manual de practicas.doc

Facultad de Ciencias Qumicas

Facultad de Ciencias Qumicas

Gmez Palacio, Durango

MANUAL DE PRCTICAS

DEL LABORATORIO DE

LA MATERIA:

MICROBIOLOGIA GENERALRESPONSABLE DE LA ELABORACIN:

Q.F.B. JOAQUIN AVALOS SOTOQ.B.P. ERNESTO CAMACHO MONTELONGOFECHA DE ELABORACIN:NOVIEMBRE DE 2009

ESTE DOCUMENTO CONTIENE

_________FOJAS TILES

DIRECTORIOC.P. RUBN CALDERN LUJN

RECTOR

DR. SALVADOR RODRGUEZ LUGO

SECRETARIO GENERAL

M.E. MARIA DE JESUS CEDILLO GOMEZ

DIRECTORA

Q.F.B. JOSE ELPIDIO RIVAS JURADO

SECRETARIO ADMINISTRATIVO

M.C. VICTOR MANUEL RODRIGUEZ GONZALEZ

SECRETARIO ACADMICO

M.S.P. SIGFREDO ESPARZA GONZALEZ

JEFE DE LA DIVISIN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E INVESTIGACIN

M.C. MARIA ELENA ALONSO NAPOLES

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PLANEACIN Y EVALUACIN

DRA. PATRICIA RAMIREZ BACA

COORDINADORA DE LA CARRERA DE: INGENIERO QUIMICO EN ALIMENTOS

Q.F.B. LUIS OTONIEL GARCIA CONTRERAS

COORDINADOR DE CARRERA: QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO

Q.F.B. JOS RUVALCABA QUIONESCOORDINADOR DE TRONCO COMUN

M.C. RODOLFO GERARDO CHEW MADINAVEITIACOORDINADOR DEL VyDE

NDICE

ConceptoPagina

I. Encuadre del Sistema de Prcticas6

I.1. Introduccin6

I.2. Cuadro de Competencias8

I.3 Niveles de Desempeo9

II. Mapa del Sistema de Prcticas16

III. Prcticas Generales de Seguridad24

III.1 Reglamentos27

IV. Contenido de cada practica en particular55

IV.1 Unidad 1 56

IV.1.1. Practica # 1 Esterilizacin y manejo de Material Microbiolgico56

IV.1.2. Prctica #2 Medios de Cultivo Preparacin y Envase58

IV.2 Unidad 261

IV.2.1 Practica #3 Mtodos Generales de Cultivo61

IV.2.2 Practica #4 Preparacin de Frotis Bacteriano63

IV.3 Unidad 366

IV.3.1 Practica #5 Morfologa de Hongos y Levaduras66

IV.3.2 Practica #6 Diferenciacin de grupos de bacterias (Tincin Gram)68

IV.4 Unidad 472

IV.4.1 Practica #7 Tcnicas de Aislamiento72

IV.4.2 Practica #8 Endosporas y Capsulas75

IV.5 Unidad 678

IV.5.1 Practica #9 Identificacin Bacteriana78

IV.5.2 Practica #10 Utilizacin de Carbohidratos83

IV.5.3 Practica #11 Prueba de Citrato85

IV.5.4 Practica #12 Produccin de Indol86

IV.5.5 Practica #13 Produccin de Acido Sulfhdrico88

IV.5.6 Practica #14 Descarboxilacin90

IV.5.7 Practica #15 Ureasa92

V.1. Mtodo de Asignacin de Calificaciones95

VI.1. Bibliografa96

I.- Encuadre del Sistema de Prcticas

I.1 Introduccin:

Microbiologa se refiere al estudio de los microorganismos y sus actividades. Forma, estructura, fisiologa, reproduccin, metabolismo e identificacin.

El objetivo de la Microbiologa es comprender las actividades perjudiciales y beneficiosas de los microorganismos y mediante esta comprensin, disear las maneras de aumentar los beneficios y reducir o eliminar los daos.

Las prcticas se encuentran divididas en:

1. Introduccin

2. Objetivo

3. Material4. Procedimiento

5. Resultados

6. Conclusiones

7. Bibliografa consultada

8. Cuestionario Previo

MISION DEL PROGRAMA DE QFB

Es un programa educativo de calidad orientado a la formacin integral de profesionales en el rea de las Ciencias Qumicas, Farmacuticas y Biolgicas, libres, responsables y competitivos con valores humanistas y ticos que generan y aplican conocimientos en el sector farmacutico, de preservacin del medio ambiente y biomdico, enlazndolos de manera oportuna y con sentido biotico con los sectores productivos, sociales y cientficos, contribuyendo al progreso de la Regin del Estado y del Pas.

VISION DEL PROGRAMA DE QFB:Al 2020 el programa educativo Qumico Farmacutico Bilogo de la Facultad de Ciencias Qumicas en Gmez Palacio contar con la Acreditacin correspondiente, con cuerpos acadmicos consolidados que favorezcan la formacin de profesionistas certificados, con gran capacidad de investigacin y alto espritu de servicio, sustentado en una amplia vinculacin con todos los actores sociales para contribuir al desarrollo social, econmico y cientfico del Pas.1.2. Cuadro de Competencias:1Competencia a Adquirir

2. Objetivo (s)3. Intencin o finalidad4. Contexto o restricciones5. Rango(s) o situaciones6. Criterio(s) de desempeo7.

Fundamento Cientfico

Motivar al Estudiante,Lleve a cabo InvestigacinAnlisis y razonamiento relacionado con la teoraPara que compruebe en la prctica lo aprendido en la clase terica

Control de cepas patgenas, manipulacin de microorganimos.

Servirn de base para la realizacin de otras prcticas de laboratorio en materias subsecuentes.Adquirir destrezas y habilidades que le permitan conocer los fenmenos que permiten el desarrollo y de los microorganismos.La Microbiologa es una Ciencia de Laboratorio con un enfoque qumico-biolgico de todas las actividades de los microorganismos

1.3. Nivel de Desempeo:

El conjunto de prcticas del presente manual te permitir llegar a un desempeo de nivel 4 de acuerdo la clasificacin de CONOCER, a saber en el Nivel 4 se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad y recursos para conciliar intereses. Se debe tener habilidad para motivar y dirigir grupos de trabajo. Las razones por las que asumimos que obtendrs un nivel de desempeo tan alto son:

1. La realizacin de las prcticas en forma y tiempo presupone el dominio de diferentes habilidades y conocimientos.

2. La elaboracin de un protocolo y un informe por prctica requiere de disciplina y laboriosidad, as como la utilizacin de herramientas computacionales.

3. Las prcticas debern ser realizadas en equipo, lo que requiere de la participacin armnica de los elementos. La capacidad de liderazgo deber ser usada en forma ptima para realizar los diversos pasos de la prctica.Ubicacin De La Materia Con Respecto Al Mapa Curricular

EJE DE FORMACIN FUNDAMENTAL Y EJE CURRICULAR DE CIENCIAS BSICAS

ASIGNATURACLAVEHORASCRDITOS

TEORAPRCTICA

Qumica Inorgnica IQUI01325

Qumica Inorgnica IIQUI02325

Qumica Orgnica IQUO01325

Qumica Orgnica IIQUO02325

Qumica Orgnica IIIQU003246

Fsica IFIS01224

Fsica IIFIS02224

Matemticas I (lgebra Lineal)MAT01224

Matemticas II (Clculo Diferencial e Integral) IIMAT02224

Matemticas III (Ecuaciones Diferenciales)MAT03224

Computacin ICOM01145

Computacin IICOM02145

Estadstica IEST01325

Estadstica IIEST02325

TOTALES: 323466

EJE DE FORMACIN DE LA DISCIPLINA Y EJE CURRICULAR DE CIENCIAS EXPERIMENTALES

ASIGNATURASCLAVEHORASCRDITOS

TEORAPRCTICA

Fisicoqumica IFIQ01325

Fisicoqumica IIFIQ02325

Qumica Analtica IQUA01448

Qumica Analtica IIQUA02448

Anlisis instrumentalANI00448

Bioqumica IBIQ01426

Microbiologa GeneralMIG00448

Biologa CelularBIC00325

Bioqumica IIBIQ02426

FisiologaFIO00404

Gentica,GEN00325

Toxicologa TOX00336

Fisicoqumica FarmacuticaFQF00426

TOTALES: 473380

EJE DE FORMACIN DEL EJERCICIO PROFESIONAL Y EJE CURRICULAR DE MICROBIOLOGA, BIOQUMICA, BIOMDICA Y FARMACOLOGA

ASIGNATURASCLAVEHORASCRDITOS

TEORAPRCTICA

Histologa, HIS00336

Inmunologa I INM01426

Inmunologa II, INM02426

Hematologa, HEM00426

Anatoma, ANT00404

Anlisis Bioqumico Clnico IABC01347

Anlisis Bioqumico Clnico IIABC02347

Bacteriologa MdicaBCM00347

Microbiologa IndustrialMII00347

Microbiologa Sanitaria MIS00347

Parasitologa PAR00336

VirologaVIR00404

Micologa MIC00347

Farmacognosia I FAG01347

Farmacognosia IIFAG02347

FarmacologaFAR00336

Tecnologa Farmacutica TFA00347

Diseo y Estabilidad de MedicamentosDEM00336

Qumica LegalQIL00336

Recursos HumanosREH00404

LiderazgoLID00404

TOTALES: 7057127

EJE DE FORMACIN DE LA DISCIPLINA Y EJE CURRICULAR DE CIENCIAS EXPERIMENTALESASIGNATURASCLAVE

Fisicoqumica IFIQ01

Fisicoqumica IIFIQ02

Qumica Analtica IQUA01

Qumica Analtica IIQUA02

Anlisis instrumentalANI00

Bioqumica IBIQ01

Microbiologa GeneralMIG00

Biologa CelularBIC00

Bioqumica IIBIQ02

FisiologaFIO00

Gentica,GEN00

Toxicologa TOX00

MAPA CURRICULAR DEL PLAN DE ESTUDIOS DE QUMICO FARMACUTICO BILOGO

EJES DE FORMACIN Y CURRICULARES

SEMESTREEJE TRANSVERSALDE FORMACIN Y CIENCIAS BSICASDE LA DISCIPLINA Y CIENCIAS EXPERIMENTALESDEL EJERCICIO PROFESIONAL EN MICROBIOLOGA, BIOQUMICA, BIOMDICA Y FARMACOLOGAOPTATIVAS (CADA SEMESTRE SE DEBER CURSAR UNA)

TRONCO COMNPRIMERINVESTIGACIN, DESARROLLO DE HABILIDADES DEL PENSAMIENTO, VALORES EN LA PROFESIN Y COMUNICACINQUI01, QUO01, FIS01, MAT01, COM01CDC00, DEH00, PSO00, BIO00, TLN00, COS00, COB00, NUT00, TSI00, TDE00, HAD00, CDF00, COO00, MDN00, SEI00, HAP00, TSH00, DIG00, TDO00

SEGUNDOQUI02, QUO02, FIS02, MAT02, COM02

TERCERMAT03, EST01FIQ01, QUA01, ANI00

CUARTOEST02QUA02, FIQ02, BIQ01, MIG00, BIC00

QFBQUINTOBIQ02ANT00, ABC01, BCM00, LID00

SEXTOFIS00ABC02, FAG01, HIS00, PAR00

SPTIMOFQF00, TOX00MIC00, FAG02, HEM00

OCTAVOGEN00MIS00, INM01, FAR00, REH00, DEM00

NOVENOMII00, TFA00, VIR00, QIL00, INM02

II. Mapa Del Sistema de PrcticasCompetencia o unidad de competencia a ser abordada

SemanaPrcticasTipoPre requisitos

UNIDAD 1 ANTECEDENTES DE LA MICROBIOLOGA

1.1 Antecedentes. Descubrimiento de los microorganismos.

1.2 Microscopia

1.3 Teora microbiana de la fermentacin, teora microbiana de la enfermedad (anlisis de la vigencia de los postulados de R. Koch).

1.4 Esterilizacin, pasteurizacin, inmunizaciones y placa slida.

1.5 Campos de aplicacin de la microbiologa.

1.6 Los cinco grandes grupos de microorganismos, segn Withaker (eucariticos y procariticos).

1 1. Esterilizacin y manejo de material microbiolgico.Laboratorio Multidisciplinario 2

rea de MicrobiologiaConocimiento Terico del manejo del autoclaveConocimiento del uso y manejo de: material de vidrio, equipo menor de laboratorio y reactivos qumicos

Uso de bata de laboratorio

2 y 3,2. Medios de cultivo: preparacin y envaseLaboratorio Multidisciplinario 2

rea de MicrobiologaConocimiento Terico del manejo del autoclave

Conocimiento del uso y manejo de: material de vidrio, equipo menor de laboratorio y reactivos qumicos

Conocimiento en el empaque del material microbiolgico


UNIDAD 2 TAXONOMA DE LOS MICROORGANISMOS

2.1 Taxonoma, nomenclatura e identificacin.

2.2 Concepto de especie bacteriana.

2.3 Categoras taxonmicas.

2.4 Sistema binario de nomenclatura.

2.5 Sistemas de clasificacin, Manual de bacteriologa de Bergeys.

2.6 Secuenciacin de genomas completos, hacia una clasificacin filogentica

4 y 5 3. Mtodos generales de cultivo.Laboratorio Multidisciplinario 2





6 y 7 4. Preparacin de Frotis bacterianoLaboratorio Multidisciplinario 2





UNIDAD 3 MORFOLOGA Y ESTRUCTURA MICROBIANA

BACTERIAS

3.1 Forma y agrupacin bacteriana

3.2 Morfologa colonial

3.3 Estructura: E. internas y E. externas

HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURIFORMES

3.4 Polimorfismo de los hongos

VIRUS

3.5 Arquitectura viral.

8 y 9 5. Morfologa de hongos y levadurasLaboratorio Multidisciplinario 2





10 y 11 6. Diferenciacin de grupos de bacterias (Tincin de Gram.)Laboratorio Multidisciplinario 2





UNIDAD 4 FISIOLOGIA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

BACTERIAS

4.1 Fisin binaria. Curva de desarrollo bacteriano.

HONGOS

4.2 Reproduccin en hongos.

4.3 Tipos de esporas sexuales y asexuales.

VIRUS

4.2 Replicacn viral: ciclo litico, ciclo lisognico.

12.13,7. Tcnicas de aislamientoLaboratorio Multidisciplinario 2





14.8. Endosporas y CpsulasLaboratorio Multidisciplinario 2





UNIDAD 6 METABOLISMO MICROBIANO

6.1 Metabolismo y obtencin de energa en bacterias quimioauttrofas y en fototrofas.

6.2 Nutricin mineral: micronutrientes y macronutrientes.

6.3 Metabolismo de los aminocidos.

6.4 Metabolismo de los carbohidratos.

6.5 Fermentacin microbiana.

15.9. Identificacin bacteriana.Laboratorio Multidisciplinario 2





16 10. Utilizacin de carbohidratos

11. Prueba de Citrato

12. Produccin de Indol

13. Produccin de Acido Sulfhdrico

14. Desacarboxilacin

15.Ureasa

Laboratorio Multidisciplinario 2





III. Prcticas Generales de Seguridad

Se toman en cuenta las diferentes normativas relacionadas con los trabajos de laboratorio en general como:3.1.- Normas Oficiales Mexicanas:

NOM-001-SPTS-2008Edificios, locales, instalaciones y reas en los centros de trabajo-Condiciones de seguridad

NOM.002.STPS-2000Condiciones de seguridad, prevencin, proteccin y combate de incendios en los centros de trabajo.

NOM-005-STPS-1998Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias qumicas Peligrosas

NOM-026-STPS-2008Colores y seales de seguridad e higiene, e identificacin de riesgos por fluidos conducidos en tuberas.

NOM-114-STPS-1996Sistema para la comunicacin e identificacin de riesgos por sustancias qumicas en los Centros de Trabajo

NOM.087-ECOL-SSA1-2002Proteccin ambiental - Salud ambiental -

Residuos peligrosos biolgico-infecciosos - Clasificacin y especificaciones de manejo

NOM-052-SEMARNAT-2005Que establece las caractersticas, el procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de los residuos peligrosos.

3.2.- Reglamentos Varios: Ley General de Equilibrio Ecolgico y Proteccin Ambiental (LEGEEPA) 16-V.2008

Agenda 21 del Fondo para el Medio Ambiente Mundial

Ley General de Salud 11-VI-2009

Reglamento Federal de Seguridad, Higiene y Medio Ambiente de Trabajo 21-I-1997

3.3.- Normativa de la UJED:

Ley Orgnica de la UJED

Reglamento General de la UJED

3.4.- Normativa de la FCQ Reglamento Interno de la FCQ

Reglamento de Laboratorio de la FCQ

Reglamento del Laboratorio de Microbiologa Manual de Bioseguridad del Laboratorio de MicrobiologaFACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

GMEZ PALACIO, DGO.LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL

REGLAMENTO DE BIOSEGURIDAD

La peligrosidad de un agente est directamente relacionada con el tipo de microorganismo y la manipulacin a la que es sometido. Por ello es bsico:

1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.

2. Conocer la metodologa de trabajo del laboratorio.

3. Conocer el equipamiento del laboratorio.

4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.

5. Conocer las leyes relacionadas con la seguridad biolgica.

6. Respetar y hacer cumplir todo lo anterior.

Para que se produzca un accidente por agente biolgico deben concurrir bsicamente cuatro elementos:

a. Un husped susceptible

b. Un agente infeccioso

c. Una concentracin suficiente de ste

d. Una ruta de transmisin apropiada.

De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de transmisin.

Las rutas de transmisin ms comunes en el laboratorio son la area y la inoculacin directa, muy por encima de todas las dems, aunque la oral, la percutanea y el contacto directo con la piel o las mucosas tambin son posibles.

Siendo imposible determinar a ciencia cierta si cualquier material biolgico est contaminado con microorganismos del grupo 2 3, ciertas muestras (respiratorias, etc.) en las que sea posible que exista un microorganismo del grupo 3 deben manipularse rutinariamente en las Cabinas de Seguridad Biolgica (CSB).

MEDIDAS GENERALES

Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier rea del laboratorio:

El acceso al laboratorio estar limitado al personal autorizado.

No deben entrar en el mismo familiares ni amigos.

El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de

seguridad.

Todas las reas estarn debidamente marcadas con la seal de riesgo biolgico y su nivel de contencin.

Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contencin biolgica.

Todas las superficies de trabajo se limpiarn y desinfectarn diariamente y siempre que se produzca un derrame. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las normas especficas para cada tipo de residuo.

El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los pasillos como almacn. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a

120 cm para poder evacuar el laboratorio en caso de emergencia.

El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizar de tal manera que, en caso de cada, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas hermticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras debern ser rgidas y resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en su interior y de fcil desinfeccin. Se etiquetarn o identificarn de forma oportuna y no podrn ser utilizadas para otros fines. Bajo ningn concepto se deben transportar las muestras a mano.

La ropa protectora, fcilmente ajustable y confortable, as como guantes, gafas, etc. debe estar disponible en todo momento. La ropa protectora de las reas con nivel de contencin 3 (batas) nunca debe ser usada fuera del rea de trabajo y si se quita debe de ser desechada automticamente en una bolsa de material contaminado. Jams debe volver a ser usada.

Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patgenos. Los guantes siempre sern desechados antes de salir del rea de trabajo. Jams se saldr de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se coger el telfono, se tocarn las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc.

Tras quitarse los guantes, se realizar un lavado de manos.

Se usarn gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles.

Se pondr extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculacin y de generacin de aerosoles.

Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Supervisor y al Jefe del Laboratorio y hacerse constar por escrito.

Nadie podr trabajar en el rea de tuberculosis con una prueba de Tuberculina negativa.

Est rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizar pipeteo automtico con material adecuado y cada trabajador ser instruido para manejarlo debidamente.

En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel contaminado es de muy difcil esterilizacin.

No debern usarse lentes de contacto.

El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.

Comer, beber, fumar y aplicarse cosmticos esta formalmente prohibido en el rea de trabajo del laboratorio, as como el almacenamiento de comida o bebida.

El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se usar un jabn antisptico y el secado se realizar con papel.

Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, sern comunicados al responsable de la Seccin correspondiente, as como al Supervisor de Bioseguridad que lo registrar haciendo constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser convenientemente vendados y despus es imprescindible ponerse guantes.

CLASIFICACIN DE LOS AGENTES

BIOLGICOS POR GRUPO DE RIESGO:

Agente biolgico del grupo 1. Se refiere a aqul que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre.

Ejemplos: B. Subtilis, Naegleria, E. coli K 12, Saccharomyces sp.

Agente biolgico del grupo 2.

Es aqul que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.

Ejemplos : Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterias, Shigella sp, Candida sp,

Cryptococcus neoformans.


Aqul que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a l generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.

Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis y bovis, Histoplasma capsulatum, Neisseria meningitidis, Coccidioides inmitis, Chlamydia trachomatis.


Se refiere a aqul que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a l profilaxis o tratamiento eficaz.

Ejemplos: Virus de Lassa, Machupo y bola.

NIVELES DE CONTENCIN

La Seguridad Biolgica se fundamenta en tres elementos:

a. Las tcnicas de laboratorio.

b. El equipo de seguridad ( Barreras primarias)

c. El diseo de las instalaciones internas (Barreras secundarias).

d. El diseo estructural del edificio especializad ( Barrera terciaria )

1. De las tcnicas de laboratorio:

El elemento ms importante para contener los riesgos biolgicos es el seguimiento estricto de las prcticas y tcnicas microbiolgicas. Como parte de estas prcticas est el desarrollo o adopcin por parte de cada laboratorio de un Manual de Seguridad Biolgica en la que se identifican los riesgos que pueda sufrir el personal y que especifique los procedimientos que puedan minimizar esos riesgos.

2. De los equipo de seguridad (barreras primarias):

Tal y como su nombre indica, las llamadas barreras primarias son la primera lnea de defensa cuando se manipulan materiales biolgicos que puedan contener agentes patgenos. El concepto de barrera primaria podra asimilarse a la imagen de una "burbuja" protectora que resulta del encerramiento del material considerado como foco de contaminacin. El ejemplo ms claro de contencin primaria lo constituyen las cabinas de seguridad biolgica.

Cuando no es posible el aislamiento del foco de contaminacin, la actuacin va encaminada a la proteccin del trabajador mediante el empleo de prendas de proteccin personal. En la mayora de las ocasiones se practica la combinacin de ambos tipos de medidas, tal como puede ser el empleo de la cabina junto con guantes y mascarilla. Todo ello sin olvidar que la mxima contencin del riesgo biolgico slo se da cuando, adems, se emplean las tcnicas de trabajo correctas unidas a un diseo del laboratorio acorde con el nivel de riesgo.

Se incluyen en este apartado tanto dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad (por ejemplo, las cabinas de seguridad biolgica), como los elementos de proteccin personal (guantes, mascarillas, batas, calzado, etc). Actualmente existen equipos de proteccin personal ( EPP ) que ofrecen un altsimo grado de proteccin, pero eso no significa que el EPP sea un substituto de una buena prctica de trabajo; La utilizacin de un equipo equivocado crear un riesgo adicional al operario al inspirar en ste un falso sentido de seguridad. El EPP se seleccionar en funcin del mximo nivel de riesgo que se espera encontrar al desarrollar la actividad

3. Del diseo y construccin de las instalaciones (barreras secundarias):

La magnitud de las barreras secundarias depender del tipo de agente infeccioso que

se manipule en el laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separacin de las zonas

donde tiene acceso el pblico, la disponibilidad de sistemas de descontaminacin

(autoclaves), el filtrado del aire de salida al exterior, el flujo de aire direccional, etc.

El diseo y construccin de un laboratorio (lo que en Seguridad Biolgica se conoce como "barreras secundarias") contribuye a la proteccin del propio personal del laboratorio, proporciona una barrera para proteger a las personas que se localizan fuera del laboratorio (es decir, aqullas que no estn en contacto con los materiales biolgicos como, por ejemplo, personal administrativo del laboratorio, enfermos y visitantes del Hospital) y protege a las personas de la comunidad frente a posibles escapes accidentales de agentes infecciosos.

Las exigencias de cada nivel de contencin se han enumerado ya, pasando ahora a comentar con ms detalle algunas de ellas, junto con otras consideraciones que, si bien no son obligatorias por ley, s deberan ser tenidas en cuenta a la hora de la evaluacin del riesgo.

a) Localizacin. Es aconsejable que el Laboratorio de Microbiologa Clnica se localice fuera del trfico del Hospital y que no sea un lugar de paso para otras dependencias en las que no exista restriccin para su acceso (cafeteras, almacenes, bibliotecas, aparcamientos).

b) Acceso de personal. En general, debe ser restringido a las personas formadas para el manejo de agentes infecciosos. Para un nivel 2 de contencin es suficiente que la puerta del laboratorio pueda cerrarse con llave, mientras que para el nivel 3 la puerta ha de ser doble adems de recomendarse un cambio de ropa.

c) Lavamano. Debe existir uno en el mismo laboratorio. Estar dotado de grifos que puedan accionarse sin utilizar las manos y situado preferiblemente cerca de la puerta de salida.

d) Lavaojos. Se recomienda que exista uno dentro del laboratorio como equipo de emergencia.

e) Superficies interiores. Los suelos, paredes y techos deben ser impermeables al agua y resistentes a diferentes productos qumicos, de forma que permitan una limpieza a fondo y una posterior descontaminacin. En el nivel 3 de contencin, adems, todas las penetraciones deben ir selladas.

f) Superficies de trabajo. Las mesas y bancos de trabajo deben ser resistentes al calor moderado, a disolventes orgnicos, cidos y lcalis.

g) Sealizacin. Siempre que el trabajo est en marcha, debe colocarse en la puerta del laboratorio la seal reglamentaria de peligro biolgico.

h) Presin negativa. Se recomienda que el laboratorio se mantenga a una presin negativa con respecto al exterior del mismo, es decir, con respecto a los pasillos u otras zonas del edificio, de manera que exista un flujo de aire desde las zonas menos contaminadas hacia las de mayor riesgo de contaminacin. Las puertas y ventanas del laboratorio han de permanecer cerradas si se quiere mantener esa presin negativa. No es aconsejable la recirculacin de aire.

i) Filtros HEPA. No existe legislacin en Espaa en cuanto a sistema y frecuencia para su comprobacin pero, siguiendo directrices de otros pases, parece aconsejable hacerla cada 6 meses o, al menos, no dejar pasar ms de 14 meses. Deber realizarla siempre una empresa especializada.

j) Residuos. Adems de la normativa general que el Hospital establezca, en funcin de la legislacin vigente, en materia de residuos biosanitarios, en un nivel 3 se recomienda que en el mismo laboratorio (o dentro de la instalacin) exista algn sistema (por ejemplo, esterilizacin por autoclave) para el tratamiento de los residuos producidos. De no ser as, el transporte de estos residuos ha de realizarse en envases sellados (ver ms adelante el apartado especfico).

a. Adiciones al Nivel 4 de contencin. Las caractersticas de diseo enumeradas se hacen obligatorias en el caso del nivel 4 de contencin, adems de otras, como el empleo de cabinas de clase III (o equipo de proteccin similar para los operarios), filtro HEPA a la entrada del aire, doble filtro HEPA a la salida del aire, etc.

CARACTERSTICA DE LOS NIVELES DE CONTENCIN:El primer principio de Bioseguridad, es la contencin. El trmino contencin se refiere a una serie de a serie de mtodos seguros en el manejo de agentes infecciosos en el laboratorio.

El trmino "contencin" se emplea para describir los mtodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. El propsito de la contencin es reducir al mnimo la exposicin del personal de los laboratorios, otras personas y el entorno a agentes potencialmente peligrosos.

Se suelen describir cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten en la combinacin, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biolgica descritos: tcnica microbiolgica, equipo de seguridad y diseo de la instalacin. Cada combinacin est especficamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vas de transmisin de los agentes infecciosos y la funcin o actividad del laboratorio.

a) Nivel de contencin 1:

Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biolgicos del grupo 1, es decir, los que no producen enfermedad en el ser humano sano y de susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prcticas de universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patgenas (E. coli K12, B. Subtilis, Naegleria sp, Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos tpicos son todos los microorganismos que se utilizan en la industria de la alimentacin para la elaboracin de quesos, cerveza, embutidos, etc.

b) Nivel de contencin 2 :

Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar patologa infecciosa humana de gravedad moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado (tcnicos de laboratorio, especialistas en Microbiologa) y son los que con ms frecuencia se estudian en el Laboratorio de Microbiologa Clnica: Estafilococos, Salmonella, Toxoplasma, Hepatitis B , etc.

c) Nivel de contencin 3:

Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del grupo 3, microorganismos que cursan con patologa grave, de difcil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y capaces de producir la muerte. El mayor y ms frecuente peligro que entraan stos es la infeccin adquirida a travs de aerosoles y por fluidos biolgicos. Por ello, las principales medidas a tomar en este caso son la correcta manipulacin y la utilizacin de cabinas de seguridad. En los Laboratorios de Microbiologa Clnica los ejemplos ms tpicos de este tipo de microorganismos son M. tuberculosis, Brucella, Coxiella burneti, St. Louis virus, etc. Slo pueden ser procesados por personal calificado y en una zona con la infraestructura recirculacin de aire, con gradiente de presin, cabinas de bioseguridad, etc. apropiada para

el Nivel de Contencin 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculacin de aire, con gradiente de presin, cabinas de seguridad, etc.

d) Nivel de contencin 4:

Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha un agente especialmente patgeno e infectocontagioso, extico o no, que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento y/o es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Este nivel tambin puede utilizarse para trabajar con animales de experimentacin infectados por microorganismos del grupo 4. Ejemplos de este nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virus bola, etc. Adems, deben incluirse en este nivel de contencin los microorganismos propios del grupo 3 que adquieran propiedades patgenas que los eleven al grupo 4. Un ejemplo sera Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso teraputico.

Las cabinas de seguridad clase III y los trajes de presin positiva, que suministran aire a cuerpo completo o trajes de presin positiva, suministrados de aire y de cuerpo son necesarios cundo se trabajar con agentes del nivel 4. Adems, de las facilidades de aislamientos, se requiere ventilacin especializada, y un sistemas especial de administracin de desecho.

En general, la naturaleza infecciosa del material clnico es desconocida y al Laboratorio de Microbiologa suelen remitirse muestras muy diversas. Excepto en casos excepcionales (por ejemplo: sospecha de fiebres hemorrgicas), el procesamiento inicial de los especmenes clnicos y las pruebas serolgicas pueden realizarse de forma segura en un nivel 2, que es el nivel recomendado para trabajar con patgenos que se transmiten por va sangunea como el virus de la hepatitis B y el VIH, a lo que habra que aadir las precauciones universales que deben ser tomadas con todas las muestras de sangre y otros materiales potencialmente infecciosos.

Los laboratorios que realicen trabajos que impliquen la manipulacin de agentes biolgicos de los grupos 2, 3 4 con fines de investigacin, desarrollo, enseanza o diagnstico debern establecer medidas de contencin que se aplicaran segn la naturaleza de las actividades, la evaluacin del riesgo para los trabajadores y las caractersticas del agente biolgico de que se trate.

MEDIDAS DE CONTENCIN SEGN NIVELES DE SEGURIDADMedidas de contencin

Medidas de contencin234

1. El lugar de trabajo se encontrar separado de toda actividad que se desarrolle en el mismo edificioNoAconsejableS

2. El aire introducido y extrado del lugar de trabajo se filtrar mediante la utilizacin de filtros de alta eficacia para partculas en el aire (HEPA) o de forma similarNoS, para la salida de aireS, para la entrada y salida de aire

3. Solamente se permitir el acceso al personal designadoAconsejableSS, con esclusa de aire

4. El lugar de trabajo deber poder cerrarse hermticamente para permitir su desinfeccinNoAconsejableS

5. Procedimientos de desinfeccin especficosSSS

6. El lugar de trabajo se mantendr con una presin negativa respecto a la presin atmosfricaNoAconsejableS

7. Control eficiente de vectores, por ejemplo, roedores e insectosAconsejableSS

8. Superficies impermeables al agua y de fcil limpiezaS, para banco de pruebas y mesa de trabajoS, para banco de pruebas, mesa de trabajo y sueloS, para banco de pruebas, mesa de trabajo, suelo, paredes y techos

9. Superficies resistentes a cidos, lcalis, disolventes y desinfectantesAconsejableSS

10. Almacenamiento de seguridad para agentes biolgicosSSS, almacenamiento seguro

11. Se instalar una ventanilla de observacin o un dispositivo alternativo en las zonas de manera que se pueda ver a sus ocupantesAconsejableAconsejableS

12. Laboratorio con equipo propioNoAconsejableS

13. El material infectado, animales incluidos, deber manejarse en una cabina de seguridad biolgica o en un aislador u otra contencin apropiadaCuando procedaSi, cuando la infeccin se propague por el aireS

14. Incinerador para destruccin de animales muertosAconsejableS, disponibleS, en el mismo lugar

LAS CABINAS DE SEGURIDAD:

Son cmaras de circulacin forzada que, segn sus especificaciones y diseo, proporcionan diferentes niveles de proteccin. Son fundamentales en un Laboratorio de Microbiologa Clnica y se clasifican segn el nivel y tipo de proteccin.

Una Cabina de Seguridad Biolgica es una barrera primaria cuando se trabaja con agentes peligrosos o infecciosos, sin embargo ellas no proveeen un completo aislamiento, por ejemplo en el control de aerosoles. Es necesario incrementar las practicas de seguridad cuando se trabaja con una de stas cabinas.

En principio es necesario distinguir entre las campanas de extraccin de gases, las cabinas de flujo laminar y las cabinas de Seguridad Biolgica.

La campana de gases (o vitrina extractora de gases) es un recinto ventilado que captura los humos y vapores procedentes de la manipulacin de los productos qumicos en el laboratorio. Si bien constituye un equipo muy til en la contencin del riesgo qumico, no ofrece proteccin alguna frente a riesgos biolgicos.

Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a travs de un filtro HEPA barriendo la superficie de trabajo. El flujo de aire puede ser vertical u horizontal. Estas cabinas ofrecen proteccin nicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca al operador, por lo que no son recomendables para el trabajo en un Laboratorio de Microbiologa Clnica. Son, sin embargo, un instrumento de trabajo imprescindible en las denominadas "zonas limpias".

Las cabinas de Seguridad Biolgica (CSB ) son recintos ventilados diseados para limitar al mximo el riesgo del personal de laboratorio expuesto a agentes infecciosos. Ello es especialmente importante si se tiene en cuenta que muchas de las operaciones realizadas en un laboratorio implican la formacin de aerosoles. Estos equipos tienen como objetivo principal proporcionar una zona de trabajo que minimice la probabilidad que una partcula transportada por el aire tiene de escapar hacia el exterior de la cabina y contaminar as al operario y a la zona que le rodea. Adems, algunas de ellas, ofrecen proteccin al material que se manipula.

La capacidad de las cabinas de seguridad para proteger al personal y el ambiente de una exposicin potencialmente peligrosa, especialmente por aerosoles, depende principalmente del apropiado funcionamiento de la cabina. Ninguna cabina debe ser utilizada en el manejo de microorganismos peligrosos, a menos que se demuestre por exmenes apropiados, que la misma cumple con las mnimas especificaciones de seguridad.

Cuando una CSB es utilizada por personal debidamente formado y consciente de la Limitaciones de sta, se convierte en un equipo de contencin muy efectivo para reducir el posible escape de contaminacin biolgica. Sin embargo, es conveniente tener muy en cuenta que una cabina no es nunca un substituto de una tcnica microbiolgica adecuada.

LOS FILTROS HEPA:Las CSB disponen de dos sistemas que impiden la salida de contaminacin: las barreras de aire y los filtros. Las barreras de aire se crean permitiendo que ste fluya en una sola direccin y a una velocidad constante dando lugar a una verdadera "cortina" de aire que se conoce como flujo de aire laminar. Es, por definicin, un flujo con ausencia de turbulencias. Los filtros HEPA (acrnimo del trmino High Efficiency Particulate Air) , hechos generalmente de lminas de fibras de borosilicato, tienen como finalidad atrapar las partculas contenidas en este flujo de aire y los empleados habitualmente son los HEPA, que retienen con una eficacia del 99,97% partculas de hasta 0,3 micras de dimetro o ms.

NORMAS DE SEGURIDAD EN LA UTILIZACIN DE EQUIPOS

1. NORMAS GENERALES

Los equipos y aparatos nunca deben colocarse en zonas de paso, en particular en los pasillos del laboratorio.

Todos los aparatos con toma elctrica debern cumplir las normativas de seguridad correspondientes. Nunca deben utilizarse en zonas mal aisladas y expuestas a la humedad.

Las fuentes de calor (calentadores, termobloques, etc.), sobre todo si se alcanzan temperaturas elevadas, debern estar debidamente sealizadas para evitar quemaduras accidentales.

Todos los procedimientos de utilizacin de aparatos deberan contar obligatoriamente con apartados relativos a su utilizacin segura.

2. NEVERAS

Un adecuado mantenimiento, limpieza y desinfeccin sistemticos de los aparatos reduce considerablemente los riesgos asociados a su utilizacin. Sin embargo, aun en estas condiciones, hay que tener en cuenta lo siguiente:

No deben almacenarse cultivos de microorganismos patgenos por inhalacin en recipientes que no estn convenientemente cerrados, especialmente si la cmara tiene un sistema de circulacin de aire.

No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos voltiles inflamables (ter etlico, por ejemplo) en neveras que no posean un sistema de proteccin antideflagracin. En los aparatos de tipo domstico que se utilizan en el laboratorio debe anularse la lmpara de la luz.

3. CONGELADORES

La congelacin es un proceso que mantiene la viabilidad de muchos agentes infecciosos, de ah un potencial riesgo y las siguientes recomendaciones:

Tratar de identificar en ficheros, listas, etc. el contenido de lo almacenado y sus riesgos potenciales.

El material potencialmente infeccioso debe colocarse en tubos, recipientes, etc. bien cerrados. No se llenarn completamente, para evitar que rebosen por efecto del aumento de volumen tras la congelacin.

Descongelar peridicamente, limpiar y desinfectar si fuese procedente.

Utilizar guantes para manipular el contenido. Si la temperatura es baja (por ejemplo -70 C o inferior), los guantes representan una proteccin adicional.

4. INCUBADORAS

La limpieza y la desinfeccin, peridicas y sistemticas, son el mtodo recomendable para reducir los riesgos derivados de la contaminacin accidental del personal del laboratorio.

5. MICROONDAS

Los microondas cada vez son ms populares en el Laboratorio de Microbiologa y constituyen una nueva fuente de accidentes, entre los ms frecuentes las explosiones cuando se usan para calentar medios con agar, ya que la diferencia de velocidad de calentamiento produce burbujas que pueden estallar.

Las botellas o matraces deben tener el tapn aflojado, ya que si est cerrado estallan fcilmente.

Estar siempre presente, con la ropa y pantalla facial adecuadas, y controlar la intensidad del aparato, que slo puede ser la mxima con agua y la mnima si se usa con agar.

Deber existir una tabla bien visible de los tiempos en cada posicin del potencimetro y de las cantidades a emplear.

Los microondas interfieren con los marcapasos. No deben ser colocados a una distancia inferior a 2 m de las personas que sean portadoras de uno de estos dispositivos.

6. AUTOCLAVES

Los autoclaves deben poseer manmetro y termostato, as como vlvula de seguridad, sistema de desconexin rpido y la purga del vapor ha de realizarse a un recipiente estanco y con agua, jams directamente al exterior.

No deben usarse si no se conocen perfectamente todos los mandos y su fundamento.

Usar guantes especiales para protegerse del calor.

No abrir jams si el manmetro no est a "0" y la purga no ha sido abierta.

Controlar una vez al mes su capacidad de desinfeccin mediante esporas, no siendo suficiente el mtodo qumico. El uso de registros de presin y temperatura de cada proceso y la instauracin de un programa de mantenimiento tambin puede ser una alternativa vlida al control mediante esporas. El agua debe ser cambiada regularmente.

7. CENTRFUGAS

Los mayores riesgos derivan, sobre todo, de la contaminacin por los aerosoles generados durante la centrifugacin de materiales biolgicos y, en menor medida, de los traumatismos accidentales. Se recomienda:

Cuando se centrifugue material biolgico potencialmente infeccioso deben utilizarse tubos cerrados; la centrfuga debe disponer de rotores o cestillos de seguridad que protejan al operador de los posibles aerosoles.

La rotura accidental de un tubo y su vertido en la cubeta representa una incidencia importante que debe ser comunicada inmediatamente al Supervisor o responsable, de forma que se proceda a la desinfeccin segura del aparato

No se deben utilizar centrfugas antiguas que no posean sistema de cierre de seguridad, del que disponen todos los aparatos actuales, ni manipular stas de forma que permitan su apertura mientras estn en funcionamiento.

Si el laboratorio dispone de ultracentrfuga, el equilibrado cuidadoso del rotor es fundamental.

PLAN DE EMERGENCIAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Los riesgos en el Laboratorio de Microbiologa se dividen en riesgos no biolgicos, comunes a otros laboratorios, y riesgos biolgicos o especficos. Los no biolgicos pueden ser qumicos, fsicos, elctricos o fuego. Entre los riesgos biolgicos no se hace referencia a las infecciones adquiridas en el laboratorio, ya que la mayora son un proceso que pasa inadvertido. La exposicin se centrar en la actuacin cuando se produce un accidente. Lo ms importante ante un accidente en el laboratorio es tenerlo previsto, simular uno como mnimo una vez al ao, discutir las medidas a tomar y sacar las conclusiones pertinentes; en definitiva no dejar nada a la improvisacin y disponer del material necesario para actuar. Es recomendable contar con Estaciones de Seguridad, del mismo modo que existen los extintores. El Supervisor de Seguridad llevar un registro de accidentes, donde se anotarn todos lo detalles del percance, as como las medidas practicadas, las personas involucradas en el accidente y los procedimientos de actuacin.

Los accidentes biolgicos se producen generalmente por: 1. Inoculacin accidental. 2. Heridas causadas por animales de laboratorio. 3. Ingesta accidental. 4. Derrames y salpicaduras: Derrames en la recepcin de muestras. Salpicaduras en cara y ojos. Salpicaduras y contacto directo. Salpicaduras en la superficie de trabajo. Salpicaduras fuera de la zona de trabajo. 5. Aerosoles. 6. Por el aire. 7. Deliberados y de origen desconocido.

En el laboratorio de microbiologa los accidentes potencialmente ms frecuentes son las heridas causadas por objetos punzantes o cortantes (pinchazo y herida sangrante). En este caso se debern aplicar las medidas bien detalladas en los Protocolos de actuacin despus de una exposicin accidental a productos biolgicos probablemente contaminados descritos en el Manual de Salud Ocupacional.Las centrfugas actuales tienen mecanismos bsicos de seguridad, pero no es infrecuente encontrar todava algunas que, debido a lo antiguo de su diseo, permiten ser abiertas antes de su parada completa, hecho inaceptable con las normativas actuales. As pues se pueden producir accidentes al frenarlas manualmente, con el consiguiente riesgo de lesin por la enorme fuerza centrfuga de las mismas.El manejo y transporte de las bombonas de gases debe ser realizado por personal especializado. Estarn bien ancladas para evitar que se caigan. En general, no debe utilizarse la luz UV porque no es esterilizante, sino slo descontaminante y produce una falsa sensacin de seguridad. En la CSB no se puede trabajar con ella encendida ya que puede dar lugar a una quemadura corneal tremendamente dolorosa. Si ello ocurre, se consultar con el Servicio de Oftalmologa.

Las quemaduras por vapor procedente de las autoclaves, as como las producidas por salpicaduras de los microondas, se tratarn tpicamente.

1. DERRAMES Y SALPICADURAS

Es uno de los apartados ms importantes por su frecuencia y porque las medidas a tomar son responsabilidad exclusiva del Laboratorio de Microbiologa y bajo ningn concepto del personal de limpieza. El procedimiento empleado, bien protocolizado, debe estar contemplado en el Manual de Seguridad. Los derrames y salpicaduras pueden ser de muchos tipos: por prdida de los diferentes envases, generalmente porque estn mal cerrados (ya que se supone que son los adecuados), por rotura de los mismos, vuelco, etc. y son muy frecuentes en la zona de recepcin de muestras. Para actuar correctamente son muy recomendables las Estaciones de Seguridad.

Lavado. Primero se eliminan los restos groseros de cristal, plstico, agar, etc., despus se lava con abundante agua y un detergente acuoso y a continuacin se inicia la desinfeccin. Hay que tener en cuenta que cualquier sustancia orgnica (agar sangre, restos de peptona,

etc.) Es extraordinariamente bloqueante de la capacidad oxidativa del hipoclorito sdico y de la capacidad de actuacin de los iodforos; por ello, la norma es primero limpiar y despus desinfectar.

Desinfeccin. Se emplear un desinfectante preferentemente lquido. Los ms tiles en el laboratorio son: 1. Hipoclorito sdico. De eleccin para suelos, cermica, etc. No debe usarse en superficies metlicas. Se utiliza a la dilucin pertinente para conseguir 50000 p.p.m. de cloro libre. Se vierte haciendo un crculo alrededor del derrame, o mejor sobre papel absorbente, y se deja actuar 20 minutos. 2. Iodforo. Se utiliza a la dilucin indicada por el fabricante. Adecuado en superficies metlicas. 3. Alcohol etlico al 70%. 4. Productos detergentes desinfectantes. Agentes como Virkon (perxido tamponado con surfactante), de fcil manejo, no corrosivo, no irritante, especialmente activo en presencia de materia orgnica y que cambia de color cuando deja de ser activo.

2. Tubos rotos dentro de la centrfuga

Se exigir siempre la presencia del Supervisor de Seguridad. En ocasiones se puede detectar el accidente antes de abrir la centrfuga, si se ha estado presente durante el proceso de centrifugacin, por el cambio de ruido en el funcionamiento de la mquina. Como esto no siempre sucede, deber existir un entrenamiento para cuando se observe el accidente al abrir la centrfuga: cerrar la centrfuga y hacer salir inmediatamente a todo el personal prescindible del rea. Vestirse como en el caso de las salpicaduras (el aerosol puede ser importante), cerrar la habitacin y:

1. Desinfectar la centrfuga por fuera.

2. Esperar 20 m.

3. Abrir la centrfuga muy suavemente.

4. Colocar todas las muestras no rotas en una gradilla o recipiente hermtico (bolsa de autoclave) y llevarlas a una CSB para manipularlas all.

5. Limpiar, sacar los restos con guantes adecuados y meterlos en bolsas de autoclave o de tipo III. Llevar las cubetas o cestillos con Virkon y el rotor, si es posible, al autoclave.

6. Desinfectar la centrfuga por dentro con iodforo o Virkon y dejar actuar 20 m.

7. Limpiar la cuba con alcohol etlico al 70%.

3. AEROSOLES

Los aerosoles son la causa ms frecuente e importante de accidente biolgico y su origen es muy variado. Muchas veces pasan inadvertidos, por lo que siempre hay que dar por hecho que existen cuando se producen derrames o salpicaduras.

La mala prctica es la fuente ms comn de los aerosoles: enfriar asas calientes hundindolas en el agar, utilizar centrfugas no hermticas, centrifugar con tubos abiertos o mal cerrados, agitar cultivos con el asa dentro del tubo, pipetear con demasiada fuerza, oler las placas, etc.

Las medidas a tomar para evitar los aerosoles son cambiar los hbitos. Deben anotarse todos los incidentes y decidir con el Supervisor de Seguridad si se toman medidas de profilaxis sobre la supuesta contaminacin. En accidentes en los que se presume la formacin de aerosol, proceder siempre con proteccin del aparato respiratorio.

ELIMINACIN DE LOS RESIDUOS PELIGROSOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Todo Laboratorio de Microbiologa debera elaborar un manual o protocolo para la gestin de estos residuos, siguiendo las directrices generales contenidas en el Plan de Residuos de cada institucin. Esta recomendacin puede ser norma obligada en el caso de que el laboratorio pretenda certificarse o acreditarse. Entre los diferentes aspectos que debe contener dicho manual se pueden citar los siguientes:

Estrategias de minimizacin de los residuos, incluyendo la reduccin en origen.

Segregacin de los residuos infecciosos de los no infecciosos.

Identificacin y tipificacin de los residuos infecciosos y su riesgo relativo.

Normas de sealizacin, rotulacin, almacenamiento y transporte.

Plan de formacin de todas las personas expuestas a estos residuos.

Normas de actuacin en caso de vertidos o roturas accidentales.

Plan de contingencia ante el fallo de las medidas de contencin habituales.

MANIPULACIN DE LOS RESIDUOS INFECCIOSOS

a) Residuos lquidos

La sangre, lquidos orgnicos, secreciones, etc. pueden eliminarse directamente por el desage con agua abundante, segn aceptan diversas reglamentaciones especficas y los manuales generales. Por lo que se refiere a los lquidos infecciosos que genera el propio laboratorio, como los sobrenadante de los cultivos, etc., es aconsejable recogerlos en un recipiente que contenga una solucin de hipoclorito sdico recin preparada. Debe calcularse el volumen mximo aceptable para asegurar la eficacia del desinfectante. Luego podran ser eliminados por los desages. No obstante, muchos laboratorios someten a los residuos lquidos, sangre incluida, a un tratamiento en el autoclave, lo que es de mayor importancia si se trata de residuos procedentes de las reas de micobacteriologa o virologa.

b) Residuos slidos

Las formas ms frecuentes de tratamiento de los residuos slidos son la incineracin y la esterilizacin por autoclave. Por lo que respecta a la incineracin realizada en los propios hospitales, es una actividad cada vez ms restringida, debido a la contaminacin que origina en las zonas urbanas donde estn implantados. Ms frecuente es transferir los residuos a empresas autorizadas, lo que debe hacerse en recipientes rgidos que debern ser transportados de forma regulada.

La esterilizacin en autoclave es la manera ms comn de tratar este tipo de residuos en el propio laboratorio que los genera. Hay que asegurarse que el ciclo del autoclave permite la esterilizacin en toda la masa de los residuos. Los programas para materiales limpios no sirven para los desechos, siendo aconsejable prolongar el tiempo y aumentar la presin del proceso de autoclavado. La utilizacin de indicadores qumicos no es suficiente para el control de la eficacia, que depender del tipo de material, volumen, etc. Las suspensiones de esporas de Bacillus tampoco pueden asegurar en todas las circunstancias que el tratamiento trmico es suficiente en las zonas ms internas de la masa de material a esterilizar, pues muchas veces no pueden ser colocadas en el lugar que sera apropiado. Algunos expertos recomiendan no utilizarlas, para evitar una falsa seguridad; alternativamente, consideran ms apropiado el control riguroso sistemtico en cada proceso (por ejemplo, registros de presin y temperatura) y el mantenimiento apropiado del autoclave.

Para una explicacin ms detallada sobre las medidas de seguridad en el descarte de material contaminado, recomendamos las Normas sobre el tema del Manual de Bioseguridad del laboratorio clnico.

ALMACENAMIENTO, TRANSPORTE Y ENVO DE MATERIAL BIOLGICO

1. ALMACENAMIENTO

El material infeccioso debera almacenarse en zonas de acceso restringido para minimizar la posibilidad de contaminacin del personal o el ambiente. El almacenamiento de material en congeladores, especialmente en los de nitrgeno lquido, presenta una problemtica especial. Debido a las bajas temperaturas, si los viales que se utilizan para el envasado no son de la calidad adecuada, pueden romperse, originando el derrame del material en el nitrgeno lquido, con la consiguiente contaminacin del recipiente. En el caso de que esto ocurra debe vaciarse el recipiente, dejar que el nitrgeno lquido se evapore y proceder a su limpieza y desinfeccin. Asimismo, cuando se maneja el material almacenado en este tipo de contenedores de congelacin, siempre se debern utilizar gafas o mascarillas de proteccin para evitar salpicaduras del nitrgeno lquido.

2. TRANSPORTE Y ENVO

No existen regulaciones o recomendaciones especficas para el transporte seguro de microorganismos patgenos, genticamente modificados o no. Sin embargo, si ampliamos la definicin de estos organismos y los consideramos como "mercancas peligrosas" o "sustancias infecciosas", hay varios documentos internacionales relacionados con el tema, como los de la Unin Postal Universal (UPU), la Organizacin Internacional de Aviacin (OIAC) y la Asociacin Internacional de Transporte Areo (IATA).

A nivel europeo se han publicado, o van a ser publicadas prximamente, varias Directivas sobre la normativa para el transporte de mercancas peligrosas en/entre los Estados Miembros. Estas Directivas, y en general todos los documentos internacionales relacionados, estn basadas en un texto nico comn, las Recomendaciones del Comit de Expertos de las Naciones Unidas para el Transporte de Artculos Peligrosos (UN).

Estas recomendaciones clasifican las mercancas peligrosas en varias clases, dos de las cuales estn relacionadas con los microorganismos patgenos, genticamente modificados o no: clase 6.2 (substancias infecciosas) y clase 9 (substancias peligrosas miscelneas y artculos). En la clase 6.2 estn incluidas las substancias que contienen, o razonablemente se espera que contengan, microorganismos viables, incluyendo bacterias, virus, rickettsias, parsitos, hongos, recombinantes hbridos o mutantes, de los que se conoce o razonablemente se cree que pueden producir enfermedad en humanos o animales expuestos a ellos.

En la clase 9 se incluyen microorganismos modificados, no peligrosos para humanos o animales, pero que podran dar lugar a cambios en animales, plantas, substancias microbiolgicas, as como en el ecosistema. Tambin se incluyen microorganismos peligrosos para el ambiente, los cuales deben de ser transportados en condiciones especificadas por las autoridades competentes del pas de origen.

Sistema bsico de embalaje. De una manera general, para el embalaje y transporte de material biolgico y teniendo en cuenta las peculiaridades en funcin de los microorganismos, un sistema bsico de embalaje se compone de:

Recipiente primario estanco, a prueba de filtraciones, etiquetado, que contiene la muestra. El recipiente debe envolverse en material absorbente.

Recipiente secundario estanco, a prueba de filtraciones, que encierra y protege el recipiente primario. Se pueden colocar varios recipientes primarios envueltos en un recipiente secundario. Se debe usar suficiente material absorbente para proteger a todos los recipientes primarios y evitar choques entre ellos.

Recipiente externo de envo. El recipiente secundario se coloca en un paquete de envo que protege al recipiente secundario y su contenido de los elementos externos, tales como dao fsico y agua. Los formularios con datos, cartas y otras informaciones de identificacin de la muestra deben colocarse pegados con cinta adhesiva en el exterior del recipiente secundario.

La Gua para el transporte de substancias infecciosas y especimenes diagnsticos, publicada por la OMS en 1997, permite un conocimiento detallado de los requerimientos especficos para las diferentes situaciones que se pueden plantear ante el envo de cualquier tipo de material biolgico, algunos de los cuales se exponen a continuacin:

1. Cantidad de substancias infecciosas que pueden enviarse en un paquete.

2. Tipos de etiquetas de riesgo para substancias infecciosas y para microorganismos genticamente modificados.

3. Tipos de etiquetas de riesgo para microorganismos no infecciosos.

4. Etiquetas para envo con dixido de carbono (hielo seco).

5. Informacin que debe figurar en la etiqueta.

6. Normas para envo con refrigerantes (dixido de carbono y nitrgeno lquido).

7. Ejemplos de formato de los documentos de envo (los originales pueden obtenerse de la compaa transportadora).

En los vuelos internacionales est estrictamente prohibido que los pasajeros transporten substancias infecciosas con ellos o en su equipaje de mano. Igualmente est prohibida la utilizacin del correo diplomtico para el transporte de este tipo de material.

Otras posibilidades de transporte de material biolgico incluyen el traslado de muestras dentro de un hospital o centro, de un laboratorio a otro, de un hospital a otro de la misma ciudad o a otra ciudad. Los principios en los que se basa un transporte seguro son los mismos en todos los casos y su finalidad es que la muestra no tenga ninguna posibilidad de salirse del embalaje en las circunstancias normales de transporte.

El transporte de material biolgico requiere una buena colaboracin entre el remitente, la compaa de transporte y el destinatario, y cada uno debe asumir sus responsabilidades para garantizar que el producto llega a su destino oportunamente y en buenas condiciones.

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICASMANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO

MICROBIOLOGIA GENERAL

RESPONSABLES DE ELABORACIN:

Q.F.B. JOAQUIN AVALOS SOTOQ.B.P. ERNESTO CAMACHO MONTELONGO

UNIDAD 1PRACTICA No. 1

ESTERILIZACIN Y MANEJO DE MATERIAL MICROBIOLGICO.

INTRODUCCIN:

Para estudiar los microorganismos, o utilizarlos en investigacin de problemas biolgicos, es necesario emplear equipo y tcnicas especiales. El conocimiento sobre la esterilizacin del equipo microbiolgico, los medios y el rea en donde se va a trabajar, es esencial en la mayora de los estudios que involucran microorganismos. Para estudiar microorganismos especficos deben estudiarse libres de cualquier posible interrelacin con otros; por lo tanto, todos los organismos extraos presentes, ya sea en los medios o en el equipo, deben eliminarse.

La esterilizacin con vapor es el mtodo ms comn para eliminar a los microorganismos extraos; sin embargo en lugares donde las condiciones lo demandan deben usarse sustancias qumicas, gases o filtracin con el mismo propsito.

OBJETIVO:

Aplicar el mtodo de la esterilizacin con vapor en el equipo de microbiologa y establecer los procedimientos precautorios para el manejo de los microorganismos.

MATERIAL:

Papel canelaVaso de precipitado de 600 ml

Cinta testigoGuante de asbesto

Tubos de ensaye 13X100 de tapn de rosca

Cajas de Petri

Pipetas de 5 ml y 10 de 1 ml

Autoclave u olla de presin

PROCEDIMIENTO:

ESTERILIZACIN CON VAPOR:

Autoclave.- Para esterilizar, generalmente se usa vapor de agua, a 15 libras de presin, durante 15 a 20 min. El vapor y la presin crean una temperatura resultante de 121, la cual destruye a la gran mayora de los microorganismos y esporas resistentes. Una olla de presin ordinaria ser un sustituto de una autoclave.

CUESTIONARIO PREVIO:

1.- Define los trminos: asepsia, esterilizacin, antisepsia, desinfeccin y sanitizacin En qu casos se utiliza cada uno?

2.- Menciona al menos cinco sustancias desinfectantes y menciona cmo actan sobre los grmenes.

3.- Cmo se aplica en un laboratorio de anlisis clnicos la NOM 087?

4.- Cmo podemos prevenir una infeccin en el laboratorio? Qu se debe hacer cuando se derrama una cepa bacteriana en el laboratorio?

5.- Cul es la utilidad de la esterilizacin en la prctica de la microbiologa?

PRACTICA No. 2

MEDIOS DE CULTIVO: PREPARACIN Y ENVASE Las bacterias pueden ser clasificadas en auttrofas y hetertrofas; las primeras comprenden las bacterias del suelo y el agua que obtienen carbn y nitrgeno del medio y que producen su propio alimento y el segundo grupo comprende a las bacterias saprfitas y parsitas.

Las bacterias para su cultivo requieren protenas, las cuales se suministran como peptonas preparadas por digestin parcial de carne con enzimas ppticas, los carbohidratos suministran el carbono necesario, otros factores como las vitaminas del complejo B, tambin son requeridos. Para algunas bacterias son necesarios nutrimentos ms complejos como el suero, la sangre, la yema de huevo, etc. Los aerobios obligados precisan de una atmsfera con oxgeno para su desarrollo; los anaerobios son incapaces de reproducirse en presencia de oxgeno; algunos pueden crecer en una atmsfera con oxgeno o sin l son anaerobios facultativos. La temperatura ptima para la mayora de las bacterias patgenas es 37 con lmites entre 15 y 40; y un pH muy cercano al neutro.

Los medios de cultivo bacteriano pueden ser slidos o lquidos, en los primeros crecen y se identifican fcilmente las colonias.

OBJETIVO:

Preparar y envasar los medios de cultivo adecuados para el crecimiento de los microorganismos. Conocer la clasificacin de los medios de cultivo.

MATERIAL:

Balanza granatariaPizeta con agua destilada

Gelatina bacteriolgica, caldo nutritivo, agar nutritivo

4 Matraces de 250 ml

EMB

Mechero, 3 Pipeta de 5 ml, algodn, esptula, cinta testigo

Probeta de 250 ml, agitador, guante de asbesto, papel canela

PROCEDIMIENTO:

1.- Caldo nutritivo. Preparar segn las indicaciones del envase, suficiente caldo para llenar sus tubos (3.5 ml por cada tubo de ensaye).Esterilizar y envasar segn las indicaciones.

2.- Agar nutritivo. Prepara segn las indicaciones del envase. Esterilizar y envasar; preparar suficiente medio para completar tubos de ensaye (3.5 ml) y cajas Petri (15 ml aprox.).

3.- Gelatina bacteriolgica. Preparar segn las indicaciones suficiente medio para llenar sus tubos (3.5 ml por cada tubo). Esterilizar y vaciar.

4.-Eosin-Metil-Blue (EMB). Se prepara segn las indicaciones del envase (15 ml por cada caja Petri).

CUESTIONARIO PREVIO (P2):

1.- Cul es la funcin de los componentes de los medios de cultivo?2.- Menciona los gneros bacterianos que forman parte de la flora corporal normal. A qu se deben los aumentos en la flora y qu problemas nos causan?

3.- Qu son los medios selectivos y diferenciales? , menciona si el EMB (eosin methil-blue) es un medio diferencial selectivo y porqu.

4.- Menciona las partes del cuerpo que estn normalmente fuertemente colonizadas por microorganismos Qu partes se encuentran desprovistas de microorganismos?

5.- Cmo se produce una caries dental? menciona a los gneros bacterianos responsables de la prod. de caries dental.

UNIDAD 2PRACTICA No. 3

METODOS GENERALES DE CULTIVO

Las bacterias necesitan nutrimentos para su crecimiento, desarrollo y sostenimiento. Utilizan una gama muy amplia de dichas sustancias que van desde productos tan simples como sales inorgnicas, anhdrido carbnico y agua hasta mezclas complejas de sangre y extracto de corazn, hgado, cerebro y otros tejidos. Estas sustancias nutritivas proporcionan carbono nitrgeno, minerales y factores de desarrollo, necesarios para la sntesis de los hidratos de carbono, lpidos, protenas, cidos nucleicos y otros constituyentes del protoplasma celular.

Se llama cultivo al proceso de propagar microorganismos brindndoles las condiciones ambientales adecuadas. Los mtodos para siembra ms comnmente usados son en placas (cajas de Petri), cultivo en picadura, cultivo en agar inclinado y en caldo.

OBJETIVO:

Efectuar las diferentes tcnicas de siembra de microorganismos y observar su desarrollo.

MATERIAL:

MICROORGANISMOS:

Asa de platino, cinta Masking

Mechero Bunsen

Cepas bacterianas

Gradilla, lpiz graso

Cajas de Petri con agar

Tubos de ensaye con medios de

gelatina, agar y caldo simple.

PROCEDIMIENTO:

1.- Cultivo en placa (cajas de Petri).- Para realizar sta siembra debe disponerse de mechero, asa de platino, un tubo con medio slido inclinado con el microorganismo por sembrar y una caja de Petri con el medio. Cerca de un mechero con el asa de platino flameada toma una muestra del microorganismo, y en la caja de Petri difunde en forma de estras hasta la zona media de la placa (previamente con un lpiz graso se divide la placa por el exterior en dos zonas). En ste momento, gire 180 e inicie la siembra en el extremo contrario. Tapa la caja de Petri e incuba a 37. Observa a las 24 y 48 hrs.

2.- Cultivo en picadura.- Cerca del mechero, en tubos con medio de gelatina inclinada, siembra las bacterias, con una asa recta, cuidando de que el trayecto de entrada sea el mismo que el de salida. Incuba a 37. Este mtodo puede ser empleado para conservar cultivos puros. Observa y anote resultados.

3.- Cultivo en agar inclinado.- En un tubo con agar inclinado, siembra los diferentes gneros bacterianos (cultivo en estras rectas). Incuba a 37 hasta que haya crecimiento. Observa y anota.

4.-Cultivo en caldo.- Cerca del mechero toma una asada del microorganismo e introducela en el tubo con caldo, mueve el asa para dispersar las bacterias en el medio.


1.- Cules son los requerimientos bsicos y especficos para que una bacteria pueda crecer?

2.- Investiga cules son los mtodos de siembra en bacterias.

3.- Qu es un cultivo axnico?, Cal es la diferencia con un cultivo genticamente puro? PRACTICA No. 4PREPARACIN DE FROTIS BACTERIANO

Las caractersticas morfolgicas de las bacterias se pueden observar utilizando microorganismos ya sea vivos o muertos(fijados), sin embargo, el estudio microscpico de clulas vivas es limitado debido a que en general slo se detectan las configuraciones de contorno de las clulas. Las preparaciones teidas de clulas fijas permiten: 1) realizar un examen ms detallado de las clulas, 2) observar los componentes internos y 3) lograr una diferenciacin de las especies microbianas.

Las sustancias qumicas que se usan comnmente para teir bacterias se conocen con el nombre de colorantes y estas pueden ser de tipo acido o bsico. En microbiologa se utilizan generalmente tres clases de tinciones.a) Tinciones Simples

b) Tinciones Diferenciales

c) Tinciones EspecialesOBJETIVO:

Preparacin de frotis bacterianos y utilizacin de tinciones simples

MATERIAL:

MICROORGANISMOS:

Portaobjetos

Asa bacteriolgica

Cepas bacterianasLpiz graso

Mechero Bunsen

Microscopio

Aceite de inmersin

Tincin de GRAM

PROCEDIMIENTO:

1.- Se usarn portaobjetos limpios.

2.- Coloca una gota de agua sobre el portaobjetos.

3.- Toma una asada del cultivo frente al mechero y colcala sobre el portaobjetos previamente etiquetado.

4.- Deja secar al aire y luego fija la muestra pasando dos o tres veces sobre la llama del mechero Bunsen, marca con el lpiz graso alrededor de donde depositaste la muestra.

5.- Coloca sobre la muestra dos o tres gotas de azul de metileno acuoso por 60 a 90 segundos

6.- Lava con agua de la llave procurando que el agua no pegue directamente en la preparacin

7.- Secar al aire

8.- Examinar 10X, 40X y 100X (aceite de inmersin puede colocarse directamente sobre el frotis)

9. Repetir mismo procedimiento con safranina.


1.- Explique que objetivo tiene el uso de las tinciones y que es un colorante2.- A que se denomina en un colorante Grupo Cromgeno y auxocromico3.- Que factores influyen en una buena preparacin de un frotis bacteriano4.- Escriba la formula qumica de los colorantes azul de metileno y cristal violeta, seala en cada uno de los grupos cromgenos y auxocromicos5.- Explica las teoras fsicas de tincin de los microorganismos y amplia las teoras qumicas de tincin de los mismos6.- Reporta los resultados obtenidos: Morfologa observada, color adquirido con azul de metileno y color adquirido con safraninaUNIDAD 3

PRACTICA No.5

MORFOLOGA DE HONGOS Y LEVADURAS

En general, los hongos se caracterizan por tener estructuras vegetativas que se alargan formando filamentos llamados hifas. Estas se originan a partir de estructuras de reproduccin conocidas como esporas y pueden o no dividirse por estructuras llamadas septos. El entrelazado de las hifas constituye a un micelio el cual se puede ver a simple vista. Este micelio puede ser vegetativo reproductivo (areo).

Las levaduras son organismos unicelulares que carecen de clorofila y presentan formas caractersticas que van de la esfrica a la ovalada.

Son mayores que las bacterias y su estructura interna es ms compleja. Se reproducen por gemacin, ocasionalmente, las clulas hijas no se separan de la madre y forman una estructura llamada pseudomicelio.

OBJETIVO: Demostracin de las caractersticas morfolgicas de los hongos (filamentosos y levaduriformes)MATERIAL:Microscopio

Cultivo de Candida albicans

Asa bacteriolgica

Cultivo de Saccharomyces cereviceae

Cultivos de hongos en pan, tortillas, frutas y vegetales

Bistur

5 portaobjetos y 5 cubreobjetos

Mechero

Pipeta Pasteur

Agitador de vidrio

Masking tape

Azul de metileno

Cristal violeta

Pizeta

Vaso de ppdo de 250 ml PROCEDIMIENTO:

1.- En un vaso de precipitado realiza una preparacin de S. cereviceae hidratando una pequea porcin de levadura de pan.

2.- Elabora preparaciones en fresco de C. albicans y S. cereviceae, colocando una gota de agua, adiciona una gota de la levadura hidratada o del tubo con Candida, aade una gota de colorante cristal violeta o azul de metileno.

3.- Realiza preparaciones de cortes de todos los hongos presentes en los dems cultivos, observa con 40X y elabora esquemas detallados de lo observado.CUESTIONARIO PREVIO:

1.- Investiga los factores que favorecen el establecimiento de las infecciones fngicas.

2.- Enlista cinco aplicaciones comerciales de los hongos.

3.- Menciona cinco tipos de infecciones producidas por hongos y menciona el gnero que los produce

4. Porqu la tincin de Gram no es importante en hongos?PRACTICAS No. 6

DIFERENCIACIN DE GRUPOS DE BACTERIAS (TINCIN DE GRAM)

Las caractersticas morfolgicas de las bacterias se pueden observar utilizando microorganismos ya sea vivos o muertos(fijados), sin embargo, el estudio microscpico de clulas vivas es limitado debido a que en general slo se detectan las configuraciones de contorno de las clulas. Las preparaciones teidas de clulas fijas permiten: 1) realizar un examen ms detallado de las clulas, 2) observar los componentes internos y 3) lograr una diferenciacin de las especies microbianas.

La tincin de Gram se encuentra entre las ms importantes para bacterias. Fue elaborada por el Dans Hans Christian Gram en 1884 y permite distinguir entre diferentes bacterias que pueden mostrar una morfologa similar. Al examen microscpico de un extendido coloreado por el mtodo de Gram que contenga una flora bacteriana mixta, aparecen las caractersticas diferenciales del mtodo. Muchas bacterias habrn conservado la combinacin violeta-yodo y se teirn de prpura (gram-positiva), otras se colorean de rojo por la safranina (gram-negativas). De sta manera, con ste procedimiento no slo se hacen visibles la forma, tamao y otros detalles estructurales, sino que pueden agruparse los microorganismos en los tipos Gram (+) y Gram (-), segn sus reacciones.

OBJETIVO:

Preparacin de frotis bacterianos y aplicar la tincin de Gram en los microorganismos y clasificarlos de acuerdo a su reaccin (+) (-).

MATERIAL:

MICROORGANISMOS:

Portaobjetos

Asa bacteriolgica

Cepas bacterianasLpiz graso

Mechero Bunsen

Microscopio

Aceite de inmersin

Tincin de GRAM

PROCEDIMIENTO:

1.- Se usarn portaobjetos limpios.

2.- Coloca una gota de agua sobre el portaobjetos.

3.- Toma una asada del cultivo frente al mechero y colcala sobre el portaobjetos previamente etiquetado.

4.- Deja secar al aire y luego fija la muestra pasando dos o tres veces sobre la llama del mechero Bunsen, marca con el lpiz graso alrededor de donde depositaste la muestra.

5.- Cubrir los frotis con reactivo de cristal violeta durante un minuto.

6.- Lavar los portaobjetos en una corriente suave de la llave durante 5 segundos.

7.- A continuacin, lavar los frotis con reactivo de yodo y luego aplicar el mismo reactivo durante un minuto.

8.- Lavar como se indic en el paso 3.

9.- Aplicar lentamente el reactivo de alcohol-acetona y seguir agregando hasta que la tintura de yodo ya no fluya del frotis.(el ndice de la decoloracin depende de varios factores que incluyen la concentracin del alcohol, el espesor del frotis y el hecho de si est hmedo o seco)

10.- Lavar inmediatamente como se hizo en el paso 3.

11.- Cubrir el frotis con reactivo de safranina durante 1 minuto.

12.- Lavar y secar presionando levemente con una toalla de papel haciendo descansar el frotis sobre la mesa. Oprimir lentamente sin tallar.

13.- Observar cada frotis en 100X con el aceite de inmersin.

14.- Dibujar y colorear la morfologa de cada espcimen en la seccin de resultados y observaciones.

RESULTADOS:

MICROORGANISMOMORFOLOGATIPO DE GRAMCOLOR FINAL


1.- Qu se necesita para preparar un buen frotis bacteriano?

2.- Adems del color adquirido, menciona otras caractersticas que se pueden observar en el microscopio

3.- En diagnstico clnico Qu aplicacin tiene la tincin de Gram.?

4.- Explica en que se basa el proceso qumico de la tincin de Gram.

5.- Cmo se preparan los colorantes Gram?

6.- Investiga qu son las pruebas preliminares o primarias para la identificacin bacteriana (explica cada una).

UNIDAD 4PRACTICA No 7

TECNICAS DE AISLAMIENTO

La identificacin exacta de muchas bacterias se hace utilizando cultivos puros, ya que las caractersticas empleadas para clasificarlas depende de la actividad de la poblacin y no de las clulas individuales, aun cuando algunas propiedades bacterianas cambien cuando se toman los microorganismos de su medio natural y se cultivan en el laboratorio. La realidad es que la clasificacin suele basarse en las propiedades de bacterias en cultivos de laboratorio.

El aislamiento de un cultivo puro se lleva a cabo tomando en cuenta las caractersticas especificas de los microorganismos por aislar; por ejemplo, si se desea obtener en forma pura una bacteria esporogena se calentara a 58C y se tratara con algn desinfectante adecuado que destruya todas las clulas excepto las esporas. Al hacer la siembra se obtendr fcilmente el crecimiento de la bacteria esporogenaOBJETIVO:

Aislar e identificar microorganismos en medios nutritivos adecuados.

MATERIAL:

Cajas con agar nutritivo

Asa bacteriolgica

PortaobjetosTubos con agar inclinado

Microscopio

Aceite de inmersin

Mechero Bunsen

Mezcla de MicroorganismosPROCEDIMIENTO:

1.- Mtodo de las Placas. Tcnica de preparacin

a) Toma un apequea cantidad de la mezcla de grmenes y con el asa siembra en estras, procurando que entre estas quede un espacio de 5mm, segn se te indique.b) Incuba a 37 C durante 24 Hrs. Observa el crecimiento de colonias

c) Toma una colonia y prepara un frotis y telo por la tcnica de Gram. Observa al microscopio

d) Si en la preparacin se observan nicamente grmenes Gram + o Gram -, trasfiera la colonia respectiva a tubos con agar inclinado.

e) Incuba a 37 C durante 24 Hrs.

f) Examina la pureza del cultivo por examen microscpico, este cultivo no debe mostrar mas de una especie bacteriana, de no ser as, repite el procedimiento hasta obtener el cultivo puro.

CUESTIONARIO PREVIO:1.- Por qu es necesario aislar a un microorganismo para identificarlo?2.- Por qu no siempre debemos estudiar a los microorganismos en cultivo puro?3.- Investiga y explica otras tcnicas para obtener cultivos puros. En una muestra de suelo, Qu tcnica debe utilizarse para obtener un cultivo puro?4.- Qu son las vacunas y que principio activo contienen?PRACTICA No. 8

E N D O S P O R A S Y CAPSULAS

Las endosporas son cuerpos de gran resistencia producidas en el interior de las clulas de ciertas bacterias, se encuentran en todas las especies de la familia Bacteriaceae, que se divide en dos gneros: Bacillus (bacilos aerobios esporgenos) y Clostridium (bacilos anaerobios esporgenos). Una bacteria generalmente produce una sola endospora.

La mayora de las bacterias, posiblemente todos los tipos estn rodeados por una capa gelatinosa, poco definida, que se tie pobremente a la que se ha denominado cpsula capa mucilaginosa. La sustancia que constituye la cpsula bacteriana es de naturaleza polisacrida.

La cpsula de las bacterias no tiene la misma afinidad por los colorantes que otros componentes de la clula, por eso se utilizan otros mtodos de coloracin especiales. El mtodo de la coloracin negativa en el cual las cpsulas se ven como un halo claro contra un fondo obscuro, se realizar en ste ejercicio.OBJETIVO:

Aplicar el mtodo de tincin diferencial para demostrar la presencia de endosporas. Observacin de cpsulas mediante el mtodo de coloracin negativa.

MATERIAL PARA ENDOSPORAS:

Mechero de Bunsen tripie c/tela Verde malaquita,

Matraz erlenmeyer de 250 ml Fucsina bsica al .05% acuosa

MicroscopioAsa bacteriolgica

PortaobjetosCultivo de Bacillus spp inclinado/48 72 hrs Aceite de inmersin

Lpiz graso, pinzas rectas (sin diente), gasas

MATERIAL PARA CAPSULAS:

Tinta china o nigrosinaAceite de inmersin Asa

Porta y cubreobjetosMicroscopioMechero Bunsen

Cultivo de 24 hrs deKlebsiella PROCEDIMIENTO PARA ENDOSPORAS:

1.- Realiza una suspensin de la bacteria (B. subtilis) en un portaobjetos sin fijarlo al calor.

2.- Coloca el portaobjetos sobre la boca del matrz con agua hirviente.

3.- Cuando se forme el agua de condensacin (vapor), entonces inunda el portaobjetos con verde de malaquita y djalo actuar por 3 min.(No dejes secar el colorante, agregando constantemente el que se evapore)

4.- Retira con unas pinzas el portaobjetos y enjuaga con agua de la llave.

5.- Aplquese Fucsina por 30 seg.

6.- Lava el portaobjetos con agua de la llave y seca el exceso de agua con una gasa.

7.- Examina con el objetivo de inmersin. Dibuja la morfologa de las clulas y la posicin de las endosporas dentro de la clula.

NOTA: las esporas se tien de verde y la clula vegetativa de rojo.

PROCEDIMIENTO PARA CAPSULAS (Mtodo de la tinta china)

1.- Se coloca sobre un portaobjetos limpio una pequea cantidad de solucin fisiolgica, agua o caldo y se le agrega una pequesima cantidad del crecimiento de un cultivo joven.

2.- Mezclar bien, agregar una gota de tinta china y cubrir inmediatamente con un cubreobjetos.

3.- Examinar inmediatamente con el objetivo de inmersin en aceite.


1.- A qu se debe el hecho de que bacterias esporgenas o productoras de cpsulas, tengan cepas que no las producen ?

2.- Qu importancia mdica tiene la presencia de cpsulas y endosporas ?

3.- Cules son los componentes qumicos de las cpsulas y las endosporas?

4.- Cules son las condiciones necesarias para que se produzcan endosporas en una bacteria ?

UNIDAD 6

PRACTICA No. 9

IDENTIFICACIN BACTERIANACuando hacemos la identificacin de una bacteria consideramos que se debe realizar un acercamiento para una investigacin bacteriolgica sin tener en mente ideas preconcebidas, considerando a nuestro microorganismo como un completo desconocido e iniciar la identificacin a partir de las caractersticas bsicas (pruebas primarias).

Las pruebas primarias necesarias para identificar a un microorganismo son:

TINCIN DE GRAM, MORFOLOGA, ACIDORRESISTENCIA, ESPORAS, MOVILIDAD, CAPACIDAD PARA CRECER EN CONDICIONES AERBICAS Y ANAROBICAS, PRUEBA DE CATALASA, PRUEBA DE OXIDASA Y PRUEBA DE OXIDO-FERMENTACIN.

PRUEBA DE CATALASA

PRINCIPIO:

Probar la existencia de la catalasa

BIOQUIMICA:

La descomposicin del perxido de hidrgeno ocurre por la accin de las enzimas catalasa y peroxidada.

2 molculas de H2O2 molculas de H2O + O2 liberacin de gas

REACTIVOS:

Perxido de hidrgeno al 3% almacenado en botella obscura

PROCEDIMIENTO:

Con un asa de aguja, tomar una asada del cultivo puro y colocarla en un tubo estril que contenga 1 ml de agua oxigenada al 3%, observar la presencia inmediata de burbujeo y anotar los resultados.

INTERPRETACIN:

Prueba POSITIVA: burbujeo inmediato

Prueba NEGATIVA: no hay burbujeo

PRUEBA DE LA OXIDASA

PRINCIPIO:

Determinar la presencia de enzimas oxidasa

BIOQUIMICA:

La prueba de la oxidasa se basa en la produccin bacteriana de una enzima intracelular OXIDASA. Esta reaccin de oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa, el cual activa la oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno molecular.

Todas las bacterias aerbicas contienen su energa por respiracin, un proceso el cual es responsable para la oxidacin de varios sustratos.

El sistema citocromo est presente usualmente en organismos aerbicos los cuales son capaces de utilizar el oxgeno como un receptor final de hidrgeno.

Citocromo oxidasa enzima

2 citocromos red 2H + O2 2 citocromos c oxidados

Oxidacin

2 citocromos red c oxidados + reactivo compuesto coloreado

PROCEDIMIENTO:

Utilizar un disco impregnado del reactivo tetrametil-para-fenilendiamina, tomar una asada del cultivo y colocarla en el disco.

INTERPRETACION:

Prueba POSITIVA: Presencia de un color obscuro

Prueba NEGATIVA: No hay presencia de color

PRUEBA DE OXIDACIN FERMENTACIN

PRINCIPIO:

Determinar el metabolismo de un carbohidrato por va oxidativa o fermentativa.

BIOQUIMICA:

La utilizacin de los carbohidratos por una bacteria ocurre metabolitamente por uno de dos procesos: fermentativo u oxidativo.

La fermentacin es un proceso anaerbico y el carbohidrato es metabolizado a dos molculas de tres carbonos, el intermediario principal es el Ac. Pirvico. El producto final de la fermentacin vara con cada especie bacteriana.

La oxidacin de la glucosa es un proceso aerbico y las bacterias que oxidan un carbohidrato son usualmente aerobias estrictas. La oxidacin requiere oxgeno o un compuesto inorgnico como aceptor terminal de electrones.

PROCEDIMIENTO:

Inocular dos tubos de medio O F (HUGH LEIFESON) con glucosa al 1%, con una asada de cultivo puro.

Un tubo se sellar con aceite mineral y se incuban por 18 o 24 Hr a 37 C.

INTERPRETACION:

Reacciones: cido A. cido y gas

Determinacin OF: FERMENTATIVO (F)

OXIDATIVO (O)

NR: No Reactivo (no oxida ni fermenta el carbohidrato)

CUESTIONARIO:

1.- Qu son las pruebas primarias y que utilidad presentan en microbiologa?

2.- Cules son los componentes OF Hugh y Leifson?

3.- A que se debe la respuesta variable de algunos gneros de bacterias a algunas pruebas?

4.- Investiga las caractersticas e importancia mdica de los gneros Bacillus, Staphylococcus y Escherichia coli PRACTICA No. 10

UTILIZACIN DE LOS CARBOHIDRATOS.

Los carbohidratos son la principal fuente de energa. Los azcares simples como la glucosa y la lactosa son los indicadores de las reacciones metablicas. Las bacterias emplean enzimas intracelulares para efectuar posteriormente la degradacin metablica de los carbohidratos.

PRINCIPIO:

Determinar la capacidad de un organismo para degradar un carbohidrato especfico, incorporado en un medio basal produciendo cido o cido con gas visible y produccin de cido sulfhdrico.

BIOQUMICA:

manual de practicas.doc

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