manual de laboratorio de bioquímica clínica
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PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA CLÍNICA
NORMAS QUE EL ALUMNO DEBERÁ CUMPLIR EN EL
AMBIENTE DEL LABORATORIO
1. Uso de la bata, el descuido por olvido de la misma tendrá como consecuencia el retiro
de la práctica.
2. La práctica comenzará a la hora fijada según horario. El retraso por más de diez (10)
minutos impedirá su entrada a la misma.
3. El alumno deberá traer estudiada la guía correspondiente, debido a que el profesor
realizará un examen corto, calificado acumulativo, el cual tendrá una ponderación del
65% de la nota práctica.
4. El estudiante entregará, en el lapso previsto por el docente, un informe sobre el trabajo
realizado durante la actividad práctica, el cual constará de introducción, metodología,
resultados, discusión y bibliografía. Este informe tendrá una ponderación del 25% de la
nota práctica.
5. El estudiante mantendrá un comportamiento cortés para con sus compañeros,
responsabilidad para con la muestra a analizar y mística de trabajo durante su actividad
práctica. Esta conducta, destreza y aptitud ante la actividad tendrá una ponderación del
10% de la nota práctica denominándose nota apreciativa.
6. El estudiante estará en la obligación de entregar, al finalizar la práctica, los resultados
obtenidos.
7. Al terminar de trabajar deberá apagar los equipos, lavar y secar el material de vidrio
utilizado y dejar el laboratorio en completo orden.
8. No se permitirá comer, beber ni fumar en el ambiente del laboratorio.
9. El material que se rompa, durante el ejercicio práctico, el alumno deberá reponerlo en
un periodo no mayor a 45 días.
2
10. La inasistencia a tres (3) actividades prácticas conducen a la pérdida de la asignatura.
11. El alumno que pierda una (1) actividad práctica, durante todo el semestre, tendrá
derecho a recuperarla al finalizar el contenido programático práctico de la asignatura.
El siguiente manual práctico recoge los protocolos de las actividades prácticas
desarrolladas, durante el periodo académico II-99, en la asignatura Bioquímica Clínica.-
Estas prácticas se han venido desarrollando desde que se abrió el séptimo semestre de la
carrera Licenciatura en Bioanálisis. Sin embargo, a partir del II semestre de 1998 surgió la
necesidad de actualizar los protocolos de trabajo, adaptar las actividades prácticas a la
realidad de los centros asistenciales y ampliar el contenido programático práctico con el
objetivo de mejorar el proceso enseñanza-aprendizaje de los estudiantes del curso. Fue en
el II semestre de 1999 en el cual este trabajo fue culminado.
Los nuevos métodos y técnicas que actualmente están en el mercado son los
descritos en este manual, lo cual les brinda a nuestros estudiantes, facilidad para la
manipulación de las mismas y por ende dar un diagnóstico rápido y preciso sobre la
patología que pueda estar presentando el paciente en estudio.
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PRÁCTICA Nº 1. CURVA DE CALIBRACIÓN.
1. Objetivo Terminal: al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de construir
de una curva de calibración para la obtención del factor de calibración y con ello la
concentración de la muestra problema.
2. Objetivos Específicos:
2.1.-Conocer la definición y las diferencias entre solución blanco, patrón o estándar y
control.
2.2.- Conocer como se prepara una solución madre y a partir de ella las soluciones
patrones usando regla de tres o ecuaciones matemáticas.
2.3.- Definir curva de calibración.
2.4.- Conocer los pasos a seguir para la construcción de una curva de calibración.
2.5.- Armar la curva da calibración y a partir de ella calcular el factor de calibración
2.6.- Explicar la importancia del factor de calibración.
4
INTRODUCCIÓN
La calibración consiste en someter las diluciones de concentraciones conocidas al
mismo procedimiento al cual fue sometida la muestra problema. Es la relación entre la
concentración y la tramitancia o absorbancia, para un procedimiento analítico
determinado.La calibración se puede realizar a través de la preparación de patrones
obteniendo las respectivas lecturas, mediante la realización de una curva de calibración, o
bien, hallando el factor de calibración. Para ello se requieren de patrones y blanco. El
patrón o solución patrón de trabajo: es una solución química de concentración conocida.
Puede ser elaborado en el laboratorio o adquirirse en casas comerciales especializadas, en
las cuales se conocen como calibrador. Actualmente las casas comerciales ofrecen en el
mercado los multicalibradores, los cuales son patrones que reportan concentraciones
conocidas de un gran número de analitos diferentes. El blanco, es una muestra de
concentración cero, a la cual se le aplica el mismo tratamiento dado a la muestra patrón.
Está formada por el solvente y los reactivos usados en la determinación analítica. Esta
muestra se utiliza con la finalidad de ajustar a cero la densidad óptica, es decir se sustrae
toda absorbancia producida por el solvente, compuestos secundarios y los reactivos.
La curva de calibración, es la relación representada gráficamente entre la absorbancia
y la concentración de la solución patrón de trabajo colocando las absorbancias en el eje de
las ordenadas (Y) y las concentraciones en el eje de las abscisas (X). Si las lecturas se
obtienen en tramitancia, la curva se debe construir en papel semilogarítmico partiendo del
100% T. Si las lecturas se obtienen en absorbancia, la curva se construye en papel
milimetrado partiendo de cero (0).
En ambos casos el resultado será una línea recta indicando la conformidad con la ley de
Beer, en otras palabras respeta la proporcionalidad.
5
Absorbancia
Concentraci
Las curvas de calibración se construyen con el fin de poder calcular la
concentración de la muestra problema. Dicho cálculo puede ser realizado de dos (2)
maneras:
- Una vez aplicada la técnica se realiza la lectura de la muestra problema en el
aparato, previo ajuste con el blanco en la longitud de onda requerida. Obtenida la lectura se
busca este valor en la curva y se traza una línea hasta cortar la recta y, de aquí se prolonga
hasta el eje de las abscisas donde se ubican las concentraciones. El punto de corte será el
correspondiente a la concentración de la muestra problema. Esta técnica se conoce como
extrapolación de la lectura
CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DESCONOCIDA POR
EXTRAPOLACIÓN DE LA LECTURA
El otro tipo de cálculo se realiza por:
- Factor de Calibración, el cual se define como la relación entre la
concentración de la solución patrón y su lectura respectiva. Posteriormente la
multiplicación de dicho factor por la absorbancia de la muestra problema nos da la
concentración de ésta.
A continuación se presenta un caso a manera de ejemplo:
Se tienen cuatro (4) patrones, cuyas concentraciones y lecturas son las siguientes:
PATRÓN CONCENTRACIÓN LECTURA
6
Punto
de corte
Concentraciones
Absorbancias
Concentra
ción de la
Lectura de la
muestra
1 1 mg/dl 0,023
2 2 mg/dl 0,046
3 4 mg/dl 0,093
4 6 mg/dl 0,140
Fuente: Arevalo, E; Becerra, G y Araujo, J.F. Análisis Instrumental. 1994.
Lectura de la muestra problema....... 0,120.
Fc1 = 1/ 0,023 = 43,478
Fc2 = 2/0,046 = 43,478
Fc3 = 4/0,093 = 43,011
Fc4 = 6/0,140 = 42,85
Factor promedio = 43,478 + 43,478 + 43,011 + 42,85 = 43,20
4
Concentración problema = 43,20 x 0,120 = 5,18
CONSTRUCCIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA GLUCOSA.
(METODO GLUCOSA OXIDASA)
Antes de preparar la solución patrón de trabajo, es necesario conocer los valores de
referencia del analito y la técnica a utilizar.
- Se preparan patrones cuyas concentraciones varíen por debajo, entre y por
encima del valor normal partiendo de cero.
- Conociendo que la glucosa varía entre 70 – 110 mg/dl, se prepararan
patrones de 200, 150, 100, 75, 50 y 0 mg/dl tomando la concentración de 200 mg/dl como
solución madre (2g en 1l de agua destilada); a partir de ella se prepararán los demás patrones.
TUBO 1 2 3 4 5 6
SOLUCIÓN MADRE
(ml)
2,0 1,5 1,0 0,75 0,5 0
AGUA DESTILADA
(ml)
0
0,5 1,0 1,25 1,5 2
CONCENTRACIÓN
(mg/dl)
200 150 100 75 50 0
7NOTA: Es recomendable iniciar con el tubo de menor
- Una vez preparado los patrones, se aplicará la técnica de la Glucosa
Oxidasa, la cual se Fundamenta en: La B-D-Glucosa es oxidada específicamente por la
Glucosa Oxidasa con producción de peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual oxida al
cromógeno (4-AAp/fenol), para producir un compuesto coloreado, mediante una reacción
catalizada por la peroxidasa.
- Técnica:
1. Tome 20 de cada patrón preparado
2. Añada 2,0 ml del reactivo de trabajo
3. Incube por 30 minutos a temperatura ambiente
4. Lea en un espectronic 20 a una longitud de onda de 510 nm
5. Anote los resultados y grafíquelos en un papel milimetrado.
CONSTRUCCIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA
CREATININA (MÉTODO: Jaffé)
Antes de preparar la solución patrón de trabajo, es necesario conocer los valores de
referencia del analito y la técnica a utilizar.
- Se preparan patrones cuyas concentraciones varíen por debajo, entre y por
encima del valor normal partiendo de cero.
- Conociendo que la creatinina varía entre 0,5 – 1,5 mg/dl, se prepararán
patrones de 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,25 y 0 mg/dl tomando la concentración de 2,0 mg/dl como
solución madre (2mg en 100 ml de agua destilada); a partir de ella se prepararán los demás
patrones.
TUBO 1 2 3 4 5 6SOLUCIÓN MADRE (ml) 2,0 1,5 1,0 0,5 0,25 0
AGUA DESTILADA (ml) 0 0,5 1,0 1,5 1,75 2
CONCENTRACIÓN (mg/dl)
2,0 1,5 1,0 0,5 0,25 0
8
NOTA: Es recomendable iniciar con el tubo de menor
Una vez preparado los patrones, se aplicará la técnica de Jaffé, la cual se
fundamenta en: La creatinina existente en un filtrado libre de proteínas reacciona con el
picrato alcalino (formado por reacción entre el ácido pícrico y el hidróxido de sodio),
formándose un tautómero de color rojo, siendo proporcional la intensidad del color a la
concentración de la muestra.
- Técnica:
1. Preparar el Picrato Alcalino (partes iguales de ácido pícrico e hidróxido de
sodio).
2. Preparar siete (7) tubos de ensayos rotulados como:
Blanc
o
0
mg/dl
0,25
mg/dl
0,5
mg/dl
1,0
mg/dl
1,5
mg/dl
2,0
mg/dl
Agua destilada (
)
100
Patrón ( ) 100 100 100 100 100 100
Picrato Alcalino
(ml)
2 2 2 2 2 2 2
Esperar 15 minutos a 37ªC y leer a 520 nm.
Realizar los cálculos en este espacio
9
PRÁCTICA N. 2. CONTROL DE CALIDAD
1.-Objetivo terminal: al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de
armar e interpretar una curva de control de calidad para establecer los límites de precisión y
exactitud..
2.- Objetivos específicos:
2.1.-Definir control de calidad
2.2.-Definir pool de suero y explicar cómo se colecta y se procesa.
2.3.-Conocer los pasos a seguir para la construcción de una curva de control de
calidad.
2.4.- Calcular, armar y aplicar la curva de control de calidad para analizar la
precisión y exactitud del trabajo.
INTRODUCCIÓN
El control de calidad se podría definir como un método estadístico que permite
determinar la precisión y exactitud del análisis realizado. La precisión se refiere al hecho
de que los repetidos análisis con la misma muestra deberán dar resultados similares, es
decir los resultados deben ser reproducibles. La exactitud nos indica la proximidad de una
concentración al verdadero valor de la concentración de la muestra.
La exactitud es difícil de determinar y se valora mejor por comparación con los
resultados obtenidos con materiales de concentración conocida previamente analizados con
métodos de referencia. La precisión se determina calculando la desviación estándar luego
de un número de análisis repetidos.
El propósito del control de calidad consiste en evaluar de forma real la capacidad
funcional habitual de un laboratorio con respecto a otros laboratorios, con el fin de
identificar problemas significativos a medida que surgen y de documentar su resolución.
10
Se han empleado numerosas técnicas de control estadístico en laboratorios clínicos
en su mayor parte de carácter manual. Sin embargo, los datos no revelan de forma eficaz
los sutiles cambios que puedan producirse en un método analítico. En consecuencia, se han
aceptado los gráficos de control como método eficaz para regular la mayoría de las
técnicas de control. Tales gráficas generalmente representan la observación de control (o
una estadística calculada) en función del tiempo (días). La gráfica de Levey-jennings
(1950) ha sido la técnica más ampliamente utilizada.
Para realizar dicha gráfica es necesario preparar un pool de suero, el cual consiste en
recoger en un envase estéril mantenido a 20°C, todos los sueros normales sobrantes del
laboratorio. Tales sueros no deben estar hemolizados, lipémicos o ictéricos. Al obtenerse un
volumen de suero relativamente elevado (litros) se descongela y con una varilla de vidrio se
desfibrina. Este producto es centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos y el sobrenadante es
guardado a 20°C en alícuotas de 5 a 10 ml contenidas en viales bien tapados y rotulados.
Durante 30 días se realizarán lecturas de dicho pool una vez aplicada la técnica
respectiva. Con los datos recogidos se calculará la media aritmética y la desviación
estándar. Estos datos estadísticos servirán para construir la Curva de Control de Calidad,
la cual será posteriormente utilizada para controlar la precisión del trabajo realizado en el
laboratorio.
CURVA DE CONTROL DE CALIDAD PARA LA GLUCOSA
Fundamento de la Técnica: la B-D-Glucosa es oxidada específicamente por la
glucosa oxidasa con producción de peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual oxida a un
cromógeno, para producir un compuesto coloreado, mediante una reacción catalizada por la
peroxidasa.
Procedimiento:
Prepare doce (12) tubos de ensayo rotulados como blanco (B), estándar (S) y
los diez restantes, Muestra (M1, M2, ....M10)
B S M
1
M
2
M
3
M
4
M
5
M
6
M
7
M
8
M
9
M
10
Agua destilada ( ) 20
Estándar ( ) 2
011
Pool de suero ( ) 2
0
2
0
2
0
2
0
20 20 20 20 2
0
20
Reactivo de Color (ml) 2,
0
2,
0
2,
0
2,
0
2,
0
2,
0
2,
0
2,
0
2,
0
2,
0
2,
0
2,0
Dejar incubar por 30 minutos a temperatura ambiente y leer en un
espectronic 20 a una longitud de onda de 510 nm. Una vez obtenida las lecturas calcular la
concentración de glucosa, en cada tubo, por factor de calibración , donde Cp es la
concentración del estándar y Lp la lectura de dicho estándar.
Hallar la concentración promedio del Pool de suero
Restar a cada concentración (X) la concentración promedio ( )= ( )
Elevar al cuadrado la resta anterior (
Calcular la desviación estándar
Construir un eje de coordenadas ubicando en las abcisas (x) los días (10), y
en las ordenadas (y) la concentración promedio ( , la cual se proyectará en el centro de
dicho eje. Por encima y por debajo de la media se calculará una (1), dos (2) y tres (3) veces
la desviación estándar. (Ver gráfica anexa)
CURVA DE CONTROL DE CALIDAD PARA CREATININA
Fundamento de la Técnica: La creatinina existente en un filtrado libre de proteínas
reacciona con el picrato alcalino (formado por reacción entre el ácido pícrico y el hidróxido
de sodio), formándose un tautómero de color rojo, siendo proporcional la intensidad del
color a la concentración de la muestra.
- Técnica:
1. Preparar el Picrato Alcalino (partes iguales de ácido pícrico e hidróxido de
sodio).
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2. Preparar doce (12) tubos de ensayos rotulados blanco (B), estándar (S) y los
diez restantes como muestra (M1, M2, M3,….M10)
B S M
1
M
2
M
3
M
4
M
5
M
6
M
7
M
8
M
9
M
10
Agua
destilada ( )
10
0
Estándar ( ) 100 100 100 100 100 100 10
0
100 100 100 100
Picrato
Alcalino (ml)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Esperar 15 minutos a 37ªC y leer a 520 nm.
Una vez obtenida las lecturas calcular la concentración de creatinina, en cada
tubo, por factor de calibración , donde Cp es la concentración del estándar y Lp la lectura
de dicho estándar.
Hallar la concentración promedio del Pool de suero
Restar a cada concentración (X) la concentración promedio ( ), es decir, (
)
Elevar al cuadrado la resta anterior (
Calcular la desviación estándar
Construir un eje de coordenadas ubicando en las abcisas (x) los días (10), y
en las ordenadas (y) la concentración promedio ( , la cual se proyectará en el centro de
dicho eje. Por encima y por debajo de la media se calculará una (1), dos (2) y tres (3) veces
la desviación estándar. (Ver gráfica anexa)
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Gráfica de Control de Levey-Jennings
Realizar los cálculos en este espacio:
Muestra Lectura Concentración(
(
14
+
+
+
-
-
-
Días
PRÁCTICA N.3. ANÁLISIS DE ORINA
1. Objetivo general: Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de
realizar un uroanálisis como prueba de rutina para evaluar la función renal.
2. Objetivos específicos:
2.1.- Conocer el método para la toma de muestra urinaria parcial
2.2.- Conocer la metodología para la realización del examen de orina:
-Examen físico
-Examen químico
-Examen microscópico
2.3.- Conocer el uso y los fundamentos de la cinta reactiva y de los métodos
confirmatorios.
2.4.- Establecer las diferencias entre los elementos organizados y no organizados de
la orina con fines diagnósticos (leococitos, hematíes, cristales, cilindros, bacterias,
levaduras, células epiteliales planas y redondas)
2.5.- Diferenciar y reconocer, según los resultados, las diferentes patologías renales
(glomérulo nefritis, síndrome nefrótico, pielonefritis, infección bacteriana, infección
micótica)
2.6.- Realizar el reporte de los resultados.
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INTRODUCCION
El análisis de orina constituye uno de los métodos más fieles para evaluar la
función renal y para el diagnóstico y pronóstico de muchas patologías que afectan al riñón.
RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA:
1) Técnica recomendada: chorro medio.
2) Lavar los genitales con agua y jabón.
3) Si es mujer separar los labios mayores o si es hombre retirar el prepucio.
4) Después de haber comenzado la micción y haber descartado un poco de
orina tomar una muestra representativa.
5) Debe ser la primera orina de la mañana.
6) Utilizar un recipiente estéril.
7) Llevarla lo antes posible al laboratorio.
8) Una vez en el laboratorio: Procesarla de inmediato, de no ser así refrigerarla
o si se va a guardar por períodos más prolongados usar conservadores.
ANALISIS:
Examen físico:
Color: de amarillo pálido a ámbar.
Aspecto: Clara
Ligeramente turbia.
Turbia
DENSIDAD: se refiere al número de solutos y al peso de estas sustancias en la
orina. La densidad se mide con un refractómetro o urinómetro.
VR: 1005 – 1030 g/ml.
OLOR: la orina es inodora.
Olor amoniacal: probable infección con bacterias.
Olor a frutas: presencia de cetonas.
Olor dulce: pus o posible infección.
EXAMEN QUÍMICO:
TIRAS REACTIVAS: el análisis químico se realiza a través de las tiras reactivas,
el procedimiento para el uso de las tiras reactivas es el siguiente:
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1) Sumergir la tira reactiva en la muestra de orina.
2) Remover el exceso de orina mediante golpes contra el borde del recipiente.
3) Comparar el color obtenido con la correspondiente carta de colores del
envase.
Los parámetros evaluados por las tiras reactivas son los siguientes:
pH URINARIO: VR: 4,7 - 7,8.
Viraje al naranja: ácido.
Viraje al verde o azul: alcalino.
PROTEÍNAS:
Indicador : azul de tetrabromofenol.
Presencia de proteínas: Azul – Verdoso.
Ausencia de proteínas: amarillo.
Prueba confirmatoria: Acido sulfosalicílico.
AZÚCARES:
Principio:
Glucosa + O2 Acido glucónico + H2O2
H2O2 + O-toluidina O – toluidina oxidasa (azul)
Prueba confirmatoria: reacción de Benedict.
CETONAS: los cuerpos cetónicos se forman durante el catabolismo de los ácidos
grasos.
Principio:
Acido acetoacético + Nitroprusiato de Na+ púrpura
Confirmatoria: prueba del cloruro férrico.
BILIRRUBINA: producto final de la degradación de los eritrocitos.
Principio:
Bilirrubina glucurónido + Sal de diazonio azobilirrubina
(azul)
Prueba confirmatoria: Reactivo de fouchet.
UROBILINÓGENO: se forma a partir de la reducción de la bilirrubina.
Principio:
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Urobilinógeno + p – dimetilaminobenzaldehido Rojo.
pH ácido
Prueba confirmatoria: Prueba de Erlich.
NITRITO: se encuentra presente en las infecciones bacterianas.
Principio:
Acido p-arsanílico + Nitritos Diazonio
Diazonio + N-1-Naftilendiamina Color rosado
SANGRE: la hematuria es la presencia de sangre en la orina, esta puede ser visible
macroscópicamente o microscópicamente y puede ser debida a diversas causas a nivel
renal: infecciones, glomerulonefritis, tumores, hipertensión, infarto renal, LES.
Principio:
Hemoglobina.
H2O2 + 0 – toluidina O-toluidina oxidasa + H2O
Prueba confirmatoria: microscópicamente.
ESTUDIO DEL SEDIMENTO URINARIO:
Técnica:
1) Colocar 10 ml de orina en un tubo de ensayo, centrifugar por 10 minutos a
1.500 r.p.m.
2) Descarte el sobrenadante y coloque el sedimento en una lámina portaobjeto
limpia, cubra la lámina con un cubreobjeto.
3) Observar al microscopio con el objetivo seco.
SEDIMENTO URINARIO:
Organizado: Células epiteliales.
Hematíes.
Leucocitos.
Cilindros.
No organizado: Cristales
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Células: Eritrocitos, leucocitos.
Células espiteliales, células del túbulo renal.
Cristales: orina Acido úrico, oxalato de calcio, uratos
ácida amorfos, ácido hipúrico, uratos de sodio,
Sulfato de calcio, cristales de cistina,
Colesterol, tirosina, leucina, sulfamidas.
Cristales: orina Fosfato triple.
Alcalina Fosfato amorfo
Carbonato de calcio
Biurato.
Biurato de amonio.
Estructuras Bacterias
Diversas Hongos
Parásitos.
Gotas de grasa y de aire.
Cabellos y Fibras.
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PRÁCTICA Nº 4. DEPURACIÓN DE CREATININA
1. Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de
determinar la depuración de creatinina como prueba diagnóstica para la insuficiencia renal.
2.- Objetivos especificos:
2.1.- Definir depuración de creatinina.
2.2.- Conocer y fundamentar la técnica para la determinación de creatinina en suero
y en orina de 24 horas (método de Jaffé).
2.3.- Conocer los interferentes de la prueba.
2.4.- Conocer y aplicar los pasos para el cálculo de la depuración de creatinina.
2.5.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos para el diagnóstico, junto a la
clínica e historia del paciente, de insuficiencia renal.
20
INTRODUCCIÓN
Es el riñón el órgano encargado de mantener el volumen y composición de los
líquidos corporales dentro de los límites fisiológicos normales. Esta función del riñón es
llevada a cabo por el acoplamiento de millones de nefronas que llevan a cabo la filtración,
secreción y reabsorción de líquidos y solutos en el plasma. La filtración en el glomérulo
ocurre por la elevada presión hidrostática de sus capilares, esta presión hace que el líquido
filtrado en el glomérulo tenga la misma composición a la del plasma, excepto que no
contiene proteínas de elevado peso molecular.
La creatinina es un producto final de la creatina del hígado. El reservorio de energía
del músculo es la unión fosfato de alta energía. Las enzimas creatina quinasa y miokinasa
separan el grupo fosfato de la creatina para formar ATP.
CKCreatina-fosfato + ADP ATP + Creatinina.
La creatinina deriva de su interconversión no enzimática en el músculo esquelético
y es liberada al plasma con una velocidad constante. La concentración de creatinina
plasmática y urinaria depende de la masa magra muscular, por lo tanto se encuentra más
elevada en los hombres que en las mujeres y sus concentraciones son independientes de la
dieta o cualquier factor del medio ambiente.
La determinación de la creatinina constituye uno de los principales parámetros para
evaluar la función renal, más específicamente la filtración glomerular, ya que la creatinina
es filtrada en el glomérulo y no se reabsorbe a nivel de los túbulos. Si el índice de filtración
glomerular (IFG) disminuye ella aumenta en el plasma y disminuye en la orina o por si el
contrario el IFG aumenta ella disminuye en el plasma y aumenta en la orina.
Significado clínico: (Depuración de creatinina)
Se encuentra aumentada en: todos los estados que conllevan a un volumen minuto
cardíaco elevado: embarazo, estados hipercatabólicos (hipertiroidismo)
Se encuentra disminuida: cuando existe un flujo sanguíneo renal disminuido: Shock,
deshidratación, hemorragias, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome nefrótico,
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glomerulonefritis, pielonefritis, mieloma múltiple, insuficiencia hepática, paludismo,
insuficiencia renal.
Procedimiento de laboratorio:
Muestra: debe ser tomada en ayunas, no debe estar hemolizada o lipémica.
Interferentes de la prueba: algunos medicamentos como: furosemidas, metil
prednisona, carbinoxolona (aumentan los valores reales de la creatinina).
Las tiacidas, diazóxido y drogas nefrotóxicas disminuyen la creatinina).
Se debe evitar tomar té, café, evitar el ejercicio intenso, estar bien hidratado para
obtener un flujo de orina superior a 2ml/minuto.
Suspender el tratamiento con cortisona, tiroxina.
La depuración de creatinina se define como el volumen plasmático en el que cierta
cantidad de creatinina es eliminada en la orina por unidad de tiempo.
Técnica a emplear: Método de jaffé.
La creatinina existente en un filtrado libre de proteínas reacciona con el picrato
alcalino (formado por reacción entre el ácido pícrico y el hidróxido de sodio), formándose
un tautómero de color rojo, siendo proporcional la intensidad del color a la concentración
de la muestra.
Procedimiento:
1) Tomar la muestra de suero del paciente
2) Medir el volumen de la orina de 24 horas con un cilindro graduado.
3) Preparación de la muestra de orina: dilución 1/10.
4) Determinación de Creatinina en orina de 24 horas y en suero
5) Preparar el Picrato alcalino (partes iguales de ácido pícrico e hidróxido de
sodio)
Determinación de Creatinina en Suero y en orina.
Blanco Standard Muestra de
suero
Muestra de orina
(1/10)
Agua destilada ( ) 100
Standard ( ) 100
Suero ( ) 10022
Orina 1/10 ( ) 100
Picrato alcalino (ml) 2 2 2 2
Esperar 15 minutos a 37ªC y leer a 520 nm.
Cálculos:
Convertir el volumen total de la orina (24 horas) en minutos:
Volumen de orina en minutos = , donde 1440 son los
minutos en 24 horas.
Depuración de creatinina = , donde U es la concentración de ceatinina en
orina, Vm volumen urinario minutado y P concentración de creatinina en suero.
Intervalo de referencia: 90 – 140 ml/min.
Realizar los cálculos en este espacio:
23
PRÁCTICA Nº 5. DETERMINACIÓN DE BILIRRUBINA
1. Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad
de determinar la concentración, total, directa e indirecta, de bilirrubina sérica para el
diagnóstico de ictericias.
2. Objetivos específicos:
2.1.- Definir ictericia
2.2.- Clasificar la ictericia en : pre hepática, hepática y post hepática.
2.3.- Relacionar los niveles de bilirrubina total, directa e indirecta para el
diagnóstico del tipo de ictericia.
2.4.- Conocer y fundamentar las pruebas bioquímicas para la determinación de
bilirrubina sérica.
2.5.- Aplicar, sobre la muestra biológica, la técnica adecuada para determinar los
niveles de bilirrubina.
2.6.- Reportar e interpretar los valores obtenidos con el fin de diagnosticar la
ictericia presente.
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INTRODUCCIÓN
La bilirrubina proviene del grupo hem de la hemoglobina contenido en los
eritrocitos. El 90% de estas células envejecidas son destruidas por los fagocitos del bazo,
hígado y médula ósea, liberando hierro, globina y el grupo hem. En el interior del histiocito
se produce la separación del hem, hierro y globina a nivel del puente -metano por las
enzimas hemoxigenasas microsómicas. El hierro y la globina son almacenados para ser
reutilizados. El hierro se almacena como ferrtina o hemosiderina dentro del histiocito, pero
la mayor parte es captado por la proteína de transporte transferrina. El hierro de la
transferrina es liberado en la médula ósea para ser utilizado en los normoblastos en
formación. La globina se degrada y pasa al fondo común de los aminoácidos.
La porción restante del anillo de porfirina (biliverdina) es reducida por la enzima
biliverdina reductasa a bilirrubina, ésta pasa a la sangre donde se combina con la albúmina
para ser transportada al hígado. En el hígado por acción de la enzima UDP-
glucoroniltransferasa es conjugada a bilirrubina conjugada, la cual es polar e insoluble en
lípidos. El glucurónido de bilirrubina se excreta en la bilis, una vez en el intestino por
acción de las enzimas bacterianas es convertido a urobilinógeno, éste se excreta en las
heces donde se oxida a urobilina o estercobilina. Parte del urobilinógeno reabsorbido se
filtra por el riñón y aparece en la orina (urobilina urinaria).
La determinación de la bilirrubina tiene gran importancia clínica ya que sirve para
evaluar la función hepática, anemias autoinmunes y la eritroblastosis fetal entre otras.
El aumento de la bilirrubina en el plasma conlleva a un estado patológico conocido
como ictericia. La cual consiste en la coloración de la piel y membranas mucosas por el
aumento de los pigmentos biliares en la sangre.
La ictericia se divide en: ictericia prehepática, hepática y post-hepática.
Ictericia pre-hepática: produce un aumento de la bilirrubina no conjugada debido a
un aumento de la liberación y metabolismo de la hemoglobina después de la hemólisis.
Ejemplo: Anemias autoinmunes, eritroblastosis fetal.
Ictericia hepática: aumento de la bilirrubina conjugada y no conjugada por
problemas intrínsecos del hígado, ya sea por defectos en el transporte o metabolismo de la
bilirrubina.
25
Entre las patologías incluidas en esta clasificación encontramos: el síndrome de
Dubin-Johnson, la enfermedad de Crigler Najjar, hepatitis, cirrosis, ictericia fisiológica
neonatal.
Ictericia post-hepática: enfermedad biliar obstructiva, espasmos o constricciones
del tracto biliar, oclusión de conductos por cálculos o de una compresión por la presencia
de un tumor. En este caso aumenta la bilirrubina conjugada.
Procedimiento de laboratorio:
Muestra: suero o plasma.
orina (proteger la muestra de la luz)
Condiciones de la muestra:
La muestra no debe estar hemolizada pues en este caso aparecen valores
falsamente elevados.
1) Debe protegerse de la luz debido a que la luz degrada a la bilirrubina
produciendo valores falsamente disminuidos.
Fundamento de la prueba:
La bilirrubina reacciona con el diazo reactivo de Erlich o P-benceno diazonio
sulfonato, formando azobilirrubina compuesto de color rosado cuya intensidad se lee
fotocolorimétricamente a 540 nm.
Muestra: suero (dilución 1:10)
1 ml de suero + 9 ml de solución salina fisiológica.
Blanco de
Directa
Directa Blanco de
Total
Total
SSF (ml) 2,5 2,5 ------ -------
Metanol (ml) ------ ----- 2,5 2,5
Diazo blanco (ml) 0,5 ----- 0,5 ----
Diazo reactivo (ml) ----- 0,5 ------ 0,5
Suero 1:10 (ml) 2 2 2 2
Guardar los tubos en la oscuridad y leer a los 30 minutos con filtro verde de 540
nm.
Cálculos:
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Bilirrubina directa (mg/dl): Absorbancia (M) x Factor 33.
Bilirrubina total (mg/dl): Absorbancia (M) x Factor 33
Bilirrubina indirecta (mg/dl): Bilirrubina total – Bilirrubina directa.
Nota: el reactivo diazoico se prepara en el momento de su uso, de la siguiente
forma:
Solución A: 20 ml ó 5 ml.
Solución B: 0,6 ml ó 0,15 ml.
Mezclar.
Intervalo de referencia:
Bilirrubina total: 0,3 – 1,0 mg/dl.
Bilirrubina directa: 0,1 – 0,15 mg/dl.
Bilirrubina indirecta: 0,2 – 0,8 mg/dl.
Resumen
Causas de hiperbilirrubinemia:
1) No conjugada:
a) Hemólisis aumentada: anemias autoinmunes, eritroblastosis fetal.
b) Ictericia neonatal.
c) Eritropoyesis ineficaz.
d) Drogas que compiten por el glucurónido.
e) Enfermedad de Gilbert.
f) Enfermedad de Crigler Najjar.
2) Conjugada:
a) Obstrucción del árbol biliar.
b) Colestasis.
c) Lesiones hepatocelulares: cirrosis, hepatitis.
d) Neoplasias hepáticas
e) Cálculos o quistes.
f) Síndrome de Dubin-Johnson y síndrome de Rotor.
27
PRÁCTICA Nº 6. PROTEÍNAS TOTALES Y FRACCIONADAS
1. Objetivo terminal: al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de
determinar la concentración de proteínas totales, albúminas y globulinas presentes en el
suero del paciente. Así mismo, interpretar los resultados con el fin de llegar a un
diagnóstico clínico.
2. Objetivos específicos:
2.1.- Definir, clasificar y diferenciar las funciones de las proteínas plasmáticas.
2.2.- Conocer las patologías y estados fisiológicos en los cuales las proteínas se pueden
presentar alteradas.
2.3.- Conocer los fundamentos y metodologías de las pruebas para la determinación de
proteínas totales y albúmina.
2.4.- Conocer los interferentes de las pruebas y las condiciones de la muestra.
2.5.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnósticos.
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INTRODUCCIÓN
Las proteínas son sustancias de primordial importancia para la vida, ya que
constituyen los elementos de las células en los que se realizan las funciones propiamente
vitales. Al igual que los lípidos e hidratos de carbono, las proteínas pueden ser utilizadas
por el organismo con fines energéticos. Pero además son elementos estructurales, que
forman la armazón arquitectónica de las células.
El plasma sanguíneo contiene en solución coloidal una gran cantidad de proteínas
(alrededor de 7g/dl). Las proteínas plasmáticas constituyen complejos de sustancias de
diferente composición y de diferente estado de hidratación, lo cual permite separarlas por
distintos procedimientos, entre ellos electroforesis.
Mediante la electroforesis se obtienen cuatro fracciones principales: la albúmina y
las globulinas y , cada una con funciones específicas. Sin embargo, las proteínas
plasmáticas cumplen funciones generales, entre las cuales se encuentran:
Intervienen en el metabolismo acuoso, principalmente manteniendo la
presión coloidosmótica.
Intervienen en el equilibrio electrolítico
Participan en el transporte de sustancias liposolubles, entre ellas los lípidos.
Actúan como hormonas, enzimas, antígenos y anticuerpos.
Interpretación Clínica de las proteínas Totales: Se utilizan para evaluar el estado
nutricional y en el estudio del edema.
Causas de proteínas totales elevadas (> 9,0g/dl): hiperinmunoglobulinemia,
gammapatías mono o policlonales. Se encuentra pseudohiperproteinemia en caso de
deshidratación.
Causas de proteínas totales disminuidas (<6,0 g/dl): gastroenteropatías,
síndrome nefrótico. Descensos debidos a la disminución de la síntesis de proteínas como
en: enfermedad hepática crónica, síndrome de malabsorción, malnutrición
agammaglobulinemia.
Causas de Albúmina elevada (>6,0 g/dl): procesos de deshidratación
(Pseudohiperalbuminemia).
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Causas de Albúmina disminuida (<3,0 g/dl): malabsorción, obstrucción intestinal,
enfermedad hepática (cirrosis, hepatitis crónica activa), fiebre reumática, síndrome
nefrótico.
PROTEÍNAS TOTALES
Método: Biuret
Principio: Las proteínas por sus uniones peptídicas reaccionan con los iones
cúpricos del reactivo de Biuret en medio alcalino formando un complejo de color violeta.
Muestra: Suero. Cuando se extraiga la muestra, y tras centrifugar, debe separase el
suero de las células. Refrigerar, almacenar a 4ºC menos de 72 horas. A –20°C es estable
durante 6 meses.
Interferencias: esteroides anabólicos, andrógenos, corticoides, insulina y
progesterona producen valores elevados de proteínas totales.
Procedimiento
BLANCO ESTÁNDAR MUESTRA
Agua destilada ( ) 50
Estándar ( ) 50
Muestra ( ) 50
Reactivo de Biuret (ml) 3 3 3
Mezclar bien, dejar en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente y leer a
540 nm.
Valores Normales: 6,3 – 8,5 g/dl.
ALBÚMINA
Método: Verde de Bromocresol
Principio: la albúmina se une al indicador Verde de Bomocresol a un pH adecuado
para formar un complejo coloreado, cuya intensidad es proporcional a la concentración de
albúmina en la muestra.
Muestra: Suero, orina parcial, orina de 24 horas, líquido cefalorraquídeo.
30
Interferencias: ampicilina, hemoglobina, heparina y lipemia dan valores
aumentados.
Procedimiento:
Blanco Estándar Muestra
Agua destilada ( ) 20
Estándar ( ) 20
Muestra ( ) 20
Reactivo (ml) 5 5 5
Mezclar bien, dejar en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente y leer a
630 nm.
Valores refenciales: 3,5 – 5,1 g/dl.
Realizar los cálculos en este espacio.
31
PRÁCTICA Nº 7. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE
ÁCIDO ÚRICO
1. Objetivoterminal: Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de
determinar los niveles séricos de ácido úrico como prueba diagnóstica del metebolismo de
las purinas.
2. Objetivos específicos:
2.1.- Conocer el origen del ácido úrico y su importancia clínica.
2.2.- Conocer las patologías y estados fisiológicos en los cuales el ácido úrico puede
alterarse.
2.3.- Conocer los fundamentos y metodologías de las pruebas para la determinación
de ácido úrico.
2.4.- Conocer los interferentes de las pruebas y las condiciones de la muestra.
2.5.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnósticos.
32
INTRODUCCIÓN
El ácido úrico es el producto final más importante del metabolismo de las purinas,
que son el producto de degradación de las nucleoproteínas contenidas en las células de los
tejidos.
La principal fuente de ácido úrico la constituyen las nucleoproteínas contenidas en
las carnes, aunque también las purinas son sintetizadas en la médula ósea a partir de los
precursores químicos sencillos como los componentes del ácido nucleico, en combinación
con nucleótidos y proteínas.
El ácido úrico en filtrado en el glomérulo renal pero casi en su totalidad (90%) es
reabsorbido en los túbulos renales.
El ácido úrico es ligeramente soluble en agua, pero forma sales solubles con
alcálisis por eso precipita fácilmente en orinas ácidas si se les deja en reposo y tiene
tendencia a formar cálculos renales en pacientes con gota. La gota es un tipo de artritis
inflamatoria articular secundaria a la cristalización de urato monosódico en la articulación.
En caso de una insuficiencia renal crónica avanzada existe un aumento
progresivo del nivel plasmático de ácido úrico.
Interpretación clínica: La cantidad total de ácido úrico circulante depende de la
síntesis y catabolismo endógeno de las purinas, de la ingesta de purinas exógenas y del
aclaramiento renal de los uratos.
Hiperuricemia primaria:
1) Gota.
Hiperuricemia secundaria:
1) Enfermedades mieloproliferativas, neoplasias, enfermedades renales,
hipertiroidismo.
Hipouricemia: enfermedades congénitas del metabolismo como la xantinuria.
Carencia o defectos purino-nucleósido-fosforilasa.
DETERMINACIÓN DE ACIDO ÚRICO:
Fundamento de la prueba: La determinación enzimática del ácido úrico se realiza
mediante las reacciones siguientes:
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Acido úrico + 2H2O + O2 Alantoina + CO2 + H2O2
H2O2 + 4-AF + DCFS Quinona rosada + 4H2O
.Muestra suero o plasma.
Orina de 24 horas.
No utilizar muestras hemolizadas.
El ácido úrico es estable en nevera por 3 días (2 ºC – 8 ºC), es estables en
congelación por seis meses.
El ácido úrico es estable en orina a temperatura ambiente por varios días.
Interferentes de la prueba:
1) La bilirrubina y el ácido ascórbico pueden ocasionar valores falsamente bajos.
2) Muestras lipémicas producen valores falsamente elevados.
Procedimiento de laboratorio:
Blanco Patrón Paciente
Agua destilada ( 60
Patrón ( ) 60
Suero ( ) 60
Reactivo (ml) 3,0 3,0 3,0
Mezclar bien e incubar por 5 minutos a 37 ºC ó 10 minutos a temperatura ambiente
y leer a una longitud de onda de 520nm.
Cálculos:
Valores de referencia:
Suero o plasma = 2,5 – 7,7 mg/dl.
Realizar los cálculos en este espacio
34
4-AF: 4-aminofenazona, DCFS:
PRÁCTICA Nº 8. CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA.
DIABETES MELLITUS
1. Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de
construir una curva de tolerancia a la glucosa como prueba diagnóstica de la Diabetes
Mellitus.
2. Objetivos específicos:
2.1.- Conocer el tratamiento del paciente para realizarle una curva de tolerancia a la
glucosa.
2.2.- Conocer los pasos para realizar una curva de tolerancia a la glucosa.
2.3.- Conocer el método adecuado y su fundamento para la determinación de
glucosa sérica.
2.4.- Aplicar el método adecuado sobre la muestra correspondiente para la
determinación de glucosa sérica.
2.5.- Armar la curva de tolerancia a la glucosa.
2.6.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos para obtener un diagnóstico
definitivo.
35
INTRODUCCION
La glucosa es el azúcar principal de la sangre que sirve a los tejidos como principal
combustible metabólico. La concentración de glucosa sanguínea está controlada por la
insulina. Esta hormona facilita la entrada de la glucosa a los tejidos extrahepáticos que son
impermeables a ella, en tanto que las células hepáticas parecen ser libremente permeables a
la glucosa. La glucosa estimula al páncreas para la síntesis y secreción de insulina.
Existen diversas patologías asociadas a niveles inadecuados de glucosa sanguínea
entre la más común está la DIABETES. La diabetes es una enfermedad metabólica,
crónica y generalizada que se manifiesta en hiperglicemia, cetosis, glucosuria, catabolismo
proteico y acidosis. Esta enfermedad está asociada a trastornos del páncreas el cual es
incapaz de producir insulina, produce insulina no funcional o niveles de ella insuficiente
para los niveles de glucosa sanguínea. La etiología de la diabetes no está clara aún, algunos
autores afirman que se deben a factores genéticos o ambientales, otros a que la diabetes se
debe a mecanismos de autoinmunidad.
Significado clínico:
Hiperglicemia
1) Hiperglicemia fisiológica: aumento de la glucosa sanguínea sin glucosuria se
observa en las excitaciones psíquicas, esfuerzos musculares y a veces en el período
menstrual.
2) Hiperglicemia febril: observada en las infecciones agudas: neumonía,
tuberculosis y sepsis.
3) Hiperglicemia encefalopática: observada en los traumatismos cerebrales.
4) En el infarto al miocardio: transitoria, dos días después del ataque cardíaco.
5) En la pancreatitis aguda.
6) En el hipertiroidismo, síndrome de Cushing, acromegalia.
Hipoglicemia:
1) En el hiperinsulinismo por insulinoma.
2) Tratamiento excesivo con insulina.
3) En la insuficiencia suprarrenal.
36
4) Hipotiroidismo.
5) Enfermedad hepática.
6) En afecciones hipofisiarias.
Determinación de la Tolerancia a la Glucosa: Esta prueba constituye un valioso
auxiliar diagnóstico. La tolerancia a la glucosa (capacidad para utilizar los carbohidratos) se
encuentra disminuida en la diabetes y aumentada en el hipopituitiarismo, hiperinsulinismo
y en la hipofunción corticosuprarrenal.
Descripción de la prueba:
Después de un ayuno de 12 horas, se le administra al paciente segùn condiciòn
fisiològica una soluciòn glucosada preparada de la siguiente manera (adulto 75g de glucosa
disueltas en 350 ml de agua, niños < de 12 años 1,75g/kg de peso en 350 ml de agua y
embarazadas 100g de glucosa en 350 ml de agua). Antes de administrar la glucosa se toma
una muestra de sangre, a la cual se le determinará los niveles de glucosa y constituirá la
glicemia basal. Posteriormente se administra la solución glucosada y se esperan 2 horas
para la toma de la segunda muestra. A esta última se le determina los valores de glicemia
para el diagnóstico. Durante la realización de la prueba el individuo debe permanecer en
reposo y se abstendrá de beber café o fumar. En los individuos normales la glicemia en
ayunas está comprendida entre 70 – 110 mg/dl, después de la administración del
concentrado, la glicemia debe elevarse y retornar, antes de las 2 horas, a los niveles basales.
En los diabéticos el retorno al nivel basal es más lento, es decir la curva de la tolerancia a la
glucosa en estos pacientes es más prolongada y más elevada que la de los individuos
normales.
Procedimiento de laboratorio:
Indicaciones: el día antes de la prueba se le explica al paciente que debe realizar un
ayuno de 12 horas. Cenar temprano y ligero.
Muestra: Suero
Fundamento: La glucosa es oxidada específicamente por la glucosa oxidasa con
producción de peróxido de hidrógeno el cual oxida al cromógeno (4 – AAP/fenol), para
producir un compuesto coloreado, mediante una reacción catalizada por la peroxidasa.
37
Glucosa oxidasaGlucosa + H20 + O2 Acido glucónico + H2O2
Peroxidasa
H2O2 + 4 aminoantipirina + Fenol Compuesto coloreado
Procedimiento:
1) Haga la determinación de glucosa sérica basal (en ayunas).
2) Adminístrele el concentrado de glucosa al paciente. Este debe tomarlo en un
lapso no mayor de 5 minutos y el tiempo cero lo marca el comienzo de la ingesta.
3) Realice las determinaciones a las 2 horas siguiendo el esquema de
trabajo que a continuación se presenta:
Blanco Estándar Muestra (hora 0) Muestra (2 h)
Agua destilada ( ) 20
Standard ( ) 20
Suero basal ( ) 20
Suero 2 horas ( ) 20
Reactivo (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5
Incube por 30 minutos a temperatura ambiente y lea en un espectronic a 510nm.
Cálculos:
GLUCOSA (mg/dl) =
Valores normales:
En ayunas (suero o plasma) = 70 – 100 mg/dl.
A las 2 horas = Normal < 126 mg/dl, Tolerante >126 < 199 mg/dl, Diabético > 200
mg/dl
38
PRÁCTICA Nº 9. PERFIL LIPÍDICO
1.- Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de
determinar el perfil lipídico con el fin de diagnosticar dislipoproteinemias y/o riesgo
coronario.
2.- Objetivos específicos:
2.1.- Definir lípidos, colesterol, triglicéridos, HDL colesterol, LDL colesterol y VLDL.
2.2.- Conocer la importancia clínica del perfil lipídico para la clasificación de las
dislipoproteinemias y diagnóstico de riesgo coronario.
2.3.- Conocer los métodos de rutina para la determinación del perfil lipídico y los
fundamentos de cada uno.
2.4.- Aplicar sobre la muestra en estudio, las técnicas adecuadas para determinar los
valores de lípidos en la misma e interpretar los resultados con fines diagnósticos de patologías
en el metabolismo lipídico.
39
PRÁCTICA Nº 9. PERFIL LIPÍDICO
Los lípidos son sustancias orgánicas insolubles en agua, pero solubles en solventes
orgánicos. Los principales lípidos del plasma humano son: el colesterol esterificado, el
colesterol libre y los triglicéridos.
El Colesterol es un alcohol esteroideo insaturado que se sintetiza en casi todas las
células del cuerpo, representa el 75% del total y constituye en componente estructural
importante de las membranas celulares, un precursor en la biosíntesis de los ácidos biliares
y las hormonas esteroideas. El colesterol libre, el cual representa el 25% del total, participa
en los procesos patológicos como principal factor en la génesis de la ateroesclerosis de
arterias vitales, causando enfermedad cerebrovascular, coronaria y vascular periférica. El
colesterol puede tener variaciones fisiológicas relacionadas con el sexo, la edad, la dieta y
el embarazo. Las variaciones patológicas coinciden a menudo con las de la lipemia, aunque
pueden presentarse variaciones discordantes. Entre las condiciones patológicas que cursan
con hipercolesterolemia están: ictericia obstructiva, cirrosis biliar, ateroesclerosis, síndrome
nefrótico, Diábetes Mellitus, entre otras. Entre las condiciones patológicas que cursan con
hipocolesterolemia están: insuficiencia hepática, hipertiroidismo, entre otras.
Los triglicéridos son ésteres de glicerol, generalmente formados por tres ácidos
grasos diferentes. Provienen de dos fuentes: una externa del intestino delgado llamado
triglicérido exógeno y una interna del hígado llamado triglicérido endógeno. Los
triglicéridos son almacenados en el tejido adiposo y constituyen una fuente potencial de
energía.
El nivel de triglicéridos en el plasma es bastante variable, dependiendo del estado de
alimentación, cantidad de ejercicios y del estado metabólico general. Se observan valores
elevados de triglicéridos en hiperlipoproteinemias fundamentalmente las de tipo I,III, IV y
V, las cuales se caracterizan por:
Tipo I: aumento de quilomicrones
Tipo III: aumento de Pre Beta e intermedia
Tipo IV: Aumento de Pre Beta lipoproteína
Tipo V: Aumento de quilomicrones y Pre Beta lipoproteína.
40
Los lípidos son transportados desde el intestino hasta los órganos donde se utilizan
por partículas especializadas llamadas lipoproteínas, las cuales representan complejos
macromoleculares que permiten la permanencia y movilización de los lípidos en un medio
que le es adverso, como lo es el medio acuoso del plasma sanguíneo.
Estas lipoproteínas se han clasificado en cuatro clases principales basándose en el
tamaño de la partícula, su composición química, características fisicoquímicas y de
flotación y movilidad electroforética. De acuerdo a su densidad se han clasificado como
quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL o LMBD), de baja densidad
(LDL o LBD) y de alta densidad (HDL o LAD).
La dosificación de cada lipoproteína, complementada con la determinación del
colesterol y los triglicéridos, proporciona lo que se conoce como “Perfil Lipídico”.
Determinación del perfil lipídico
1.- Triglicéridos
Método de la glicerol fosfato oxidasa (GPO)
Fundamento: Los triglicéridos son hidrolizados por acción de la lipasa microbial
en glicerol y ácidos grasos libres (FFA). El glicerol es fosforilado por adenosina-5-
trifosfato (ATP) en glicerol-3-fosfato (G3P) en una reacción catalizada por glicerol kinasa
(GK). El G3P se oxida a fosfato dihidroxiacetona (DAP) con formación de peróxido de
hidrógeno (H2O2) en una reacción catalizada por la enzima glicerol fosfato oxidasa (GPO).
El H2O2 oxida al cromógeno (4-AAP) por acción de la enzima peroxidasa para formar una
coloración roja de quinoneimina, la cual es proporcional a la concentración de triglicéridos
en la muestra.
Procedimiento:
Prepare cuatro (4) tubos de ensayos rotulados como blanco (B), estándar
(S), Control (C) y muestra (M)
Reactivo B S M
Agua destilada ( ) 30
Estándar ( ) 30
Muestra ( ) 30
Reactivo de color (ml) 3 3 3
41
Incubar por 15 a 20 minutos a temperatura ambiente y leer a 540 nm.
Para calcular la concentración de triglicéridos en la muestra se aplica la siguiente
ecuación:
, donde Cx es la concentración del analito en la muestra, Fc el factor de
calibración y Lx la lectura de la muestra. Recuerde que el factor de calibración se calcula
dividiendo la concentración del patrón (Cp) entre su lectura (Lp), es decir .
Valores Normales :
36 – 165 mg/dl.
2.- Colesterol
Método de la Colesterol Esterasa:
Fundamento: El colesterol esterificado es hidrolizado por acción de la enzima
colesterol esterasa para producir colesterol libre y ácidos grasos. El colesterol libre es
oxidado por la colesterol oxidasa para formar colest-4eno-3-ona y peróxido de hidrógeno.
En presencia de la peroxidasa, el peróxido de hidrógeno formado oxida al cromógeno
(DEA-HCL/AAP), el cual producirá un color proporcional a la cantidad de colesterol en la
muestra.
Procedimiento:
Prepare cuatro (4) tubos de ensayo rotulados como blanco (B), estándar (S), control (C) y
muestra (M).
Reactivo B S M
Agua destilada ( ) 30
Estándar( ) 30
Muestra( ) 30
Reactivo de color (ml) 3 3 3
Incubar por 15 a 20 minutos a temperatura ambiente y leer a 500 nm.
Para calcular la concentración de colesterol en la muestra se aplica la siguiente
ecuación:
42
, donde Cx es la concentración del analito en la muestra, Fc el factor de
calibración y Lx la lectura de la muestra. Recuerde que el factor de calibración se calcula
dividiendo la concentración del patrón (Cp) entre su lectura (Lp), es decir .
Valores Normales:Deseable: < 200 mg/dl
Límite: 200-239 mg/dl
Alto: > 240 mg/dl
3.- HDL Colesterol
Método de Precipitación
Fundamento: Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las lipoproteínas de muy
baja (VLDL) son precipitadas selectivamente del suero sanguíneo a un pH de 5,7 por la
adición del reactivo fosfotungstato amortiguado, dejando las lipoproteínas de alta densidad
(HDL) en el sobrenadante. La centrifugación del suero pretratado resulta en un
sobrenadante aclarado que contiene HDL, el cual es analizado por el método enzimático de
colesterol (Colesterol Esterasa).
Procedimiento:
1. En tubos de centrífuga pipetee sucesivamente 0,5 ml de suero y 1 ml de
solución precipitante.
2. Agite enérgicamente durante 10 segundos y déjelo en reposo durante 10
minutos a una temperatura menor de 25ºC.
3. Centrifugue a 3.500 r.p.m durante 15 minutos
4. Tome 0,2 ml del sobrenadante claro para la determinación enzimática de
colesterol. (Ver procedimiento para la determinación del colesterol)
Valores Normales
Sexo Pronóstico favorable Riesgo normal Indicador de riesgo
Hombres (mg/dl) > 55 35 - 55 < 35
Mujeres (mg/dl) > 65 45 - 65 < 45
4.- LDL Colesterol
43
Método indirecto; según Friedewald:
Fundamento: Esta fórmula da resultados fiables siempre y cuando los
quilomicrones no están presentes, el contenido de triglicéridos es inferior a 400 mg/dl y el
paciente no padece de hiperlipoproteinemia del tipo III.
Valores normales :
Sospechoso: a partir de 150 mg/dl
Elevado: a partir de 190 mg/dl
5.- VLDL
Método indirecto; según Rifking
Fundamento: La relación entre los triglicéridos y la VLDL es constante (1:5), lo
cual ha permitido desarrollar una ecuación que de manera indirecta cuantifica a la VLDL.
Valores normales:
10 – 36 mg/dl
6.- Marcadores de riesgo coronario
Indice
Valor deseable: < 3
Indice
Valor deseable: > 0,23
Realizar los cálculo en este espacio
44
PRÁCTICA Nº 10. DETERMINACIÓN SÉRICA DE CALCIO Y FÓSFORO
1. Objetivo general: Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de
determinar los niveles de calcio y fósforo séricos con fines diagnósticos de patologías
óseas.
2. Objetivos específicos:
2.1.- Conocer las fuentes principales de calcio y fósforo.
2.2.- Conocer la relación existente entre calcio y fósforo sérico.
2.3.- Conocer los fundamentos y técnicas de las pruebas de rutina para la
determinación de calcio y fósforo séricos.
2.4.- Conocer los interferentes de las pruebas como también el tipo de muestra.
2.5.- Conocer las diversas patologías y estados fisiológicos que se presentan con
niveles aumentados o disminuidos de calcio y fósforo.
2.6.- Aplicar sobre la muestra adecuada las técnicas correspondientes para establecer
un diagnóstico definitivo a partir de la clínica del paciente y los niveles de calcio y fósforo
encontrados en dicha muestra.
45
INTRODUCCIÓN
El fósforo existe en todas las células del organismo, pero la mayor parte (el 80%) se
encuentra combinado con el calcio en los huesos y en los dientes. Un 10% se halla en
combinación con proteínas, con lípidos y carbohidratos, y en otros compuestos de la sangre
y del músculo. El fósforo se encuentra en casi todos los alimentos de la dieta, por lo tanto
no se conoce que ocurra una deficiencia dietética en el hombre. El consumo de fósforo debe
ser de 1,5 g/día en los adultos y un poco mayor en los niños, en los lactantes el consumo de
fósforo es aún mayor. El metabolismo del fósforo se encuentra, en gran parte, relacionado
con la del calcio, la relación de estos dos elementos es 1:1 cuando el aporte de vitamina D
es adecuado.
Interpretación Clínica de los Valores de Fósforo Sérico:
Hipofosfatemia: en general asintomática, pero si es marcada puede dar una serie de
manifestaciones clínicas como: insuficiencia respiratoria, acidosis metabólica, fallo
cardíaco y alteraciones hematológicas. Si es moderada ocasiona debilidad muscular.
1) Raquitismo: pueden llegar a ser tan bajos como 1 a 2 mg/100 ml.
2) En el hiperparatiroidismo, en la enfermedad celíaca.
3) Pacientes con defecto tubular renal (heredado o adquirido), en la reabsorción
de los fosfatos: raquitismo familiar, el síndrome de Toni-Fanconi. En todos estos casos
ocurre un aumento de la excreción del fosfato en la orina y este hallazgo permite
diferenciar a estos pacientes de aquellos en los que la causa del fósforo sanguíneo
disminuido es una deficiencia de vitamina D.
4) Por disminución de aporte: malabsorción intestinal, diarreas, fijación de
fosfatos en el tubo digestivo por tratamiento con antiácidos, alimentación parenteral
exclusiva con líquidos pobres en fosfatos, alcoholismo crónico, carencia de vitamina D.
5) Vómitos, diarreas.
Hiperfosfatemia: determina hipocalcemia y tetania si es importante y aguda. Si es
crónica conlleva a calcificaciones vasculares y tisulares especialmente a nivel del riñón. Se
observa en:
1) Por aumento de ingresos: intoxicación por vitamina D, exceso consumo de
productos lácteos, por administración continua de laxantes ricos en fosfatos.
46
2) En la IRC o en la IRA: por disminución del filtrado glomerular.
3) En el hipoparatiroidismo y en la acromegalia.
4) Pacientes con quemaduras extensas.
5) Tumores, leucemias, linfomas.
Procedimiento de Laboratorio:
Muestra: Suero u Orina de 24 horas. Medir el volumen total de orina y realizar una
dilución 1:50.
Fundamento:
La reacción de fósforo inorgánico con molibdato de amonio en presencia de
ácido sulfúrico produce un complejo de fosfomolibdato no reducido que se lee a 340 nm.
Procedimiento de Laboratorio:
Blanco Estándar Muestra
Reactivo enzimático (ml) 3 3 3
Suero (ul) -------- 60
Estándar (ul) --------- 60 --------
Agua destilada (ul) 60 ---------- ----------
Mezclar y leer la absorbancia a los 5 minutos a 340 nm.
Cálculos:
Intervalo de Referencia:
Adultos: 4,0 –7,0 mg/dl.
Niños: 0 – 1 año: 4,9 – 7.9 mg/dl.
1 a 15 años: 3,4 – 6,2 mg/dl.
47
INTRODUCCIÓN
El calcio es un mineral presente en el ser humano, éste existe en concentraciones
mayores que cualquier otro mineral. El cuerpo de un hombre adulto de 70 Kg de peso
contiene aproximadamente 1,200 g de calcio. El 90% de calcio en el organismo se
encuentra en el esqueleto, donde es mantenido como depósitos de fosfato de calcio.
También se encuentra en los líquidos corporales en forma no ionizada. Esta pequeña
cantidad es importante para el proceso de la coagulación, el mantenimiento de la
excitabilidad normal del corazón, de los músculos y nervios, y para los aspectos
diferenciales de la permeabilidad de las membranas.
El calcio se encuentra presente principalmente en la leche y sus derivados,
mantequilla, quesos, natas. Se encuentra en menores cantidades en la yema de huevo,
frijoles, lentejas, nueces, higos, coliflor.
Los requerimientos diarios de calcio son los siguientes:
Hombres y mujeres después de los 18 años de edad: 800 mg/día.
2do y 3er. Trimestre del embarazo: 1,2 mg/día.
Lactantes y menores de 1 año: 360 – 540 mg/día.
Niños de 1-18 años: 0,8 – 1,2 mg/día.
El calcio proveniente de la dieta es absorbido por un proceso de transporte activo en
la parte superior del intestino delgado. El proceso es regulado por el 1,25-
dihidroxicolecalciferol un metabolito de la vitamina D. La absorción de calcio es facilitada
por la vitamina D, las proteínas y la lactosa. Mientras que la absorción se encuentra
inhibida por el fitato (granos de cereales), el oxalato (las espinacas) y los fosfatos.
Estados patológicos:
A) Relación con las paratiroides:
Hiperparatiroidismo: elevación del calcio sérico con disminución del fosfato.
Hipoparatiroidismo: disminución del calcio sérico con aumento del fosfato.
B) Osteoporosis: es la pérdida progresiva del tejido óseo y está relacionada con
un aporte inadecuado de calcio.
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C) Raquitismo: consiste en una calcificación defectuosa de los huesos debido a
un bajo contenido en el organismo de vitamina D, a una deficiencia de calcio y fósforo en
la dieta o a una combinación de ambos factores.
D) Enfermedades renales: IRC, nefritis, nefrosis ocasionan disminución del
calco sérico por aumento de filtración del catión a nivel glomerular.
E) Se encuentra aumentado en el mieloma múltiple y en enfermedades
neoplásicas de los huesos.
Procedimiento de laboratorio:
Muestra:
1) Suero fresco no hemolizado o plasma heparinizado.
2) Remover el coágulo del suero tan rápido como sea posible, ya que los
glóbulos rojos pueden absorber calcio.
3) Muestras viejas de suero que contengan partículas visibles precipitadas no
deben utilizarse.
4) Calcio en suero es estable por 24 horas a temperatura ambiente, una semana
entre 2-8 ºC.
Interferencias:
1) Sustancias que forman complejos con el calcio, dan resultados incorrectos.
2) Hemólisis severa o lipemia puede causar resultados elevados.
Fundamento:
El método utiliza O-Cresolftaleina complexona como cromógeno, el calcio
reacciona con el cromógeno en un medio alcalino produciendo un color violeta. La
intensidad del color es proporcional a la concentración del calcio en la muestra.
Medio alcalinoCALCIO + (CPC) (color violeta) complejo CPC - calcio
Blanco Estándar Muestra
Agua destilada ( ) 60
Estándar ( ) 6049
Suero ( ) 60
Reactivo de color
(ml)
3,0 3,0 3,0
Incubar 1 minuto a temperatura ambiente. Leer en el espectrofotómetro a 570 nm.
Cálculos:
Valores esperados = 8,5 –10,4 mg/dl.
Realizar los cálculos en este espacio
50
PRÁCTICA Nº 13. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE
AMILASA
1. Objetivo general: Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de
determinar los niveles séricos de amilasa con fines diagnósticos de pancreátitis aguda.
2.- Objetivos específicos:
2.1.- Definir y conocer la procedencia de la amilasa y su función en el organismo.
2.2.- Relacionar los valores de la amilasa con diversas patologías que cursan con
amilasemia.
2.3.- Distinguir entre una pancreatitis aguda y crónica.
2.4.- Conocer los interferentes y tipo de muestras utilizadas en la determinación de
la amilasa sérica.
2.5.- Conocer y fundamentar las pruebas bioquímicas de rutina para la
determinación de amilasa.
2.6.- Aplicar sobre la muestra adecuada la técnica correspondiente para el
diagnóstico de pancreatitis aguda.
2.7.- Reportar e interpretar los resultados con fines diagnóstico de afección
pancreática.
51
INTRODUCCIÓN
La amilasa es una enzima que degrada moléculas hidrocarbonadas complejas en
componentes más pequeños. Es producida por el páncreas exocrino y las glándulas
salivales para ayudar a digerir el almidón. Se encuentra también en el hígado y en el
revestimiento de las trompas de Falopio.
La amilasa humana se denomina amilasa por su capacidad para romper los
enlaces polisacáridos 1-4 al azar. El producto final de la acción de la Amilasa sobre el
polisacárido es la formación de maltosa y algunas moléculas de glucosa.
La actividad de dicha enzima aumenta en el suero y en la orina de pacientes
afectados de pancreatitis. Para la detección de esta condición se utiliza la determinación de
la amilasa. La pancreatitis se presenta a menudo como una emergencia médica, por lo que
la determinación de dicha enzima debe ser prueba "stat" o inmediata.
Existen otras condiciones capaces de provocar aumento de la amilasa sérica,
incluyendo paperas, parotiditis, abcesos tubáricos, derrame pleural, obstrucción intestinal,
traumatismo abdominal, cirugía intrabdominal, trombosis mesentérica, peritonitis, úlceras
gástricas, aneurisma de aorta, traumatismo cerebral y hemorragia esplénica.
Interpretación Clínica:
Alrededor del 80% de los pacientes con pancreatitis aguda manifiestan
valores elevados de amilasa pancreática en las primeras 24 horas.
La amilasa pancreática diferencia entre pancreatitis aguda y crónica.
La mayor actividad de la amilasa se encuentra en las glándulas parótidas y el
páncreas, si bien hay actividad en ovarios e intestinos, los valores aumentados en ausencia
de pancreatitis aguda se observan en parotiditis (isoenzima salival), en obstrucción o infarto
intestinal, embarazo ectópico, enfermedad del tracto biliar de cualquier origen, en
cetoacidosis diabética, quiste y pseudoquiste pancreático, peritonitis.
La macroamilasemia consiste en la presencia en suero de amilasa unida a
imunoglobilina no filtrable por el glomérulo, lo cual provoca un aumento importante en
suero, mientras que no existe eliminación urinaria de amilasa.
Se describen niveles elevados de amilasa en individuos alcohólicos y en
algunos tumores de pulmón y ovario.
52
Muestra:
- Suero.
- Orina de 24 horas.
- Orina de 2 horas.
- Líquido peritoneal.
- Líquido pleural.
Interferentes de la Prueba:
- Se observan incrementos de la amilasa sérica en tratamientos con drogas que
producen constricción del esfínter de ODDI y por la contaminación de la muestra con
saliva.
- Se observan disminuciones en las muestras tratadas con oxalato o citrato.
Las hipertrigliceridemias pueden inducir falsas disminuciones de amilasa.
Procedimiento de laboratorio:
En dos (2) tubos de ensayo rotulados como blanco y muestra añadir:
Blanco Muestra
agua destilada. (ml) 75
suero ( ) 75
reactivo de color (ml) 3,0 3,0
Incubar por 1 minuto y leer a 405 nm.
Cálculos
amilasa = lectura x 3.178
Valor Normal = 25 - 125 u/l.
53
PRÁCTICA Nº 14. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE
CREATINA QUINASA.
1. Objetivo terminal: al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad
de determinar los niveles séricos de creatina quinasa como prueba de ayuda diagnóstica de
afecciones cerebrales, musculares y cardíacas.
2. Objetivos específicos:
2.1.- Definir y conocer la distribución de la creatina quinasa y su función.
2.2.- Conocer las diferentes isoenzimas de la Creatina quinasa e interpretar los
niveles séricos de cada una.
2.3.- Conocer y fundamentar las pruebas bioquímicas para la determinación de la
creatina quinasa.
2.4.- Aplicar sobre la muestra biológica respectiva la técnica adecuada para la
obtención de resultados y reportar e interpretar los resultados obtenidos
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INTRODUCCIÓN
La creatina quinasa (CK) es una enzima celular, ampliamente distribuida en los
tejidos del organismo, principalmente en el músculo esquelético, tejido cardíaco y cerebro.
Su función está asociada con la generación de trifosfoadenosina (ATP) para sistemas
contráctiles o de transporte.
La CK cataliza la fosforilación reversible de la creatina; reacción en la cual el
ATP actúa como dador del grupo fosfato.
Creatina + ATP fosfocreatina + ADP.
Existen tres isoenzimas la CK MM (músculo), la CK-MB (híbrida en el corazón y la
CK-BB en el cerebro, músculo liso, tiroides, pulmones y próstata.
Interpretación Clínica: los incrementos de CK-BB aparecen en determinados tipos
de cáncer (próstata, vejiga, pulmón e intestino), cirugía cardíaca, traumatismos cardíacos y
en enfermedades del tejido conectivo.
Los aumentos de la CK-MM se producen predominantemente en la distrofia
muscular, rabdomiólisis (destrucción o degeneración del tejido muscular debido a una o
varias causas, en especial traumatismos), polimiositis (inflamación que produce debilidad
de los músculos de los hombros, caderas y cuello, habitualmente asociada con dolor
muscular y lasitud), infarto al miocardio, isquemia miocárdica, lesión cerebral,
insuficiencia renal crónica, shock avanzado y atresia biliar.
Los aumentos de CK-MB se presentan en enfermedades miopáticas y enfermedades
inflamatorias del corazón. Tras un infarto al miocardio las CK-MM y CK-MB ingresan al
sistema circulatorio como resultado de la lesión de la célula muscular cardíaca. El aumento
de la concentración de estas isoenzimas se puede detectar a las 4 y seis horas después del
infarto; las concentraciones máximas aparecen habitualmente a las 18 y 24 horas, y los
valores normales se recuperan a las 36 y 72 horas. También se observan elevaciones de la
CK-MB tras la cirugía cardíaca y en las extensiones de los infartos, la isquemia miocárdica,
pericarditis, hipotiroidismo y en los corredores de maratón.
Tipo de ensayo: cinético; Medir el cambio de absorbancia por 3 minutos.
Longitud de onda = 340 nm.
55
Fundamento: su procedimiento emplea un anticuerpo policlonal del monómero
CK-M para inhibir completamente la actividad del CK-MM y una mitad del CK-MB.
Entonces la actividad del monómero CK-B no es inhibida y puede ser medida. La actividad
de la CK-B es medida usando la siguiente serie de reacciones:
CK-BADP + creatinafosfato Creatina + ATP
HKATP + glucosa ADP + glucosa - 6 – P
G6PDHG-6-P + NAD 6-fosfogluconato + NADH + H+
Procedimiento de laboratorio:
En dos (2) tubos de ensayo rotulados como blanco y muestra añadir:
Blanco Muestra
Agua destilada (ml) 3,0
Muestra ( ) 150
Reactivo (ml) 3,0
Mezclar y leer al minuto, a los dos minutos y a los tres minutos
Cálculos:
CK total = Abs/min (corregida) x VT x 1000
6,22 x LP x Vm
VT = volumen total.
VM = volumen de la muestra.
6,22 = coeficiente de extinción milimolar de NADH.
1000 = conversión de unidades de ml a l.
LP = paso de la luz en cm (sí una celda de 1 cm es usada).
Nota: El resultado debe ser multiplicarlo por 2.
Valor de referencia: 0 - 22 U/l
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PRÁCTIVA Nº 12. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE
FOSFATASA ALCALINA
1.- Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de
determinar los niveles séricos de fosfatasa alcalina con el fin de diagnosticar procesos de
obstructivos y óseos.
2.- Objetivos específicos:
2.1.- Definir y conocer la ubicación celular de la fosfatasa alcalina.
2.2.- Reconocer la interpretación clínica de la fosfatasa alcalina para la evaluación
de procesos obstructivos.
2.3.- Conocer los interferentes de las pruebas.
2.4.- Conocer y fundamentar las pruebas bioquímicas para la determinación sérica
de la fosfatasa alcalina.
2.5.- Aplicar sobre la muestra en estudio la técnica respectiva, para la determinación
sérica de la fosfatasa alcalina y reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines
diagnósticos de procesos obstructivos y óseos.
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INTRODUCCIÓN
La fosfatasa alcalina es una hidrolasa con muy poca especificidad de sustrato. Se
encuentra presente en casi todos los tejidos del cuerpo especialmente en el epitelio
intestinal, túbulos renales, hueso, hígado y placenta. Su localización celular es la
membrana.
En el suero de individuos normales el origen, de la fosfatasa alcalina en el 50%, es
hepático y óseo (aunque la contribución relativa de esas dos fracciones al total de actividad
enzimática es marcadamente edad dependiente). Los individuos de los grupos sanguíneos B
y O secretores tienen en sus sueros fosfatasa alcalina de origen intestinal.
Existen 5 isoenzimas principales de esta enzima<. Hepática, ósea, intestinal, renal y
placentaria. Se diferencian entre ellas por su estructura molecular y por sus propiedades
físico-químicas, antigénicas y catalíticas.
Aparte de esas formas moleculares, la fosfatasa alcalina puede presentar algunas
formas atípicas: fracción biliar (también asociada como fracción hepática rápida o
hepática); formas de origen neoplásicos (isoformas Regan, Nagao y Kasahara) y formas de
migración lenta (complejos moleculares de gran tamaño constituidos por la enzima y una
molécula de IgG). La fracción biliar parece ser que es un complejo de la enzima con restos
moleculares procedentes de la ruptura de las membranas de los hepatocitos o de las células
del tracto biliar. Las fracciones de origen canceroso tienen algunas propiedades físico-
químicas muy semejantes a las de la función placentaria.
Interpretación clínica:
Como otras enzimas, la fosfatasa alcalina tiene muy poca especificidad y puede
encontrarse elevada en múltiples situaciones. Sin embargo, tiene dos aplicaciones clínicas
muy útiles:
En la enfermedad obstructiva hepática.
En la enfermedad metabólica ósea, asociada al incremento de la actividad
osteoblástica.
En la enfermedad obstructiva hepática se produce una elevación sérica importante
sobre todo, si la obstrucción es extrahepática. En la enfermedad parenquimatosa hepática la
elevación es en general muy discreta.
58
En las enfermedades metabólicas óseas, constituye prácticamente la única enzima
que tiene utilidad diagnóstica. Se encuentra principalmente elevada en la enfermedad de
Paget, en el raquitismo, osteomalacia (elevación muy discreta) y en el hiperparatiroidismo
con implicación ósea.
En las metástasis óseas sólo se produce elevación de la fosfatasa alcalina en aquellas
metástasis que dan lugar a lesiones osteoescleróticas con formación ósea de novo y gran
actividad osteoblástica. En las metástasis osteolíticas la fosfatasa alcalina permanece sin
cambio.
Procedimiento de laboratorio:
Método: p-nitrofenilfosfato.
Muestra: suero libre de hemólisis.
Longitud de onda: 405 nm.
Temperatura: 25 ºC, 30 ºC y 37 ºC.
Blanco Muestra
Agua destilada (ml) 3
Reactivo (ml) 3
Suero ( ) 75
Mezclar bien e incubar por 1 minuto, leer a 405 nm. Llevar a cero el instrumento
con agua destilada y anotar las absorbancias a intervalos de 1 minuto durante los próximos
3 minutos
Cálculos: Fosfatasa alcalina en la muestra: A/min x 2187.
Valores esperados:
25 ºC 30 ºC 37ºC
22-79 U/l 27-95 U/l 35-123 U/l
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PRÁCTICA Nº 11. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE
TRANSAMINASAS (Alanina y Aspartato amino transferasa)
1.- Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de
determinar los niveles séricos de las transaminasas con el fin de diagnosticar y evaluar
pronósticos en alteraciones ubicadas en el hígado o en el corazón.
2.- Objetivos específicos:
2.1.- Definir y conocer la ubicación celular de las transaminasas.
2.2.- Reconocer la interpretación clínica de las transaminasas para la evaluación de
afección hepática y cardíaca.
2.3.- Conocer los interferentes de las pruebas.
2.4.- Conocer y fundamentar las pruebas bioquímicas para la determinación sérica
de las transamimasas.
2.5.- Aplicar sobre la muestra en estudio la técnica respectiva, para la determinación
sérica de transaminasas.
2.6.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnósticos de
infartos al miocardio y afecciones hepáticas
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INTRODUCCIÓN.
Las transaminasas catalizan la transferencia de un grupo amino desde un
aminoácido hacia un cetoácido. Estas enzimas son la alanina aminotransferasa (ALT) y la
aspartato aminotransferasa (AST).
Alanina Aminotransferasa (ALT) o Transaminasa Glutámico Pirúvica (TGP).
Esta enzima cataliza la transferencia del grupo amino de la alanina al ácido cetoglutámico.
ALT Alanina + ácido cetoglutarato ácido pirúvico + ácido glutámico
La alanina aminotransferasa se encuentra presente en los tejidos y su aparición en el
suero es un índice de lesión tisular similar a la aparición de la aspartato aminotransferasa.
Sin embargo, los valores séricos de ALT son más pronunciados en las lesiones hepáticas
que en las lesiones miocárdicas siendo ésta enzima un indicador específico de daño
hepático.
Interpretación clínica:
La máxima actividad de la ALT se manifiesta en el hígado, músculo esquelético,
riñón y corazón. Elevación importante de la ALT se observa en necrosis del hepatocito, en
traumatismo extenso del músculo esquelético, golpe de calor, miocarditis, cirrosis, ictericia
obstructiva, infarto agudo del miocardio y en enfermedades hemolíticas.
Otros casos: se han descrito niveles elevados de ALT en obesos, en niños con
leucemias linfocíticas agudas y en el síndrome de Reye.
Interferencias: La hemólisis interfiere aumentando los niveles de ALT. Se han
descrito incrementos debido a drogas hepatotóxicas, así como a inyecciones musculares.
Aspartato Aminotransferasa (AST) o Transaminasa Glutámico Oxalacética
(TGO).
Esta enzima cataliza la transferencia del grupo amino del aspartato al ácido
cetoglutámico.
Aspartato + ácido cetoglutarato ácido oxalacético + ácido glutámico.
Todos los tejidos contienen aspartato aminotransferasa, particularmente el corazón,
el hígado y el músculo esquelético. Existen dos (2) isoenzimas una mitocondrial (mAST) y
61
una citosólica (cAST). Estas dos isoenzimas difieren notablemente en cuanto a su
estructura y a sus propiedades químicas y físicas. Sin embargo, ambas catalizan la misma
reacción y solamente existen pequeñas diferencias en los pasos catalíticos.
Interpretación clínica:
Incremento de la AST se observan en hepatitis fulminantes, hepatitis virales,
necrosis o daño del hepatocito por cualquier causa, ictericia colestásica, hepatitis crónica,
tóxica o alcohólica. En esta última predomina la AST sobre la ALT. Mientras que en la
hepatitis vírica la ALT predomina sobre la AST. En el síndrome de Reye aumenta la AST
fundamentalmente.
Otros casos: Niveles elevados se observan también en enfermedades de origen
muscular, cardíaco, predominando en infarto agudo al miocardio la elevación de la AST
sobre la ALT. En la cirrosis hepática puede estar normal o discretamente aumentada.
Se han descrito valores disminuidos de la AST en pacientes urémicos y en
tratamiento con metromidazol, así como en el déficit de vitamina B6 (piridoxal).
Interferencias: La hemólisis interfiere aumentando la concentración de AST.
Igualmente la isoniazida, fenotiazinas, eritromicina, esteroides anabólicos, opiáceos y
salicilatos provocan aumentos de AST en suero.
Fundamento de la AST (TGO): La aspartato aminotrnasferasa cataliza la
transferencia del grupo amino del L-aspartato a - ketoglutarato dando oxalacetato y L-
glutamato. El oxalacetato se reduce a malato en una reacción catalizada por malato
deshidrogenasa (MDH).
En esta misma reacción un equivalente de NADH se oxida a NAD. La
disminución en absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la
AST. La lactato deshidrogenasa (LDH) se adiciona para reducir rápidamente cualquier
piruvato presente en el suero de modo que no interfiera con el ensayo.
ASTL-aspartato + -Ketoglutarato Oxalacetato + L-glutamato. MDH Oxalacetato + NADH + H+ L- Malato + NAD+ + H2O
Procedimiento:
62
Blanco Muestra
Agua destilada (ml) 3
Reactivo (ml) 3
Suero ( ) 300
Leer la disminución de la absorbancia cada minuto por 3 minutos, determinar el
Abs/min y multiplicar por el factor 1768 para obtener los resultados UI/l.
Cálculos:
AST en la muestra = Abs/min x VT x 1000
6,22 x Vm x Pl
donde, VT es el volumen total del ensayo (3,3 ml), 6,22 es la constante, 1000 la
conversión de unidades de ml a l, VM el volumen de la muestra en ml (0,3) y Pl el paso de
la luz en cm (1).
Valores de referencia:
25 ºC. 30 ºC 37 ºC
hasta 22 UI/l hasta 28 UI/l hasta 40 UI/l.
Fundamento de la GPT (ALT): La ALT cataliza la transferencia de los
aminogrupos de L- alanina a ketoglutarato resultando en la formación de piruvato y L-
glutamato. La lactato deshidrogenasa cataliza la reducción de piruvato y la oxidación
simultánea de NADH a NAD. La disminución de absorbancia a 340 nm es directamente
proporcional a la actividad de la ALT.
ALTL-alanina + ketoglutarato piruvato + L- glutamato. LDHPiruvato + NADH + H+ L- Lactato + NAD+ + H20
63
Procedimiento:
Blanco Muestra
Agua destilada (ml) 3
Reactivo (ml) 3
Suero ( ) 300
Leer la disminución de la absorbancia cada minuto por 3 minutos y determinar el
Abs/min.
Cálculos:
ALT (GPT) = Abs/min x VT x 1000
6,22 x Vm x Pl
donde VT es el volumen total del ensayo (3,3 ml), 6,22 una constante, 1000 el factor
de conversión de unidades de ml a l, VM el volumen de la muestra en ml (0,3) y Pl el paso
de la luz en cm (1).
Valores de referencia:
25 ºC 30 ºC 37 ºC
hasta 20 UI/l hasta 26 UI/l 38 UI/l
64