Mantenimenti e adesione cellulare a

diversi substrati SperimEstate 2014

Marta Malavolta Elisa Mannini

Greta Novelli ISIT BASSI BURGATTI

Obiettivo

L’obiettivo della nostra ricerca sui mantenimenti era quello di studiare quali fossero i substrati più adatti alla crescita di fibroblasti (NIH3T3). I substrati migliori erano quelli dove le cellule aderivano meglio e in maggior numero.

Indice 1. Fibroblasti

2. Mantenimento cellulare

- Split e conta

- Fissazione

3. Substrati

- Polidimetilsilossano

(PDMS)

- Chitina

4. Semina su substrati

5. Osservazione dei risultati

- Microscopio ottico

- Microscopio a

fluorescenza

- Microscopio a scansione

elettronica (SEM)

Fibroblasti• I fibroblasti sono cellule presenti nei tessuti connettivi e hanno la

funzione di sintetizzare i componenti della matrice extracellulare. • I fibroblasti sono cellule adese, fusiformi con prolungamenti

citoplasmatici che arrivano fino a 30mm; il loro ciclo cellulare è di 12ore.• I fibroblasti da noi utilizzati sono di origine animale (NIH-3T3 mouse

embryonic fibroblasts) e sono stati geneticamente modificati tramite l’inserimento del gene che codifica per la proteina GFP (GreenFluorescentProtein) in modo da poter essere osservati al microscopio a fluorescenza.

Fibroblasto in divisione

Fibroblasti• I fibroblasti sono cellule presenti nei tessuti connettivi e hanno la

funzione di sintetizzare i componenti della matrice extracellulare. • I fibroblasti sono cellule adese, fusiformi con prolungamenti

citoplasmatici che arrivano fino a 30mm; il loro ciclo cellulare è di 12ore.• I fibroblasti da noi utilizzati sono di origine animale (NIH-3T3 mouse

embryonic fibroblasts) e sono stati geneticamente modificati tramite l’inserimento del gene che codifica per la proteina GFP (GreenFluorescentProtein) in modo da poter essere osservati al microscopio a fluorescenza.

Fibroblasto in divisione

Mantenimento cellulare • Il mantenimento di cellule in vitro

serve per studiare fenomeni biologici come la crescita e l’adesione delle cellule su un determinato substrato.

• Le cellule crescono all’interno di fiasche contenenti il mezzo cellulare specifico per il tipo di cellula.

• Le cellule che abbiamo coltivato sono cresciute in incubatore a 37°C con una concentrazione del 5 % di CO2.

• Durante la coltura cellulare sono necessarie alcune procedure atte a mantenere condizioni ottimali alla crescita cellulare, come il cambio medium e lo split.

• Per quanto riguarda l’osservazione delle cellule al microscopio fluorescente o al SEM, è prima necessaria una fissazione.

• Quando le cellule arrivano a confluenza (ovvero quando il numero di cellule diventa elevato e si perdono le condizioni ideali per la coltura cellulare) occorre eseguire lo split.

• Essendo cellule adese, è necessario rompere i contatti focali che hanno col substrato, tramite l’enzima tripsina, in modo da poter risospendere le cellule e trasferirle nella camera di conta.

• Per stimare il numero di cellule presenti nel campione si esegue la conta con la camera di Burker.

Split e conta

Camera di Burker al microscopio ottico

Fissazione • La fissazione ha la

funzione di mantenere inalterata la morfologia dei campioni biologici al fine di osservarli ed impedire l’avanzamento dei processi putrefattivi.

• A seconda del tipo di campione e delle tecniche che si intendono utilizzare, si può ricorrere a differenti modalità di fissazione con mezzi chimici (paraformaldeide, glutaraldeide, etc.) o fisici.

Substrati • I substrati sono materiali che vengono utilizzati

per l’adesione cellulare. • Ogni substrato presenta caratteristiche differenti

che possono permettere o meno l’adesione cellulare. Quelli da noi studiati sono stati: il PDMS e la chitina.

PDMS Chitina

PDMS

• Il PDMS è un polimero composto da silicone e un agente curante.

• È biocompatibile e perfettamente trasparente ma non è biodegradabile.

• È facilmente lavorabile grazie alla sua flessibilità.

• È utilizzato per la costruzione di chip microfluidici, come additivo alimentare e dall’industria cosmetica.

Chitina

• La chitina è il secondo polisaccaride più diffuso dopo la cellulosa. È il costituente fondamentale di crostacei, artropodi, molluschi e funghi.

• È biodegradabile e biocompatibile e per questo è molto studiata per la medicina rigenerativa e trova impiego anche nel settore cosmetico.

Semina su substrati

• Abbiamo seminato i fibroblasti in una multiwell da 24 pozzetti, all’interno della quale abbiamo inserito i diversi substrati da analizzare: PDMS, chitina e vetro (controllo).

• La funzione del controllo è quella di verificare di aver seminato correttamente le cellule, a prescindere dai risultati ottenuti con i diversi materiali.

Osservazione dei risultati Gli strumenti che abbiamo utilizzato per l’osservazione dei

campioni sono 3 microscopi di diverso tipo:

Microscopio ottico Sfrutta la radiazione luminosa nella lunghezza d’onda della luce visibile.

Microscopio ottico a fluorescenza Utilizzato per osservare campioni organici o inorganici, sfruttando i fenomeni della fluorescenza o della fosforescenza indotti nel campione.

Microscopio a scansione elettronica (SEM) Sfrutta un fascio di elettroni che colpisce il campione e viene catturato da un rilevatore, fornendo un immagine digitale.

OSSERVAZIONE RISULTATI AL MICROSCOPIO OTTICO

Controllo al microscopio ottico

Osservazione cellule del controllo su coverslip.

Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura.La chitina è stata ricoperta con un gel proteico a base di fibrina per aumentare l’adesione e la proliferazione cellulare.

CHITINA e FIBRINA al microscopio ottico

OSSERVAZIONE RISULTATI AL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

Controllo al microscopio a fluorescenza

La presenza delle cellule esclude eventuali errori sistematici

PDMS al microscopio a fluorescenza

Le cellule sono poche e non hanno aderito bene data la loro sfericità (indice di mancata adesione).

Pozzetto del PDMS al microscopio a fluorescenza

Come ulteriore verifica della corretta semina delle cellule (oltre al vetrino di controllo) abbiamo osservato anche al microscopio il pozzetto della multiwell nel quale avevamo posto il PDMS per seminare le cellule. È chiaramente visibile il segno dell’angolo di PDMS. Nel pozzetto le cellule hanno dunque aderito senza problemi.

CHITINA al microscopio a fluorescenza

Cellule sulla chitina non trattata per idrolisi alcalina.Le cellule sono poche e non hanno aderito bene data la loro sfericità (indice di mancata adesione).

Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura.Il numero di cellule adese è maggiore ma ancora non siamo nelle condizioni ottimali per la crescita cellulare.

CHITINA con FIBRINA al microscopio a fluorescenza

Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura.La chitina è stata ricoperta con un gel proteico a base di fibrina per aumentare l’adesione e la proliferazione cellulare.La colorazione è data dall’uso di un saggio di immunofluorescenza che permette di evidenziare le strutture citoplasmatiche, il nucleo e i contatti focali.

OSSERVAZIONE RISULTATI AL SEM

CHITINA al SEM

Chitina trattata per idrolisi alcalina a diversi ingrandimenti SEM.

Chitina tratta per idrolisi alcalina ricoperta con un gel proteico a base di fibrina.

NIH-3T3 su CHITINA al SEM

330 mm 100 mm

15 mm 3 mm

Conclusioni

• Osservando (dopo 24 ore dalla semina) l’effettiva presenza di cellule nel controllo abbiamo potuto escludere eventuali errori sistematici.

RISULTATI:- Le cellule non hanno aderito al PDMS- Sulla chitina non trattata rispetto a quella

trattata, si è notato che l’adesione cellulare è sfavorita.

- Per rendere la chitina favorevole per la crescita dei fibroblasti abbiamo ricoperto il substrato con un gel proteico a base di fibrina.

BIBLIOGRAFIA

JESSAMINE M. K. NG et al. "Components for integrated poly(dimethylilosane) microfluidic system ". Electrophoresis (2002) 23:3461-3473

MORGANTI P. "Uso biomedico delle nanofibrine di chitina". Ricerca e industria clinica (2009) 4.

http://www.lastampa.it/2013/02/18/scienza/benessere/medicina/ustioni-e-cicatrici-dai-crostacei-una-soluzione-efficace-per-la-cura-9UEZNtYrgx6nrPwOjNTOoK/pagina.html

http://www.elveflow.com/microfluidic-reviews-and-tutorials/the-poly-di-methyl-siloxane-pdms-and-microfluidic

http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=fibroblast