MARTIN POIRIER

FRACTIONNEMENT ET CARACTÉRISATION

DE LA CHITINE DANS LE SYSTÈME

N,N-DIMETHYLACÉTAMIDE 1 CHLORURE DE LITHIUM

Mémoire

présenté

à la Faculté des études supérieures

de l'Université Laval

pour l'obtention

du grade de maître ès sciences (M.Sc.)

Département de chimie

FACULTÉ DES SCIENCES ET DE &NIE

UN IVERSITÉ LAVAL

O Martin Poirier, 2000

National Library 1*1 of Canada Bibliothèque nationale du Canada

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La chitine, le deuxième bio-polymère en abondance, ea ses principaux

dérivés, sont utilisés dans une vaste gamme d'applications allant de l'agriculture

au domaine biomédical. Plusieurs de ces applications nécessitent un contrôle

étroit de la masse moléculaire et de la polymolécularité. On ne trouve pas, dans

la littérature, un procédé permettant le fractionnement de la chitine sur

l'ensemble des espèces moléculaires présentes dans la distributison naturelle.

Le présent travail est principalement axé sur la mise au point d'une

méthode de fractionnement par extractions sélectives sur un coacervat. Le

système N,N-diméthylacétamide / chlorure de lithium (DMAc / LiCI) est un solvant

de la chitine qui présente les caractéristiques permettant de mentre en place une

telle procédure. Un essai de fractionnement par gélification sélective à

température élevée est également discuté. La chromatogra phie d'exclusion

stérique dans DMAc 1 LiCl 5% en double détection avec la réfractométrie et la

diffusion de la lumière permet une caractérisation massique complète des

fractions obtenues. Les constantes de l'équation de Mark-Houwink-Sakurada de

la chitine dans ce même système de solvant ont aussi été déterminées.

REMERCIEMENTS

Je tiens d'abord à remercier mon directeur de recherche, Monsieur Gérard

Charlet, pour ses importants conseils, sa disponibilité et la confiance accordée

tout au long du projet.

Je remercie également Messieurs Alain GuiIIou, Dany Pelletier, Pierre

Blier et Marcel Levesque, de l'entreprise rimouskoise Aqua-Biokem BsL, pour le

soutien financier et l'espoir d'un avenir prometteur.

Je remercie aussi le Conseil de Recherche en Sciences Naturelles et en

Génie du Canada (CRSNG) de m'avoir accordé une bourse d'études supérieures

à incidence industrieHe.

Merci aux examinateurs de ce mémoire, la professeure Josée Brisson et le

professeur Mario Leclerc, pour les différentes corrections suggérées.

Merci a tous les membres du CERSIM, enseignants, professionnels de

recherche et étudiants, parmi lesquels je me suis fait de bons amis.

Merci beaucoup à mes parents, Denise et Viateur, de m'avoir toujours

encouragé et fortement appuyé dans mes nombreuses démarches.

Merci également à Julie Dionne pour le soutien moral 2t la motivation

apportée durant les deux dernières années.

iii

TABLES DES MATIÈRES

œ œ

RESm'IE -----_____-_--------------------------------------------*--** * --------------- * ...................................

REMERCIEMENTS .-*_------__-__----------------------------------------------------------------------.---------

TABLE DES MATIÈRES -----------------------*------------------------------------------ ** -----*-----------

LISTE DES Fm.JRES --------------------*------------------------*-----------*-------------------------*--*---

CHAPITRE I - INTRODUCTION

CHAPITRE II - PURIFICATION ET CARACTÉRISATION DE LA CHITINE

Chromatographie d'exclusion stérique .---a--*----------------- e -

Réfmctometrre .------- * -------**-.+--------------------------------------*--- *--

. . Diffusion de la hl iere ------_-_-_--- *

Détermination de l'incrément d'indice de réfraction

en fonction de la concentration de chitine ----------.--_-----

Méthode et résultats .------ * -----------------------------.--------- * -----*--

CHAPITRE III - FRACTIONNEMENT DE LA CHITINE

3.1 Intmduction *----------------------.--------------.----- * * ****----------------------------.-.-------------- 60

3.4 Détermination de l'équation de Mark-Houwink-Sakurada --------.-------

3-4-1 MétkKXfe .____--- * -_----------------------------------------------*---------------,-----------------

3.42 Résultats et discussion *_______-__________---------------------------- * -----------------

CHAPITRE IV - CONCLUSION ET PERSPECTIVES

LISTE DES FIGURES

Figure 1 -1

Figure 1.2

Figure 1.3

Figure 1.4

Figure 1.5

Figure 2.1

Figure 2.2

Figure 2.3

Figure 2.4

Figure 2.5

Figure 2.6

Structure chimique de la chitine et du chitosane

Repliements de chaînes proposes pour la chitine-a

La structure de la chitine-a (plans bc et ab)

Mécanisme proposé pour la solubilisation de la chitine

Courbe de distribution schématisée d'un polymère

polymolécu laire

Lien covalent probable dans le complexe chitine-

protéine

Purification initiale de la chitine (procédé ABK modifié)

Dernières étapes de purification de la chitine

Spectre infrarouge de la chitine purifiée non fractionnée

Courbe d'étalonnage utilisée pour la détermination du

degré d'acétylation de la chitine par spectroscopie

infrarouge

Détermination de la viscosité intrinsèque de la chitine

non fractionnée dans DMAc / LiC15%

vii

Figure 2.7

Figure 2.8

Figure 2.9

Figure 3.1

Figure 3.2

Figure 3.3

Figure 3.4

Figure 3.5

Figure 3.6

Schéma illustrant de manière simplifiée le mécanisme 43

de migration différentielle dans une colonne de SEC

Graphique de Debye pour une tranche du volume 57

d'élution de la chitine non fractionnée

Chromatogramme de la chitine non fractionnée obtenu 59

par chromatographie d'exclusion stérique en double

détection

Détermination de la viscosité intrinsèque des fractions 64

obtenues par gélification sélective

Observation par microscopie optique de la dispersion 69

du coacervat pendant la première extraction (après 10

minutes d'agitation)

Observation par microscopie optique de la dispersion 69

du coacervat pendant la première extraction (après 30

minutes d'agitation)

Observation par microscopie optique de la dispersion 70

du coacervat pendant la première extraction (après 45

minutes d'agitation)

Observation par microscopie optique de la dispersion 70

du coacervat pendant la première extraction (après 90

minutes d'agitation)

Schématisation du parcours de fractionnement par 72

extractions sélectives sur un coacervat

viii

Figure 3.7

Figure 3.8

Figure 3.9

Influence de la formation du coacervat sur le parcours 73

de fractionnement

Détermination de la viscosité intrinsèque des fractions 75

de chitine obtenues par extractions sélectives sur un

coacervat

Chromatogrammes de quelques fractions obtenues par 76

extractions sélectives sur un coacervat

Figure 3.10 Reconstitution de la courbe d'élution de la chitine non 81

fractionnée par addition des chromatogrammes des

fractions obtenues

Figure 3.1 1 Détermination des constantes de l'équation de Mark- 84

Houwink-Sakurada de la chitine dans DMAc / LiCl5%

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1.1 Arrangement des chaînes dans les trois formes de 4

chitine

Tableau 1.2 Solvants répertoriés pour la chitine 9

Tableau 1.3 Applications reliées à la chitine et à ses principaux II

dérivés

Tableau 1 -4 Description des masses moléculaires moyennes 14

utilisées

Tableau 1.5 Exemples d'applications nécessitant un contrôle de la 22

masse moléculaire

Tableau 2.1 Teneur en azote et en carbone de la chitine calculée en 31

fonction du degré d'acétylation

Tableau 2.2 Résultats des analyses pour la détermination de la 31

teneur en protéines résiduelles dans la chitine

Tableau 2.3 Résultats des analyses de degré d'acétylation par 36

spectroscopie infrarouge

Tableau 2.4 Résultats des analyses de masse moléculaire de la 58

chitine non fractionnée par chromatographie d'exclusion

stérique en double détection

Tableau 3.1 Résultats de l'essai de fractionnement par gélification 63

sélective

Tableau 3.2 Résultats du fractionnement par extractions sélectives 77

sur un coacervat

Tableau 3.3 Viscosité intrinsèque de fractions obtenues après 80

différentes périodes d'extraction

Tableau 3.4 Fractions provenant de différents essais de 83

fractionnement par extractions sélectives sur un

coacervat ayant également été utilisées pour la

détermination des constantes de I'équation de Mark-

Houwink-Sakurada de la chitine dans DMAc / LiCl 5%

Tableau 3.5 Comparaison des valeurs des constantes a et K de 85

I'équation de Mark-Houwink-Sakurada de la chitine

dans DMAc / LiCi 5% provenant de la littérature

LISTE DES SYMBOLES

AE

C

CES

CLHP

C.V.

DA

DCA

DMAc

DMF

dn/dc

GPC

h

He-Ne

I

le

1e.ç

1 O

K (éq. 12)

K (éq. 4)

k"

k'

constante de l'équation de Mark-Houwink-Sakurada

second coefficient du viriel dans l'expression de la pression

osmotique

analyse élémentaire

concentration

chromatographie d'exclusion stérique

chromatographie liquide haute performance

coefficient de variation

degré d'acétylation

acide dichloroacetique

NI N-diméthylacétamide

diméthylformamide

incrément d'indice de réfraction en fonction de la concentration

chromatographie par perrnéation de gel

heure

hélium-néon

indice de polymolécularité

intensité de la iumière diffusée par le soluté

intensité de la lumière diffusée par le solvant

intensité de la lumière incidente

constante de calibrage du réfractomètre

constante de l'équation de Mark-Houwink-Sakurada

constante de Kraemer

constante de Huggins

coefficient de partage

masse

mole / litre

masse moléculaire

xii

MeOH

MHS

Mn

MP

M"

N

nl

n2

NA

N-F

ni

nm

NMP

no

P/P

P/V R

r (éq. 14)

r (éq. 5)

R(0)

ri

RMN I3c RMN 'H

rpm

RSP S

SEC

T

méthanol

Mark-Houwink-Sakurada

masse moléculaire moyenne en nombre

masse moléculaire moyenne en poids

masse moléculaire moyenne viscosimétrique

nombre de plateau théorique

nombre de moles de solvant

nombre de moles de polymère

nombre d'Avogadro

non fractionnée

nombre de molécule de l'espèce i

nanomètre (1 m)

N-méthylpyrrolidone

indice de réfraction du solvant

fonction de diffusion

poids / poids

poids / volume

constante molaire des gaz

distance entre le détecteur et le volume diffusant

nombre de segments par chaîne de polymère

rapport de Rayleigh

distance entre le centre de masse d'une particule et l'espèce de

masse i

résonance magnétique nucléaire du carbone

résonance magnétique nucléaire du proton

révolution par minute

résolution spécifique

écart type

chromatographie d'exclusion stérique

température

temps d'écoulement de la solution de polymère

xiii

TCA

TCDI

THF

to v vc Vd

ve

vi VP W

h

acide trichloroacétique

température critique de démixtion inférieure

tétrahydrofuranne

temps d'écoulement du solvant

volume élémentaire diffusant

volume de la phase concentrée

volume de la phase diluée

volume d'élution

volume interstitiel

volume poreux

largeur de pic à la base

longueur d'onde

paramètre d'interaction polymère-solvant

coefficient d'absorptivité molaire

viscosité de la solution

sucre dans sa forme cyclique dont le groupement hydroxyle

attaché au carbone anomérique est en position équatoriale

angle entre la direction d'observation et la direction du faisceau

incident

fraction volumique du solvant

fraction volumique du polymère

énergie libre de mélange

enthalpie de mélange

entropie de mélange

viscosité du solvant pur

viscosité relative

viscosité spécifique

viscosité intrinsèque

rayon de giration d'une particule

CHAPITRE I

INTRODUCTION

1.1 La chitine

1 .l .f Introduction

La quantité annuelle de chitine produite par biosynthèse en fait le

deuxième bio-polymère en abondance après la cellulose. On retrouve la chitine

chez plusieurs organismes comme constituant important de l'exosquelette

(crustacés, insectes, mollusques ...) et aussi comme principal polymère fibrillaire

dans les parois cellulaires de quelques champignons et de certaines algues

chlorophycées.'

On estime mondialement a 10" tonnes métriques environ la quantité de

chitine produite annuellement par biosynthèse? Au Québec, on évalue à environ

700 tonnes potentielles par année la chitine provenant uniquement des résidus

de pêche^.^

La chitine est un poly[~-(l+4)-2-acétarnido-2-deoxy-D-glucopyranose]

(figure4 .l), soit une structure linéaire très similaire à celle de la cellulose (poly[p-

(1+4)-D-glucopyranose] ). La similarité de ces deux structures se reflète bien

dans les rôles communs, structural et protecteur, joués par les deux polymères

dans la nature. Le nom « chitine » provient du mot grec « XLZOV » qui signifie

tunique, cotte de mailles.'

Le chitosane, le principal dérivé de la chitine, est obtenu par N-

déacétylation en milieu alcalin concentré. On le retrouve chez certains

champignons et certains insectes, mais son abondance est beaucoup moins

étendue que celle de la chitine.' Le chitosane est un poly[P-(1-4)-2-amino-2-

deoxy-O-glucopyranose] (figure 1 .1).

chitine

r

L

chitosane

Figure 1.1 Structure chimique de la chitine et du chitosane

Jusqu'à présent, la chitine pure fut seulement identifiée dans les épines

extracellulaires des diatomées Thalassiosira fluviatilis et Cyclofella ~ry-ptica.~ Le

poly[~-(I+4)-2-acéiamido-2-deoxy-D-glucopyranose], en tant qu'entité, est donc

normalement obtenu au laboratoire après plusieurs procédures de purification

nécessaires à l'enlèvement des autres constituants (protéines, minéraux,

lipides ...) présents dans les tissus d'un organisme. Hackman a proposé le terme

« chitine native » afin de distinguer la chitine présente dans un réseau complexé

de la chitine isolée et purifiée.=

1 .1.2 Structure chimique et état physique

La chitine fut isolée pour la première fois en 181 1 par ~raconnot.~ II obtint,

à partir de champignons, une fraction résistante aux solutions alcalines

concentrées. Le composé, qu'il nomma « fungine », était toutefois un mélange

de chitine et d'un autre polysaccharide non-azoté. En 1823, Odier isola un résidu

insoluble, qu'il appela chitine, à partir de carapaces de scarabées par des

traitements répétés avec des solutions chaudes de KOH.~ Par leur méthode

d'extraction I transformation, il est probable que Braconnot et Odier ait finalement

obtenu du chitosane plutôt que de la chitine. Le chitosane fut décrit et reconnu

pour la première fois en 1859 par Rouget et nommé en 1894 par Hoppe-

~ e ~ l e r . ~ ~ ~ Chitine, chitosane et cellulose ont été confondus pendant longtemps.

En 1886, Tiemann confirma la présence d'un groupement amine sur le carbone 2

et la configuration D-glucose du chitosane." Ce n'est qu'en 1912 que Brach et

von Fürth conclurent que la chitine était un N-acetyl-D-glucosamine polymérisé."

Bien d'autres découvertes importantes permirent de décrire encore plus en

détails la structure chimique de la chitine. Une revue historique plus complète

est présentée dans le livre « Chitin Chemistry D.'

Les termes chitine et chitosane sont fréquemment utilisés dans la

littérature, mais aucun des deux termes ne représente une structure chimique

unique. En fait, il n'y a pas vraiment de frontière structurale fixe entre les deux

composés. II s'agit plutôt d'un continuum de différents copolymeres d'unités N-

acetyl-D-glucosamine et d'unités D-glucosamine où le chitosane se distingue par

sa solubilité en soluticns aqueuses acides diluées. On définit ainsi chaque

copolymere par un degré d'acétylation (DA), soit par le pourcentage d'unités

acétylées dans la chalne de polymère. La transition chitine - chitosane se produit

à un degré d'acétylation de 50% environ, mais c'est toutefois la solubilité en

solutions aqueuses acides diluées qui déterminera l'appellation du copolymère.

Varum et collaborateurs ont démontré par RMN 'H et 13c, que les unités

acétylées et non-acétylées dans la chitine et le chitosane étaient distribuées de

façon aléatoire (distribution bernoulliene).12

La chitine possède une structure cristalline très ordonnée. On la retrouve

sous trois formes polymorphes (a, P et y) qui diffèrent selon l'arrangement des

chaînes dans la région cristalline (tableau 1 .A).' La chitine-a est la forme la plus

abondante et semble aussi être la plus stable puisque les chitines+ et -y peuvent

être transformées en chitine-a par des traitements appropriés.4v13114 Blackwell

suggéra en 1988 que la chitine y soit un mélange distordu de chitines-a et -P plutôt qu'une troisième vraie forme poiymorphe.15

Tableau 1.1 Arrangement des chaînes dans les trois formes de chitine

Forme

--

Arrangement des ~haines

-

Schématisation

Chitine-a Antiparallèie

Chitine+ Parallèle

Chitine? Deux parallèles pour une anti-parallèle

Les arrangements de chaînes antiparallèle dans la chitine-a et parallèle I

antiparallèle dans la chitine-y proviennent des repliements de la chaîne sur elle-

même. Le phénomène des repliements de chaînes dans les polymères fut

observé pour la première fois en 1957 lors de la séparation de cristaux simples

de polyéthylène.16 En 1967, Ruda11 proposa l'arrangement représenté à la figure

1.2 pour la chitine-a.17 En support à cette proposition, des feuillets de trois

chaînes d'épaisseur furent observés dans plusieurs complexes chitine-a-protéine

par microscopie électronique.'?

La chitine-a est constituée de mailles cristallines orihorhombiques (groupe

d'espace P212,2~, a = 4.74 A, b = 18.86 A, c = 10.32 A) ou I'axe c est dans le

sens de la fibre (figure 1.3). '8p19 Par la présence de nombreuses liaisons

hydrogène interchaînes parallèles à I'axe a, les chaînes de chitine sont empilées

en feuillets et sont alignées dans une même direction a l'intérieur de chaque

feuillet. Les liaisons hydrogène interfeuillets dans la chitine-a (absentes dans la

chitine+) sont en majeure partie responsables de sa grande résistance au

gonflement dans l'eau et conséquemment, de sa plus grande abondance dans la

nature.

Figure 1.2 Repliements de chaînes proposes pour la chitine-a

: atome d'oxygéne 1 - liaison hydrogène intrachaîne [ (C3)-OH. -. . . .O (cyde) ] 2- liaison hydrogène intrachaine [ (CG)-OH.. . . . .O=C (C2) ]

: atome d'azote 3- liaison hydrogène interchaîne [ (C6)-OH.. . . . .OH-(C6) ] 4- liaison hydrogène interchaine f (C2)-NH...---O=C (C2) ] 5- liaison hydrogène interchaine [ (C6)4lH,. . . ..OH-(C6) ]

Figure 1.3 La structure de la chitine- (plans bc et ab)

1.1 -3 Solubilité

Malgré la similarité structurale, la chitine est insoluble dans les solvants

usuellement utilisés pour la cellulose (solutions aqueuses d'hydroxyde de

cuprammonium, de cupriethylenediamine et de cadoxen).' Quelques autres

systèmes de solvants exotiques » furent ainsi mis en place afin de contourner

cette situation. On peut regrouper ces systèmes en trois catégories : les

solutions aqueuses de sels neutres, les solvants acides, et les solvants

organiques neutres (tableau 1.2).

Les mélanges de N,N-dirnéthylacétamide (DMAc) / chlorure de lithium

(LiCI) et de N-rnéthylpyrrolidone (NMP) 1 LiCl utilisés pour la solubilisation de la

chitine furent découverts en 1977 par ~ust in .~ ' Rutherford et Austin comparèrent

l'efficacité de ces deux systèmes de solvants à plus de 200 autres systèmes

potentie~s.~' Ils conclurent que DMAc 1 LiCl et NMP 1 LiCl présentaient les

propriétés les plus intéressantes pour la solubilisation de la chitine. À

température ambiante, ces systèmes n'engendrent pas de dégradation ni de

modification chimique. Une solution de chitine dans DMAc / LiCl 5% (plp) peut

conserver sa viscosité initiale pendant une période de 48 jours.21 Plusieurs

études par RMN démontrent qu'il n'y a pas de réaction entre la chitine et DMAc 1

LiCl 5%, donc qu'il s'agit d'un vrai solvant de la chitine.' On peut utiliser DMAc 1

LiCl (48% p/p) pour différentes méthodes de mesure de masse moléculaire

(viscosimétrie", chromatographie d'exclusion stérique et diffusion de la

26), pour la synthèse de dérivés de chitine en conditions h~rnogenes~'*~~ et aussi 32.33 pour la préparation de fibre^^'-^' et de films .

La solubilité de la chitine dans DMAc 1 LiCl semble dépendre du degré

d'acétylation. Plus le degré d'acétylation est élevé, plus le pourcentage de

solubilité est élevé. Cela démontre l'importance du groupement N-acétyle dans

le mécanisme de solubilisation. Selon Paner et Beste, il y aurait formation de

complexes cationiques faibles entre LiCl et DMAc. Ces complexes

solubiliseraient ensuite le « polyélectrolyte >> formé par l'interaction des ions

chlorures avec les groupements N-acétyle et hydroxyle de la chitine (figure 1.4)?

La structure exacte du complexe de solubilisation chitine-LiCI-DMAc n'est

toutefois pas encore connue précisément.

Vincendon démontra par RMN 'H que les liaisons hydrogène intrachaîne

[ (C3)-OH.. .. . .O (cycle) ] (figure 1.3) présentes dans la chitine à l'état solide

persistaient en solution dans DMAc / LiCl 5%.35 La présence de ces liaisons

hydrogènes empêche ainsi toute rotation autour du lien glycosidique et maintient

une rigidité considérable des chaînes de chitine en solution dans ce solvant.

Figure 1.4 Mécanisme proposé pour la solubilisation de la chitine

Tableau 1.2 Solvants répertoriés pour la chitine

Catégorie Solvant Caractéristiques

Solutions Solutions aqueuses Le pouvoir de solubilisation varie selon le s$L: aqueuses concentrées de LiCNS > Ca(CNS)2 > Cal2 > CaBr2 > CaC12. de sels LiCNS, Ca(CNS)2, neutres Cal2. Ca&, CaCI2 Nécessite des températures élevées pour la dissofution

(9S°C pour LiCNS). Cela peut engendrer une dégradation de la chitine?7

Solvants Solutions aqueuses acides de HCI (>8,5M),

H2S04 et H3P04

HCOOH (98%)

HCOOH (98%) + DCA ou TCA (20-50% p ~ p ) ~ ~

Production de dérivés O-sulfonés avec ~ ~ ~ 0 4 ? ~ . ~ ~

Hydrolyse rapide de la chatne de

Solubilisation d'untérivé O-fomylchitine plutôt que la chitine elle-même.

Nécessite plusieurs cycles de congélation / décongelationP2

Le temps de solubilisation est très long pour la chitine-u (-3 semaines)P3

Hydrolyse rapide de la chaine de chitineea

Hydrolyse lente de la chaîne de chitine.42

La chitine-a est peu soluble.

Hydrolyse de la chaîne de chitine.

SoIvants DMF 1 ~~0~~~ Pas de dégradation ni de modification chimique. organiques neutres

CF3CH(OH)CF3 et Critiqués Our leurs effets néfastes sur la couche d'ozone CF3COCF3 ' 6 ~ 2 0 ~ (CFC ...). W

DMAc / LiCI (2-9% Pas de dégradation ni de modification chimique. plp) et NMP 1 LiCl (2-9% p/p)20*21

MeOH 1 Pas de dégradation ni de modification chimique. CaC12 '2H20 (60-70% p ~ v ) ~ Le solvant seul est sujet à la précipitation.

Détruit la structure cristalline de la chitine.

1.1 .4 Propriétés et applications

Les propriétés physiques, chimiques et biologiques de la chitine et de

quelques-uns de ses dérivés (principalement le chitosane) leur confèrent un

potentiel enorme dans une vaste gamme d'applications (tableau 1.3). La chitine

est un produit naturel biodégradable, biocompatible, bio-actif, possédant une

bonne résistance mécanique. Toutes ces qualités en font évidemment un

matériau attrayant pour la commercialisation. Son utilisation dans l'industrie

(alimentaire, cosmétique, pharmaceutique, pâtes et papiers, etc.. .) bien que

répandue, est toutefois encore relativement limitée. Les premières productions

industrielles de chitine furent effectuées au Japon en 1970 à partir de carapaces

de crustacé^.^' Par la suite, le développement intensif de produits à base de

chitine et de chitosane par des compagnies a l'extérieur du Japon ouvra la porte

aux marchés européen et nord-américain. Aujourd'hui, le Japon est le meneur

mondial pour la production et l'utilisation de chitine et de chito~ane.~' L'utilisation

de carapaces de crustacés comme matière première pour la production de bio-

polymères à haute valeur ajoutée est une façon écologique très positive de

récupérer cette biomasse-déchet qui pourrait potentiellement devenir un

problème environnemental.

Les caractéristiques de la matière première (carapaces de crustacés)

utilisée pour la production de chitine peuvent influencer considérablement les

propriétés fonctionnelles du produit résultant. Les différences de constitution de

chaque espèce, mais aussi la période annuelle où l'espèce est pêchée, sont des

facteurs importants qui peuvent occasionner des variations au niveau de la

reproductibilité dans un processus de production. Les propriétés fonctionnelles

de la chitine sont souvent reliées à la masse moléculaire et peuvent être

affectées par la présence d'impuretés. II est donc nécessaire que chaque

procédé de production soit ajustable selon les caractéristiques de la matière

première utilisée.

De par sa solubilité en milieu aqueux faiblement acidifié, le chitosane est

utilisé plus fréquemment que la chitine dans tes applications reliées au domaine

biomédical. Ses propriétés cationiques en solution (une charge positive par unité

glucosamine) lui permettent également de chélater très efficacement les métaux

(traitement des eaux) et d'adhérer à des surfaces chargées négativement

(cosmétique)."

Une dizaine d'autres dérivés de la chitine, moins « populaires )> que le

chitosane , sont aussi utilisés pour plusieurs applications. Les dérivés N-acyle

(une chaîne aliphatique remplace le groupement CH3 sur le carbonyle) et O-

hydroxy-alkyle (une chaîne O-alkyle remplace le groupement hydroxyle sur le

carbone 6) sont les plus utilisés.53

Tableau 1.3 Applications reliées à la chitine et à ses principaux dérivés

Polymère Principales applications -- p. - - - - p p -- -

Chitine Fabrication de peau artificielle (Bestchitin W@)*

Fibre pour sutures biodégradabless3

Supplément alimentaire (favorise l'absorption de protéines)s5

Substrat pour l'immobilisation de cellules microbiennes ou d'enzymess3

Membranes pour la dialyses6

~ o n ~ i c i d e ' ~

~ertilisant'~

Contrôleur de mobilité de pesticidess

Fabrication de papier58

Fibre fortifiante pour la fabrication de papiersg

Fibre textile (augmente l'affinité des tissus pour certains pigment^)^'

Fabrication de vibrateur pour enceinte acoustiques3

Tableau-3 (suite)

Polymère Principales applications

C hitosane Support pour la libération contrôlée de médicamentm7

Supplément alimentaire (favorise l'absorption de protéines)"

Agent hypocholestérolémiant52"8

Agent hémostatique (favorise la coagu on}^.^^

Fibre textile7'

Fongicide et bactéricide pour la consewation alimentaire et l'enrobage de semen~es'~"~

Agent clarifiantU

Substrat pour l'immobilisation de cellules microbiennes ou

~er t i l i san t~~

Agent floculant pour le traitement des eaux

Fabrication de lentilles ~ornéennes?~

Ingrédient pour produits capillaires et dermatologique^^^^^^

Guide d'ondes optiquen

Dérivés Phase stationnaire en chromatographieu N-acyle

Membrane de dialyse et d'u~trafiltration~~

Papier et fibress3

Fabrication de lentilles cornéennes53

Système auto-érodant pour la libération contrôlée de médicaments3

Dérivés Émulsifiants3 O-hydroxy- al kyleS3 Hydratant pour produits dermatologiques (Liquid ~ h i t i n @ ) ~ ~

Aussi utilisés pour leur propriétés de cristalix liquidess3

N.B. : Certaines de ces applications sont considérées comme potentielles et ne font pas encore l'objet de productions industrielles.

1.2 Le fractionnement

1.2.1 Introduction

En règle générale, la composition d'une substance polymère n'est pas

homogène. On peut classer les différences entre les macromolécules d'un

polymère en trois grandes catégories de propriétés : masse moléculaire,

composition chimique (ratio de copolymères, branchements.. .) et configuration

moléculaire (tacticité). Le fractionnement d'un polymère est la séparation des

différentes espèces moléculaires présentes dans ce polymère. Puisque la chitine

est un polymère linéaire de composition chimique homogène, le fractionnement

sera effectué uniquement selon la masse molécu laire.

Pour [a plupart des polymères synthétiques, la distribution de masses

moléculaires est une caractéristique générale résultant de la nature particulière

de la méthode de polymérisation employée. II en est de même pour les

polymeres naturels où la distribution de masses provient habituellement de la

formation même du polymère par un organisme ou simplement de la dégradation

causée par le procédé d'extraction. L'existence d'une dispersion de masses

moIéculaires dans les substances macromoléculaires est une propriété

fondamentale qui nécessite l'utilisation de plusieurs masses moyennes pour sa

description. Cette hétérogénéité exerce une influence permanente sur toutes les

propriétés du polymère, autant en solution qu'à l'état solide.

Plusieurs techniques expérimentales peuvent être utilisées pour mesurer

les différents types de masse moléculaire rn~yenne.?~ Dans le présent travail, les

masses moléculaires moyennes en poids et en nombre ont été déterminées par

chromatographie d'exclusion stérique en double détection avec la réfractométrie

et la diffusion de la lumière (voir tableau 1.4).

Le fractionnement est également utilisé pour réduire la polymolécularit~

d'un échantillon de polymère. L'indice de polymolécularité, soit le rapport entre

les masses moléculaires moyennes en poids et en nombre (Mp I Mn), renseigne

sur la dispersion de la distribution de masses d'un polymère. Si un échantillon

est idéalement isomoléculaire, la valeur de ce rapport sera égale à l'unité. Plus

la polymolécularité sera grande, plus la valeur de ce rapport sera élevée.

Plusieurs types de distribution sont toutefois possibles pour un même indice d e

polymolécularité.

Tableau 1.4 Description des masses moléculaires moyennes utilisées

Masse moléculaire moyenne Description

En nombre

En poids

Viscosimétrique

L'équation de Mark-Houwink-Sakurada (MHS) relie la viscosité intrinsèque

hl d'une solution de polymère à la masse moléculaire (équation 4).

Cette équation, où K K )) et << a >> sont des paramètres caractéristiques

d'un système polymère-solvant, est strictement valide pour les échantillons dee

polymère isomoléculaire. Lorsque le polymère est polymoléculaire, la masse

moUculaire donnée par l'équation est une moyenne viscosimétrique (MW)

(tableau 1.4, équation 3). Les paramètre cc K )> et G a » peuvent être obtenus par

l'étude des masses moléculaires moyennes en poids et des viscosités

intrinsèques d'une série d'échantillons de distributions étroites (voir section 3.4).

Pour les polymères linéaires flexibles, le paramètre K a », qui est fonction de la

rigidité de la chaine en solution, varie habituellement entre 0.5 (valeur obtenu en

solvant thêta de Fiory) et 0.8 (valeur obtenue en bon solvant). La valeur de

l'exposant a )> est généralement plus élevée (0.8 - 1.1) pour les polymère ayant

un squelette plus rigide ou des propriétés de drainage particulièrement élevées

(chitine, cellulose ...).74 La relation de MHS pour un système polymère-solvant

donné, une fois les paramètres N K )) et <( a )) connus, permet d'évaluer la masse

moléculaire d'un polymère homologue par simples mesures de viscosité dans les

mêmes conditions.

La figure 1.5 représente une courbe de distribution fictive schématisant les

valeurs approximatives de chacune des masses moyennes.

-. - - -

Longueur de chaîne

Figure 1.5 Courbe de distribution schématisée d'un polymère polymoléculaire

1.1 -2 Méthodes

On peut regrouper les nombreuses méthodes de fractionnement

existantes en quelques catégories : modification de solubilité, chromatographie,

sédimentation, diffusion. ultrafiltration et fusion de zone.75 La chromatographie

d'exclusion stérique (SEC) préparative est une méthode très efficace mais plutôt

dispendieuse. Le volume de phase stationnaire nécessaire à l'obtention d'une

bonne séparation chromatographique augmente linéairement avec la quantité

d'échantillon injectée. A cela s'ajoute des techniques de remplissage peu

abordables qui mènent souvent à des colonnes préparatives de coûts très

élevés. La SEC sera donc utilisée à des fins analytiques seulement (voir la

section 2.4.2).

Le présent travail portera principalement sur des méthodes de

fractionnement par modification de solubilité. Le principe de base de cette

technique est la subdivision d'un échantillon de polymère en plusieurs fractions

en utilisant les différences de soiubilité entre les espèces moléculaires de

différentes tailles présentes dans l'échantillon. Dans un solvant donné à

température et concentration constanies, la solubilité d'un polymère linéaire est

dépendante de sa longueur. On peut utiliser, à titre purement qualificatif,

l'expression de l'énergie libre de mélange (AG,) pour une chaîne de polymere

flexible ayant une conformation en pelote statistique (obtenue à partir du modèle

de réseau de Flory) pour comprendre l'influence de la longueur de chaîne sur la

solubilité. 76.77

Dans cette équation, T est la température, R la constante molaire des gaz,

nl le nombre de moles de solvant, n2 le nombre de moles de polymère, r le

nombre de segments par chaîne de polymère, x le paramètre d'interaction

polymère-solvant, <pi la fraction volumique de solvant et cpz la fraction volumique

de polymère. Dans des conditions identiques de solvant, température et

concentration, l'équation 5 permet de vérifier que AGm de courtes chaînes de

polymère est inférieure à AGm de longues chaînes de polymère. Les chaînes de

polymère les plus courtes sont donc les plus solubles. II existe aussi des

conditions de solubilité limite, où seules les chaînes courtes sont solubles.

Les considérations précédentes s'appliquent pour des solutions d'un

polymère obéissant au modèle de Flory-Huggins. Elles sont toutefois vraies de

manière qualitative pour des solutions d'un polymère semi flexible rigide (la

chitine dans le système DMAc / LiCI).

Plusieurs facteurs doivent être pris en considération lors de l'élaboration

d'une méthode de fractionnement par modification de solubilité. Afin de favoriser

le développement d'un équilibre de phases adéquat permettant une séparation

efficace des différentes espèces moléculaires, les variations du pouvoir de

dissolution du solvant doivent être relativement faibles. L'abaissement du

pouvoir extracteur du solvant peut être obtenu par ajout de non-solvant dans un

système solvant I non-solvant oii par une variation de température (diminution de

la température pour la plupart des systèmes et augmentation pour les systèmes

présentant une température critique de démixtion inférieure). Par ces

procédures, on obtient un fractionnement par précipitation où les plus grandes

masses précipitent en premier et constituent les premières fractions.

Inversement, l'augmentation du pouvoir de dissolution du solvant mène au

fractionnement par extraction, technique dans laquelle les petites masses sont

extraites en premier. L'augmentation du pouvoir extracteur peut être obtenu par

ajout de solvant dans un système solvant / non-solvant ou par une variation de

température.

L'utilisation de solvants mixtes, tel que DMAc / LiCI, permet aussi d'obtenir

des modifications précises du pouvoir de dissolution par changement graduel de

la concentration d'un des composants. Puisque le mécanisme de dissolution de

la chitine repose sur l'interaction des complexes [DMAc - Li]' CI- formés dans le

solvant, il est évident que la concentration de LiCl aura une influence sur le

pouvoir de dissolution. Certains comportements caractéristiques de ces solvants

sont également à considérer dans la compréhension du processus de

modification de solubilité. L'adsorption préférentielle de chacun des composants

du solvant sur les différents segments d'une chaîne de polymère est un

phénomène bien connu. 23-75g78 Termonia a récemment démontré, par

modélisation. que ce comportement était fortement dépendant de la masse

mo~éculaire.~~ Dans un système bon solvant / mauvais solvant, l'adsorption

préférentielle du bon solvant augmente avec la diminution de la longueur de la

chaîne. Donc plus la chaîne est longue, plus les phénomènes d'adsorption

préférentielle risquent d'affecter la solubilité du polymère. On peut ainsi faire

l'analogie avec le système DMAc / LiCI où DMAc-LiCI serait un bon solvant et les

composés individuels des mauvais solvants. II serait donc possible d'observer, à

des concentrations critiques de précipitation, une ségrégation de masses

moléculaires induite par ces comportements d'adsorption préférentielle.

Certains facteurs volumiques doivent également être pris en considération.

Plus le rapport volumique (V&) des phases concentrée (V,) et diluée (Vd) en

polymère est élevé, moins efficace est le fractionnement si on utilise la phase

concentrée (riche en polymère) pour la récupération des fractions plutôt que la

phase diluée. D'autres facteurs reliés aux interactions polymère-solvant et à la

concentration initiale de polymère sont aussi associés à I'accumulation de

résidus de faibles masses moléculaires dans les fractions de grandes masses

(low-molecular tai~ing).~' II semble que ce comportement soit inhérent aux

méthodes de fractionnement par précipitation.80

La méthode d'extraction directe sur un polymère à l'état solide présente

toutefois les mêmes problèmes d'accumulation résiduelle de petites masses.

Aussi fines les particules de polymères non dissoutes soient-elles dans un

mélange, elles sont suffisamment grandes pour présenter un enchevêtrement de

chaînes qui retiendra captives une bonne partie des chaînes courtes,

normalement solubles." D'autres méthodes de fractionnement par extraction,

telle que l'extraction sélective sur un coacervat (phase riche en polymère), sont

toutefois reconnues pour leur efficacité supérieure. Cette dernière méthode sera

détaillée à la section 3.3.

La mise en place d'une procédure de fractionnement requiert une

connaissance approfondie du système polymère / solvant en présence. Cela

nécessite donc une investigation détaillée de certains paramètres :

7) Au niveau du système polymère /solvant et de l'échantillon même:

- Solvants et non-solvants potentiels

- Solubilité du polymère (concentrations critiques de précipitation)

- Stabilité dans le solvant utilisé

- Stabilité en fonction de la température

- Présence d'impuretés et possibilités de purification

- Masses moléculaires moyennes

- Courbe de distribution de masse

2) Au niveau de la technique :

- Préparation de l'échantillon

- Ratio polymère 1 solvant (pour obtenir un rapport VJVd adéquat)

- Température de fractionnement

- Ajustement de l'équilibre de phases (intensité et durée d'agitation)

- Récupération des fractions (filtration, centrifugation, etc.)

L'évaluation d'une méthode de fractionnement s'effectue selon plusieurs

étapes spécifiques. Dans un premier temps, la viscosimétrie est utilisée pour

donner un aperçu rapide du pouvoir de séparation de la méthode (voir section

2.4.1). Les viscosités intrinsèques obtenues sont comparées entre elles afin de

vérifier s'il y a séparation d'espèces moléculaires distinctes. Si la technique

s'avère effkace, chaque fraction obtenue est ensuite analysée en terme de

masses moléculaires moyennes (Mp et Mn) et de polymolécularité. II est

également essentiel de s'assurer qu'il n'y a pas eu de modification chimique

durant le processus. Lorsque la méthode semble au point, le jugement de la

qualité et de l'efficacité du fractionnement repose sur l'analyse des critères

suivants :

7 ) La comparaison des masses moléculaires moyennes : On peut évaluer

l'efficacité du fractionnement en comparant les masses moléculaires moyennes

de quelques fractions à celles de l'échantillon non fractionné. Dans un

fractionnement efficace. on peut ainsi observer une gradation (ou un

déplacement) d'une même masse moléculaire moyenne entre chacune des

fractions.

2) La diminution de l'indice de polymolécularité : La diminution du rapport Mp /

Mn (obtenu par chromatographie d'exclusion stérique en double détection) est

également une bonne indication de l'efficacité du fractionnement. L'indice de

polymolécularité seul peut toutefois être trompeur puisque plusieurs distributions

sont évidemment possibles pour un même rapport Mp 1 Mn. On doit donc

analyser l'étroitesse de chaque fraction directement à partir des courbes de

distribution.

3) La balance massique : Après récupération et séchage, la somme des masses

de toutes les fractions devrait être égale à la masse initiale de polymère. La

masse des fractions est habituellement légèrement plus faible que la masse

initiale. II est raisonnable d'assumer qu'une quantité de polymère peut être

perdue durant certaines opérations telles que la séparation de phases et la

filtration. Des masses de fractions trop élevées peuvent être reliées a un

mauvais séchage. Les masses de chacune des fractions doivent être similaires

afin qu'une bonne gradation en poids moléculaires soit atteinte. On vise

généralement 10% de la masse initiale par fraction, mais des valeurs de 6 à 18%

sont très acceptable^.^^

4) La moyenne des viscosités intrinsèques des fractions obtenues : La viscosité

intrinsèque de l'échantillon non fractionné est une moyenne en poids des valeurs

de chaque composante individuelle :

On peut ainsi comparer la valeur mesurée du polymère de départ et la valeur

calculée à partir de l'équation 6 pour toute les fractions. Si les valeurs sont

similaires, ce critère confirme que le fractionnement s'est déroulé correctement.

Une valeur calculée beaucoup moins élevée peut indiquer qu'iI y a eu

dégradation durant le processus de fractionnement.

1.3 Problématique

Tel que mentionné précédemment, l'hétérogénéité des masses

moléculaires dans un échantillon de polymère exerce une influence permanente

sur toutes ses propriétés, autant en solution qu'à l'état solide. Plusieurs

applications de la chitine et de ses dérivés nécessitent ainsi un contrôle étroit au

niveau de la masse moléculaire et de la polymolecularité. II est d'ailleurs

déplorable de noter qu'un grand nombre d'études ne tient pas compte de

l'influence de ces paramètres sur les propriétés spécifiques d'un produit ou d'un

système.

On retrouve néanmoins dans la littérature des exemples concrets

d'applications nécessitant un ordre de grandeur spécifique de masse moléculaire

(voir tableau 1.5). Pour la fabrication de membranes56v72 et de fibres7o, on utilise

généralement des échantillons de masse moléculaire élevée alors que pour la

plupart des applications où des mécanismes de mise en solution et de transport 71.81 sont impliqués (comme en agriculture ), les masses moléculaires sont

beaucoup plus petites.

Dans les hydrogels à base de chitosane ainsi que dans différentes

formulations d'encapsulation utilisés pour la libération contrôlée de médicaments,

la masse moléculaire du chitosane influence directement Ia vitesse de libération

de la substance médicamenteuse. 62*63*67 De même. l'efficacité de la chitine et du

chitosane comme fongicides serait intimement reliée à la masse mo~éculaire.~'

D'autres applications particulières ne nécessitent toutefois pas de contrôle

strict au niveau des masses moléculaires utilisées (agent floculant dans le

traitement des eaux usées, agent clarifiant dans l'industrie alimentaire, fibres

fortifiantes dans l'industrie du papier , etc.).

Tableau 1.5 Exemples d'applications nécessitant un contrôle de la masse moléculaire

PoIymère Application Masse moléculaire (M,) ( x l oJ g mol-')

Chitine Membrane à dialyse56 >IO00

Chitine Fongicide c20

Chitosane Encapsu Iation 62-64 >1 O00

Chitosane Lentilles cornéennes72 -1 000

Chitosane Hydrogel 65-67 -1 00-200

Chitosane ~ertilisant~' cl O0

Pour obtenir des échantillons

de polymolécularité réduite, deux

fragmentation et le fractionnement.

de chitine de masses moIéculaires variées et

types de méthodes s'offrent à nous : la

On peut décrire la fragmentation comme une méthode de dégradation

contrôlée où on provoque des ruptures de liaisons chimiques sur la chaîne

principale d'une macromolécule. Puisqu'il s'agit de processus de

dépolymérisation, ce sont des méthodes par lesquelles on obtient seulement des

masses moléculaires moyennes inférieures à celles de l'échantillon de départ.

Du côté de la littérature, on retrouve quelques méthodes de fragmentation ayant

été appliquées à la chitine : I'hydrolyse enzymatique,82v83 l'hydrolyse acide, 84,85

I'hydrolyse par radicaux libres," l'hydrolyse par oxydations86 I'hydrolyse par

dépressurisation" et l'irradiation aux ultrasons. 22.23

Certaines enzymes, telles que les chitinases, peuvent être utilisées pour

I'hydrolyse enzymatique de la chitine. Cette méthode spécifique et coûteuse

permet d'obtenir des fractions de faible masse moléculaire sans modification

chimique'*83 mais semble toutefois conduire à des échantillons hautement

polymo~éculaire.~~

Les méthodes d'hydrolyse acide, par radicaux libres, par oxydation et par

dépressurisation ne semblent pas permettre I'obtention de fractions de faible

polymolécularité (à moins de dépolymériser jusqu'à I'obtention d'o~i~ornères). '~~

Ces méthodes engendrent généralement des modifications chimiques

(notamment sur les unités termina~es)'~" ainsi que des changements au niveau

de la structure cristalline de la chitine, d'ou modification de la solubilité et

formation d'agrégats en solution. 88.89

La méthode par irradiation aux ultrasons permet d'obtenir des fractions de

faible polymolécularité mais semble également provoquer des changements de

la structure cristalline de la chitine. 22.90

Afin d'obtenir un plus large éventail de masses moléculaires tout en évitant

les possibilités de modifications physiques et chimiques associées aux

différentes méthodes de fragmentation présentées, deux méthodes de

fractionnement ont été investiguées. Le présent travail est donc principalement

axé sur une méthode de fractionnement par extractions sélectives sur un

coacervat. Un essai de fractionnement par gélification sélective a température

élevée est également discuté. A notre connaissance, il n'existe aucune méthode

de fractionnement ayant été appliquée à la chitine.

Quelques méthodes de fractionnement sont répertoriées pour le

chitosane. "lg2 Puisque l'objectif du travail est d'obtenir des fractions de chitine

de masses moléculaires distinctes, il ne serait pas avantageux de passer par

l'intermédiaire du chitosane pour le fractionnement et tenter ensuite de revenir à

la chitine par N-acétylation.

1.4 Objectifs du projet

L'objectif principal de ce travail consiste en la mise au point d'une méthode

permettant une séparation efficace des différentes espèces moléculaires de

chitine présentes dans la distribution naturelle.

Deux autres objectifs sont également poursuivis: l'optimisation des

conditions d'analyse de la masse moléculaire de la chitine par chromatographie

d'exclusion stérique dans DMAc 1 LiCi 5% en double détection avec la

réfractométrie et la diffusion de la lumière devrait permettre le développement

d'une méthode de caractérisation massique complète. Les quelques méthodes

existantes ne permettent qu'une caractérisation massique partielle.

Enfin, la détermination des constantes de l'équation de Mark-Houwink-

Sakurada de la chitine dans DMAc / LiCl 5% constitue le dernier objectif. Cela

nécessite l'obtention par fractionnement de plusieurs fractions de faible

polymolécularité et de masses moléculaires distinctes réparties sur un large

domaine de masse.

CHAPITRE II

PURIFICATION ET CARACTÉRISATION DE LA CHITINE

Le chapitre II traite, dans un premier temps, des différentes étapes de

purification nécessaire à l'obtention d'une chitine de haute pureté. Le matériel de

départ provient de résidus de crevette de l'espèce Pandalus Borealis (crevette

nordique) recueillis après cuisson et décorticage à l'usine de transformation

Fruits de Mer de l'Est du Québec de Matane en septembre 1997. Ces résidus

sont principalement constitués de carapaces et de céphalothorax. Les méthodes

utilisées pour la caractérisation chimique et physique des échantillons de chitine

fractionnés et non fractionnés sont présentées par la suite. En raison de leur

importance cruciale dans le présent travail, une plus grande attention est

accordée aux méthodes de détermination de masse moléculaire (viscosimétrie et

chromatographie d'exclusion stérique en double détection).

2.1 Purification de la chitine

La chitine provenant de carapaces de crustacés se présente sous forme

de complexes protéiques enchevêtrés dans un réseau de sels minéraux

principalement constitué de carbonate de calcium. Les protéines sont associées

à la chitine par différents modes de complexation : forces de van der Waals

(-2%), liens ioniques (-3%), agglomérations stériques (-15%), liens hydrogène

(-25%) et liens covalents (-55%).' Par des études de diftaction des rayons X,

Rudall et Kenchington ont obsewé des répétitions régulières de liaisons

protéiques à des intewalles de 31A sur la chaîne de chitine. En support a

d'autres études', cela démontre qu'une protéine est liée de façon covalente à

toute les six unités N-acétylglucosamine, probablement par une structure N-acyle

(figure 2.1 ).4

Figure 2.1 Lien covalent probable dans le complexe chitine-protéine

La purification complète de la chitine native nécessite l'enlèvement de

quatre ensembles de constituants principaux : protéines, minéraux, lipides et

pigments caroténoïdes. La présence de liens covalents chitine-protéine

demande généralement des processus de déprotéination sévères qui peuvent

affecter la masse moleculaire de la chitine résultante. II en est de même pour les

méthodes de déminéralisation en milieu acide qui peuvent également mener à

l'hydrolyse des chaînes de chitine. Plusieurs procédures variées sont

répertoriées mais aucune standardisation n'a été adoptée. La déprotéination par

des solutions de NaOH et la déminéralisation par des solutions de HCI sont

toutefois les méthodes les plus couramment utilisées.'

Lipides et pigments étant associés aux protéines, ceux-ci sont

majoritairement arrachés de la chitine lors de la déprotéination. Le principal

pigment caroténoïde, I'astaxanthine (3,S'-dihydroxy-P,p-carotène-4.4'-dione),

peut ainsi être récupéré sous forme de caroténoprotéine. Les lipides et pigments

qui n'ont pas été éliminés lors des traitements de déproteination et de

déminéralisation sont enlevés par un lavage final à l'acétone. De plus amples

détails sont présentés dans le livre « Chitin Chemistrp qui offre une revue

exhaustive des techniques de purification de la chitine.'

Une partie des procédés enzymatiques et chimiques utilises dans le

présent travail pour la purification de la chitine a été développée par Aqua-

~iokern''~ inc (ABK). Ces procédés seront donc présentés en survol afin que

l'entente de confidentialité conclue à l'occasion du présent travail soit respectée.

Figure 2.2 Purification initiale de la chitine (procédé ABK modifié)

Chaque étape du procédé a été consciencieusement optimisée

(concentrations, proportions, température, durée et intensité d'agitation) de façon

a maximiser la pureté de la chitine obtenue et à minimiser toute réduction de la

masse moléculaire. Plusieurs lavages à I'eau distillée chaude ont été effectués

entre chacune des étapes de purification.

La chitine ainsi obtenue est pure à 98.5% (voir section 2.2). La dernière

étape de purification se produit lors de la solubilisation de la chitine dans le

solvant N,N-diméthylacétamide / chlorure de lithium 5% (DMAc / LiCl 5%). Les

chaînes de chitine (4-5%) encore associées à des protéines (1.2%) sont

insolubles et peuvent ainsi être enlevées par centrifugation. Le matériel insoluble

constitue environ 5-6% de la chitine mise en solution. Les sels minéraux (0.29%)

sont éliminés par les rinçages à I'eau distillée (figure 2.3).

Figure 2.3 Dernières étapes de purification de la chitine

2.2 Analyse des constituants résiduels

2.2.1 Protéines

Deux techniques ont été utilisées pour l'évaluation de la teneur en

protéines résiduelles dans la chitine: la méthode kjeldahl pour la détermination de

l'azote total ainsi que l'analyse élémentaire pour la détermination des

pourcentages de carbone, hydrogène et azote.

Dans la méthode kjeldahl, l'échantillon de chitine est digéré à haute

température (440 OC) en présence de peroxyde d'hydrogène. d'acide sulfurique,

de sulfate de potassium et d'oxyde mercurique. L'azote présent dans

I'échantillon est ainsi minéralisé en azote ammoniacal. Par la suite, un complexe

impliquant I'azote ammoniacal, le salicylate de sodium et I'hypochlorite de sodium

est formé en milieu alcalin. La concentration de ce complexe vert émeraude est

ensuite évaluée par spectrophotométrie d'absorbance visible à une longueur

d'onde de 625 nm. Le pourcentage d'azote provenant de la chitine (en tenant

compte du degré d'acétylation) est soustrait à la valeur obtenue par

spectrophotométrie et un facteur de conversion azote-protéine de 6.25 est utilisé

pour déterminer la teneur résiduelle en pr~téine.'~

Les analyses élémentaires (AÉ) ont été effectuées sur un analyseur

élémentaire Carlo-Erba 1106 (Fisons, CHN) permettant de déterminer les

concentrations en carbone, hydrogène et azote d'un échantillon. II est possible

d'évaluer s'il y a présence ou non de protéines dans la chitine purifiée en

comparant les pourcentages de carbone, hydrogène et azote obtenus à ceux

calculés pour une structure chimique théorique tenant compte du degré

d'acétylation (tableau 24.' L'utilisation du rapport NIC (%azote 1 %carbone)

permet d'éviter les variations attribuables à la présence d'humidité dans

l'échantillon.

Tableau 2.f Teneur en azote et en carbone de la chitine calculée en fonction du degré d'acétylation

degré d'acétylation (%)

teneur en azote (%) 8.69 8.26 7.87 7.52 7.19 6-89 teneur en carbone (%) 44.71 45.33 45.89 46.39 46.89 47.29 rapport N/C 0.194 0.182 0.171 0,162 0.153 0,146

Le tableau 2-2 montre bien la concordance entre les valeurs obtenues par

la méthode kjeidahl et les résultats des analyses élémentaires. Les protéines

restantes semblent donc avoir été enlevées lors des dernières étapes de

purification. Les données calculées pour la chitine pure sont issues d'une

structure théorique possédant un degré d'acétylation de 91 % (voir les analyses

de degré d'acétylation à la section 2.3).

Tableau 2.2 Résultats des analyses pour la détermination de la teneur en protéines résiduelles dans la chitine

paramètre chitine purifiée chitine purifiée valeur calculée (le purification) (2" purification) (chitine pure,

DA de -91 %)

azote total kjeldahl (%) 7-24 protéine (%) 1 -2

azote par AÉ (%) 8.72 carbone par AÉ (%) 51 -51 rapport NIC 0.169

2.2.2 Sels minéraux

La détermination de la teneur en sels minéraux dans les échantillons de

chitine s'effectue en deux étapes. On procède premièrement à une combustion à

600 I 20 OC dans un four moufle pendant 18 heures pour ensuite déterminer la

quantité restante de cendres par gra~imétrie.'~ Après les premières étapes de

purification, la teneur en sels minéraux dans la chitine est de 0.29%. La mise en

solution de la chitine dans DMAc / LiCI 5% permet d'enlever complètement les

minéraux qui sont retenus dans [a structure cristalline en feuillets de la chitine.

Ainsi, la quantité de sels minéraux après la purification finale est pratiquement

nulle (<0.005%).

2.2.3 Lipides et pigments

Les lipides et pigments caroténoïdes sont premièrement extraits de la

chitine purifiée par plusieurs lavages à l'acétone puis le solvant est enlevé par

évaporation sous pression réduite. L'extrait pigmenté est ensuite solubilisé dans

I'hexane et séché avec du sulfate de magnésium anhydre. Les pigments

caroténoïdes totaux sont alors dosés par spectrophotométrie dyabsorbance

visible à une longueur d'onde de 472 nm (E = ~ I O O ) . ~ ~ Par la suite, I'hexane est

évaporé et la quantité de lipides extraits est déterminée par gravimétrie.

Ap&s les premières étapes de purification, les concentrations en pigments

et lipides sont inférieures aux limites de détection des méthodes utilisées

(pigments caroténoïdes totaux: < 0.1 pg/g, lipides : < 0.005%).

2.3 Détermination du degre d'acétylation

2.3.1 Spectroscopie infrarouge

Tel que discuté à la section 1.1.2, la chitine peut se caractériser en terme

de degré d'acétylation (DA). Plusieurs types de techniques peuvent être utilisées

pour la détermination de ce paramètre : spectroscopie infrarouge, analyse

élémentaire, spectroscopie RMN, spectroscopie UV, spectroscopie de masse,

dichroïsme circulaire, pyrolyse I chromatographie en phase gazeuse. analyse

thermique et titrage des groupements amine.'195 Certaines de ces techniques

présentent toutefois des inconvénients au niveau du temps d'analyse, du coût et

de l'exactitude.

La spectroscopie infrarouge est une technique peu coûteuse qui a

l'avantage de permettre l'analyse d'échantillons à l'état solide. Plusieurs

méthodes par spectroscopie infrarouge ne sont toutefois exactes que dans un

domaine restreint de degré d'acety~ation.~~ Cela est évidemment relié aux choix

erronés des bandes d'absorbance et des lignes de base.

La méthode utilisée dans le présent travail (Shigemasa et coll.) est valable

et précise pour un domaine de degré d'acétylation de O à 100%.'~ La bande

d'absorbance amide II à 1560 cm" est utilisée pour quantifier le nombre de

groupements N-acétyle alors que la bande d'absorbance C-O (1070 cm-'), qui ne

varie pas avec le degré d'acétylation, est utilisée comme standard interne afin de

corriger les variations de quantité de matériel exposé au faisceau infrarouge. Les

lignes de base 1900-1500 cm-' et 1200-860 cm" sont utilisées pour mesurer

I'absorbance des bandes amide II et C-O respectivement (figure 2.4). Le rapport

de ces intensités d'absorbance est ensuite transposé sur une courbe

d'étalonnage (A1550/A1070 en fonction du DA, figure 2.5) qui permet d'obtenir le

degre d'acétylation. La relation A1560/A1070 en fonction du DA est linéaire pour

des degrés d'acétylation de O à 100%.

- 1070 cm-'

1560 cm-' &

4000 3500 3000 2500 2000 1500

nombre d'onde (cm-')

Figure 2.4 Spectre infrarouge de la chitine purifiée non fractionnée

O 20 40 60 80 1 O0

Degré d'acétylation (%)

Chitosane partiellement acétylé i Mélange chitine / chitosane

Figure 2.5 Courbe d'étalonnage utilisée pour la détermination du degré d'acétylation de la chitine par spectroscopie infrarouge

Le degré d'acetylation des échantillons utilisés par Shigemasa a été

déterminé par RMN 'H (dans DCI 20% 1 D20 pour la chitine et acide formique

deutéré / D20 pour le chitosane). La plupart des échantillons utilisés ont été

obtenus par acétylation contrôlée de chitosane commercial. Les autres

échantillons sont des mélanges de chitosane complètement déacétylé (DA de

0%) et de chitine complètement acétylée (DA de 100%) de degrés d'acétylation

apparents calculés selon le ratio chitine / ~hitosane.'~

Les analyses par spectroscopie infrarouge du présent travail ont été

effectuées selon le protocole suivant. Le pastillage de mélanges de 2 mg

d'échantillon finement broyé de chitine et de 98 mg de KBr (Sigma, grade IRTF)

a été réalisé sur une presse Carver (20000 livres, 10 minutes). Les pastilles ont

ensuite été séchées 24 heures à 60 OC sous pression réduite. Les mesures ont

été effectuées sous atmosphère d'azote sur un spectromètre Magna IR 560

(Nicolet) couplé au logiciel d'acquisition Omnic 3.0 (Nicolet). La durée

d'acquisition était de 100 scans et la résolution de 2 cm-'. Les spectres ont

ensuite été analysés avec le logiciel GRAMS 386 (Galactic Industries

Corporation).

Les degrés d'acétylation obtenus pour trois échantillons de chitine purifiée

non fractionnée varient entre 91 et 92% (tableau 2.3). Ces résultats sont bien

concordants avec les analyses élémentaires effectuées sur les mêmes

échantilions (voir le tableau 2.2, section 2.2.1 ).

Tableau 2.3 Résultats des analyses de degré d'acétylation par spectroscopie infrarouge

Échantillon Al sso 1 A1070 Degré d'acétylation (%)

Chitine purifiée Chitine purifiée Chitine purifiée

2.4 Détermination des masses moléculaires moyennes

2.4.1 Viscosimétrie

2.4.1 .i Principe

L'étude de la viscosité de solutions macromolécufiaires est une méthode

empirique très utile pour la détermination des masses moléculaires de polymères

linéaires. Les perturbations produites dans I'éc~ulem~ent d'un fluide par la

présence de grandes molécules dissoutes se traduisent par une augmentation de

la viscosité du système. Plus le volume hydrodynamique des molécules

dissoutes est grand, plus I'accroissement de la viscosité est important. Le

volume hydrodynamique est relie à l'écart quadratique moyen entre les

extrémités de la chaîne, lequel est fonction de la masse mto~éculaire.~~

En pratique, on détermine la viscosité de solutions rnacrornoléculaires en

comparant le temps d'écoulement (t) d'un volume donné d e solution à travers un

capillaire au temps d'écoulement (t) d'un volume égal de solvant pur. On

appelle viscosité relative (qr) le rapport entre la viscosité de la solution (q) et celle

du solvant pur (q,). Pour des solutions suffisamment déluées, la densité de la

solution est très voisine de celle du solvant pur et l a viscosité relative est

exprimée par le rapport t 1 b.96 L'accroissement relatif de la viscosité, appelé

viscosité spécifique (qsp) s'écrit comme suit :

Pour des solutions extrêmement diluées (où les rnotecules de soluté sont

indépendantes les unes des autres), la perturbation totale de l'écoulement est

égale à la somme des perturbations causées par chacune des molécules prise

La viscosité spécifique est ainsi directement proportionnelle à la

concentration et on peut écrire l'expression suivante :

ou c représente la concentration en gramme par décilitre (g dl") et hl la

viscosité intrinsèque (en dL g-'), une grandeur caractéristique de la taille et de la

forme des molécules de soluté. Le terme (qsp 1 C) dépend des interactions

hydrodynamiques et thermodynamiques entre les molécules de soluté.

Pour déterminer correctement la viscosité intrinsèque, on doit extrapoler à

concentration nulle les résultats calculés à ['aide de deux relations empiriques,

soit celles de Huggins [9] et Kraerner [? O].

II est avantageux de porter sur un même graphique les viscosités réduite

(qs, / CI et inhérente (In q, 1 c) en fonction de c de façon à obtenir une meilleure

évaluation de l'ordonnée à l'origine [q] normalement commune aux deux courbes

(figure 2.6).

McCormick et Shen ont observé que l'accroissement de viscosité

intrinsèque de solutions de cellulose dans DMAc / LiCl (pour des concentrations

en LiCl de O à 4%) était fonction de la force ionique.97 Un effet polyélectrolyte dû

à l'interaction entre les ions chlorure et les protons hydroxyle est probablement à

l'origine de ce comportement. II semble toutefois que cet effet polyélectrolyte soit

annulé à des concentrations de LiCl supérieures à 4%.

2.4.1.2 Méthode et résultats

Des solutions de 0.03 à 0.05% de chitine dans DMAc (Aldrich, 99.8%,

anhydre) 1 LiCl (Sigma Ultra, 99.0%, anhydre) 5% plp ont été préparées pour les

mesures de viscosité. La chitine avait préalablement été broyée pendant 15

minutes dans un broyeur Micro-mill (Scienceware). Une période d'agitation de

72 heures était nécessaire à la solubilisation complète de l'échantillon.

Chaque solution a ensuite été filtrée sur un filtre de nylon 0.45 pm

(Phenomenex) préalablement séché et pesé. Après filtration, les filtres ont été

rincés avec 20 ml d'eau distillée afin d'enlever toute trace de DMAc / LiCI, séchés

24 heures à 100 OC et pesés à nouveau. Cette procédure permet de déterminer

les concentration exactes des solutions de chitine analysées en plus d'éviter la

présence de poussières ou particules insolubles qui pourraient affecter les

mesures.

Les mesures de viscosité ont été effectuées dans un viscosimetre de type

Ubbelohde (no.1, 8-91 7) à niveau suspendu en immersion dans un bain d'eau

distillée thermostaté à 30.00 + 0.01 OC. Le viscosimètre utilisé présente une

correction d'énergie cinétique négligeable pour des temps d'écoulement

supérieurs à 150 seconde^.'^

Pour chaque échantillon, trois à quatre dilutions ont été effectuées à

même le viscosimètre et trois lectures de temps d'écoulement (avec une

reproductibilité de l'ordre du dixième de seconde) ont été prises pour chacune

d'elles. Durant la procédure, cinq minutes environ étaient nécessaires entre

chaque dilution pour l'obtention de l'équilibre thermique. Afin d'obtenir une

précision acceptable pour la détermination de la viscosité intrinsèque, la viscosité

relative (tk,) de la solution mère doit être comprise entre 1.5 et 1.8 et celle de la

plus petite dilution supérieure à 1 . A . A tous les six échantillons, le viscosimètre a

été lavé avec une solution d'acide chromique 1 sulfurique.

concentration (g d ~ ' )

[q] = 21.5 dL g-A (relation de Huggins) ' [q] = 21.5 dL g" (relation de Kraemer)

Figure 2.6 Détermination de la viscosité intrinsèque de la chitine non fractionnée dans DMAcILiCI 5%

En tenant compte des incertitudes maxhales sur le temps d'écoulement,

la concentration et la fluctuation de température, l'erreur expérimentale sur

chaque valeur de viscosité relative est de t 0.4 dL g-' environ. La viscosité

intrinsèque de la chitine non fractionnée utilisée dans le présent travail est de

21 -5 dL g" (figure 2.6). L'écart type (s) pour 5 mesures de cet échantillon est de

0.3 dL g-' et le coefficient de variation (C.V. = (s I moyenne) x 100) est de 1.4%.

2.4.2 Chromatographie d'exclusion sterique en doubie détection

2.4.2.1 Chromatographie d'exclusion sterique

Suite à un développement considérable durant les deux dernières

décennies, la chromatographie d'exclusion stérique (SEC), aussi appelée

chromatographie par perméation de gel (GPC), permet le fractionnement

analytique ou préparatif des polymères en solution selon leur taille. Ce

fractionnement est obtenu par I'élution d'une solution de polymère sur un gel

poreux (constituant la phase stationnaire) en équilibre thermodynamique avec le

solvant. Cette technique non-destructive et non-interactive est fondée sur les

différences de pénétration des molécules de I'échantillon dans les pores de la

phase stationnaire. Ces pores sont du même ordre de grandeur que les espèces

à séparer lorsqu'elles sont en solution dans la phase mobile. La taille d'une

macromolécule en solution se définit ainsi par son volume hydrodynamique.

Le mécanisme d'exclusion stérique repose sur l'équilibre

thermodynamique entre deux phases : le solvant dans le volume interstitiel (Vi) et

le solvant dans le volume poreux (V,). Si KçEC est le coefficient de partage, le

volume d'élution (V,) d'une macromolécule est défini par :

La SEC est donc un procédé normal de chromatographie pouvant être

décrit par un mécanisme d'équilibre. Des facteurs cinétiques (diffusion et effets

hydrodynamiques) influencent également le processus de chromatographie, mais

le facteur d'influence principal, la distribution d'équilibre, est d'origine purement

entropique (KSEC I eASIR).99 Le coefficient de partage évolue ainsi en fonction,

d'une part de la taille et de la topologie de la chaîne macromoléculaire, d'autre

part de la distribution de la taille des pores.

Une particularité de la SEC est que le coefficient de partage KsEC varie

seulement de zéro à l'unité. Cela signifie que toutes les molécules de soluté,

quelque soit leur masse moléculaire, sont éluées entre deux volumes limites Vi

(exclusion totale) et Vi + V, (perméation totale). Les molécules d'un échantillon

se distribuent ainsi selon leur taille entre le volume interstitiel et une fraction K (O

c K c 1) du volume poreux. Les très grosses molécules sont totalement exclues

(K = O) et sont éluées les premières, alors que les molécules très petites ont

accès à une grande partie du volume poreux et sont éluées les dernières (figure

2.7). De par la nature du support poreux, Vi et V, sont sensiblement égaux.

Pour la plupart des polymères analysés par SEC, les écarts d'élution entre

les différentes espèces moléculaires sont si petits que les pics résultants sont en

fait un continuum représentant une courbe de distribution.

Une des difficultés majeures concernant l'analyse de la masse moléculaire

de la chitine par SEC en simple détection par réfractométrie réside dans le fait

qu'il n'y a pas d'étalon disponible commercialement. L'utilisation de standards de

structures chimiques différentes (ayant inévitablement des volurnes

hydrodynamiques différents de ceux de la chitine dans le même solvant) ne peut

mener qu'à l'obtention d'une masse moléculaire qui sera décalée par un facteur

plus ou moins important de la valeur réelle. 100,101

Ce problème d'étalonnage peut être éliminé par l'utilisation d'une méthode

de détection absolue de masse moléculaire telle que la diffusion de la lumière

statique. La chromatographie d'exclusion stérique couplée en double détection

avec la réfractométrie et la diffusion de la lumière permet ainsi de déterminer la

masse moléculaire de la chitine en solution diluée sans aucun étalonnage.

\- exc~usion

> perméation seteclive

, ; volume deirétenlion !

I b n

particule de gel O O 4.4 0

volume dëlution

Figure 2.7 Schéma illustrant de manière simplifiée le mécanisme de migration différentielle dans une colonne de SEC

2.4.2.2 Réfractométrie

La plupart des substances en solution dans un solvant changent l'indice

de réfraction de la solution de façon proportionnelle à leur concentration. Ce

facteur de proportionnalité, appelé incrément d'indice de réfraction en fonction de

la concentration (dnldc), est indépendant de la masse moléculaire lorsque celle-

ci est supérieure à 10 000 g mol-' environ. La réponse en voltage du

réfractomètre (détecteur) peut s'exprimer par :

Voltage du réfractomètre = K (dnldc) c 21

où K est une constante d'appareillage, c la concentration du polymère (en g ml*')

et dnldc l'incrément d'indice de réfraction en fonction de la concentration du

soluté (en mL gal), spécifique au système polymère-solvant. La constante K peut

être déterminée par étalonnage avec des solutions de chlorure de sodium ayant

un dn/dc bien connu.

2.4.2.3 Diffusion de la lumière

Les physiciens et chimistes se sont intéressés très tôt au phénomène de

diffusion de la lumière par les gaz, les liquides et les suspensions colloïdales.

Déjà en 1871, Lord Rayleigh proposait un traitement théorique de la diffusion de

la lumière pour les gaz parfaits. Suite à cela, Einstein développait en l 9 f 0 une

théorie plus générale applicable aux milieux denses tels que les liquides et les

solides. C'est en 1943 seulement que Debye étendait cette théorie aux solutions

diluées, en particulier aux solutions de polymères. II démontra que l'étude de la

lumière diffusée, en fonction de la concentration et en fonction de l'angle

d'observation, permet d'évaluer la masse moléculaire moyenne en poids du

soluté, la forme et les dimensions des molécules en solution et la grandeur des

interactions soluté-solvant. L'applicabilité de cette méthode s'étend sur un -1 96.102 domaine très large de masse moléculaire (-1000 à 10 000 000 g mol ).

Aux fréquences optiques, presque toutes les substances peuvent être

considérées comme des diélectriques. Lorsqu'un faisceau lumineux

monochromatique de longueur d'onde h frappe une petite particule isotrope de

dimension inférieure à U20, le champ électrique de l'onde incidente polarise

cette particule. Le déplacement opposé des électrons et des noyaux fait

apparaître un dipôle oscillant en phase avec le champ excitateur. La particule en

oscillation électrique se comporte alors comme une source secondaire et réémet,

dans toutes les directions, une onde diffusée de même longueur d'onde que [a

lumière incidente (diffusion de Rayleigh). L'amplitude de l'onde diffusée est

fonction de la polarisabilité de la particule. Le calcul de I'intensité de la lumière

diffusée par un milieu consiste donc a faire la somme des vibrations émises par

chaque dipôle en tenant compte des fluctuations atomiques ou moléculaires et

du principe des interférences lumineuses. Une description détaillée de la théorie

de la diffusion de la lumière peut être retrouvée dans l'ouvrage de ~ l o r y . ~ ~

Suite aux travaux de Debye, il est admis que I'intensité de la lumière

diffusée par une solution diluée de macromolécules peut s'exprimer selon la

relation suivante :

concentration en polymère

second coefficient du viriel apparaissant dans l'expression de la pression

osmotique

masse moléculaire moyenne en poids 2 2 -1 -4 4rr2(dn/dc) no NA h (pour lumière incidente polarisée verticalement)

incrément d'indice de réfraction de la solution en fonction de la

concentration de polymère

nombre d'Avogadro

indice de réfraction du solvant

longueur d'onde de la lumière incidente

rapport de Rayleigh

fonction de diffusion

Dans le cas d'une solution idéale de petites particules isotropes, la théorie

électromagnétique de la diffusion permet d'exprimer I'intensité le diffusée par le

soluté moins celle diffusée par le solvant le,s à la distance r du volume

élémentaire diffusant V, 8 étant l'angle entre la direction d'observation et la

direction du faisceau incident. Cette intensité est généralement exprimée par Ie

rapport de Rayleigh R($) correspondant. où 1, est l'intensité de la lumière

incidente:

Lorsque le soluté est constitué de macromolécules de dimension

supérieure à U20, les particules ne peuvent plus être considérées comme des

sites diffusants ponctuels. La lumière diffusée par les différents dipôles de la

même molécule mène à des interférences destructives non négligeables

provoquant une atténuation de I'intensité diffusée. Dans ces conditions, les

ondes diffusées par les motifs successifs de la macromolécule ne seront en

phase que si 0 est nul. Le déphasage entre les ondes diffusées par les sites

diffuseurs est d'autant plus important que 8 est grand et les interférences

résultantes diminuent I'intensité de la lumière diffusée. Cet effet s'amplifie avec

l'augmentation des dimensions de la macromoIécuIe.

Le fonction de diffusion P(0) peut ainsi être utilisée pour étudier la

grandeur et la morphologie des molécules en solution. Le calcul complet de P(0)

a été réalisé pour des macromolécules de géométries diverses telles que des

sphères, des bâtonnets et des pelotes gaussiennes. On a démontré que si les

dimensions de la particule ne sont pas trop grandes ou que l'angle de diffusion

tend vers zéro, cette fonction ne dépend que du carré moyen du rayon de

giration erg2> de la particule :

On définit le rayon de giration cr t>" comme le second moment de distribution de

masse autour du centre de masse d'une particule :

où rj est la distance entre l'espèce de masse i et le centre de masse de la

particule.

On peut finalement écrire l'équation 13 sous la forme suivante :

Pour la diffusion de la lumière en mode par lot où plusieurs concentrations

d'une même solution sont utilisées, Zimm suggéra une méthode graphique

permettant d'obtenir les valeurs de Mpl A2 et <r& Cela est possible en portant

en graphique Kc / R(0) en fonction de sin2(0/2) + kc (où k est une constante

arbitraire) et en extrapolant simultanément les courbes à concentration nulle et à

angle nul. Sur la courbe obtenue à concentration nulle, la pente limite et

I'ordonnée à I'origine conduisent aux grandeurs (16x2nO2 erg2> ) 1 (3k2 MM,) et l/Mp

respectivement. À angle nul, la pente et I'ordonnée a l'origine de la courbe

obtenue conduisent aux grandeurs 2A2 et 1IM ,.

Pour la diffusion de la lumière en mode chromatographique où une seule

concentration faible est injectée, on utilise plutôt la méthode de Debye pour la

détermination des valeurs de Mp et <r$> pour chaque tranche de 0.01 ml du

volume d'élution d'un échantillon. Un graphique de Debye, Kc 1 R(8) en fonction

de sin2(8/2), est ainsi tracé pour chaque tranche de volume Vi, où I'ordonnée à

I'origine est 1 1 Mp et la pente Cr:>.

La concentration q de l'espèce molécuIaire Mi pour chacune des tranches

est obtenue par réfractométrie. On peut exprimer la concentration par

l'expression suivante, où ni est le nombre de molécules:

A partir des valeurs de ni et Mi pour chacune des tranches du volume

d'élution. il est possible de calculer Mp et Mn pour l'échantillon entier (voir le

tableau 1.4).

2.4.2.4 Détermination de l'incrément d'indice de réfraction en fonction de

la concentration de chitine

L'utilisation de solvants mixtes pour des mesures physico-chimiques de

polymères nécessite certaines précautions dans l'interprétation des résultats

expérimentaux. La détermination de masse moléculaire par diffusion de la

lumière requiert ainsi l'utilisation d'une valeur de dnldc très précise. On observe

généralement, dans les solutions de polymère en solvant mixte, une adsorption

préférentielle de chaque composant du solvant sur les différents segments de la

chaîne de Ce phénomène nécessite des manipulations

spécifiques afin de déterminer correctement dnldc de la chitine dans DMAc 1 LiCl

5% plp. Les mesures de dnldc doivent ainsi être effectuées sur des solutions de

chitine en équilibre osmotique avec le solvant utilisé. La valeur dnldc doit donc

être obtenu à potentiel chimique constant de LiCI (pression d'équilibre de

Donnan). Cela peut être réalisé en dialysant les solutions de chitine / DMAc 1

LiCI 5% contre DMAc 1 LiCl 5%. Si l'équilibre osmotique entre le solvant et les

solutions à analyser n'est pas atteint par dialyse avant de procéder aux analyses

par diffusion de la lumière, seulement des masses moléculaires apparentes

seront obtenues. 78.1 02

L'incrément d'indice de réfraction en fonction du changement de

concentration de polymère (le contraste du polymère par rapport au solvant) est

exprimé par dnldc. L'approximation usuelle de dn/dc est An/Ac, où An est la

différence d'indice de réfraction entre deux solutions de polymère de

concentration c, et cb (Ac = cb - c ~ ) . Due à l'absorption préférentielle du LiCl sur

la chitine, la concentration de LiCl autour du polymère sera différente de celle du

reste de la solution. Le An mesuré ne reflétera donc pas seulement le

changement de concentration en polymère, mais également le changement de

concentration de LiCl dans le reste de la solution. Cela peut être évité si les deux

solutions (a et b) sont dialysées contre le solvant (DMAc / LiCl 5%). La

différence de composition des solvants de ces solutions disparaîtra durant la

dialyse due à la migration du LiCl au travers de la membrane semi-perméable.

Ainsi lorsque I'équilibre osmotique entre les solutions et le solvant sera atteint, le

An mesuré reflètera uniquement le changement de concentration de polymère.

Les membranes tubulaires conventionnelles étant solubles dans DMAc /

LiCl 5%, nous avons utilisé des cellules d'acier inoxydable dans lesquelles deux

réservoirs de 2.5 mL sont séparés par une membrane de nylon (0.2pm,

Phenomenex) supportée par des joints de teflon. Chaque échantillon a été

dialysé 5 jours contre DMAc 1 LiCl 5% plp. Des rotations sur l'axe

perpendiculaire à la membrane ont été effectuées occasionnellement sur les

cellules afin d'accélérer l'atteinte de I'équilibre La diffusion des

chaînes de chitine au travers de la membrane de nylon semble négligeable après

5 jours (vérification par viscosimétrie).

Les mesures de dnldc ont été effectuées sur un réfractomètre différentiel

Optilab 9 0 3 ~ ~ (Wyatt Technology Corporation) à une longueur d'onde de 632.8

nm. Un bain thermostaté couplé à un système de pompage en circuit fermé

assurait une température constante de 65 OC environ. L'atteinte de I'équilibre

thermique a nécessité quelques heures d'attente. Les données ont été acquises

et traitées sur le logiciel dndc 4.05b (Wyatt Technology Corporation). Le logiciel

calcule le dn/dc a partir des voltages obtenus pour chaque plateau de

concentration connue.

Cinq solutions de chitine dialysées de concentrations réparties entre

0.0095 et 0.1145 g d ~ ' ont été utilisées pour mesurer le dnldc. La valeur

obtenue pour la détermination du dnldc de la chitine dans DMAcl LiCl 5% p/p est

de 0.391 t 0.006 g m ~ ' .

2.4.2.5 Méthode et résultats

Peu de travaux ont été réalisés sur la détermination de la masse

moléculaire de la chitine. Différentes méthodes ont été proposées, mais aucune

procédure standard n'a été adoptée.

Hackman et Goldberg ont déterminé les masses molécuIaires de solutions

de chitine dans LiSCN aqueux à 95 OC par diffusion de la lumière classique.37

Les problèmes inhérents à ce solvant ont déjà été discutés à la section 1.1.3.

Hasegawa et coll. ont analysé des solutions de chitine dans DMAc / LiCl

5% par SEC et étalonné leur système avec des échantillons de cellulose de

degré de polymérisation connu.26 Pour des masses moléculaires identiques, les

volumes hydrodynamiques des échantillons de cellulose sont différents de ceux

de la chitine dans le même solvant. Cela ne peut mener qu'à l'obtention d'une

masse moléculaire erronée. Dans un autre article, les mêmes auteurs ont utilisé

des étalons de pullulane (très peu soluble dans DMAc / LiCI 5%) pour

l'étalonnage et un débit de phase mobile de 0.1 m l / minute, très faible pour un

appareillage de SEC.*^

Striegel et Timpa ont utilisé la SEC en double détection avec la

viscosimétrie et la réfractométrie (à 80 OC) ainsi qu'une calibration universelle à

partir de standard commerciaux de polystyrène et de divers p~l~sacchar ides.~~

Le solvant utilisé était DMAc / LiCI 0.5%, un solvant dont le pouvoir de

solubilisation ne permet que la mise en solution des petites masses. Cela se

reflète bien dans les courbes d'élution déformées ainsi que dans les valeurs de

masses moléculaires obtenues.

Les travaux les plus intéressants ont été effectués par Terbojevich et coll.

qui ont utilisé la diffusion de la lumière classique pour déterminer les masses

moléculaires de solutions dialysées de chitine dans DMAc / LiCl 5%. 22.23 L~

méthode ne permet toutefois pas de déterminer la courbe de distribution et

l'indice de polymolécularité des échantillons analysés.

Certaines des méthodes citées plus haut sont intéressantes, mais aucune

ne permet une caractérisation massique complète de la chitine. La mise en

place d'une méthode de caractérisation efficace et complète constitue donc un

objectif d'intérêt.

Comme iI a été mentionné précédemment, la diffusion de la lumière

statique est une méthode absolue pour la détermination de la masse moléculaire

des polymères. Une méthode absolue n'est toutefois pas nécessairement exacte

ou reproductible! II est donc important d'effectuer correctement certaines

opérations cruciales afin d'obtenir des résultats valables.

f nstrumentation

L'appareillage de SEC utilisé est constitué d'une pompe de

chromatographie liquide haute performance (Waters, HPLC 515), d'une colonne

linéaire PL-gel lOpm (Waters) et d'une colonne Shodex KF-804 (Waters). Deux

détecteurs, soit un réfractomètre différentiel Optilab 903 (Wyatt Technology

Corporation) et un photomètre de diffusion de la lumière multi-angles DAWN

DSP-F (Wyatt Technology Corporation), sont connectés en série à la sortie des

colonnes. L'acquisition et le traitement des données ont été effectués avec le

logiciel Astra 4.70.07 (Wyatt Technology Corporation).

Le photomètre de diffusion de la lumière multi-angles DAWN DSP-F est

constitué de 18 détecteurs indépendants (répartis autour de la celIule

d'écoulement) pouvant mesurer l'intensité de la lumière diffusée sur un domaine

angulaire de 15" à 160". L'acronyme anglais MALLS (multi-angle laser light

scattering) est souvent utilisé pour décrire le principe de ce type d'appareil. La

source de lumière est un laser He-Ne (5 mW) polarisé verticalement d'une

longueur d'onde de 632.8 nm. II est également possible d'effectuer des analyses

à température élevée (jusqu'à 150 OC) sur ce système.

Chromatoqraphie

Le solvant utilisé pour I'élution est DMAc (Aldrich, 99.8%' anhydre) I LiCl

(Sigma Ultra, 99.0%, anhydre) 5% p/p. Le solvant ainsi que chaque solution de

chitine à analyser ont été filtrés sur une membrane de nylon de 0.45 pm

(Phenomenex). Tel que discuté a la section 2.4.3.4, toutes les solutions ont été

dialysées 5 jours contre le solvant avant d'être analysées.

Puisque les colonnes sont initialement remplies de tétrahydrofuranne

(THF), une procédure de conditionnement doit être suivie afin de ne pas

endommager la phase stationnaire. Le changement de gonflement du gel poreux

doit se faire de manière graduelle. DMAc étant miscible dans THF, il n'est pas

nécessaire d'utiliser un solvant intermédiaire.

Conditionnement :

1) DMAc (0.200 mL / minute pendant 16 heures)

2) DMAc / LiCl 0.5% (0.200 mL / minute pendant 3 heures)

3) DMAc / LiCl 1.5% (0.200 mL 1 minute pendant 3 heures)

4) DMAc I LiCI 3.5% (0.200 mL / minute pendant 3 heures)

5) DMAc I LiCl5.0% (0.600 mL / minute pendant 16 heures)

Retour au THF :

1) DMAc (0.200 mL / minute pendant 16 heures)

2) THF (0.200 mL / minute pendant 16 heures)

Dans la pratique. l'étalement de la courbe d'élution ne provient pas

uniquement de la polyrnolécularité de l'échantillon étudié. D'autres facteurs. tels

que le volume non négligeable de la solution injectée et la diffusion longitudinale

du soluté dans les colonnes et les canalisations, contribuent à l'étalement du pic

d 'é l~ t i on .~~ L'augmentation du débit d'écoulement permet de réduire l'étalement

cinétique des pics obtenus et conséquemment, d'augmenter la sensibilité de la

méthode."

Les analyses ont été effectuées a une température de 65 OC afin de

réduire la viscosité du solvant et d'augmenter le débit d'écoulement jusqu'à

l'atteinte de la pression maximale permise (1000 psi). Les deux colonnes étaient

positionnées dans un chauffe-colonne (Waters) réglé à 65.0 OC. Le photomètre

de diffusion de la lumière était également maintenu à cette température par un

système de chauffage interne alors que le réfractomètre et le réservoir de solvant

étaient chauffés par un bain thermostaté couplé à un système de pompage en

circuit fermé (Polyscience). Tous les conduits extérieurs étaient isolés de façon à

minimiser les pertes de chaleur. L'atteinte de l'équilibre thermique a nécessité

quelques heures d'attente.

Le débit utilisé pour les analyses du présent travail était de 0.600 mL /

minute. Le maximum idéal serait de 1 mL / minute, mais la température

nécessaire serait trop élevée et risquerait d'engendrer des dégradations de la

chitine. Le temps d'analyse était de 30 minutes environ par échantillon.

La volume de solution injecté était de 500 pL et la concentration limite de

chitine dans DMAc 1 LiCI 5% pour la surcharge (overloading) des colonnes était

de 0.12 g dl-' environ. Au-delà de cette concentration, des déformations étaient

observées sur la courbe d'élution donnée par le réfractomètre.

On caractérise habituellement l'efficacité d'un système de

chromatographie par le nombre de plateaux théoriques (N). Cette valeur

renseigne sur la qualité du parcours de séparation. Puisque le volume d'élution

(V,) et la largeur de pic à la base (W) nécessaires au calcul du nombre de

plateaux théoriques sont déterminés par I'utitisation d'un détecteur, la valeur

obtenue est évidemment influencée par les contributions de la colonne, du

détecteur et des c0nduits.9~

N = 16 [ (v , -v~) I w12 11 91

On peut bien voir par l'équation 19 que le nombre de plateaux théoriques

augmente avec la diminution de la masse moléculaire (les petites masses étant

éluées les dernières).

La détermination du nombre de plateaux théoriques se complique

fréquemment lors de la chromatographie de macromolécules puisque les

substances isomoléculaires nécessaires à cette évaluation ne sont pas

disponibles dans la plupart des cas. L'utilisation d'une substance de faible

masse moléculaire (ex. : benzène) pour la détermination du nombre de plateaux

théoriques renseigne sur l'état des colonnes mais ne sera pas représentative du

nombre de plateaux théoriques effectifs lors de la séparation d'échantillons de

chitine. Aucun étalon de chitine n'étant disponible commercialement, la

détermination du nombre de plateaux théoriques n'a donc pas été effectuée pour

le présent système.

On peut toutefois estimer la résolution spécifique du système en utilisant

les chromatogramrnes des fractions F-1 (plus petite masse moléculaire) et F-7

(plus grande masse moléculaire) (voir la section 3.3). La résolution spécifique

Rsp se définit comme suit :

où Ve est le volume d'élution, W la largeur du pic d'élution à la base, 1 l'indice de

polymolécularité (Mp I Mn) et M la masse moléculaireg9. La résolution spécifique

entre les fractions 1 (Mp = 81000 g mol-') et 7 (Mp = 708000 g mofl) est de 0.684.

Plus la valeur de Rsp est élevée, meilleure est l'efficacité de séparation du

système.

Diffusion de la lumière

Le photomètre de diffusion de la lumière nécessite d'être calibré avec un

solvant dont le rapport de Rayleigh est bien connu. On calibre ainsi le détecteur

placé à 90° de la direction de la lumière incidente avec du toluène de grade

CLHP filtré sur 0.02 Pm.

La sensibilité de chaque détecteur du photomètre de diffusion de la

lumière n'est pas la même du fait de leur position différente autour de la cellule

d'écoulement. II est donc nécessaire de normaliser la réponse de chaque

détecteur avant de procéder aux analyses. On utilise pour cela un échantillon

isornoléculaire de dimension inférieure à W20 de la lumière incidente, donc

diffusant la lumière isotropiquement. Les intensités enregistrées à chaque

détecteur sont ensuite normalisées à partir de l'intensité maximum enregistrée

par le détecteur placé à 90" de la direction de la lumière incidente. Puisque les

étalons commerciaux disponibles n'étaient pas solubles dans DMAc 1 LiCl 5%,

nous avons utilisé un étalon de polystyrène isomoléculaire de 35 000 g mol-' de

masse moléculaire (Pressure Chemical Company) dans DMAc 1 LiCl 0.5 % à un

débit de 0.600 mL / minute et une température de 65 OC pour la normalisation

des détecteurs. Les indices de réfraction des deux solvants étant très

rapprochés, les différences au niveau de la normalisation seront considérées

comme négligeables. Les valeurs massiques obtenues pour cet étalon

permettent aussi de vérifier l'état du système avant de procéder aux analyses.

II est également essentiel de déterminer de façon précise (avec le logiciel

Astra) le délai volumique entre les deux détecteurs. L'alignement permet ainsi de

coupler correctement le signal du réfractomètre à celui du photomètre de

diffusion de la lumière. L'étalon isomoléculaire ayant servi à la normalisation

peut servir à cet effet. Le délai entre les deux détecteurs était de 0.240 mL.

Comme nous en avons discuté à la section 2.4.2.3, les calculs effectués

par le logiciel Astra ont été réalises à partir de la méthode de Debye. Le

graphique de Debye permet d'évaluer si la fonction polynomiale choisie pour le

lissage des données expérimentales est valable pour chacune des tranches du

volume d'élution de l'échantillon (figure 2.8). Pour des molécules ayant un rayon

de giration entre 20 et 50 nm environ, le formalisme de Zimm [K c 1 R(0) versus

sin2(8/2)], permet généralement l'utilisation de fonctions polynomiales d'ordres

plus faibles que le formalisme de Debye [R(0) / K c versus sin2(0/2)].

Résultats

Le tableau 2.4 résume les résultats des analyses de masse moléculaire de

la chitine non fractionnée par chromatographie d'exclusion stérique en double

détection. Le logiciel Astra donne une estimation de l'incertitude sur chaque

quantité calculée en déterminant les fluctuations statistiques du signal de chaque

détecteur. Quatre injections du même échantillon ont été réalisées afin de

déterminer l'écart type sur les valeurs obtenues pour chaque paramétre.

L'analyse de polysaccharides par diffusion de la lumière statique conduit

quelquefois à des surestimations de la masse molé~ulaire.'~' Ce problème est

relie a la formation d'agrégats en solution (phénomène dépendant de la

concentration) et peut être détecté lorsque le signal de diffusion de la lumière est

bi-rnoda~.'~' Aucune distribution bi-modale n'ayant été observée dans le présent

travail, cela laisse croire que les conditions d'utilisation du système ne

favorisaient pas la formation d'agrégats en solution.

Peak, Slice : 1, 516 Volume : 10.160 mL Fit degree : 2 Conc. : (1.249I0.017)e-4g/mL MW : (7.790 * 0.282)e+5 g/mol Radius : 127.8 t 3.5 nm

I

90" & AUX detectors

Figure 2.8 Graphique de Debye pour une tranche du volume d'élution de la chitine non fractionnée

Tableau 2.4 Résultats des analyses de masse moléculaire de la chitine non fractionnée par chromatographie d'exclusion stérique en double détection

paramètre valeur moyenne des écart type incertitudes

- MP 570 x 1 o3 g mol-' 3.1 % 2 x 103 mol-' - Mn 400 x 1 o3 g mol' 2.9 % 2 x 103 g mol-' - - Mp 1 Mn 1 -43 3.5 % 0.02

crg2>" 92.1 nm 3.2 % 0.4 nm

On peut remarquer un faible décalage entre les courbes d'élution de

chaque détecteur sur le chromatogramme de la chitine non fractionnée (figure

2.9). Cela démontre bien la sensibilité accrue du photomètre de diffusion de la

lumière pour les masses moléculaires plus élevées. Les volumes interstitiel et

poreux des colonnes utilisées sont approximativement de 8 m l et I O mL

respectivement.

La chromatographie d'exclusion stérique dans DMAc / LiCl 5% en double

détection avec la réfractométrie et la diffusion de la lumière permet donc une

caractérisation massique complète de la chitine.

- Diffusion de la lumière (90') - Réfractométrie

8 9 10 11 12 13

volume d'élution (ml)

Figure 2.9 Chromatogramme de la chitine non fractionnée obtenu par chromatographie d'exclusion stérique en double détection

CHAPITRE III

FRACTIONNEMENT DE LA CHITINE

3.1 Introduction

Le chapitre III porte principalement sur l'élaboration de deux méthodes de

fractionnement distinctes dans le solvant DMAc ! LiCI. Une première méthode

par précipitation sera discutée brièvement à la section 3.2 alors que la méthode

par extractions sélectives sur un coacervat (section 3.3) sera traitée en détail.

Les raisons relatives au choix de DMAc / LiCI comme solvant de

fractionnement ont déjà été discutées dans le chapitre I . Ce solvant n'engendre

pas de modification chimique et physique sur la chitine et permet l'obtention de

modifications précises du pouvoir de dissolution par changement graduel de la

concentration de LiCI.

La section 3.4 traite spécifiquement de la détermination des constantes de

l'équation de Mark-Houwink-Sakurada de la chitine dans DMAc / LiCl 5%.

3.2 Fractionnement par gélification sélective

3.2.1 Principe

Une augmentation de température améliore généralement la solubilité d'un

polymère dans un solvant. L'effet inverse se produit toutefois pour les systèmes

présentant une température critique de démixtion inférieure (TCDI). De tels

systèmes présentent une séparation de phase à température élevée à proximité

de cette température. La décomposition de phase mène habituellement à une

phase riche et une phase pauvre en polymère.

Les considérations suivantes ne décrivent pas le cas généra1 d'un système

présentant une TCDl mais s'appliquent au système chitine / DMAc / LiCl 5% et à

quelques autres cas de gélification à température élevée.lo4 La solubilité d'un

polymere dans un solvant peut se traduire par l'équation de Gibbs-Helmholtz :

AG, = AH, - TAS, PI 1

Lorsqu'on chauffe une solution de polymère, la différence de coefficient

d'expansion thermique entre le solvant (dont le volume croît rapidement avec la

température) et le polymère (dont le volume change peu au chauffage) devient le

facteur déterminant la solubilité. Le changement principal dans la

thermodynamique de la solution provient de la contraction du solvant en

présence du polymère, ce qui apporte une large contribution négative à AH, et

ASm. L'énergie libre de mélange devient alors drastiquement dépendante de la

température. Lorsque la température est dépasse la TCDI, le terme entropique

-TAS,, défavorable au mélange, dépasse l'enthalpie de mélange négative et

l'énergie libre de mélange devient positive, d'où séparation de phase.'* La

démixtion, soit la substitution de la plupart des contacts polymère-solvant par des

contacts polymère-polymère (phase concentrée) et solvant-solvant (phase

diluée), peut être reliée qualitativement à la fusion des différentes structurations

régionales du solvant sur le polymère, donc dépend de la structure moléculaire.

Dans un même système, la température critique de démixtion inférieure

augmente avec la diminution de la masse moléculaire.

Deux publications traitent du comportement réversible de gélification à

température élevée pour le système chitine / DMAc / LiCI 5%. 22.41 Terbojevich et

coll. ont associé ce comportement à I'augmentation de l'instabilité du complexe

DMAc-LiCI avec I'augmentation de la température." La présence d'une TCDi

semble toutefois plus plausible. Ils ont observé des transitions gel-solution très

brusques et une diminution de la température de gélification (entre 90 et 115 OC)

avec l'augmentation de la concentration de chitine (entre 2.5 et 0.5%)~'~

Une augmentation contrôlée de la température du système jusqu'à la

TCDl devrait donc permettre de précipiter les différentes espèces moléculaires

sélectivement, les grandes masses en premier, puis les plus petites.

3.2.2 Méthode

Une solution (200 mL) de chitine non fractionnée de 0.31% p/v dans DMAc

/ LiCl 5% p/p a été chauffée sous atmosphère d'azote dans un ballon bi-col en

immersion dans un bain d'huile thermostaté d'une stabilité de + 0.05 OC.

L'homogénéisation de la solution était assurée par une agitation mécanique

vigoureuse. L'élévation lente de la température jusqu'à l'atteinte de la

température critique de démixtion inférieure (1 11 OC) permettait au système de

s'équilibrer thermiquement. Arrivée à cette température, la solution a été laissée

en stabilisation thermique pendant cinq autres minutes sous agitation.

II s'agissait alors de récupérer le gel formé qui allait constituer la première

fraction. Puisque le gel était trop fin pour être séparé par filtration et qu'il adhérait

partiellement à la paroi de verre du ballon, la récupération a été effectuée avec

des billes de verre de 2 mm de diamètre ajoutées à la solution. Le gel ainsi

immobilisé sur les billes et sur la paroi permettait l'enlèvement du surnageant par

succion. Le surnageant récupéré a ensuite été chauffé à nouveau pour un

deuxième tour de fractionnement alors que le gel immobilisé sur les billes de

verre a été récupéré à température de la pièce et précipité selon le protocole

présenté à la figure 2.3. Cinq fractions ont été récupérées au total.

3.2.3 Résultats et discussion

La méthode de fractionnement par gélification sélective utilisée comporte

plusieurs dificultés majeures qui la rendent peu pratique et peu efficace. La

solution commence à jaunir légèrement après une heure de chauffage, ce qui

indique qu'il y a dégradation de la chitine durant le processus. Techniquement,

la séparation du gel et de la solution en conservant une température élevée

constante n'est pas très aisée a mettre en place.

Tableau 3.1 Résultats de l'essai de fractionnement par gélification sélective

Fraction Masse récupérée viscosité intrinsèque (9) (dL g-7

Non fractionnée 0.620 (masse initiale)

0,OO 0 , O l 0,02 0,03 0 ,O4 0,05

concentration de chitine (g dl-')

Figure 3.1 Détermination de la viscosité intrinsèque des fractions obtsnues par gelification sélective

On peut observer que la viscosité intrinsèque des fractions obtenues

diminue en fonction du temps de chauffage (voir tableau 3.1 et figure 3.1) et que

les viscosités intrinsèques des premières fractions (contenant normalement les

plus grandes masses) sont inférieures à la viscosité intrinsèque de la chitine non

fractionnée (N-F). Même si des améliorations peuvent être apportées, ces

premiers résultats démontrent que la dégradation causée par le chauffage prime

sur la capacité de fractionnement de la méthode. II faut donc se tourner vers une

autre méthode, soit le fractionnement par extractions sélectives sur un coacervat.

3.3 Fractionnement par extractions sélectives sur un coacervat

3.3.1 Principe

Dans la littérature actuelle, le terme coacewat est utilisé pour décrire la

phase liquide riche en polymère obtenue par l'addition d'un non-solvant à une

solution de polymère. Dans une méthode de fractionnement par extractions sur

un coacervat, un volume approprié de non-solvant est premièrement ajouté à la

solution de polymère pour la formation du coacervat La presque totalité du

polymère doit se retrouver dans cette nouvelle phase. La phase diluée

(contenant les plus petites masses) est alors isolée et le polymère s'y retrouvant

est récupéré et constitue la première fraction. Plusieurs extractions sont ensuite

effectuées sur le coacervat avec des mélanges de solvants de pouvoir extracteur

de plus en plus élevé. Cette procédure est répétée jusqu'à ce que le

fractionnement soit terminé.105 Afin que la méthode soit reproductible, la

température doit demeurer constante a chacune des étapes de fractionnement.

La méthode par coacervation comporte plusieurs avantages qui la rendent

pratique et efficace : ajustement rapide de l'équilibre de phase, suppression de

I'accumuIation de résidus de faible masse dans les fractions de masse plus

élevée, économie de solvant et non-solvant par l'utilisation de faible volume

comparativement à d'autres méthodes et facilité de mise en place.80 Les deux

désavantages principaux sont la dificulté d'estimation de la quantité de polymère

extrait dans la phase diluée et la nécessité que le coacervat demeure sous forme

de liquide ou de gel (le polymère ne doit pas floculer) durant tout le processus de

fracti~nnement.~'

Cette technique a été utilisée avec succès pour le fractionnement de

quelques polymères: polyéthylène de haute densité, 106,107,108

p o l y p r ~ p y l è n e , ~ ~ ~ ~ ' ~ ~ poly(téréphtha1ate d 'éthy~ène),~~'*~ '~ p~ l~capro lac tame~~~ et

po~yarnide.~~

3.3.2 Méthode

Les différents solvants utilisés dans cette méthode sont des

solutions de DMAc 1 LiCl dans lesquelles la concentration de LiCl régit le pouvoir

de dissolution. Plus la concentration de LiCl est élevée, plus le pouvoir

extracteur est grand. Le choix de DMAc comme non-solvant semble inévitable

puisque tout autre solvant (eau, acétone, alcool divers, éther, etc.) ajouté à une

solution de chitine 1 DMAc 1 LiCl 5% provoque une précipitation dramatique de la

solution sous forme de grosses masses gélatineuses et le système perd alors

son pouvoir de dissolution. Le DMAc permet donc de provoquer une démixtion

contrôlée de la solution et mène à la formation d'une phase concentrée et d'une

phase diluée.

tes extractions des différentes espèces moléculaires doivent être

effectuées dans une zone de solubilité sélective comprise entre deux limites, soit

la précipitation complète et la solubilisation complète. Pour la chitine utilisée

dans le présent travail, ces limites ont été évaluées à -0.25% LiCl / DMAc et

-1.3% LiCl / DMAc respectivement. La limite de précipitation a été évaluée

qualitativement par l'observation de l'aspect de la chitine en solution après l'ajout

de différents vofumes de DMAc à une solution de chitine de 1 % dans DMAc / LiCI

5%. L'évaluation de la limite de solubilisation a été réalisée par re-dissolution

d'un coacervat formé à des conditions spécifiques (0.4% LiCI / DMAc, ratio

chitine : solvant de 0.8 : 1000) avec différentes solutions de DMAc / LiCl dans un

ratio volumique solvant : coacervat de (10 : 1). La zone de solubilité sélective,

dans ces conditions, se situe donc entre 0.35% et 1.2% LiCl / DMAc.

Toutes les étapes d'extraction ont été effectuées dans un erlenrneyer de

1000 mL sous atmosphère d'azote en immersion dans un bain thermostaté d'eau

distillée maintenu à 25 + 0.1 OC. La température de fractionnement a été fixée à

une valeur près de la température ambiante de façon à minimiser les écarts de

température entre les différentes étapes de manipulation. Une agitation

magnétique constante assurait une bonne distribution spatiale du coacervat dans

l'ensemble de la solution de fractionnement.

II est très important d'optimiser ['étape de formation du coacervat en

choisissant un volume adéquat de DMAc a ajouter à la solution de chitine / DMAc

1 LiCl 5%. Cette étape cruciale dirige le parcours de fractionnement et la qualité

des extractions subséquentes. Les fractionnements [es plus intéressants ont été

obtenus lorsque le coacervat était formé à une concentration de LiCl de 0.4%.

Le volume optimal de DMAc a ajouter à 80 rnL de solution de chitine 1 .O8 % p/v

dans DMAc / LiCl 5% est donc de 920 mL. D'autres volumes et concentrations

initiales de LiCl ont été essayés, mais l'efficacité moindre des extractions suivant

cette première étape ont permis de fixer des valeurs pour ces paramètres. Ce

point sera traité un peu plus loin à la section 3.3.3.

Pour chaque extraction (sauf à la formation du coacervat), le rapport

volumique ( V a ) des phases concentrée (V,) et diluée (Vd) a été maintenu à une

valeur de 1/10 afin de favoriser une séparation adéquate des deux phases. Cela

permet également d'obtenir une bonne répartition de la chitine dans chacune des

fractions. Une faible variation de ce rapport conduisait souvent à l'impossibilité

de séparation des deux phases (solution complètement gélifiée ou liquéfiée).

Pour chaque extraction, une période d'agitation magnétique à haute

intensité d'une durée de 1Y2 heure a été attribuée pour l'ajustement de l'équilibre

de phases. Les observations effectuées par microscopie optique à différents

temps d'agitation montrent que le coacewat est réparti de façon pratiquement

homogène dans la solution de fractionnement après 45 minutes d'agitation

(figures 3.2 à 3.5). Chaque échantillon de la solution de fractionnement a été

déposé sur une lamelle de verre et recouvert d'une micro-lamelle pour ensuite

être observé en champ clair sur un microscope Zeiss Axioskop couplé à un

objectif Leica (160/-, L25/0.22, OT4W0.34) et une caméra à trois CCD (Hitachi).

L'acquisition et le traitement des images ont été réalisés avec le logiciel Image-

Pro Plus (Media Cybernetics).

Puisque la récupération de la phase diluée par décantation du coacervat

serait trop longue et que la filtration ne semblait pas appropriée (le coacervat est

très fin et il y a possibilité d'évaporation du DMAc), la centrifugation a été choisie

pour la séparation des deux phases. Quatre bouteilles de polypropylène de 250

ml ont été utilisées dans une centrifugeuse réfrigérante Sorval ajustée à 25 + 1

OC. Les solutions ont été centrifugées à 8000 rpm pendant une heure et la

décantation finale a été réalisée par l'amorce d'un siphon afin d'éviter le mélange

des deux phases à séparer. Une centrifugeuse réfrigérante Sorval RC-5B a été

utilisée pour les essais sur des petits volumes. Cette technique fonctionne bien

mais occasionne toutefois des pertes de matériel attribuables au fait que le

coacewat colle à la paroi des bouteilles de centrifugation.

Figure 3.2 Observation par microscopie optique de la dispersion du coacewat pendant la première extraction (après 10 minutes d'agitation)

Figure 3.3 Observation par microscopie optique de la dispersion du coacewat pendant la première extraction (après 30 minutes d'agitation)

Figure Obsewation par microscopie optique de la dispersion coacenrat pendant la première extraction (après 45 mini d'agitation)

Figure Observation par microscopie optique de la dispersion coacenrat pendant la première extraction (après 90 mini d'agitation)

Les concentrations de LiCl des différentes solutions de DMAc / LiCl

utilisées pour les extractions doivent être réparties entre 0.35% et 1.2% LiCl /

DMAc environ, soit dans la zone de solubilité sélective. Autour de 0.85% LiCl /

DMAc, on peut observer une solubilisation massive du coacervat accompagnée

d'une diminution de la sélectivité massique de dissolution. Le calcul de la

concentration réelle en LiCI a été réalisé en assumant que les proportions de LiCl

et de DMAc étaient identiques dans chacune des phases. Le parcours de

fractionnement est schématisé à la figure 3.6.

3.3.3 Résultats et discussion

Les fractions obtenues par extractions sélectives sur un coacervat ont été

analysées par spectroscopie infrarouge et analyse élémentaire. II semble bien

qu'aucune modification chimique ne se soit produite durant le fractionnement. II

serait surprenant que les fractions soient chimiquement différentes de la chitine

non fractionnée puisque la dernière étape du processus de purification était une

solubilisation dans DMAc / LiCl 5% (section 2.1).

La figure 3.7 montre l'influence de la formation du coacervat sur le

parcours de fractionnement. À 0.35% LiCl / DMAc, le coacervat formé est trop

compact et encore un peu trop près de la précipitation complète. Les extractions

avec des solutions de faible pouvoir de dissolution ne sont pas possibles dans de

cours délais et la solubilisation massive à des concentrations de LiCI plus

élevées mène à l'obtention de quelques fractions seulement réparties sur un

faible domaine de masses. La formation du coacervat à 0.50% LiCl / DMAc

permet l'extraction des petites masses avec des solutions de faibles pouvoir de

dissolution, mais la sélectivité est moindre que dans la coacervation à 0.4% LiCl 1

DMAc. Le fait que les masses des dernières fractions soient plus faibles que

dans la coacervation à 0.4% LiCI / DMAc est probablement dû au gradient de

concentration plus brusque autour de 0.8% LiCI.

solution de chitine non fractionnée

formation du coacervat par ajout de DMAc

\ extractions sélective

solubiIisation complète fin du fractionnement

4

Fraction isolée dans le surnageant

Figure 3.6 Schématisation du parcours de fractionnement par extractions sélectives sur un coacervat

O coacervation à 0.35% LiCI coacervation à 0.40% LiCl coacewation à 0.50% LiCI

0,3 0,4 0.5 0.6 0,7 0.8 0,9 1.0 1,1 1,2

% LiCI / DMAc (plp)

Figure 3.7 Influence de la formation du coacervat sur le parcours de fractionnement

La formation du coacervat doit donc être effectuée à une concentration de

LiCl / DMAc où la précipitation partielle de la chitine est relativement faible. On

peut ainsi parler d'une zone de transition entre la précipitation et la coagulation

de la chitine (coacervation). Tel que mentionné à la section précédente, 0.4%

LiCl / DMAc semble être fa concentration optimale pour la formation du

coacervat. Cette concentration permet d'obtenir une répartition avantageuse des

différentes espèces moléculaires lors des extractions sélectives. Cette valeur ne

serait probablement pas optimale pour un échantillon de chitine de masse

moléculaire et de distribution de masse différentes.

En plus du pouvoir de dissolution propre à chaque mélange DMAc / LiCI,

d'autres facteurs sont également à considérer dans la compréhension du

mécanisme de fractionnement : la cinétique de te-dissolution du coacenrat , la

ségrégation de masses moléculaires induite par des comportements d'adsorption

préférentielle du LiCI et du DMAc sur les chalnes de chitine ainsi que

l'encombrement stérique causé par la structure physique du coacervat.

L'influence non négligeable de ces facteurs ne sera toutefois pas étudiée dans le

présent travail.

La figure 3.8 montre les courbes obtenues lors de la détermination de la

viscosité intrinsèque des fractions provenant du fractionnement final sur 0.864 g

de chitine. Afin d'alléger le graphique, seule la relation de Huggins est

présentée. On peut observer que les fractions 1 à 4 ont des viscosités

intrinsèques inférieures à la chitine non fractionnée alors que les fractions 6 et 7

ont des valeurs supérieures à cette dernière. Cela signifie qu'il y a bien eu

séparation d'espèces moléculaires distinctes par fractionnement. Le nombre

plus important de fractions de faibles masses moléculaires (ayant des viscosités

intrinsèques inférieures à celle de la chitine non fractionnée) indique que la

sélectivité de la méthode est plus grande pour les petites masses moléculaires.

Les résultats de la détermination de la viscosité intrinsèque sont résumées dans

le tableau 3.2.

1 F 4 N-F /

--

0,OO 0,OI 0,02 0,03 O ,O4 0,OS 0,06

concentration (g d ~ ' )

Figure 3.8 Détermination de la viscosité intrinsèque des fractions de chitine obtenues par extractions sélectives sur un coacewat

8 9 10 11 12 13 14 15

Volume d'élution (ml)

Figure 3.9 Chromatograrnmes de quel ues fractions

coacervat 9 obtenues par extractions sé ectives sur un

La figure 3.9 montre les chromatogramrnes des fractions 1, 3, 5, 6 et 7

obtenues lors du fractionnement final de 0.864 g de chitine. Les fractions 2 et 4

ne sont pas présentées afin de ne pas surcharger la figure. On peut observer le

déplacement des courbes de distribution de la fraction 1 vers la fraction 7. Cela

indique clairement qu'il y a bien eu séparation d'espèces moléculaires distinctes

par fractionnement. La dispersion similaire des courbes d'éiution des fractions 1 ,

2, 3 et 4 est légèrement plus faible que celle de la chitine non fractionnée (figure

2.9). Les courbes étroites des fractions 5 et 7 correspondent bien aux indices de

polymolécularité de 1.33 et 1.28 calculés par le logiciel Astra. La fraction 6

contient sensiblement les mêmes masses élevées que dans la fraction 7, mais

beaucoup plus de masses faibles, ce qui a pour effet de diminuer la masse

moléculaire moyenne et d'augmenter la polymolécularité de cette fraction. Ces

résultats sont détaillés dans le tableau 3.2.

Tableau 3.2 Résultats du fractionnement par extractions sélectives sur un coacervat

N-F --- 0.864 21.5 570 92.1 1 -45 (masse initiale)

Tel qu'introduit à la section 1.2, le jugement de la qualité et de l'efficacité

du fractionnement repose sur l'analyse des certains critères :

1) L'augmentation de la masse moyenne en poids de la fraction 1 vers la

fraction 7 indique clairement qu'il y a bien eu séparation d'espèces moléculaires

distinctes par fractionnement.

2) Les fractions obtenues ont des indices de polymolécularité inférieurs à

celui de la chitine non fractionnée. La méthode utilisée permet donc de réduire la

dispersion de la distribution de masse dans chacune des fractions. L'analyse

direct de la forme des courbes d'élution permet également de contre-vérifier les

valeurs obtenues. Les formes des courbes d'élution obtenues sont similaires à

celle d'une distribution gaussienne.

3) La somme des masses des sept fractions obtenues n'est pas égale a la

masse initiale de chitine. Le pourcentage de récupération de 79.6% est

principalement attribuable à l'utilisation de la centrifugation lors de la séparation

de phases. Même en rinçant avec le solvant servant à l'extraction suivante, le

coacewat reste partiellement collé à la paroi des bouteilles de centrifugation. Le

20.4% de perte correspond à 0.176 g de chitine. Une fois cette quantité divisée

par 7 (nombre de fractions) et par 4 (nombre de bouteilles pour la centrifugation

d'une fraction), on obtient une perte de 6 mg environ par bouteille lors d'une

centrifugation, ce qui est très faible. Ces pertes sont probablement plus

importantes dans les grandes masses puisque celles-ci sont présentes dans le

coacervat jusqu'à la fin du fractionnement. II se peut également qu'il y ait eu des

pertes lors de la filtration sur goosh (porosité fine) de la chitine précipitée dans

chacune des fractions. Les masses récupérées pour ces fractions s'échelonnent

entre 5.5 et 21.5 % de la masse initiale. On peut observer que la masse des

fractions augmentent avec l'augmentation de la concentration de LiCl dans le

solvant utilisé pour l'extraction. Cela indique que la sélectivité de la méthode est

plus grande lorsque les concentration de LiCl dans DMAc sont inférieures à la

limite de solubilisation massive de 0.85% LiCI / DMAc.

4) La moyenne des viscosités intrinsèques des fractions obtenues

(équation 6, [q] = X(mi [qli) 1 mi), est plus faible que la viscosité intrinsèque de

la chitine non fractionnée puisque la récupération est de 79.6%. En assumant

que tout le matériel non récupéré se serait retrouvé dans la fraction 7, la valeur

donnée par l'équation 6 serait égale à 20.3 dL g-', ce qui se rapproche de la

valeur initiale de 21.5 dL g" pour la chitine non fractionnée.

La reproductibilité de la méthode pour des quantités à fractionner de

l'ordre du gramme n'a pas été évaluée en raison des coûts reliés à l'achat de

solvant. Les premiers essais sur des petites quantités (0.1 g) dans les mêmes

proportions donnent toutefois un bon aperçu de la constance des extractions à

une même concentration de LiCl 1 DMAc (tableau 3.3). Toutes les extractions on

été effectuées après une coacervation à 0.4% LiCl 1 DMAc, mais à des temps

d'agitation différents (entre 60 et 120 minutes). Le faible écart type sur chacune

des valeurs de viscosité intrinsèque démontre que la reproductibilité des

extractions est très bonne en considérant l'erreur expérimentale sur les mesures

(section 2.4.1.2).

Une reconstitution de la courbe d'élution de la chitine non fractionnée par

addition des chromatogrammes des fractions obtenues et ajustement des

proportions de chaque fraction est présentée à la figure 3.10. La courbe de

reconstitution a été construite en assumant que tout le matériel non récupéré

aurait dû se retrouver dans la fraction 7. La courbe de reconstitution correspond

de manière satisfaisante à la courbe de la chitine non fractionnée compte tenu de

l'incertitude reliée au matériel non récupéré ainsi qu'au fait que la multiplication

d'une courbe par un facteur x ne donne pas le même résultat qu'une variation

chromatographique associée à un facteur x de concentrati~n.~~

Tableau 3.3 Viscosité intrinsèque de fractions obtenues après différentes périodes d'extraction

viscosité intrinsèque (dL g-')

temps d'agitation 1 O extraction 2" extraction 3" extraction (minute) (0.40% LiCI / DMAc) (0.60% LiCl / DMAc) (0.75% LiCl / DMAc)

moyenne écart type

La méthode de fractionnement par extractions sélectives sur un coacervat

permet donc une séparation efficace des différentes espèces moléculaires de

chitine présentes dans la distribution naturelle. Malgré la légère perte de

sélectivit6 massique à des concentration de LiCl I DMAc supérieures à 0.85% et

l'obtention de fractions terminales un peu volumineuses, cette méthode reste

néanmoins pratique, fonctionnelle et efficace. Les fractions obtenues s'étendent

sur un domaine de masse de 81000 à 708000 g mol-', soit sur un ordre de

grandeur environ. Une intéressante réduction de la polymolécularité (de 1.45 à

1.3) a également été observée pour certaines fractions.

- reconstitution - chitine N-F

8 9 10 11 12 13 14

volume d'élution (ml)

Figure 3.1 0 Reconstitution de la courbe d'élution de la chitine non fractionnée par addition des chromatogrammes des fractions obtenues

3.4 Détermination de l'équation de Mark-HouwinkSakurada

3.4.1 Méthode

L'équation de Mark-Houwin k-Sakurada (M HS) reliant la viscosité

intrinsèque [q] d'une solution de polymère à la masse moléculaire a déjà été

introduite à la section 1.2 (équation 4).

Les paramètre <( K )> et a n peuvent être obtenus par l'étude des masses

moléculaires moyennes en poids et des viscosités intrinsèques d'une série

d'échantillons de distributions étroites. Les fractions obtenues par

fractionnement par extractions sélectives sur un coacervat ont été utilisées à

cette fin.

Le constante « a » est obtenue par le calcul de la pente du graphique de

log [q] en fonction de log Mp. L'ordonnée à l'origine de ce graphique correspond

à la valeur log K (figure 3.1 1 ).

Une bonne )) relation [q] - M doit généralement être obtenue par l'étude

d'un minimum de quatre échantillons de classes A (MdM,, c: 1.25), B (1.30 S

MdMn 1.75) et exceptionnellement C (1.8 2 MdMn 1 2.4) si on utilise Mp et d'un

minimum de quatre échantillons de classe A et exceptionnellement B si on utilise

M~~~

Les fractions utilisées pour la détermination des constantes de l'équation

de MHS ont des indices de polymolécularité compris entre 1.28 et 1.44. En plus

des fractions F-1 à F-7 (tableau 3.2), cinq autres fractions provenant de divers

essais de fractionnement seront également utilisées (voir tableau 3.4).

Tableau 3.4 Fractions provenant de différents essais de fractionnement par extractions sélectives sur un coacervat ayant également été utilisées pour la détermination des constantes de l'équation de Mark-Houwink-Sakurada de la chitine dans DMAc / LiCl5%

3.4.2 Résultats et discussion

Les valeurs obtenues pour les constantes a » et K K » de l'équation de

MHS de la chitine dans DMAc I LiCl 5% p/p sont de 0.95 (k0.02) et 7.6 x IO-'

(k0.2 x IO-') dL gd respectivement (figure 3.1 1). L'incertitude sur ces valeurs a

été évaluée à partir des coefficients de variation ambuables aux analyses de

viscosimétrie et de chromatographie d'exclusion stérique en double détection. Le

coefficient de corrélation de la droite tracée à la figure 3.1 1 est de 0.9952, ce qui

démontre l'excellente linéarité de la relation obtenue (équation 22).

La détermination des constantes de I'équation de MHS de la chitine dans

DMAc I LiCl 5% a déjà fait l'objet de quelques publications."i23v115 Les

différentes valeurs de a a )) et « K N trouvées dans la littérature sont présentées

dans le tableau 3.5.

Figure 3.1 1 Détermination des constantes de l'équation de Mark-Houwink-Sakurada de la chitine dans DMAc 1 LiCl 5%

Tableau 3.5 Comparaison des valeurs des constantes a et K de l'équation de Mark-Houwink-Sakurada de la chitine dans DMAc 1 LiCI 5% provenant de la littérature

groupe de recherche a K domaine de masse (dL g-l) (x 10" g mol")

- -- --

Terbojevich et coll. (1 988) O -69 2.4 x IO" 90 - 510

Shimahara et coll. (1 988) 0.71 - --

Terbojevich et coll. (1 996) O .88 2.1 x l o 4 120 - 580

Présent travail (2000) O -95 7.6 x 1 O-' 80 - 710 (I 0.02) (r 0.2 x 10-7

Les valeurs de a D de 0.69 et 0.71 proviennent d'études effectuées à

partir d'un nombre trop faible d'échantil lon~.~~ Terbojevich et col. ont eux-

mêmes remplacé la valeur de 0.69 proposée en 1988 par une nouvelle valeur

égale à 0.88 (en 1996) obtenue à partir d'un plus grand nombre d'échantillons.

La valeur de la constante <c a » est généralement élevée (0.8 - 1.1) pour

les polymères ayant un squelette rigide ou des propriétés de drainage

particulièrement élevées en solution.74 Puisque la cellulose est reconnue pour de

telles propriétés de drainage, il est probable que la chitine se comporte de

manière similaire.74

Vincendon a déjà démontré par RMN 'H que les liaisons hydrogène

intrachaîne [ (C3)-OH.. . . . .O (cycle) ] (figure 1.3) présentes dans la chitine à l'état

solide persistaient en solution dans DMAc / LiCl 5%.35 La présence de ces

liaisons hydrogènes empêcherait ainsi toute rotation autour du lien glycosidique

et maintiendrait une rigidité considérable des chaînes de chitine en solution dans

ce solvant.

2 x Les valeurs relativement élevées des rayons de giration Cr, > par rapport

aux masses moléculaires (obtenues par diffusion de la lumière) renseignent sur

la rigidité élevée des chalnes de chitine en solution dans DMAc / LiCl 5%

(tableaux 3.2 et 3.4). Cela est bien en accord avec la citation du paragraphe

précédent.

La valeur de 0.95 I 0.02 obtenue pour la constante c a >> est donc très

plausible et concordante avec toutes les observations citées précédemment. Le

fait que cette valeur soit un peu plus élevée que celle obtenue par Terbojevich et

colt. en 1996 est probablement attribuable à l'utilisation d'échantillons répartis sur

un domaine de masse plus large.

L'équation 22 permet donc de déterminer la masse moléculaire moyenne

en poids (M,) d'un échantillon de chitine de polymolécularité similaire (1 -3 - 1.4)

par des mesures de viscosité dans DMAc / LiCl 5% à des conditions identiques.

Si la polymolécularité de l'échantillon étudié est différente, l'équation 22 mène à

l'obtention d'une masse moyenne viscosimétrique (Mt,). Mais puisque la

constante « a N est égale a 0.95 (E l ), l'expression de Mv devient pratiquement

égale à la masse moléculaire moyenne en poids (M,) (voir les équations 2 et 3).

Le fait que certains auteurs ne précisent pas le domaine de masse dans

lequel une relation de type MHS est effective peut conduire à des erreurs

systématiques lors d'utilisations futures. L'équation obtenue dans le présent

travail est valide pour le domaine de masse de 80000 a 710000 g mol-' et pour

des échantillons ayant un degré d'acétylation aux alentours de 91 %.

CHAPITRE IV

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

4.1 Conclusion générale

Les trois principaux objectifs poursuivis dans ce travail ont été atteints

avec succès : Le premier objectif était de mettre au point une méthode

permettant la séparation efficace des différentes espèces moIéculaires présentes

dans la chitine non fractionnée. N,N-diméthylacétamide / chlorure de lithium

(DMAc / LiCI) est un solvant de la chitine qui présente les caractéristiques

permettant de mettre en place une procédure de fractionnement par extractions

sélectives sur un coacervat. La méthode développée permet I'obtention de

fractions s'étendant sur un domaine de masse de 81000 à 708000 g mol". soit

sur un ordre de grandeur environ. Une intéressante réduction de la

polymoIécularité a également été observée pour certaines fractions. Un essai de

fractionnement par gélification sélective a été tenté, mais la méthode s'est avérée

peu efficace et peu pratique.

L'optimisation des conditions d'analyse par chromatographie d'exclusion

stérique en double détection avec la réfractométrie et la diffusion de la lumière

constituait le deuxième objectif de ce travail. La méthode développée permet

une caractérisation massique complète de la chitine par l'obtention des masses

moyennes en poids et en nombre, du rayon de giration et de la courbe de

distribution de masse.

Le troisième objectif reposait sur la détermination des constantes de

l'équation de Mark-Houwink-Sakurada de la chitine dans DMAc 1 LiCl 5%. Cela

nécessitait l'obtention par fractionnement de plusieurs fractions de faible

polyrnolécularite et de masses moléculaires distinctes réparties sur un large

domaine de masse. Cette équation, valide pour des masses de 80000 à 710000

g mol" et pour des échantillons ayant un degré d'acétylation aux alentours de

91 %, permet maintenant de déterminer la masse moléculaire d'un échantillon de

chitine par une simple mesure de viscosité dans les mêmes conditions. La

viscosimétrie est une méthode analytique facile à mettre en place

comparativement à la chromatographie d'exclusion stérique en double détection.

Cette étude permet également d'approfondir les connaissances sur le

système de solvant DMAc / LiCI. L'utilisation de solvants mixtes a récemment

fait l'objet d'un grand intérêt pour la mise en œuvre et la séparation de polymère.

Certains procédés industriels pour la coagulation de polymère sont basés sur la

formulation de solvants mixtes conçus pour amener une solution a la limite de la

non-miscibi~ité.~'

4.2 Perspectives

Quelques améliorations pourraient être apportées à la méthode de

fractionnement par extractions sélectives sur un coacervat. La perte de

sélectivité dans les grandes masses pourrait probablement être minimisée par

l'utilisation de rapports volumiques V, / Vd plus grands lors des extractions avec

des solutions ayant une concentration en LiCl / DMAc supérieure à 0.85%.

L'étape de séparation de phases par centrifugation pourrait également être

améliorée afin d'augmenter le pourcentage de récupération de la chitine.

Un fractionnement initial sur des quantités plus importantes permettrait le

re-fractionnement de chaque fraction obtenue par la même méthode. Une

diminution supplémentaire de la polymolécularité serait sans aucun doute

observée dans les nouvelles fractions.

La récupération du DMAc et du LiCl semble relativement simple à mettre

en place. Puisque DMAc ne forme pas d'azéotrope avec l'eau, une distillation

sous pression réduite permettrait de récupérer le solvant sans difficulté. LiCl

pourrait facilement être purifié par calcination dans un four moufle. La

récupération du DMAc et du LiCl permettrait ainsi le fractionnement de quantités

beaucoup plus importantes à des coûts moindres.

La chromatographie à contre-courant pourrait peut-être permettre

l'automatisation de la méthode par une procédure en continue. Cette technique

a déjà été utilisée pour le fractionnement en continu de polymères par extractions

sélectives sur un coacer~at .~~

Si l'amélioration au fractionnement permettait d'obtenir des fractions de

polymoiécularité (Mp I Mn) inférieure à 1.2, ces fractions pourraient servir de

standards pour l'étalonnage de système de chromatographie d'exclusion stérique

en simple détection par réfractométrie. Puisqu'un photomètre de diffusion de la

lumière est assez dispendieux et surtout difficile d'utilisation, la possibilité

d'étalonner un système directement par l'utilisation d'échantillons de masses

moléculaires connues et de faible polymolécularité constituerait un avantage

économique non négligeable.

La production de chitosane de faible polymolécularité à partir des fractions

de chitine obtenues par fractionnement par extractions sélectives sur un

coacervat est également à envisager.

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