manipulation of oil synthesis in nannochloropsis
DESCRIPTION
PRESENTASITRANSCRIPT
Manipulation of oil synthesis in Nannochloropsis strain NIES-2145 with a
phosphorus starvation–inducible promoter from Chlamydomonas
reinhardtiiMasako Iwai, KoichiHori, Yuko Sasaki - Sekimoto, Mie Shimojima and
Hiroyuki Ohta
Prima Fitria Hillman1420412010
Latar Belakang
Teknologi Biofuel Dari Mikroalga
Triasilgliserol(TAG)
Nutrien Stress
P Starvation
N Starvation
gen CrDGTT4
gen CrDGAT
Nannochloropsis
Ditentukan:1. Jumlah Total Lipid2. Jumlah neutral lipid3. Jenis Asam Lemak
Metodologi
Kondisi Kultur
Nannochloropsis sp
Medium f/2atau F2N
P starvation(tanpa pospat)
N stravation(Tanpa NaNO3
dan NH4Cl)
Standar
Analisis Diferensial Tingkat Ekspresi Gen
Tingkat ekspresi gen CrDGATdan gen SQD2
Tingkat ekspresi gen CrDGTT4
Nannochloropsis strain NIES-2145
Dikultur dalam medium standar,-N dan -P
Dikultur dalam medium standar,dan -P
quatitative real time PCR(q-PCR)
Konstruksi dan IdentifikasiCrDGTT4-overexpressing NIES-2145 Cell Lines
Dipotong dengan enzim restriksiEcoRV dan SpeI dengan
DNA Blunting Kit
Gen CrDGTT4 (pCrSQD2aDGTT4) yang mengandung
C.reinhardtiiSQD2 promoter region and mengkoding sequence dari
gen DGTT4
pMD-NT7 Dipotong dengan enzim restriksiEcoRV
Diklon ke dalam Dikembangkan dalam medium selektif
Level Overekspresi ditentukan dengan
qPCR
Ektraksi dan Pemisahan Lipid
Sel Nannochloropsis Dipanen denganSentrifugasi
Total Lipid diekstrak Dalam chloroform/methanol
Lipid dipisahkan Dengan two-dimensional thin-layer chromatography (TLC)
Lipid Divisualisasidi bawah sinar UV
Persiapan Fatty Acis Methyl Ester
Lipid Diinkubasi selama 1 jam pada suhu 85oCdalam 5%(v/v)hydrogenchloride–methanol
FAME Diekstrak dengan hexan dan ditentukandengan GC
Kuantitatif : GC Kualitatif : GC-MS
SQD2 cDNA
RNADiekstrak dari medium standar
dan -P dengan metodaphenol/chloroform
Total RNA (500ng)
Digunakan untuk sintesis cDNAdengan oligo(dT)18 sebagai primer
dengan reverse transcriptase
Gen sekuens diklon kedalam vektor PMD20 untuk DNA sekuensing
Analisis Filogenetik
Asam Amino disekuens dengan MAFFTv7.220
Analisis Filogenetikdengan MEGA6
Analisis Motif
New PLACE (https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid=&lang=en&pj=640&action=page&page=newplace), database of
cis-acting regulatory DNA elements from plants
menemukan binding motifs dari transcription factors
Hasil Pertumbuhan Sel
TAG Akumulasi
TAG Akumulasi Pada -P
Peningkatan Aktivitas PromotorHomolog SQDG dan SQD2 selama P starvation
Analisis Filogenetik
Ekspresi Gen SQD2 dengan q-PCR
Ekspresi Gen CrDGTT4 dengan q-PCR
Perubahan TAG Akumulasi Setelah Overexpresi
Analisis Komposisi Asam Lemak dari Total Lipid
Analisis Komposisi Asam Lemak dari Fraksi TAG
Analisis Kuantitatif Lipid
Analisis Kuantitatif Asam Lemak Pada Membran Lipid
Analisis Kuantitatif Asam Lemak 18:1 Pada Membran Lipid
Analisis Kuantitatif Asam Lemak 20:3 Pada Membran Lipid
Kesimpulan
Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa promotor SQD2 dari alga
hijau C. reinhardtii berguna sebagai promotor heterolog pada
Nannochloropsis strain NIES-2145. Hasil penelitian ini menunjukkan
bahwa ada sistem kontrol ekspresi umum dalam berbagai spesies
alga, termasuk mikroalga primer dan sekunder untuk adaptasi P
rendah. Hasil ini, bersama dengan terjadinya sintesis gen SQDG
diseluruh spesies alga. Ini juga menunjukkan bahwa promotor
SQD2 dari C. reinhardtii dapat diterapkan pada berbagai ganggang
sebagai upaya meningkatkan jumlah lipid sehingga lebih efisien
untuk produksi biodiesel dari mikroalga .
Daftar Pustaka
Masako Iwai, Koichi Hori, Yuko Sasaki -Sekimoto, Mie Shimojima and Hiroyuki Ohta. Manipulation of oil synthesis in Nannochloropsis strain NIES-2145 with a phosphorus starvation– inducible promoter from Chlamydomonas reinhardtii. 2015. Frontier In Microbiology Vol6(912):1-14