rugosporus pirroindomicina

S. albus

O D C P

estructura básica

staC

thal

vioC

banco de genesmodificadores

G

H

M

vioD

pyrH

Extracción y purificación (HPLC)

Caracterización estructural(MS, NMR)

Ensayos de actividad antitumoralstaC

thal

vioC

banco de genesmodificadores

G

H

M

vioD

pyrH

combinaciones de genes modificadores (en plásmidos)

staC pyrH

staCH G

staC vioD G M

vioC vioD G

staC

thal

Biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles (III)

S. albus

O D C P

estructura básica

RebCRebP

III. Cierre delsistema de anillos

RebCRebP

PyrH

RebH

I. Modificaciónde Trp

RebORebD

II. Dimerización

RebG

IV. Glicosilación

RebM

V. Modificacióndel azúcar

RebCRebP

StaC

RebP

StaC

RebP

StaC

RebP

Trabajo en curso y planes inmediatos

Agotar las posibilidades de la biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles:

Modificaciones del sistema de anillos (aglicón)

Modificaciones del azúcar

Y combinar ambos tipos de modificaciones