manual de tecnicas de estudio de fauna
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7/26/2019 Manual de Tecnicas de Estudio de Fauna
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2015SoniaGallina Tessaro
Editora
MANUALde tcnicas del
estudio faunade la
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estudio faunade la
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Primera edicin, 2015
D.R. por Instituto de Ecologa, A.C.Carretera antigua a Coatepec No. 351,
El Haya, Xalapa 91070, Veracruz, Mxico
ISBN 978-607-7579-45-8, primera edicin
Ttulo: Manual de tcnicas del estudio de la faunaEditora: Dra. Sonia Gallina Tessaro
Impreso en Mxico ~ Printed in Mexico
Publicacin en lnea:
http://www.inecol.edu.mx/inecol/libros/Manual_de_ tcni-cas_del estudio_de_la_fauna.pdf
Forma sugerida para citar este libro:Gallina, S. (ed.) 2015.Manual de tcnicas del estudio de la
fauna. Instituto de Ecologa, A.C. Xalapa, Veracruz, Mxico.
Revisin de estilo, diseo y formacin editorial: InstitutoLiterario de Veracruz, S.C.
Fotografas de Alberto Gonzlez Gallina con excepcin delvenado temazate que es de Alejandro Gonzlez Gallina
D.R. Ninguna parte de esta publicacin, incluyendo el diseo de lacubierta, puede ser reproducida, traducida, almacenada o transmitida
en manera alguna ni por ningn medio, ya sea elctrico, qumico,mecnico, ptico de grabacin o de fotocopia, sin permiso previo del
editor. Prrafos pequeos o figuras aisladas pueden reproducirse,dentro de lo estipulado en la Ley Federal del Derecho de Autor y el
Convenio de Berna, o previa autorizacin por escrito de la editorial.
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Sonia Gallina TessaroEditora
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PhD. Martn Ramn Aluja Schuneman HoferDIRECTOR GENERAL
L.A. Rubey Baza RomnDIRECTOR ADMINISTRATIVO
Dr. Guillermo ngeles lvarez
SECRETARIO ACADMICO
M.C. Alberto Rsquez ValdepeaSECRETARIO TCNICO
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ndice de Cuadros
ndice de Figuras
Introduccin
Lista de Participantes
Captulo 1.Tcnica de colecta, manejo y envo de muestras biolgicas de
fauna silvestre. Luis M Garca Feria, Arturo BarbachanoGuerrero y
Antonio A. Vsquez Aguilar.
Captulo 2. Tcnicas de campo y laboratorio para el estudio de parsitos.
Diego Santiago - Alarcon.
Captulo 3. Aplicaciones del anlisis de istopos estables para el manejo y
conservacin de fauna silvestre. Eduardo Njera Hillman.
Captulo 4. Mtodos estadsticos aplicados al estudio de vertebrados.
Dante Alfredo Hernndez Silva y Gerardo Snchez Rojas.
Captulo 5. Evaluacin de la diversidad de especies en ensamblajes de ver-
tebrados: un primer acercamiento midiendo y comparando la riqueza
de especies. Eduardo Pineda y Claudia E. Moreno.
Captulo 6.Anlisis de viabilidad poblacional aplicado al manejo de fauna.
Salvador Mandujano.
Captulo 7.Tcnicas para estimar la capacidad de carga para herbvoros.Salvador Mandujano y Sonia Gallina.
Captulo 8.Tcnicas para el estudio de murcilagos. Areli Rizo - Aguilar,
Luis Gerardo vila - Torresagatn, Liliana Fuentes Vargas, Ana Cristel
Nuez Lara, Gabriela I. Flores Nuez, Sergio Albino Miranda.
Captulo 9.Mtodos de investigacin social: fundamentos, tcnicas y apor-
taciones para el entendimiento de las relaciones sociedad - vida silves-
tre. Alicia Castillo y Juan L. Pea - Mondragn.
ndice
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Captulo 1
Cuadro 1.1.Muestras adecuadas en funcin del sitio anatmico de estudio.
Cuadro 1.2.Requerimiento de conservacin en funcin del mtodo diag-
nstico a utilizar.
Cuadro 1.3.Ejemplos de algunos sistemas de transporte de muestra y su
uso final.
Captulo 4
Cuadro 4.1.Cuatro tipos de diseos y pruebas estadsticas univariadas.
Captulo 9
Recuadro 9.1.Acceso a campo.
Recuadro 9.2.Observacin participante.
Recuadro 9.3.Qu incluir en las notas de campo?
Recuadro 9.4.Preparacin y conduccin de entrevistas individuales.
Recuadro 9.5.Preparacin y conduccin de grupos focales.
Recuadro 9.6.Preparacin y levantamiento de encuestas.Recuadro 9.7.Preparacin y facilitacin de talleres (participativos y otros).
ndice de cuadros
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Captulo 1
Figura 1.1. Sistemas comerciales para el transporte de muestras.
Captulo 2
Figura 2.1. Poste para sostener la red y tensores de la red que se colocan en
el poste
Figura 2.2. Pasos para colocar una red de niebla.
Figura 2.3. Manera correcta de sostener un ave en la mano.
Figura 2.4. Ave en posicin para tomar muestra de sangre de la vena del
ala y puncin de la vena braquial.
Figura 2.5a. Obtencin de la sangre usando un tubo microcapilar con hepa-
rina.
Figura 2.5b. Material necesario para guardar la muestra de sangre y prepa-
rar los frotis sanguneos.
Figura 2.5c.Estacin de trabajo de campo.
Figura 2.6. Preparacin de frotis sanguneos.
Figura 2.7. Cajas para guardar porta objetos con capacidad para 24 mues-
tras (estas se utilizan en el campo, figura izquierda) y para 100 mues-
tras (figura derecha).Figura 2.8.Mtodo alternativo para guardar los porta objetos utilizando
papel.
Figura 2.9.Colorante Giemsa disuelto en buffer salino listo para ser verti-
do en cajas o contenedores Coplin.
Figura 2.10.Bandeja de secado.
Figura 2.11.Foto de un microscopio ptico.
ndice de figuras
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Figura 2.12.Parsitos del Orden Haemosporida que infectan a las aves.
Figura 2.13.Diagrama general de medidas morfolgicas de longitud (arri-
ba) y ancho (abajo) que son usados para la descripcin de especies de
parsitos haemosporideos.Figura 2.14.Fotos de clulas blancas tomadas de frotis sanguneos de perico.
Captulo 3
Figura 3.1. Reaccin metablica simplificada mostrando el fracciona-
miento isotpico.
Figura 3.2.Estructura de isotpica de carbono y nitrgeno de un sistema
con plantas C3 (arbustos) y C4 (pastos), consumidas por herbvorosramoneadores y pastadores.
Figura 3.3.Determinacin de la proporcin de individuos provenientes de
localidades de origen geogrfica e isotpicamente distintas.
Captulo 4
Figura 4.1.La indagacin cientfica se realiza mediante un ciclo dinmico,
de dos componentes que estn ligados.
Figura 4.2.Distribucin de la frecuencia de dos variables aleatorias, la
longitud total y el largo total del tamao de cuerno de los machos del
escarabajo Phaneus adonisque habita la Barranca de Metztitln.
Figura 4.3. Representacin grfica de lo que son una poblacin, una mues-
tra y una unidad de observacin, utilizando como ejemplo una pobla-
cin de patos, Anas platyrhynchos diazi.Figura 4.4. Representacin de los diferentes diseos de estudios.
Figura 4.5. rbol de decisin para escoger los mtodos estadsticos ms
adecuados en los diseos de estadstica univariada ms comunes.
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Captulo 5
Figura 5.1. Ejemplo de un diseo de muestreo considerando un esfuerzo
de colecta similar, en cada ambiente y en cada fragmento o parcela
que conforman a ese ambiente.Figura 5.2.Cobertura de la muestra y dficit de la muestra determinadas
en funcin de las abundancias relativas del conjunto de especies que
forman el ensamblaje.
Figura 5.3.Ejemplo del formato y arreglo de los valores para calcular la
cobertura de la muestra en una hoja de clculo.
Figura 5.4. Formatos de bases de datos que pueden ser usados como
archivos de entrada en el programa EstimateS v. 9.1 para generar cur-vas de acumulacin.
Figura 5.5.Curvas de acumulacin de especies de dos ensambles en fun-
cin del nmero de individuos registrados.
Figura 5.6. Comparacin de la riqueza de especies de ocho ensambles.
Captulo 6
Figura 6.1.Cambios de la abundancia (N) de una poblacin a travs del tiempo.
Figura 6.2. El efecto vrtice o vortex.
Figura 6.3. Componentes o pasos generales de un proceso de anlisis de
viabilidad poblacional.
Figura 6.4. Cambio en la probabilidad de extincin (Pe) o de persistencia (1
Pe) conforme el porcentaje de decline de la poblacin cambia.
Captulo 7
Figura 7.1.Clasificacin de las tres diferentes aproximaciones y mtodos
para estimar la capacidad de carga (K).
Figura 7.2.Relacin hipottica entre la densidad de venados, comporta-
miento productivo individual, peso corporal y produccin/unidad de
rea.
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Figura 7.3. Modelo de cambio en la capacidad de carga (K) en funcin de la
cantidad o superficie de hbitat y de la calidad del hbitat medida a
travs de algn ndice.
Captulo 8
Figura 8.1.Partes de una red de niebla.
Figura 8.2.Colocacin de redes de niebla en pasos de vuelo y en cuerpos
de agua.
Figura 8.3.Equipo necesario para hacer uso de redes de niebla.
Figura 8.4.Oscilograma y espectrograma de los pulsos, de una especie de
la familia Molossidae.Figura 8.5.Interfaz de Sonobat mostrando una secuencia de una especie
de la familia Vespertilionadae.
Figura 8.6. Interfaz de Echo Meter Touch con sonogramas de la familia
Vespertilionidae.
Figura 8.7.Mtodo directo de estimacin de murcilagos (A. jamaicensis)
en un refugio caverncola.
Figura 8.8.Sistema de iluminacin, grabacin de video y deteccin acsti-
ca simultneo en un refugio caverncola.
Figura 8.9.Toma de muestra de sangre.
Figura 8.10.Transportadora de murcilagos.
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Sergio Albino Miranda.Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Autno-
ma del Estado de Morelos ([email protected]).
Luis Gerardo vila-Torresagatn. Facultad de Ciencias Biolgicas, Universi-
dad Autnoma del Estado de Morelos ([email protected]).
Arturo Barbachano-Guerrero. Laboratorio de Medicina de Conservacin,
Seccin de Estudios de Posgrado e Investigacin, Escuela Superior de
Medicina, Instituto Politcnico Nacional ([email protected]).
Alicia Castillo lvarez .Instituto de Investigaciones en Ecosistemas y Susten-
tabilidad, UNAM-Campus Morelia ([email protected]).
Gabriela I. Flores Nez. Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Aut-
noma del Estado de Morelos ([email protected]).
Liliana Fuentes Vargas. Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Aut-
noma del Estado de Morelos ([email protected]).
Sonia Gallina Tessaro. Red de Biologa y Conservacin de Vertebrados, Insti-
tuto de Ecologa, A.C., Carretera antigua a Coatepec No. 351, El Haya,
C.P. 91070, Xalapa, Ver., Mxico ([email protected]).Luis M Garca Feria. Red de Biologa y Conservacin de Vertebrados, Instituto
de Ecologa, A.C., Carretera antigua a Coatepec No. 351, El Haya, C.P.
91070, Xalapa, Ver., Mxico ([email protected]).Salvador Mandujano Rodrguez.Red de Biologa y Conservacin de Verte-
brados, Instituto de Ecologa, A.C., Carretera antigua a Coatepec No.
351, El Haya, C.P. 91070, Xalapa, Ver., Mxico (salvador.manduja-
Claudia E. Moreno.Centro de Investigaciones Biolgicas, Universidad Aut-
noma del Estado de Hidalgo. Pachuca, Hidalgo, Mxico (cmore-
lista de participantes
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Eduardo Njera Hillman. COSTASALVAJE A.C. Blvd. las Dunas 160-203,
Fracc. Playa Ensenada, C.P. 22880, Ensenada, Baja California, Mxico.
Institucin donde se llev a cabo la investigacin: Red de Biologa y
Conservacin de Vertebrados, Instituto de Ecologa, A.C., Carreteraantigua a Coatepec No. 351, El Haya, C.P. 91070, Xalapa, Ver., Mxico
Ana Cristel Lara Nez. Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Aut-
noma del Estado de Morelos ([email protected]).
Juan L. Pea-Mondragn.Instituto de Investigaciones en Ecosistemas y Sus-
tentabilidad, UNAM-Campus Morelia ([email protected]).
Eduardo Pineda Arredondo. Red de Biologa y Conservacin de Vertebrados,Instituto de Ecologa, A.C. Xalapa, Veracruz, Mxico (eduardo.pine-
Areli Rizo-Aguilar. Facultad de Ciencias Biolgicas, Secretara de Investiga-
cin, Universidad Autnoma del Estado de Morelos (areli.ri-
Gerardo Snchez Rojas. Laboratorio de Conservacin Biolgica, rea Acad-
mica de Biologa, Instituto de Ciencias Bsica e Ingeniera, Universidad
Autnoma del Estado de Hidalgo ([email protected])
Diego Santiago Alarcn. Red de Biologa y Conservacin de Vertebrados,
Instituto de Ecologa, A.C., Carretera antigua a Coatepec No. 351, El
Haya, C.P. 91070, Xalapa, Ver., Mxico ([email protected]).
Dante Alfredo Hernndez Silva. Laboratorio de Conservacin Biolgica, rea
Acadmica de Biologa, Instituto de Ciencias Bsica e Ingeniera, Uni-versidad Autnoma del Estado de Hidalgo ([email protected]).
Antonio A Vsquez Aguilar.Red de Biologa Evolutiva, Instituto de Ecologa, A.C.
Apoyo Editorial:Rolando Gonzlez Trpaga. Red de Biologa y Conservacin
de Vertebrados, Instituto de Ecologa, A.C., Carretera antigua a Coate-
pec No. 351, El Haya, C.P. 91070, Xalapa, Ver., Mxico (rolando.gonza-
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agradecimientos
Agradecemos el apoyo econmico brindado por el Instituto de Ecologa, A.C. a
travs de la Secretara Acadmica con el Dr. Guillermo Angeles para hacerposible la publicacin electrnica de este manual. Adems por el apoyo del
Director General, Dr. Martn Aluja Schuneman para realizar el Retiro Acadmi-
co de la Red de Biologa y Conservacin de Vertebrados en septiembre del
2014 (Proyecto 20035-30844), durante cuya estancia se aprovech para que
dos rbitros revisaran cada captulo, por lo tanto agradecemos a los investiga-
dores y tcnicos de la red, as como a los estudiantes de posgrado que partici-
paron: Salvador Mandujano Rodrguez, Eduardo Pineda Arredondo, Diego
Santiago Alarcn, Luis Garca Feria, Fernando Gonzlez Garca, Rolando Gon-
zlez Trpaga, Adriana Sandoval Comte, Pilar Carb Ramrez, Carolina Her-
nndez Lara, Eva Lpez Tello Mera, y en especial a nuestra asistente Roco
Rodrguez por su ayuda en la logstica.
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El proceso de la edicin de un libro, podemos afirmar que es un camino
tortuoso que hay que recorrer para llegar a un final satisfactorio
cuando se tiene el producto final. Por qu digo que es un camino
tortuoso? Porque en un inicio uno concibe la idea a raz de notar una
necesidad de comunicacin de la informacin que se genera a lo largo
de aos de experiencia, de difundir hacia un pblico determinado que le
pueda servir de ayuda y le sea de provecho. Luego entonces sigue un
proceso de reunir, con diversos autores, la informacin pertinente. Para
el proceso de seguimiento, el editor se convierte en una especie de
capataz, por as decirlo, ya que debe estar persiguiendo a los autores.
Esta persecucin es la que lleva ms tiempo, as por ejemplo, para este
manual llev ms de tres aos, aunque parezca mentira, y en el camino
uno piensa que nunca va a lograr ver el final.
Este manual de tcnicas que incluye nueve captulos, fue concebido para
estudiantes, tcnicos e investigadores que quieren incursionar en este
interesante campo de la ecologa, y es un complemento del anterior
Manual de tcnicas para el estudio de la Fauna Silvestreeditado por S.
Gallina y Carlos Lpez-Gonzlez, publicado tambin de forma
electrnica en el 2011 por el INECOL y la Universidad Autnoma de
Quertaro y una segunda edicin con el Instituto Nacional de Ecologa y
Cambio Climtico (INECC) de SEMARNAT.
introduccin
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Aprovecho este espacio para hacer extensivo un agradecimiento a todos
los autores y revisores, por su paciencia y por creer en este arduo
proceso para verlo concluido. Espero que se sientan satisfechos por el
producto final, as como tambin espero que a todos los usuarios que lo
consulten les sirva de ayuda para poner en prctica lo que se plasma
aqu, ya que la finalidad ltima del manual es que sea una herramienta
til para aplicarse en el campo de la ecologa, el manejo y la
conservacin de la fauna silvestre.
Sonia Gallina
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RESUMEN
La obtencin de muestras biolgicas es una de las mayores dificultades para
la investigacin de especies silvestres. Existen varias formas de obtener mues-
tras biolgicas, tanto de manera invasiva como no invasiva; diferentes tcni-
cas han sido desarrolladas para obtener las muestras dependiendo de la espe-
cie de estudio y el objetivo del muestreo. En este captulo, a manera de manual
de campo, se describen de forma general las tcnicas de captura, toma y mane-
jo de muestras para distintas especies de vertebrados y para distintos objeti-
vos de estudio, desde el muestreo para estudios epidemiolgicos infecciosos
(macro y microparsitos) como para estudios en aspectos de gentica de
poblaciones, a partir de animales vivos como de cadveres.
INTRODUCCIN
El trmino medicina de la conservacin fue acuado por Kosch, con la premisa
de que la salud conecta a todas las especies del planeta, al contemplar elaspecto ecolgico de la salud que involucra la degradacin ambiental, el decli-
ne de la biodiversidad y las enfermedades emergentes en humanos y animales
(Kosch 1996). En la medicina de la conservacin, el trabajo multidisciplinario
es lo ms factible para obtener excelentes resultados en los planes de control y
monitoreo de enfermedades, as como el manejo y la conservacin de las espe-
cies (Meffe 1999, Osofsky et al.2000, Spear 2000, Deem et al.2001, Mainka
2001, Norris 2001, Aguirre et al.2002, Karesh et al.2005).
Luis M. Garca Feria, Arturo Barbachano-Guerreroy Antonio A. Vsquez Aguilar
captulo unoTcnicas de colecta, manejo y envo demuestras biolgicas de fauna silvestre
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Las enfermedades tienen un papel importante en la regulacin del tamao, la
densidad, distribucin y estructura de las poblaciones, con efectos sutiles y
consecuencias visibles a largo plazo (Hamilton y Zuk 1982, May 1983, Robin-
son y Bolen 1989, Hudson et al.1992,Zuk et al.1998); no obstante, debido a
que las poblaciones no pueden estar libres de enfermedades, se intenta reali-
zar la diminucin de los riesgos que les producen, as como la transmisin
inter e intraespecie. Para la evaluacin de dichos riesgos, es necesario conocer
a la enfermedad desde un punto de vista de patogenia y ecolgico, realizar su
vigilancia sanitaria y epidemiolgica ya que as se podr detectar la presencia,
recurrencia, emergencia o dispersin de la enfermedad estudiada (Mrneret
al.2002), adems de las caractersticas propias del agente etiolgico.
Recientemente, la necesidad de estudiar las interacciones de las enfermedades
en un contexto ecolgico ha llevado a magnificar el esfuerzo de estas tcnicas
hacia la toma de muestras de animales silvestres terrestres, arborcolas, acuti-
cos, voladores, etc. considerando tambin el agente etiolgico de estudio: infec-
ciosos (macroparsitos: metazoarios; microparsitos: virus, bacterias, proto-
zoarios y hongos), alteradores fisiolgicos (endocrinos y toxinas) o genticos.
La toma de muestras para el diagnstico de patgenos u otros agentes no
infecciosos que producen daos y alteraciones en la fisiologa y la reproduc-
cin (salud) de los seres vivos, en muchos casos, ha sido una de las limitantes
cuando se trata de fauna silvestre. Desde hace mucho tiempo se han realizado
diferentes tcnicas de colecta de muestras, adaptando los mtodos desarro-
llados a partir de las tcnicas de muestreo en humanos, animales domsticos
o de animales de zoolgicos.
Las tcnicas de muestreo se pueden clasificar principalmente en dos tipos, las
no invasivas y las invasivas. Las tcnicas no invasivas son aquellas que no
requieren de la contencin del animal, mientras que para las muestras invasi-
vas, por el contrario, requieren de la contencin del individuo y son las tcni-
cas mayormente usadas para un buen muestreo.
CAPTULO UNO
Manual de tcnicas del estudio de la fauna / Sonia Gallina Tessaro
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La obtencin de muestras pueden realizarse para diferentes objetivos, entre
los cuales tenemos el monitoreo de enfermedadescon el fin de contribuir al
conocimiento de la salud ecolgica y evaluar el impacto de las actividades
humanas en el ecosistema respecto a la aparicin de enfermedades emergen-
tes (enfermedades que aumentan su incidencia o aumentan su rango de distri-
bucin en un lapso de tiempo corto y actual). Para esto, se debe vigilar la inci-
dencia y prevalencia de la enfermedad en la poblacin silvestre, determina-
cin de rango de posibles vectores (si es que la enfermedad lo requiere) y dis-
tribucin y densidad poblacional de estos, el riesgo sobre los animales de pro-
duccin y viceversa, as como el posible riesgo en la salud humana (zoonosis).
En el caso de sospecha de que una enfermedad infecciosa pueda estar cau-sando mortalidad o morbilidad en animales de vida silvestre, es importante
conocer los procedimientos para lograr un muestreo adecuado y representa-
tivo. Estos procedimientos deben dirigirse a anlisis especializados y encon-
trar informacin epidemiolgicamente relevante, sin que exista una desvia-
cin o error que nos pudiera llevar a las conclusiones incorrectas y, peor an,
tomar decisiones errneas en funcin de informacin confusa o no conclu-
yente, que pudiera generar ms problemas de los que se pudieran estar pre-
sentando por la aparicin de un brote infeccioso. Otro factor que debemos
tener en cuenta, es la diferencia entre asociacin y causalidad; la presencia de
un agente reconocido como patgeno en una muestra biolgica, no significa
definitivamente que gener una patologa en el animal de donde proviene la
muestra, pues muchas veces estn presentes como una consecuencia de algu-
na otra patologa, de manera azarosa, o simplemente no estn causando una
infeccin sintomtica.
El estudio y diagnstico de las enfermedades es una rama de investigacin
bastante profunda y requiere de aos de experiencia y tcnicas e instrumenta-
cin especializada, sin embargo el objetivo de sta seccin no es dar un entre-
namiento en diagnstico, sino adiestrar en un correcto manejo de muestras
para que se logre hacer un diagnstico adecuado. Cabe mencionar que el diag-
nstico directo del agente infeccioso consiste en generar evidencia de la pre-
sencia del patgeno, sin embargo, en muchas enfermedades tiene suficiente
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Luis M. Garca Feria, Arturo BarbachanoGuerrero y Antonio A. Vsquez Aguilar
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valor diagnstico las metodologas indirectas, como son la bsqueda de anti-
cuerpos especficos o metabolitos del patgeno, como toxinas.
Existe una gran diversidad de vertebrados silvestres con los que uno puede
tener la necesidad de tomar muestras, y la diversidad de enfermedades infec-
ciosas que pueden adquirir es igualmente grande. La variedad de agentes
infecciosos que se han reconocido como causantes de enfermedad en anima-
les (domsticos y de vida silvestre) es sumamente vasta, e incluye organismos
acelulares, como los virus, viroides y priones, y organismos celulares, estos
ltimos pudiendo dividirlos en bacterias y organismos eucariontes (hongos,
protozoarios, helmintos, etc.). El conocimiento de la historia de vida de los
patgenos, sus vectores y distribucin, adems del conocimiento y vigilanciaepidemiolgica, puede ayudar en el desarrollo de programas de recuperacin,
viabilidad y determinacin de amenazas en poblaciones de especies silves-
tres, as como la planeacin de reservas y manejo de poblaciones.
Por otro lado, el crecimiento de la poblacin humana ha llevado a una deman-
da energtica mayor, a la necesidad de produccin de ms alimento y al con-
trol de plagas, y estas necesidades conllevan el uso de sustancias para hacer
ms eficiente la produccin. El uso indiscriminado de pesticidas (herbicidas,
fungicidas e insecticidas y otros qumicos), tambin llamados alteradores
fisiolgicos, afecta las funciones metablicas de muchos organismos, inclu-
yendo al humano, y han sido dispersadas en el aire y en el agua por ms de 50
aos. Por ejemplo, contaminantes inorgnicos en tortuga marinas (Barcel-
Vera 2004); contaminantes orgnicos persistentes (COPs) y su relacin con
hormonas sexuales (Gonzlez-Juregui 2008). Adems de los qumicos que
causan toxicidad en el sistema endocrino, tambin son considerados altera-dores a aquellos que causan dao en el ADN con efectos en el desarrollo. Ade-
ms del monitoreo de la salud del sistema endocrino en la poblacin, determi-
nando los niveles de diferentes hormonas, es necesaria la evaluacin del siste-
ma inmunitario, ya que la presencia de individuos adultos reproductores y
jvenes saludables no necesariamente reflejan la salud de la poblacin.
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Tcnicas de colecta, manejo y envio de muestras biologicas de fauna silvestre
Luis M. Garca Feria, Arturo BarbachanoGuerrero y Antonio A. Vsquez Aguilar
Los cambios en el hbitat, como la prdida de continuidad o fragmentacin, la
consecuente fragmentacin de las poblaciones, la disminucin de los tama-
os poblacionales, efectos climticos y catstrofes naturales, han resultado
en la prdida de la variabilidad gentica de las poblaciones de fauna silvestre.
La disminucin de la variabilidad gentica puede estar reflejada en la adapta-
cin y respuesta a la exposicin a patgenos, esto es, a la disminucin en la
respuesta inmunolgica de los individuos, llegando a un potencial epidmico
inminente que puede exterminar a una especie local o regionalmente, o en el
peor de los casos la extincin definitiva. Bajo este esquema, es de suma impor-
tancia verificar y tener un monitoreo de la salud genticade las poblaciones
silvestres.
Para cada tipo de agente etiolgico existen condiciones ptimas de toma, trans-
porte y conservacin de muestras, de manera que no existe una tcnica univer-
sal, pero s existen patrones bsicos que nos ayudarn a que la valiosa muestra
que obtengamos mantenga su viabilidad para el diagnstico de una enferme-
dad, desequilibrio metablico u otra etiologa. Otro problema con el que nos
podemos encontrar, es la dificultad de hacer un diagnstico presuntivo en cam-
po, por lo que no siempre sabremos cul es el tipo y manejo ptimo de la mues-
tra. En este captulo hacemos la descripcin de la teora y las tcnicas bsicas
de manejo de muestras en campo para un exitoso diagnstico, monitoreo de
enfermedades infecciosas, alteradores fisiolgicos y estudios genticos, as
como algunas tcnicas de diagnstico que pueden realizarse en campo.
Eleccin de la muestra
La eleccin de la muestra depender de dos factores principales: la sospecha o
diagnstico presuntivo del agente etiolgico, y el conocimiento de la patog-nesis de la enfermedad que se buscar. Para el primer factor, es necesario reco-
nocer algn sndrome, comportamiento, diferencia temporal de una prevalen-
cia, hospedero especfico o un signo patolgico observable que pudiera ser
patognomnico o fuertemente asociado con una enfermedad, como por ejem-
plo: la coloracin verdosa de la mucosa del estmago muscular es un signo
caracterstico de intoxicacin por plomo en aves acuticas; la aparicin de
lceras en encas y pezuas de bovinos, nos genera la sospecha de fiebre afto-
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26CAPTULO UNO
sa, y podramos dirigir el muestreo para diagnosticar la presencia del agente
que la provoca. Para el segundo factor, requiere conocimientos ms especiali-
zados sobre los rganos o zonas anatmicas que afecta el agente sospechoso,
como en el caso de rabia, sabiendo que el virus slo se replica levemente en
tejido muscular (al comienzo de la infeccin por inoculacin por una mordida)
y fuertemente en tejido nervioso, sera incorrecto tomar una muestra de san-
gre, pues lo ms probable es que no se encuentre una carga viral detectable en
ese tipo de muestra, a diferencia de una muestra de tejido de la herida fresca o
el encfalo de un animal que ha comenzado a presentar sndrome por rabia. En
caso de no sospechar de una enfermedad especfica o considerar varios agen-
tes etiolgicos como posibles causantes de la patologa presentada, es reco-
mendable tomar muestras dirigidas a mltiples enfermedades, de manera quese abarque un espectro amplio sin generar una sobrecarga a la institucin
encargada del diagnstico y los costos no sean demasiado elevados.
Mtodos de colecta de muestras
Los mtodos de colecta de muestras varan de acuerdo a la especie animal de
estudio y de las muestras requeridas como se puntualiz anteriormente. Las
tcnicas que describiremos contemplan la toma de muestras de sangre, mues-
tras de excretas, hisopados (rectal, vagina, oral y nasal), raspado cutneo y
para colecta de ADN.
Colecta de sangre
Aves
En las aves, los sitios de colecta de sangre cambian de acuerdo al tamao ytipo de ave. En general, se consideran las venas radiales y la yugular derecha y
en ocasiones, la vena tarsal en aves acuticas. En aves de tamao pequeo,
como Paseriformes y Trochilinae, es difcil la puncin y la obtencin de vol-
menes suficientes para realizar una biometra hemtica (Ritchie et al.1994);
se considera que entre el uno y el tres por ciento del volumen total de sangre
en animales sanos se pueden colectar a partir del volumen calculado con la1.02ecuacin alomtrica 65(W ), es decir, si un ave pesa 500 g, tiene un volumenkg
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total calculado de 32.05 ml de sangre y se puede obtener una muestra de entre
0.32 y 0.96 ml de sangre (Sedgwick y Martin 1994). Una regla general, para
prevenir el riesgo de hipotensin y falla cardiaca asociada, es que la muestra
de sangre nunca deber exceder de 1 ml por 100 g de peso corporal por mes
(Ancrenaz et al.2003).
Mamferos
Las tcnicas de muestreo en los mamferos, se ajustan principalmente al tama-
o del animal, por ejemplo, en mamferos pequeos, como algunos roedores,
se debe exponer la zona ventral del animal y lograr la extraccin de sangre de
manera intracardiaca. La aguja debe ser insertada en el 4 o 5 espacio inter-
costal, al lado izquierdo inmediato del esternn. La succin debe ser lenta, yaque por el tamao del corazn la presin negativa de la aguja puede colapsar
el rgano. Tambin en mamferos pequeos, la obtencin de sangre puede ser
de la vena caudal en la zona ventral de la base de la cola; en esta tcnica el volu-
men de sangre comnmente es bajo, pero fcilmente se pueden llenar tubos
capilares. Con sta misma tcnica se puede colectar una pequea cantidad de
sangre de murcilagos, pero de la vena superficial radial.
En mamferos de tamao mediano, la venopuncin se realiza prioritariamente
en venas yugulares, radiales, femorales, safenas y/o caudales, sin embargo,
cualquier vaso de calibre suficiente para obtener la cantidad de sangre reque-
rida es buena opcin. En animales de mayor tamao se facilita an ms por el
calibre de los vasos.
Reptiles
Pequeas cantidades de sangre pueden ser colectadas en lagartijas de tamaopequeo a partir de la amputacin de alguna de las uas o de las falanges. Tam-
bin puede puncionarse la vena coccgea ventral, no obstante, se debe tener cuida-
do, ya que en muchas ocasiones las lagartijas pueden auto-amputarse la cola como
reflejo en defensa a la depredacin. La opcin de puncin intracardiaca tambin es
viable, pero slo se deber usar en casos de que no haya otra opcin. Las venas
yugulares son preferidas, al igual que la vena abdominal ventral, en sta ltima, si
no se efecta cuidadosamente, se pueden desarrollar hemorragias serias.
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En serpientes es de eleccin la puncin cardaca, buscando el corazn en el
primer tercio del cuerpo del animal. En serpientes venenosas se debe contener
de manera segura antes de realizar le tcnica. Es recomendada en individuos
mayores a los 300 gramos. Otra opcin de menor riesgo es el seno venoso coc-
cgeo ventral, se debe tener cuidado de no afectar los hemipenes. En animales
sedados, principalmente animales venenosos, pueden puncionarse en las
venas palatinas y las sublinguales.
La tcnica de obtencin de sangre en cocodrilos y tortugas marinas bsica-
mente es la misma; la puncin se hace cerca de la insercin del crneo y las
vrtebras cervicales, en el plexo venoso post-occipital, se pueden obtener un
buen volumen de muestra pero puede mezclarse con linfa. En tortugas semia-cuticas, la obtencin de muestras sanguneas de buen volumen se puede
hacer en la vena yugular, localizada caudodorsal a la membrana timpnica; las
metatarsales, en el plexo venoso braquial; venas ceflicas, en la vena femoral o
en la vena dorsal caudal. En ocasiones es de buena eleccin la puncin carda-
ca, introduciendo la aguja entre las placas pectorales y abdominales del plas-
trn sobre la lnea media (Mautino y Page 1993). Sin embargo, se debe conside-
rar tranquilizar qumicamente al animal.
En tortugas terrestres, se ha considerado las mismas vas que en las semiacuti-
cas; no obstante, se deben anestesiar a los individuos debido a la gran fuerza que
tienen cuando se protegen dentro del caparazn. Por otro lado, pequeas cantida-
des de sangre para microhematocrito o para anlisis genticos pueden obtenerse
de la puncin de los vasos sanguneos de las falanges (GarcaFeriaet al.2015).
AnfibiosEl mtodo de obtencin de sangre en animales del orden Anura, se dirige a la
puncin intracardiaca, la vena abdominal central (Raphael 1993) y al plexo
sublingual (Heatley y Johnson 2009); en salamandras es considerada la vena
caudal y la puncin cardiaca. En especies de gran tamao se pueden puncio-
nar los vasos visibles de las extremidades. Dependiendo del tamao del ani-
mal, es seguro colectar sangre correspondiente a aproximadamente el uno
por ciento del peso corporal en animales sanos (Heatley y Johnson 2009).
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Para todos los vertebrados, las muestras sanguneas podrn servir para obte-
ner slidos totales, niveles de hematocrito, conteo de total y diferencial para
leucocitos. Estos valores variarn dependiendo de la especie, edad, sexo y
temperatura. Adems, las muestras sanguneas se pueden usar para el diag-
nstico de diversas enfermedades, por ejemplo, al separar el suero se podrn
hacer distintas pruebas serolgicas como inmunoensayos enzimticos
(ELISA) o pruebas de aglutinacin, para la deteccin de anticuerpos de enfer-
medades como fiebre del Oeste del Nilo o toxoplasmosis, entre otras. Este tipo
de diagnstico es fcil de realizar in situ, siempre y cuando se cuente con un
lector de ELISA o un microscopio, ya que venden diversos kits comerciales de
diagnstico rpido para una gran gama de enfermedades.
Obtencin de Suero
Para obtener el suero se necesita colocar la muestra de sangre en tubo sin anti-
coagulantes; estos tubos regularmente se diferencian de los dems por tener
un tapn color rojo. Una vez que se tenga la muestra hay dos formas de sepa-
rar el suero del paquete celular, una es por centrifugacin a aproximadamente
4000 rpm con la ayuda de una centrifuga, y la otra es dejando reposar las
tubos para que el paquete celular se sedimente. Es recomendable hacerlo lo
ms pronto posible, pues as se evita la lisis celular y por consecuente la conta-
minacin del suero con compuestos intracelulares. Una vez que se sedimente
el paquete celular, se podr obtener el suero para realizar las pruebas serol-
gicas in situy el resto del suero se podr congelar para ser trasportado al labo-
ratorio de destino y realizar pruebas posteriores.
Obtencin de plasma
Para la obtencin de plasma se recomienda el uso de heparina, ya que puedeprevenir la hemlisis. Para el almacenaje, existen tubos que se caracterizan
por tener un tapn color verde. La heparina se usa a razn de 0.1 a 0.2 mg/ml
de sangre total, evitando as la coagulacin por neutralizacin de la trombina;
sin embargo, no resulta satisfactoria para recuentos de leucocitos o cuando
han de prepararse extensiones de sangre, porque en ste segundo caso, pro-
duce un fondo azul en las preparaciones teidas con el colorante de Wright;
no obstante, no afecta el hematocrito ni el tamao corpuscular. Es importante
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la eleccin del agente anticoagulante, pues algunos mtodos moleculares o
inmunolgicos se ven afectados por ellos.
Una vez obtenida, la muestra es centrifugada o los tubos se mantienen en repo-
so para que el paquete celular sedimente; posteriormente, se puede medir el
hematocrito. Debido al anticoagulante, es factible volver a mezclar el plasma
con el paquete celular y se puede tomar muestras de sangre para realizar
microhematocrito o frotis sanguneos, aunque hay que tomar en cuenta las
desventajas que se tiene con la tincin de Wright.
Pruebas bioqumicas
Cuando se requiere realizar pruebas qumicas de la sangre, se necesita utilizarEDTA como anticoagulante, a menos que se vayan a cuantificar iones de calcio
o magnesio; el tubo a utilizar se caracteriza por tener un tapn de color mora-
do. El EDTA evita la coagulacin por eliminacin del calcio libre de la sangre.
La sangre tratada se puede utilizar para preparar extensiones hasta dos horas
despus de su extraccin, para esto, hay que mezclar minuciosamente la san-
gre si la concentracin de EDTA es superior a 2 mg/ml de sangre total. La san-
gre puede ser almacenada a 4C durante 24 horas sin efecto aparente sobre la
hemoglobina, el hematocrito, el nmero de leucocitos y de hemates; si por lo
contrario la sangre se almacena durante 4 horas a temperatura ambiente, apa-
rece un valor de hematocrito elevado an sin afectar los parmetros restantes.
Tcnica de colecta y manejo de excretas
La colecta y el manejo de las excretas es bsicamente la misma para todas las
especies, sin embargo, hay especificaciones dependiendo de la calidad de la
muestra. Por ejemplo, cuando se tiene la oportunidad de manipular al animal,se pueden obtener muestras frescas de heces. Las muestras frescas para anli-
sis parasitoscpico, en caso de no ser estudiadas inmediatamente, pueden ser
preservadas en formol al 4%, etanol al 70% o mantenerse en refrigeracin a 4C
(Friend y Franson 1999,Marks y Houston 2009). Nunca deben ser congeladas
debido a la posible destruccin de componentes diagnsticos, como el estalla-
miento de los huevos y oocitos de parsitos entricos.
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Tcnicas de muestreo cutneo
El raspado es la tcnica de exploracin que ms se utiliza para la piel. Cuando
se sospecha de dermatofitos (hongos o tias) es necesario cortar el pelo de la
zona afectada, ya sea con tijeras o con mquina. Despus se debe limpiar la
zona con una gasa limpia humedecida en alcohol 70% o agua estril, para reti-
rar detritus y los fragmentos de pelo cortado. Posteriormente, el pelo de la
periferia de la zona afectada es arrancado con pinzas y colocado en el por-
taobjetos y con una hoja de bistur se deben raspar los mrgenes de la lesin.
La muestra obtenida del raspado es colocada en un portaobjetos y protegida
con un cubreobjetos (Mueller 2000,Scott et al.2001).
Cuando se sospecha de acariasis (sarnas), despus de que se hace una limpie-za de la zona afectada como en la tcnica de colecta de dermatofitos, se pelliz-
ca la piel para extraer a los caros. Despus se coloca una o dos gotas de aceite
mineral sobre la piel que no escapen los caros y colectar fcilmente el raspa-
do con la hoja de bistur tan profundo hasta que salgan pequeas gotas de
sangre de la piel. El material recogido es colocado en un portaobjetos exten-
dindolo en una capa delgada y homognea, luego proteger con un cubreobje-
tos (Mueller 2000,Ballweber 2001,Scott et al.2001).
Tcnicas para colecta para estudios fisiolgicos
Actualmente existen varios tipos de tcnicas de deteccin de toxinas y otros
elementos que causan alteracin fisiolgica en los animales. El factor comn
para el diagnstico es mantener la muestra colectada en refrigeracin o conge-
lacin, a partir de animales muertos u otros elementos (p. ej., sedimentos, agua,
granos, etc.) (Friend y Franson 1999). Sin embargo, para el diagnstico in vivode
estos agentes etiolgicos y/o la alteracin fisiolgica producida, es necesario lacolecta de muestras de suero (Friend y Franson 1999), heces y orina (Hodges y
Heistermann 2003,Caney 2010).
La obtencin de suero para estos estudios se realiza a partir de sangre com-
pleta en tubos sin anticoagulante. Posteriormente es centrifugada a 4000 rpm
o se deja reposar para que se separe el paquete celular en dado caso de no con-
tar con una centrfuga (ver detalles en la seccin de obtencin de suero). El
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suero puede mantenerse en refrigeracin por periodos cortos, pero es reco-
mendable mantenerlo en congelacin.
La orina puede ser colectada en campo con el uso de bandejas, en el caso de
especies arborcolas; aspiracin con jeringa o pipeta, en el caso de encontrar
orina estancada o salpicada en las hojas; o por absorcin con papel filtro (Hod-
ges y Heistermann 2003). Si se captura al animal y se mantiene anestesiado, la
orina puede obtenerse por cistocentesis (Caney 2010).
Muchas hormonas son relativamente estables a temperatura ambiente por
varios das, las formas conjugadas de las hormonas son menos estables, lo
ideal es mantener la muestra de orina en refrigeracin para traslados cortos yposteriormente congelarla (
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gre completa por cada 5 ml de solucin. Otra opcin es la sustancia amorti-
guadora y preservadora de RNA, principalmente el RNAlater(Applied Biosy-
stemsLife Technologies, Van Allen Way, Carlsbad, California), con el cual se
pueden mantener las muestras a temperatura ambiente (25C) por una sema-
na o a 37C por 24 horas, pudindose utilizar tambin para preservar ADN.
Cuando el origen del ADN son plumas, las muestras frescas pueden mante-
nerse secas a temperatura ambiente durante dos semanas o hasta por un mes
a 4C y obtenerse ADN de alta calidad (Bello et al.2001). Tambin se pueden
almacenar en gel de silica y mantenerse secas a temperatura ambiente para no
degradar el ADN (Taberlet et al.1999,Balkiz et al.2007) o preservarse en eta-
nol al 70% (Balkiz et al.2007).
Las muestras de pelo deben tener el folculo y pueden obtenerse de manera no
invasiva que arranquen el pelo completo, tomando mayor importancia el
folculo piloso (Valderrama et al.1999,Zielinski et al.2006,Garca-Feria 2008,
Amndola-Pimienta et al.2009). El almacenamiento puede ser de la misma
manera que para las plumas. Se recomienda que el pelo sea almacenado en
bolsas de papel y mantenidas secas (Grossens et al.1998,Woods et al.1999,
Sloane et al.2000). El uso del gel de silica o la congelacin para el almacenaje
de muestras de pelo es la mejor opcin, siendo ms ventajosa la congelacin a
-20C (Roon et al.2003).
Las muestras fecales para estudios de ADN muchas veces no se pueden obte-
ner frescas. Las heces pueden utilizarse tanto frescas (Hoss et al.1992) como
secas (Wasser et al.1997,Daln et al.2004) para obtener las clulas epiteliales
del intestino presentes dentro y en la superficie de la excreta. No obstante, laaccin de las nucleasas presentes en la excreta puede degradar el ADN. Para
minimizar la degradacin por la interferencia de la enzima, se pueden usar
diferentes mtodos de preservacin como la deshidratacin por aire seco, alma-
cenamiento en etanol al 70%, congelacin a -20C, o el uso de sustancias amor-
tiguadoras que contengan altas concentraciones de sales (p. ej., DET,Frantzen
et al.1998). Distintas formas de colecta de ADN de manera no invasiva son des-
critas en Piggot y Taylor (2003). Una forma sencilla es la colecta de la excreta, su
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secado en papel absorbente y su almacenamiento en viales con gel de silica.
Con esta tcnica, la muestra puede tener una duracin de entre 3 das hasta 4
aos a temperatura ambiente antes de la extraccin del ADN (Regnaut et al.
2006). Si se cuenta con algn preservador y protector de cidos nucleicos (p.ej.,
RNAlater) la excreta fresca es la mejor eleccin (Vigilant y Guschanski 2009).
Para todas las muestras realizadas para la extraccin de ADN, hay que consi-
derar que deben ser protegidas de la humedad y de la exposicin a la luz ultra-
violeta para que no sea degradado el ADN (Lindahl 1993).
Consideraciones para el muestreo de agentes infecciosos
A continuacin se presenta un cuadro donde se enlistan de manera general lasmuestras adecuadas en funcin del sitio anatmico donde se replica el agente
etiolgico del que se sospecha.
La muestra puede ser transferida a un medio de transporte, siempre y cuan-
do tenga las caractersticas para conservar organismos anaerobios.
La muestra tomada debe ser representativa y tener un volumen suficiente
para el anlisis; es necesario tomar en cuenta la cantidad y el tipo de anlisis
que se realizarn. Las tcnicas de biologa molecular normalmente requieren
volmenes pequeos para proceder a la extraccin de cidos nucleicos, 1 ml
como mximo; para proceder al aislamiento de bacterias, hongos o virus, se
recomienda tomar una muestra de 3-5 ml en el caso de que sea lquida, frag-
mentos de 2 por 2 cm en el caso de que sean fragmentos de tejido, o un hisopa-
do que haya sido presionado contra la zona afectada o donde se espera encon-
trar el microorganismo y depositarlo en un medio de transporte. Cuando serealizan necropsias, es recomendable para estudios bacteriolgicos, seccio-
nar partes de los rganos afectados de manera que al arribar la muestra al
laboratorio, se pueda volver a seccionar para exponer zonas del tejido que no
han estado en contacto directo con el medio ambiente. Al recolectar heces, es
preferible que la muestra no entre en contacto con fuentes de contaminacin
natural como es el suelo o agua del medio ambiente, sino que sea depositada
en un contenedor estril. En todos los casos se debe proceder a tomar una
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Cuadro 1.1 Muestras adecuadas en funcin del sitio anatmico de estudio.
SITIO ANATMICO
Vas respiratorias altas
Vas respiratorias inferiores
Tracto urinario
Tracto genital
Heridas superficialesHeridas profundas
Piel
Tracto gastrointestinal
Sistema circulatorioSistema nervioso
Cavidad tica, ocular o bucal
MUESTRA ADECUADA
Hisopado farngeo, secreciones
Aspirados, biopsia
Orina (chorro medio, cateterizacino aspirado), hisopado uretral, biopsiade rin o vejiga
Hisopado uretral (macho)o vaginal (hembra)
Aspirados de pus o secrecionesAspirados, biopsia de tejido necrosado
Biopsia de piel, secreciones
Hisopado rectal, heces, biopsia de
tejido intestinal, hgado, estmago
Sangre, biopsia de corazn, bazo,lquido cefalorraqudeo, biopsia deencfalo, mdula espinal
Hisopado tico, ocular, bucal,aspirado de secreciones
EJEMPLO DE AGENTE ETIOLGICO
Virus de Influenza, Bordetella pertussis
Virus de Newcastle, Streptococcus pneumonia
Leptospiraspp., Enterococcusspp.
Brucellaspp., Citomegalovirus
Staphylococcus aureus,Clostridiumspp.
Erysipelothrix rhusiopathiae
Salmonellaspp., Strongyloidesspp.
Brucellaspp., virus DengueVirus de la Rabia, virus del Oeste del Nilo
Adenovirus, Herpesvirus, Candidaspp.
muestra lo ms limpia posible, es decir, que tenga una baja posibilidad de
contaminarse con agentes microbianos que se encuentran en el medio
ambiente, evitando de esa manera la obtencin de resultados falsos positivos;
de igual manera no se deben tomar muestras de animales o tejidos en descom-
posicin, pues la microbiota saprfaga puede enmascarar al patgeno que
pudo haber sido responsable de la mortalidad.
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Conservacin de la muestra
Uno de los factores clave para tener xito en un procedimiento diagnstico, es
la conservacin de la muestra, es decir, evitar la degradacin del sustrato a
agente que servir como detectable por un mtodo determinado; la eleccin
de un mtodo de conservacin depender principalmente del tipo de estudio
que se realizar.
La variedad de mtodos diagnsticos de enfermedades infecciosas es grande
y aumenta continuamente con el desarrollo y el uso de nuevas tecnologas, en
especial en las ltimas dcadas con la aparicin de tcnicas moleculares cada
vez de mayor sensibilidad; sin embargo, existen metodologas sencillas utili-
zadas desde hace muchos aos que siguen siendo la mejor opcin, pues com-binan caractersticas adecuadas en cuanto a sensibilidad, precio, facilidad en
anlisis y conservacin de muestras y representatividad epidemiolgica. Los
mtodos diagnsticos se podran dividir en funcin del mtodo requerido de
conservacin de la muestra (Cuadro 1.2).
La refrigeracin o congelacin de muestras en campo no siempre ser posible,
debido a que en muchas ocasiones no se contar con el instrumental suficien-
te, sin embargo se pueden hacer recomendaciones bsicas. Para mantener
refrigerada una muestra en campo, se recomienda usar refrigerantes en gel
contenidos en bolsas selladas, en el caso de no contar con ellas, se puede usar
hielo, teniendo cuidado de no generar una acumulacin exagerada de agua en
el contenedor de las muestras, que puede mermar su conservacin. Las mues-
tras que se requieren congelar, debern mantenerse en un contenedor con
hielo seco el mayor tiempo posible; es necesario recordar que el hielo seco
pasa a estado gaseoso continuamente y no deber ser almacenado en contene-dores sellados hermticamente.
A su vez, el mtodo de conservacin ser diferente dependiendo de la naturale-
za del patgeno que se requiere conservar, es decir, virus, bacteria, hongo, pro-
tozoario o helminto. Cada uno de ellos tiene diferentes niveles de susceptibili-
dad a factores del medio ambiente, por lo que existen sistemas ptimos para
cada uno de ellos, algunos factores bsicos a considerar son los siguientes:
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Cuadro 1.2Requerimiento de conservacin en funcin del mtodo diagnstico a utilizar.
REQUERIMIENTODE CONSERVACIN
Conservar viabilidaddel organismo
Conservar estructuradel organismo
Conservar estructurasubcelular del organismo
Conservar metabolitos
MTODOSDIAGNSTICOS
Aislamiento o cultivodel organismo patgeno,deteccin de actividadfenotpica
Observacin directa enbusca del agente
Deteccin de cidosnucleicos,protenas o lpidos
Deteccin de toxinas
o anticuerpos
ESTRATEGIADE CONSERVACIN
Refrigeracin en medioque evite proliferacin
Depsito de la muestraen solucin que evite
descomposicin y noafecte estructura
Congelacin de lamuestra en una solucinque detenga actividadbioqumica de degradacin
Congelacin sin diluir
EJEMPLOSDE CONSERVACIN
Hisopado en mediode transporteStuart en refrigeracin
Heces en solucin deformol al 10%
Hisopado farngeo enmedio de transporte viralen congelacin
Suero congelado
Cuando la muestra para hacer diagnstico viral es lquida, normalmente no
requerir usar medios de transporte, pero cuando sean hisopados o fragmen-
tos de tejido, es necesario sumergirlos en un medio de transporte que los pro-
teja. La resistencia de los virus depender de la complejidad de su estructura;
las muestras deben ser mantenidas a temperatura de refrigeracin, pero si el
transporte de la muestra tomar ms de 24 horas, se recomienda congelar enhielo seco. Los medios para transporte de virus en general contienen un regu-
lador de pH, protenas para estabilizar los virus y antibiticos para prevenir el
desarrollo de microbiota acompaante.
Las bacterias son un conjunto de organismos con capacidades metablicas
muy diversas, entre ellas podemos encontrar bacterias acidfilas y alcalfilas,
aerobias y anaerobias, psicroflicas y termoflicas; esta gran variedad hace
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difcil la eleccin del sistema de conservacin. En todos los casos requieren un
soporte que permita su viabilidad celular, proteja su maquinaria enzimtica
para poder metabolizar rpidamente sustratos en el laboratorio y no permita
la proliferacin de bacterias. Existen hoy en da muchos sistemas comerciales
para conservar bacterias segn sea el tipo: medios para bacterias anaerobias,
aerobias, esporulados y exigentes. No se deben congelar las muestras, pues la
clula bacteriana se ve muy afectada con los cristales de agua que se forman al
disminuir la temperatura.
Muchos hongos se caracterizan por tener estructuras de reproduccin resis-
tentes al medioambiente, sin embargo, algunos son muy sensibles a cambios
de temperatura y pierden viabilidad rpidamente, por lo que se recomiendatransportar las muestras a temperatura ambiente. Cuando las muestras no
sern entregadas para el procedimiento diagnstico en menos de 24 horas se
recomienda refrigerar, para evitar el crecimiento de bacterias acompaantes,
a menos que se use un medio con agentes antibacterianos. Los hongos son
microorganismos aerobios, por lo que no deben ser transportados o almace-
nados en contenedores que favorezcan las condiciones reductoras o sean
especializados en organismos anaerobios.
Los protozoarios y helmintos normalmente no son diagnosticados por mto-
dos de aislamiento o proliferacin, sino que se busca identificar estructuras
patognomnicas o movilidad caracterstica. En el caso de preservar las estruc-
turas se recomienda una solucin fijadora, como lo puede ser el formol en
solucin salina; las muestras que se encuentren en el agente fijador, no
requieren ser refrigeradas, pues en esa solucin no hay actividad metablica.
Cuando se busquen hemoparsitos, es recomendable hacer in situun frotis yfijarlo, de manera que se pueda hacer una tcnica de tincin en el laboratorio.
Medios de transporte para la muestra
Un medio de transporte se puede definir como un sistema en el cual se conser-
varn caractersticas seleccionadas de una muestra por un tiempo determina-
do. La complejidad de estos sistemas depender de las caractersticas de la
muestra que se requiera conservar; en el caso de requerir conservar la estruc-
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tura celular o pluricelular de un organismo para observacin microscpica,
como es el caso de quistes o huevos de algn protozoario o helminto intesti-
nal, se puede adicionar a la muestra un agente que detenga toda actividad
metablica y de degradacin de la muestra, sin que modifique la estructura
que buscaremos, como puede ser el formol al 10%, sin embargo, esa muestra
no ser til para el aislamiento de bacterias entricas. En el caso de requerir
conservar la viabilidad de un agente infeccioso para su aislamiento y amplifi-
cacin, como el aislamiento de un virus en un sistema de cultivo celular, se
requiere conservar la capacidad del organismo de multiplicarse, sin que haya
proliferacin del agente buscado ni otros organismos que pudieran enmasca-
rar su presencia. Si la metodologa que se usar para el diagnstico es cuanti-
tativa, es estrictamente necesario que la concentracin del sustrato a cuantifi-car no vare desde la toma de muestra hasta el anlisis, como pudiera ser la
cuenta viable de bacterias enteropatgenas en heces.
En el caso de ser un medio para transportar muestras cuyo diagnstico no
requerir la viabilidad del organismo, como es el caso de identificacin de
estructuras de resistencia (quistes) o de transmisin (huevos), tendrn compo-
nentes que eviten la degradacin de la muestra y no afecten la estructura que
se identificar, por ejemplo, una solucin de formol al 10% conservar de mane-
ra adecuada una muestra fecal para la identificacin de quistes de protozoa-
rios entricos. Si se espera observar movilidad microscpica de flagelados ent-
ricos, es necesario que la muestra de heces sea fresca y se analice lo ms pronto
posible o se mantenga en una solucin isotnica, como solucin salina al 0.8%.
Cuando el mtodo diagnstico se base en el aislamiento y crecimiento del
agente infeccioso, es de suma importancia mantener la muestra de maneraque no se pierda la viabilidad del organismo. La congelacin de una muestra
sin un adecuado crioprotector, afecta de manera significativa la cantidad de
clulas que permanecern viables al descongelar la muestra, por lo que es
recomendable mantener la muestra en refrigeracin a 4C.
En casos cuando se pretende diagnosticar a un patgeno que se encuentra en
bajas concentraciones en la muestra, se pueden usar medios de enriquecimien-
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SISTEMA DE TRANSPORTE
Tejido congelado
Tejido fresco (refrigerado)
Tejido en formol 10%
Heces frescas/ en solucin salina 0.8%, (refrigerado)
Heces en formol 10%
Hisopado en medio de transporte Amies*
(refrigerado)
Hisopado en medio de transporte Stuart*
(refrigerado)
Hisopado en medio Caldo Tetrationato*
Hisopado en medio de transporte viral
Exudado recolectado en jeringa (refrigerado)
Exudado recolectado en frasco (refrigerado)
APLICACIN
Inmunohistopatologa,
tcnicas de biologa molecular
Aislamiento de bacterias u hongos
Histopatologa
Observacin de patgenos entricos mviles
Observacin de quistes entricos
Aislamiento de bacterias anaerobias
Aislamiento de bacterias aerobias y hongos
Enriquecimiento para deteccin de Salmonellaspp.
Aislamiento y deteccin de virus
Aislamiento de bacterias anaerobias
Aislamiento de bacterias aerobias y hongos
Cuadro 1.3Ejemplos de algunos sistemas de transporte de muestra y su uso final.
CAPTULO UNO
* Ver Apndice II
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to para disminuir la cantidad de agentes acompaantes y promover el desarro-llo de algn agente etiolgico especfico. Como ejemplo, la inoculacin de un
hisopado rectal en el medio de enriquecimiento Caldo Tetrationato para enri-
quecer la muestra y lograr la identificacin de algunas baterias del gnero Sal-
monella.
Actualmente existen diferentes fabricantes de medios de transporte especia-
lizados para un gran tipo de muestras y de agentes infecciosos, entre ellas
podemos encontrar los sistemas: AssayAssure, Copan y BD (Fig. 1.1).
El contacto con el laboratorio diagnstico
Al recolectar la muestra es necesario tomar todos los datos que pudiera
requerir el laboratorio que realizar el diagnstico, como son: especie del ani-
mal del que se recolect la muestra, sexo, signos observados, tipo de muestra
recolectado, fecha de toma y envo de muestra, administracin previa de anti-
biticos, tipo de conservacin que se us y medio de transporte utilizado. Se
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Figura 1.1.Sistemas comerciales para el transporte de muestras. A) sistema AssayAssure; B)
sistema de hisopados bacteriolgicos Copan; C) sistema de transporte viral de BD.
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42CAPTULO UNO
debern incluir todos los datos en un documento en donde se enliste la canti-
dad de muestras que se envan, los diagnstico(s) que se solicita(n), nmero
de identificacin de cada muestra, zona geogrfica donde se recolect y el
nombre y procedencia del personal encargado de la toma, transporte y envo
de las muestras.
Bioseguridad
Cuando se presenta una mortalidad o morbilidad en animales, al tomar la
muestra es necesario considerarla como potencialmente infecciosa, pues exis-
ten muchos patgenos de animales que pueden causar patologas en los huma-
nos, algunas de ellas muy graves. Se recomienda tomar la mayor cantidad de
precauciones posibles que se puedan aplicar en el campo; entre los requeri-mientos bsicos estn: guantes de ltex, cubre bocas, lentes de seguridad y, de
ser posible, el uso de batas desechables; el sitio donde se toma y maneja la
muestra deber ser desinfectado antes y despus de su uso con una solucin
de cloro al 5%. Es muy importante que el personal o instrumentacin utilizada
en el muestreo no se conviertan en fmites que pudieran diseminar la enfer-
medad infecciosa a otras regiones geogrficas, esto se evitar si se utiliza ropa
exclusiva para el muestreo y se desecha cada vez que se usa. Las muestras
deben recolectarse en contenedores resistentes al transporte y envo, y ade-
ms, embalarse de manera que no representen riesgo al personal que las
transporta y recibe. Deben ser etiquetadas o marcadas con tal seguridad de
que durante la conservacin o el envo no se pierda el control sobre la identi-
dad de cada una de las muestras.
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APNDICE ITipo de muestra dependiendo del anlisis requerido
y su posibilidad de realizarlo en campo.
MUESTRA
Sangre completa
Plasma
Suero
ANLISIS
Hematologa
Patgenos
Toxicologa
Inmunologa
Gentica
Qumica
Qumica
Endocrinologa
Inmunologa
Toxicologa
OBJETIVO DEL DIAGNSTICO
Conteo eritrocitos y leucocitos
Hematocrito
Tasa de sedimentacin eritroctica
Frotis para conteo celularFrotis para bacterias
Frotis para hemoparsitos
Aislamiento bacteriano
Pesticidas
Anticuerpos
Extraccin ADN
Vitaminas, minerales y metales
Enzimas, electrolitos
Hormonas
Globulinas, anticuerpos
Pesticidas
ANLISIS
IN SITU
Posible
S
S
SS
S
No
No
No
No
No
Posible
No
No
No
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APNDICE IIMEDIOS Y REACTIVOS
Formol 4 y 10%Reactivos para un litroFormol 4 o 10 mlAgua destilada
96 o 90 ml
Lysis buffer(Longmire et al.1997)ReactivosTrisHCl 2 M, pH 8.0 50 ml
EDTA 0.5 M, pH 8.0
200 mlNaCl 5 M 2 mlAgua bidestilada 975 mlSDS 20% (peso/volumen). 25 ml
Solucin salina fisiolgica al 0.9 %ReactivosCloruro de sodio 0.9 gAgua destilada c.s.p. 100 ml
Procedimiento: Mezclar el cloruro de sodio en el agua destilada, una vezlista la solucin, guardar en frasco en un lugar fresco.
Colorante de WrightReactivosColorante de Wright 0.3 gMetanol (CH3 OH) 100 mlGlicerol 3.0 mlProcedimiento: Disolver en un mortero el colorante con el glicerol, unavez disuelto se adiciona el metanol trasvasndolo a un frasco mbar.Posteriormente se debe de agitar y filtrar antes de usar.
Caldo TetrationatoReactivosPeptona Proteosa 2.5 g/LCasena Pancretica Digerida 2.5 g/LOxgall 1 g/L
CAPTULO UNO
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Tiosulfato de Sodio 30 g/LCarbonato de Calcio 10 g/LPreparacin: Disolver los componentes en agua desionizada y hervir,enfriar a 60C. Agregar 2 ml de solucin de iodo (6 g de cristales de iodo
y 5 g de ioduro de potasio en 20 ml de agua desionizada) por cada 100ml de medio. No recalentar o esterilizar en autoclave. Usar inmediata-mente. pH final 8.4 0.2. Usar controles microbiolgicos para evaluar elcorrecto funcionamiento.
Medio de transporte AmiesReactivosCloruro de Sodio
3 g/LCloruro de Potasio
0.2 g/L
Cloruro de Calcio
0.1 g/LCloruro de Magnesio
0.1 g/LFosfato de Potasio Monobsico
0.2 g/LFosfato de Sodio Dibsico
1.15 g/LCarbn Vegetal
10 g/LAgar
4 g/LPreparacin: Disolver los componentes en agua desionizada, hervir ydistribuir en tubos con tapn de rosca. Esterilizar a 121C por 15 minu-
tos; pH final 7.3 0.2. Usar controles microbiolgicos para evaluar elcorrecto funcionamiento.
Medio de transporte StuartReactivosTioglicolato de Sodio 1 g/LGlicerofosfato de Sodio 10 g/LCloruro de Calcio 0.1 g/LAzul de Metileno 2 mg/L
Agar
3 g/LPreparacin: Disolver los componentes en agua desionizada, hervir ydistribuir en tubos con tapn de rosca. Esterilizar a 121C por 10 minu-tos; pH final 7.3 0.2. Usar controles microbiolgicos para evaluar elcorrecto funcionamiento.
RNAlater
Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. Ambion, Inc.Applied Biosystem, Referencia: AM7020, AM7024, AM7021, AM7022,
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AM7023Qiagen. Referencia 76104, 76106.SigmaAldrich. Referencia R0901.
Algunos sistemas de transporte de muestrasThermo Scientific, Sistema AssayAssure(http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productscaralog_11152_L11023_97173_1_4)
Copan(http://www.copanusa.com/index.php)
BectonDickinson
(http://www.bd.com/ds/productCenter/CT.asp)
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APNDICE III
ALGUNOS LABORATORIOS DE DIAGNSTICO EPIDEMIOLGICO EN MXICO.
Laboratorio de Medicina de ConservacinEscuela Superior de Medicina. Instituto Politcnico Nacional. Plan de San Luisy Daz Mirn s/n, Col. Casco de Santo Toms, Del. Miguel Hidalgo, C.P. 11340,Mxico DF, Mxico. Tel.: 57296000 ext. 62753.Correo electrnico: [email protected].
Departamento de Microbiologa e InmunologaFacultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autno-
ma de Mxico. Servicio de diagnstico: tels.: 01 (55) 56 22 59 00 / 01 / 03, Fax:01 (55) 56 22 59 71.http://www.fmvz.unam.mx/fmvz/servicios/s_microbiologia.html
Instituto de Diagnstico y Referencia Epidemiolgica, Secretara de SaludFederalBenjamn Franklin #132 Col. Escandn Del. Miguel Hidalgo, C.P. 11800. Mxi-co, DF.Tels.: 2614 6892 al 96http://www.cenavece.salud.gob.mx/indre/interior/servicios.html
Comisin MxicoEstados Unidos para la Prevencin de la Fiebre Aftosa yOtras Enfermedades Exticas de los AnimalesSAGARPACPA. Km. 15.5 Carretera MxicoToluca, Col. Palo Alto, DelegacinCuajimalpa, C.P. 05110, Mxico D.F.
Laboratorio de Entomologa Mdica
Universidad Autnoma de Nuevo Len. Pedro de Alba s/n, Ciudad Universita-ria. C.P. 66451. San Nicols de los Garza, Nuevo Len. Mxico.
Centro de Investigaciones Regionales Hideyo Noguchi. Universidad Aut-noma de Yucatn. Unidad Itzes. Avenida Itzas # 490 x Calle 59. Colonia Cen-tro C.P. 97000 Mrida, Yucatn, Mxico. Tels.: (999) 9245809,9245755, Fax:(999) 9236120. Email: [email protected]
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INTRODUCCIN
Los parsitos representan el tipo de vida ms exitoso en la Tierra, dado que se
estima que ms del 50% de los organismos son parsitos, y esta cifra vara
dependiendo de la definicin de parsito que se use (Poulin y Morand 2000,
Poulin 2007). El parasitismoen trminos generales se define como una rela-
cin o simbiosis en la cual uno de los participantes, el parsito, daa a su hus-
ped o vive a expensas de l (Schmidt y Janovy 2009). Normalmente una rela-
cin parasitaria se representa con los smbolos +/, que indican que un orga-
nismo, el parsito, se beneficia (+) y otro, el husped, es perjudicado ( -)
(Schmidt y Janovy 2009). En los animales el parasitismo ha evolucionado o
aparecido al menos 60 veces de manera independiente (Poulin y Morand 2000).
Cuando un parsito vive sobre la superficie del husped se le conoce como
ectoparsitoy si vive dentro del husped se le llama endoparsito (Schmidt y
Janovy 2009). La mayora de los parsitos son parsitos obligados, es decir,estos no pueden completar su ciclo de vida sin pasar al menos parte de su vida
infectando a un husped. Existen parsitos facultativos, los cuales no son
normalmente parasticos pero pueden convertirse en parsitos cuando acci-
dentalmente son comidos o entran en una herida u otra cavidad del husped.
Cuando un parsito entra o se adhiere a una especie de husped que es dife-
rente a la de su husped normal, entonces se le conoce como un parsito acci-
dentalo incidental. Algunos parsitos viven todo el tiempo dentro o sobre su
captulo dosTcnicas de campo y laboratorio para el estudio de parsitos
sanguneos del orden haemosporida en aves terrestresDiego Santiago-Alarcon
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husped, a estos se les llama parsitos permanentes (p. ej. piojos, parsitos
de malaria), mientras que un parsito temporalo intermitente (p. ej. mosqui-
to, chinche) nicamente se alimenta del husped y luego se retira. Los parasi-
toides son insectos como avispas (Hymenoptera) o moscas (Diptera) que
inyectan sus huevos en un husped, el cual es por lo regular otro insecto ms
pequeo, y donde se desarrollan las etapas inmaduras de la avispa o mosca y
finalmente matan al husped cuando emergen. Los parsitos protoleanos
son aquellos insectos en los cuales solo las etapas inmaduras son parasticas.
Finalmente, muchos parsitos son huspedes de otros parsitos, a esta condi-
cin se le conoce como hiperparasitismo(p. ej. un caro sobre un mosquito,
Schmidt y Janovy 2009).
Los parasitlogos definen varios tipos de husped, dependiendo del papel
que el husped juega en el ciclo de vida del parsito. El husped definitivoes
aquel organismo en donde el parsito alcanza su madurez sexual. Algunos
estudios han mostrado que no existe reproduccin sexual en algunos parsi-
tos (p. ej. amebas y muchos trypanosomas), en estos casos el husped definiti-
vo se define de manera subjetiva, como aquel que es ms importante para los
humanos. El husped intermedioes aquel que se requiere para llevar a cabo
una etapa de desarrollo del parsito, pero no se alcanza la madurez sexual en
dicho husped. Un husped paratnicoo de transporte es aquel en el cual el
parsito no lleva a cabo ningn tipo de desarrollo, pero se mantiene vivo y
puede infectar a otro husped. Cualquier animal que trae consigo un agente
infeccioso que puede ser transmitido al humano se le conoce como husped
reservorioo simplemente reservorio, an cuando dicho animal sea un hus-
ped normal para el parsito, es decir un reservorio puede ser un husped defi-
nitivo, intermedio, o paratnico (Schmidt y Janovy 2009).
En una relacin parasitaria puede haber ms de un husped, lo cual depende
del parsito que se estudie. Los ciclos de vida de los parsitos pueden ser sim-
ples o complejos. Por ejemplo, los piojos (Insecta: Phthiraptera) tienen un ciclo
de vida simple, en donde el parsito pone sus huevecillos sobre el husped, los
cuales pasan por varias etapas de desarrollo (ninfas) sobre el mismo husped
hasta llegar al adulto, y se repite nuevamente el ciclo (Schmidt y Janovy 2009).
CAPTULO DOS
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Su modo de transmisin es principalmente vertical (de padres a hijos), aunque
tambin puede presentarse transmisin horizontal (entre individuos de una
misma poblacin o de diferentes especies) (Whiteman et al.2004). Por el con-
trario, los gusanos nemtodos (Phylum: Nematoda) han evolucionado ciclos de
vida complejos, en donde interviene ms de un husped (Poulin 2007). Por
ejemplo, el gusano Gnathostoma spinigerum(Nematoda: Gnathostomatidae)
tiene un husped definitivo (p. ej. gato), de dos a tres hospederos intermedios
(coppodo, anfibio o pez), y varios hospederos paratnicos (humanos, cerdos,
aves o vboras) (Schmidt y Janovy 2009). La complejidad del ciclo de vida de un
parsito tiene fuertes implicaciones para su control mdico. Si no se conoce
con certeza las diferentes etapas del ciclo de vida existe una alta probabilidad
de que los intentos por controlar una epidemia fallen; o en el mejor de loscasos, se puede gastar ms dinero del que se debera debido a que no se est
atacando la etapa del ciclo de vida del parsito que es ms susceptible, y que
producira la mayor reduccin en el tamao poblacional del parsito.
La diversidad de los parsitos