mateja cegnar ,julijana kristl dostavni sistemi ...medrazgl.si/arhiv/mr05_4_06.pdf · dnk, ter...

$: Mateja Cegnar ,Julijana Kristl Dostavni sistemi ...medrazgl.si/arhiv/mr05_4_06.pdf · DNK, ter monoklonska protitelesa, pridob-ljena s hibridoma tehnologijo. Vzporedno pri{tevajo$
MED RAZGL 2005; 44: 447–462 PREGLEDNI ^LANEK

447

Mateja Cegnar1, Julijana Kristl2

Dostavni sistemi nanometrskih velikosti za vnos proteinov in genov

Nanosized Drug Delivery Systems for Proteins and Genes

IZVLE^EK

KLJU^NE BESEDE: zdravilo spro{~anje sistemi, rekombinantne beljakovine, genetsko zdravljenje, nanotehnologija

V prispevku predstavljamo sisteme in mo`nosti vnosa proteinskih u~inkovin in genov v telo.Dostavljanje u~inkovin na mesto delovanja postaja vse bolj pomembno, saj so se z odkritjemgenoma in s tem povezanim znanjem o gensko zasnovanih boleznih pojavile u~inkovitej{ein zelo specifi~ne u~inkovine. Novi sistemi so pove~ini nanometrskih velikosti (nanodelci, lipo-somi, nanokompleksi), zgrajeni iz dolo~enih nosilnih snovi, in imajo {irok spekter prednosti.Omogo~ijo ciljanje v tkivo/celico, pove~ajo biolo{ko uporabnost u~inkovine, ji podalj{ajo delo-vanje na ciljnem mestu ter nudijo za{~ito pred encimsko razgradnjo, {e posebej proteinomin nukleinskim kislinam. Vektorji za vnos genskega materiala v celico so virusni in neviru-sni. Zaradi velikih pomanjkljivosti virusnih vektorjev postajajo zanimivej{i nevirusni vektorji,ki vklju~ujejo nosilec s kationskim zna~ajem, kar omogo~a povezovanje z negativno nabitomolekulo DNK. Tvorba kompleksov pomeni za{~ito genskega materiala in olaj{a vnos v celi-co. Za vodenje procesov v celici, kot so endocitoza, izstop iz lizosoma, razpad kompleksa, vstopv jedro in vklju~evanje v jedrno DNK, pripnejo na nosilni sistem specifi~ne molekule, ki pove-~ajo ciljanje, zlitje z membranami, spremenijo mikrookolje v celici ali druga~e vplivajo na celi~nefunkcije, ki olaj{ajo vnos genskega materiala v jedro. S kombiniranjem virusnih in nevirusnihvektorjev so razvili hibridne vektorje, ki so varnej{i od virusnih in u~inkovitej{i od nevirusnih.

ABSTRACT

KEY WORDS: drug delivery systems, recombinant proteins, gene therapy, nanotechnology

This article reviews most systems and approaches for delivery of protein drugs and thera-peutic genes into the body. Issues in drug delivery are becoming more important as morepotent and specific drugs become available, with knowledge about diseases available fromthe human genome project. To achieve optimal therapeutic efficacy, drug delivery systemsshould be customized and very innovative. Novel systems are often nanosized, prepared withthe use of specific excipients, and they also have multifaceted advantages in drug delivery.These systems in general can be used to provide targeted (cellular/tissue) delivery of drugs,to improve oral bioavailability, to sustain drug/gene effect at target place, and to improvethe stability of therapeutics agents against enzymatic degradation, especially of protein, pep-tide and nucleic acid drugs. Vectors for gene delivery can be divided into two major groups:viral and nonviral. Due to several limitations of viral vectors, nonviral vectors attract moreattention; they consist of a carrier with cationic character that is able to associate with thenegatively charged DNA molecule. Formation of this complex protects DNA against dena-turation and enables its entry into cells. For specific processes that must take place, such as

1 Asist. dr. Mateja Cegnar, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, A{ker~eva 7, 1000 Ljubljana.2 Prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, A{ker~eva 7, 1000 Ljubljana.

M. CEGNAR, J. KRISTL DOSTAVNI SISTEMI NANOMETRSKIH VELIKOSTI ZA VNOS … MED RAZGL 2005; 44

448

UVOD

Prelomnico v razvoju moderne biotehnolo-gije je v 70-ih letih postavila rekombinantnatehnologija DNK, ki je vpeljala izdelavo protein-skih u~inkovin celo v industrijsko proizvodnjo.Prvi rekombinantni protein, ki se je pred25 leti pojavil na trì{~u, je bil inzulin, s ~imerje za~rtal strm vzpon tovrstnih u~inkovinv medicinski uporabi. Danes je na trì{~uEvropske unije odobrenih okoli 90 tak{nihizdelkov. Hiter razvoj je v 80-ih letih botrovalnovodobnim t. i. biofarmacevtskim izdelkom,med katere danes uvr{~ajo proteinske u~in-kovine, izdelane z rekombinantno tehnologijoDNK, ter monoklonska protitelesa, pridob-ljena s hibridoma tehnologijo. Vzporednopri{tevajo k biofarmacevtskim izdelkom tudinovej{a zdravila, ki vklju~ujejo fragmentenukleinskih kislin. Raziskave na podro~jumolekularne genetike so namre~ v 90-ih letihomogo~ile sekvenciranje ~love{kega genoma,kar je razjasnilo nekatere gensko zasnovanebolezni in prispevalo k bolj{emu razumevanjunjihove patogeneze. S tega vidika so obliko-vali nov na~in zdravljenja, ki posega v genskiustroj celice. Razvili so koncept genskegazdravljenja, ki cilja na bolezni, kot so rak,vnetja, oku`be, bolezni krvoìlnega in ̀ iv~ne-ga sistema ter druge genske napake (1–3).

Prve u~inkovine, ki delujejo na ravninukleinskih kislin, so se pojavile v zdravlje-nju bakterijskih oku`b, virusnih in rakavihobolenj. Delujejo tako, da onemogo~ijo delova-nje ali sintezo nukleinskih kislin pri bakterijahali hitrodele~ih se virusih in rakavih celicah.Tovrstne u~inkovine so kinoloni, alkilirajo~icistostatiki, antimetaboliti oz. analogi purinskihin pirimidinskih baz, antracinski antibiotiki,alkaloidi in druge spojine, ki delujejo bodisikot kelatorji molekul DNK, zavirajo delova-nje encimov ali druga~e ustavijo proceseceli~ne delitve. Navedene u~inkovine so pred-vsem v klasi~nih farmacevtskih oblikah.

V peroralnih farmacevtskih oblikah (tabletah,kapsulah idr.) so najve~krat majhne in stabil-ne molekule u~inkovin, ki lahko difundirajoskozi biolo{ke membrane, medtem ko sopri ve~jih molekulah pogostej{e parenteral-ne oblike, kot so injekcije in infuzije. Kerso s parenteralnimi oblikami povezani ve~jistro{ki zdravljenja, manj{a sprejemljivost pribolnikih, sistemski toksi~ni u~inki, ve~kratnoodmerjanje ter navsezadnje tr`ni interesi, raz-vijajo nove farmacevtske oblike, ki se vse boljuveljavljajo.

Novej{i nosilni sistemi za vnos u~inkovinv telo imajo prednosti, kot so za{~ita u~in-kovine v fiziolo{kih pogojih, nadzorovanospro{~anje u~inkovine, zmanj{anje neèlenihu~inkov, manj{e {tevilo odmerjanj ter pospe-{ena dostava u~inkovin s kratko razpolovnodobo (1, 2). Med slednjimi so predvsem pro-teini in genski fragmenti s svojo zna~ilnozgradbo (slika 1). Njihova biolo{ka uporabnostje skoraj vedno omejena zaradi fiziolo{kih ovirv organizmu. Mednje pri{tevamo fizikalneovire, kjer celi~ne membrane ovirajo prehodvelikim in hidrofilnim molekulam, kot so pro-teini in nukleinske kisline, ter encimske ovire,kjer med mnoìco najrazli~nej{ih encimovlahko izpostavimo proteaze in RNK-aze ozi-roma DNK-aze (3–5).

Metode in tehnologije, ki jih uporabljajoza izdelavo nosilnih sistemov za proteinskeu~inkovine in gene, so si v osnovi podobne,vendar se med seboj vseeno nekoliko razli-kujejo. Proteini namre~ obstajajo v nativnitridimenzionalni strukturi, ki pogojuje njiho-vo terapevtsko delovanje, zato proizvodnjanjihovih nosilnih sistemov prvotno temelji nazagotovitvi najugodnej{ih pogojev izdelave,ki ohrani popolnost proteina. Denaturiraniprotein ima poleg neu~inkovitosti {e dodat-ne slabosti, kot so neèleni stranski u~inki inimunski odziv.

Za razliko od proteinskih u~inkovin zah-tevajo geni za svoje delovanje le kemijsko

cell recognition, endocytosis, cytosolic trafficking, endosomal escape, dissociation of the com-plex, efficient nuclear uptake and gene expression, several specific molecules are attachedto gene delivery devices enabling targeting, fusion with the membrane and changes in themicroenviroment, or other ways of affecting cellular function for successful transgenic expres-sion. Combinations of viral and nonviral components are hybrid vectors, which are safer thanviral vectors and more efficient than nonviral ones.

MED RAZGL 2005; 44

449

celovitost fragmentov nukleinskih kislin, ven-dar je sposobnost za doseganje u~inkovitegaizraànja genskega materiala v celici pogojenas povsem druga~nimi dejavniki. ê je mestodelovanja proteinskih u~inkovin bodisi zunajali znotraj celice, je tar~a genskih fragmen-tov vedno znotraj celice oz. {e dlje – v samemjedru celice. Zato morajo sistemi za vnos genovpremostiti mnogo ve~ encimskih in fizikalnihovir, preden doseèjo svojo tar~o. [ele po uspe-{ni vklju~itvi gena v jedrno DNK pride dotransgenskega izraànja in terapevtskega odzi-va, kar je odvisno predvsem od lastnostigenskega vektorja (npr. plazmida) ter stanjacelice.

V prispevku bomo predstavili pristope indostavne sisteme za vnos proteinskih u~in-kovin in genov, od katerih so slednji {elev eksperimentalni fazi, medtem ko sistemis proteini è stopajo na tr`no podro~je.

SISTEMI ZA VNOS REKOMBINANTNIH PROTEINSKIH UÎNKOVIN

Prve proteinske u~inkovine, ki so utrle pot v kli-ni~no uporabo, so uporabljali za nadomestnozdravljenje. Z razvojem biotehnolo{kih metodin sekvenciranja genov je postalo proteinskoinènirstvo u~inkovito orodje za sintezo novihproteinskih u~inkovin: rekombinantnih krv-nih faktorjev, rekombinantnih hormonov,citokinov, cepiv, monoklonskih protiteles interapevtskih encimov (1, 2). Zaradi slabosti,ki jih imajo proteinske u~inkovine v fiziolo{-

kih pogojih, uveljavljajo razli~ne pristope,s katerimi lahko izbolj{ajo biolo{ko uporabnostproteinov, spremenijo njihovo imunogenost,razpolovno dobo, hitrost delovanja idr. V tanamen raziskujejo razli~ne kemijske spremem-be proteinov, ki zakrijejo njihove neèlenelastnosti, ter nove mo`nosti dostave glede namesto njihovega vnosa ali farmacevtsko obli-ko, ki jo vnesejo v organizem. Vse spremembe,ki jih izvajajo s proteini, so mo`ne {ele obdobrem poznavanju fizikalno-kemijskih last-nosti proteinov (npr. velikosti, molekulskemase, konformacijske stabilnosti idr.), njegovefarmakokinetike (razpolovne dobe) in far-makodinamike (farmakolo{kega delovanja,imunogenosti idr.) ter njegove klini~ne uporabe(èleni odmerek, mesto vnosa) (6). Klasi~neparenteralne oblike sku{ajo vse bolj nadome-stiti z novimi pristopi, metodami in sistemiza dostavo proteinskih u~inkovin, vendar jemnogokrat njihov prehod iz bazi~nih raziskavv stopnjo razvoja {e vedno omejen s klju~nimi

Slika 1. Strukturna zgradba DNA fragmenta in proteina je eden najpomembnej{ih dejavnikov, ki vpliva na izbiro ustrezne farmacevtskeoblike.

Podro~je Teàve in slabosti

proizvodnja stro{ki proizvodnje, prenos v ve~je merilo,izkoristek

stabilnost vpliv proizvodnje in nosilnega sistema na proteinsko u~inkovino

biolo{ka uporabnost dele` u~inkovine v sistemskem obtokuvarnost/toksi~nost vpliv nosilnega sistema na mesto aplikacije

in njegova toksi~nost

Tabela 1. Klju~ni dejavniki pri oblikovanju nosilnih sistemovs proteinskimi u~inkovinami (1).

sladkorno-fosfatna veriga

Struktura DNA

osrednja os

par du{ikovihbaz

malabrazda

velikabrazda

premer20 Å

en zaklju~enzavoj 34 Å

3,4 Å

A

aminokislineaminokislina aminokislina

molekulavode

Struktura proteina

aminokislina

vodikova vez

α-vija~nica

C. Terciarnastruktura

β-nagubanastruktura

B. Sekundarna D. Kvartarna

peptidna vez

aminokisline

peptidna vez

A. Primarna struktura


450

vpra{anji o proizvodnji, stabilnosti proteina(slika 2), biolo{ki uporabnosti, varnosti oz. tok-si~nosti kon~nega izdelka idr. (tabela 1) (1, 2).

Nanodelci za parenteralni vnos

Ve~ino danes dostopnih proteinov na trì{~udajejo parenteralno. Proizvajalci so zato usme-rili razvoj novej{ih farmacevtskih oblik k tak-{nim injektabilnim sistemom in pripomo~kom,ki olaj{ajo vnos v organizem in pove~ajo spre-jemljivost pri bolnikih. To so injekcije v ovoj-nini, ki si jih bolniki lahko dajejo kar sami,taki so npr. avtoinjektorji oz. injekcijske briz-ge v obliki peresa za inzulin, rekombinantnirastni hormon idr. (1, 7).

Ker ima ve~ina proteinskih u~inkovin krat-ko razpolovno dobo, jih je treba ve~krat inji-cirati. Da bi se izognili pogostemu dajanju, ̀ e

razvijajo šdepo’ oblike ali pa proteine kemij-sko modificirajo. Med slednjimi postopki jepogosto pegiliranje oz. kovalentno vezanjepolietilenglikolnih (PEG) verig na proteinskou~inkovino. Tako proteinu pove~ajo biolo{-ko uporabnost, podalj{ajo razpolovno dobo,zmanj{ajo imunogenost in proteolitsko raz-gradnjo ter obenem pove~ajo stabilnost alitopnost. Med pegiliranimi proteini najdemona trì{~u PEG-adenozin deaminazo (Ada-gen® – Enzon/NPS Pharmaceuticals), PEG-as-paraginazo (Oncaspar® – Rhone-Poulenc Rorer),PEG-interferon alfa-2b (PEG-INTRON® –Schering-Plough) in PEG-interferon alfa-2a(PEGASYS® – Roche) (7).

Druga mo`nost za podalj{anje delovanjeproteinske u~inkovine so depo oblike. V toskupino uvr{~ajo vsadke, mikrosfere, nanodel-ce ter injektabilne gele. Med vsadke uvr{~ajotudi novej{e osmotske ~rpalke, ki jih najve~-krat vstavijo podko`no s kirur{kim posegom.Nekateri med temi sistemi omogo~ajo tudiponovno polnjenje ̀ e vnesenih ~rpalk, s ~imerlahko prilagodijo odmerjanje proteinske u~in-kovine za posameznega bolnika ali dolo~enozdravljenje (1, 7).

Trenutno je razvoj na podro~ju depo oblikusmerjen v uporabo biopolimerov, ki se v orga-nizmu razgradijo na biolo{ko skladne in raz-gradljive spojine. Izmed naravnih polimerovuporabljajo peptide (kolagen, ̀ elatino, albu-min idr.) in polisaharide (hitosan, alginat,{krob, dekstran, celulozo, hialuronsko kisli-no idr.), od sinteznih pa najpogosteje polie-stre (polilaktide (PLA), poliglikolide (PGA),

Slika 2. Aktivna tridimenzionalna zgradba proteinske u~inkovinein dejavniki, ki vplivajo na konformacijsko stabilnost pri oblikovanju.

Polimeri Mehanizem razgradnje

Naravniproteini: albumin, globulin, èlatina, kolagen, kazein encimska razgradnja (proteaze, kolagenaze …)

polisaharidi: {krob, celuloza, hitosan, dekstran, alginat encimska razgradnja (amilaze, alginaze), kislinska hidroliza

Sinteznipoliortoestri esterska hidroliza, esteraze

polianhidridi hidroliza

poliamidi hidroliza

polialkilcianoakrilati hidroliza

poliestri (laktidi/glikolidi, polikaprolaktoni) esterska hidroliza, esteraze

polifosfazeni hidroliza, raztapljanje

psevdopoliaminokisline encimi, proteaze

Tabela 2. Biorazgradljivi polimeri za nadzorovano spro{~anje proteinov.

liofilizacijapH

stri`ne sile

tlaki

temperatura

hidrofilne/hidrofobne mejnepovr{ine

soli

organska topila

nosilni materiali

vlaga

MED RAZGL 2005; 44

451

polikaprolaktone), polianhidride, poliortoe-stre, polifosfazene ter poliaminokisline (tabe-la 2) (1, 5, 7).

Pri naravnih polimerih najpogosteje upo-rabljajo metodo premreènja makromolekulv sisteme razli~nih geometrij. Vendar imajotudi ti svoje pomanjkljivosti: slabo ohranjajoobliko zaradi nabrekanja, imajo majhno trdnost,njihova sestava niha in je slab{e razloèna,lahko so prisotni razli~ni kontaminanti alipreostanki reagentov, dodanih pri izdelavi.Vse ve~ uporabljajo sintezne polimere, ki so~istej{i in imajo znano sestavo. S spreminja-njem njihove molekulske mase, stereokemijemonomerov, razmerja komonomerov ter obli-ke polimernih verig lahko dobijo {irok spekterpolimerov z razli~nimi tehnolo{kimi last-nostmi in obna{anjem v in vitro ter in vivopogojih (6).

Izdelava nosilnih sistemov iz sinteznihpolimerov poteka najve~krat z emulzijskimimetodami, ki vklju~ujejo uporabo organskihtopil in fizikalno tehnolo{kih postopkov. Obojeima velik vpliv tako na lastnosti farmacevt-ske oblike, ki jo èlijo izdelati, kot na celovi-tost oz. stabilnost proteinske u~inkovine, kijo med postopkom vgrajujejo (1, 6, 8, 9, 10).Uporabljajo organska topila, ki raztapljajopolimer, vendar minimalno vplivajo na sta-bilnost proteina in jih po izdelavi enostavno

odstranijo. Slika 3 prikazuje postopek za izde-lavo mikrosfer ali nanodelcev. Tudi vsadkepogosto izdelujejo z emulzijskimi metodami,le da uporabijo druga~ne tehnike vlitja v kalu-pe dolo~enih geometrij (1, 6). Izbira ve~sto-penjskega emulzijskega postopka je odvisna odstabilnosti proteina. ê je protein v kristalniobliki stabilen tudi v organskem topilu, ga lah-ko dispergirajo v polimerno organsko fazo karv suhi obliki (enoemulzijski postopek). V ve~i-ni primerov pa protein najprej raztopijo v vod-ni fazi, ga {ele nato emulgirajo v organsko fazos polimerom in tvorijo predemulzijo (slika 3).Naslednje stopnje izvedejo pri obeh postop-kih podobno. Z dodatkom zunanje vodne faze,ki vsebuje stabilizator, pripravijo emulzijo oz.dvojno emulzijo. Z velikostjo vnosa fizikalnihobremenitev med emulgiranjem definirajosistem, bodisi mikrosfere ali nanodelce. V kon~-ni stopnji organsko topilo odstranijo iz nastalihmikrosfer ali nanodelcev pod zniànim tla-kom ali z dodatkom zunanje vodne faze, kipovzro~i difuzijo organskega topila iz nastalihdelcev. Slednje je mo`no le v primeru, ko jeorgansko topilo delno topno v vodi in njegovatopnost hitro nara{~a z ve~anjem deleà vod-ne faze (6, 8).

Za izdelavo ve~jih delcev, mikrosfer, pogostouporabljajo tehnologijo su{enja z razpr{e-vanjem, kjer za razliko od zgoraj omenjenega

odstranjevanje organskega topila:• odparevanje ( p)• difuzija v vodno fazo

↓

• spiranje• zbiranje delcev (lo~evanje,

centrifugiranje idr.)• liofiliziranje delcev (suho

stabilno stanje)

a) tvorba primarne emulzije

vodna raztopinaproteina

vodna raztopinas stabilizatorjem

disperzija polimernihdelcev s proteinom

b) tvorba dvojne emulzije

me{anje

me{anje (emulzija v/o/v)

raztopina polimerav organskem topilu

primarna emulzija(v/o)

primarna emulzija(v/o)

Dvoemulzijski postopek za izdelavo mikro- ali nanodelcev

Slika 3. Dvoemulzijski postopek za izdelavo mikrosfer ali nanodelcev. v – voda, o – olje.


452

postopka disperzijo polimera z u~inkovinorazpr{ijo v toku vro~ega zraka, ki sproti odstra-ni uporabljena topila (6). Novej{i je postopek,kjer proteinsko u~inkovino dispergirajo v raz-topino polimera, nato pa disperzijo razpr{ijov teko~em du{iku, ki od nastalih delcev odteg-ne topilo (7). Lupron Depot® je prvi dostavnisistem na trì{~u, ki vsebuje u~inkovino lev-prolid acetat, vgrajeno v mikrosfere PLGA,katerega dajanje je enkrat mese~no in jenamenjen zdravljenju raka na prostati (11).Podobne oblike s proteinskimi u~inkovinami,ki jih najdemo na trì{~u, so predstavljenev tabeli 3 (6, 7, 12).

Omejitve pri izdelavi mikrosfer ali nanodel-cev sta kompleksnost proizvodnega postopkain dele` oz. izguba u~inkovine pri vgrajeva-nju (1). Alternativa omenjenim oblikam soinjektabilni geli ali in situ parenteralni dostav-ni sistemi, ki so manj zahtevni za izdelavo inomogo~ajo vnos ve~jih koncentracij protein-ske u~inkovine (1, 5). V ta namen uporabljajoteko~o obliko razli~nih polimerov, ki po injici-ranju v telesu ustvarijo depo sistem, v kateregaje ujeta u~inkovina. Med tovrstne sistemeuvr{~ajo: termoplasti~ne polimere, ki so pripovi{ani temperaturi teko~i, po injiciranju sev telesu strdijo in tvorijo depo obliko; in situpremreèvalne polimere, ki imajo pripetefunkcionalne skupine za medsebojno premre-ènje v telesu; in situ obarjalne sisteme, kjerpolimer raztopijo v organskem topilu, ki se poinjiciranju zme{a s telesnimi teko~inami inzapusti polimer v trdni obliki; ter sisteme,ki pri telesni temperaturi gelirajo in nadzo-rovano spro{~ajo u~inkovino (5, 13). Primerdostavnega sistema na trì{~u je SABER™.To je dostavni sistem oz. biorazgradljivi gel,sestavljen iz polimera saharoza acetatizo-butirata v fiziolo{ko sprejemljivem topilu(etanol, benil benzoat idr.), ki po injiciranju

difundira in zapusti polimer v poltrdnem sta-nju (1, 7).

Spro{~anje proteinske u~inkovine, ki sevklju~i v nastali sistem, je odvisno od njenedifuzije skozi gelsko re{etko. Poglavitni dejavni-ki so velikost molekul proteinske u~inkovine,koli~ina vgrajenega proteina, njegova topnostin molekulska masa, sestava polimernega nosil-ca ter velikost in oblika nastalega ogrodja (11).

Novej{i so dostavni sistemi, ki spro{~a-jo u~inkovino glede na spremembo v telesuoz. mikrookolju. Razvijajo jih z u~inkovina-mi, ki ne zahtevajo konstantnih plazemskihkoncentracij, temve~ se spro{~ajo glede nadra`ljaje, bodisi notranje, ki so odvisni odpotreb organizma (t. i. sistemi z zaprto zan-ko), ali zunanje, ki jih po potrebi izvajajo nasistem (t. i. sistemi z odprto zanko) (4, 14).

Sistemi z zaprto zanko so najbolj raziska-ni za zdravljenje sladkorne bolezni, kjer seinzulin spro{~a glede na spremembe v kon-centraciji glukoze. Taki so pH-odvisni sistemiin sistemi kompetitivne desorpcije. Pri prvemvgradijo v nosilni polimer inzulin in encimglukoza-oksidazo, ki pretvarja glukozo v glu-konsko kislino. Zaradi nastanka kisline se zniàpH v nosilcu, kar omogo~i spro{~anje inzu-lina. Do spro{~anja pride zaradi pove~anetopnosti inzulina pri nizkem pH ali zaradipH-odvisnega polimera, ki pri nizkem pHnabreka in omogo~i spro{~anje inzulina zara-di poru{ene strukture polimernega ogrodja.Pri kompetitivni desorpciji izkori{~ajo ve~joafiniteto glukoze za dolo~en ligand, ki zatosprosti inzulin. Primera sta kompeticija glu-koze, ki ima ve~jo afiniteto, in glikoziliranegainzulina s konkavalinom A, ali fazni prehodpolimera premreènega s konkavalinom iz gelstanja v sol stanje, kjer se z vezavo glukoze nakonkavalin zmanj{a premreènost. Podobni

Zdravilo Protein Polimer Vnos Bolezenski znaki

Lupron Depot® levprolid acetat PLA sc./im. rak na prostatiNutropin Depot® rekomb. ~l. rastni hormon PLGA sc./im. pomanjkanje rastnega hormonaZoladex® goserelin acetat PLA sc. rak na prostatiSandostatin LAR® okreotid acetat PLGA sc./im. akromegalija, rak v prebavnem traktuTrelstar Depo® triptorelin pamoat PLGA sc./im. agonist gonadoliberina

Tabela 3. Tr`no dostopni polimerni dostavni sistemi s proteinskimi u~inkovinami (odobreni od ameri{ke Agencije za hrano in zdravila – FDA).PLA – polimer mle~ne kisline, PLGA – kopolimer mle~ne in glikolne kisline, sc. (subkutano) – v podko`je, im. (intramuskularno) – v mi{ico.

MED RAZGL 2005; 44

453

so sistemi, ki izrabljajo {e druge interakcije,kot so antigen-protitelo, encim-substrat idr.

Sistemi z odprto zanko omogo~ijo spro{~a-nje proteinske u~inkovine glede na spremembe,ki jih povzro~ijo od zunaj. Na vne{eni sistemdelujejo z magnetnim poljem, ultrazvokom,elektri~nim poljem, temperaturo, svetlobo alimehansko silo, zaradi ~esar nastanejo v njemfizikalne spremembe, ki pove~ajo spro{~anjeu~inkovine iz nosilca (14).

Neparenteralne farmacevtskeoblike

Vse ve~ je raziskav, kjer kot alternativo parente-ralnim oblikam razvijajo neinvazivne dostavnesisteme. Najpogostej{e poti vnosa neparente-ralnih oblik so skozi plju~a, skozi koò ter skoziusta. Vsaka izmed njih ima svoje ovire, ki jihprikazuje tabela 4 (1).

Ker se biolo{ka uporabnost proteinskihu~inkovin po neparenteralnem vnosu zmanj-{a za ve~ kot polovico, morajo pri sistem-skem zdravljenju ob visokih koncentracijahproteina {e vedno uporabljati parenteralnopot. Obratno pa je lahko lokalno zdravljenjez dostavo proteinske u~inkovine na mestodelovanja veliko u~inkovitej{e ̀ e pri majhnihodmerkih v primerjavi s parenteralnim vno-som (1, 6).

Dostavni sistemi skozi plju~a

Plju~a predstavljajo obetajo~o pot vnosau~inkovine v telo ne le za lokalno, temve~ tudisistemsko delovanje. Absorpcija je hitra zara-di velike specifi~ne povr{ine plju~ in tesnegastika med alveolarnim epitelijem in krvnimobtokom (1, 7, 15). Vendar so v {tudijahdokazali, da je sistemska absorpcija inzulinaskozi plju~a le 10 do 15% v primerjavi s podko`-

no injekcijo, ki zna{a 20 do 30% intravenskegaodmerka (1). Razliko pripisujejo mnoìci enci-mov, ki so prisotni v plju~ih in zato zmanj{ajobiolo{ko uporabnost inzulina. Druga teàvaje odziv plju~. Odvisno od posamezne protein-ske u~inkovine lahko ta izzove razli~ne lokalneu~inke na plju~no tkivo oz. je lahko njen odme-rek za sistemsko delovanje prevelik, da bi jovnesli skozi plju~a. Proizvajalci vse ve~ uva-jajo nove pristope in ovojnino, ki olaj{ajoin izbolj{ajo dostavo proteinske u~inkovinev plju~ne alveole, kjer je absorpcija najinten-zivnej{a. Na~rtujejo tak{ne oblike, ki tvorijoaerosole z èlenimi lastnosti, bodisi disperzi-jo trdih delcev ali vodnih kapljic v zra~nemtoku. Najpomembnej{a lastnost tovrstnih oblik,ki dolo~a mesto dostave v plju~ih, je povpre~nimasni aerodinami~ni premer delca. Ta para-meter vklju~uje velikost, obliko in gostotodelca, ki naj bi za dostavo globoko v plju~-ni sistem zna{al 1 do 3 μm (7, 15). Z vidikastabilnosti proteina so najprimernej{a far-macevtska oblika pra{ki za inhaliranje. Zaizdelavo pra{kov, ki morajo imeti veliko disper-zibilnost in preto~nost, pogosto uporabljajotehnologijo su{enja z razpr{evanjem ali novej{otehnologijo z uporabo superkriti~nih teko-~in. Inhalacijske farmacevtske oblike imajoprednost, da ne zahtevajo sterilnosti, ki je zaparenteralne oblike obvezna, pa~ pa natan~nodolo~eno najve~je {tevilo nepatogenih mikroor-ganizmov (17). Kljub temu izdelujejo tovrstnefarmacevtske oblike ve~inoma v brezku`nihpogojih z nadzorovano vsebnostjo vlage v zra-ku. Pogosto dodajo proteinski u~inkovini {espojine, ki {~itijo njeno strukturo med razpr-{evanjem ali prepre~ijo vezavo vlage na delcein tvorbo agregatov. Za{~ito pred encimi lahkodoseèjo z vklju~evanjem proteinske u~inkovi-ne v biorazgradljive nanodelce ali mikrosfere.Tovrstne sisteme lahko na~rtujejo tudi tako,da zadrìjo spro{~anje proteina v plju~ih dalj-{e ~asovno obdobje. Namre~, poskusi na ìvalihso pokazali, da ima v porozne delce vgrajeniinzulin 12 ur dalj{e delovanje, kot ~e je v prostiobliki. Kljub potencialu omenjenih sistemovje dostava skozi plju~a omejena le na pro-teinske u~inkovine, ki delujejo v nizkih oz.srednjih koncentracijah ter ne povzro~ajostranskih u~inkov niti lokalnega draènjaplju~nega tkiva (1, 2, 7).

Mesto dostave Teàve in slabosti

dostava skozi plju~a epitelijske celice, proteaze, alveolarnimakrofagi, vpra{ljiva dostava u~inkovine,definirani odmerki, hitra absorpcija

dostava skozi koò roèna plast koè, proteaze, makrofagi,absorptivna povr{ina koè

dostava skozi usta epitelijske celice prebavil (tesni stiki), proteaze, ekstremne vrednosti pH

Tabela 4. Teàve in slabosti pri neinvazivni dostavi proteinskihu~inkovin.


454

Dostavni sistemi skozi koò

Najve~ja ovira pri dostavi proteinske u~inko-vine skozi koò je roèna plast. [ele motnjav oviralni funkciji koè privede do absorpcijeve~jih molekul ali delcev skozi njo (liposomi,nanodelci idr.). Pove~an prehod delcev v koòdoseèjo z iontoforezo, elektroporacijo, z upo-rabo ultrazvoka ali pospe{evalca toka delcevv koò.

Pri iontoforezi uporabljajo oblièm podob-ne sisteme, ki jih po namestitvi na koòpriklju~ijo na elektri~ni tok majhne jakosti (go-tota toka = 500 μA/cm2). Transport molekulv koò omogo~ata elektromigracijski (tok ionovv elektri~nem polju) in elektroosmozni tok.Slednji nastopi pri uporabi elektri~nega tokana negativno nabiti biolo{ki membrani, kjerprotiioni ustvarjajo dodaten pretok molekul odanode h katodi. Zaradi tega lahko z iontofo-rezo dostavljajo v koò tudi nenabite in ve~jemolekule, npr. proteine (16, 18, 21). Med testi-ranimi proteini (kot so inzulin, kalcitonin,paratireoidni hormon, vazopresin, somatosta-tin idr.) (16) so le redki primerni za dostavljanjez iontoforezo glede na odmerek, ki je potre-ben za dosego farmakolo{kega delovanja, infizikalno-kemijske lastnosti proteina. Najve~jouporabnost je iontoforeza dosegla z razvo-jem neinvazivnega diagnosti~nega orodja, kina podlagi nasprotnega elektroosmotskegatoka iz koè izlo~i nenabite molekule, kot je glu-koza. Sistem Glucowatch® (Cygnus Inc., ZDA),ki je namenjen bolnikom s sladkorno bolez-nijo, omogo~a hitro in neinvazivno spremljanjeravni glukoze v krvi (slika 4). Sistem imav stiku s koò dve identi~ni hidrogelni plo{~i-ci z elektrodama, ki zbirata glukozo, ki jo natoprek encimsko katalizirane reakcije zazna bio-senzor in pretvori v ~itljiv signal. Z razvojembioinènirstva in mikroelektronike je sistemv obliki ro~ne ure zelo priro~en za uporabo;signalna opozorila {e dodatno opomnijo bol-nika na nastop kriti~nih vrednosti glukozev krvi (18, 19).

Pri elektroporaciji pove~ajo vnos u~inko-vin v koò tako, da nanjo dovajajo kratkeelektri~ne impulze, ki lokalno povzro~ijospremembe v membranah. Prenos molekulje odvisen od napetosti, trajanja, obsega in{tevila povzro~enih impulzov (20). Kot u~in-kovito so dokazali kombinacijo elektroporacijein iontoforeze, ki sinergisti~no pove~a vnos

molekul v koò. Z uporabo ultrazvo~nih sondzmanj{ajo barierno funkcijo koè zaradi kavi-tacije (velike lokalne tla~ne razlike), ki motiurejenost lipidov med keratinociti v roèni pla-sti. Pri vseh na{tetih pristopih lahko pove~ajoprehod molekul skozi koò tudi s pospe{eval-ci absorpcije, surfaktanti.

Slabost omenjenih pristopov je, da koòpo{kodujejo, jo draìjo ali izzovejo imunskiodgovor. Prav tako je vpra{ljiva tudi stabilnostproteinske u~inkovine ob prisotnosti takofizikalnih kot kemijskih pospe{evalcev. Kljubpove~ani prepustnosti koè je dostava protein-skih u~inkovin skozi njo z omenjenimi pristopiprimerna le za primere, ki zahtevajo majhneodmerke. Namre~, absorptivna povr{ina koèje omejena na majhen predel, protein pa poprehodu skozi roèno plast pri~akajo tudimakrofagi in celice imunskega odziva, kidodatno zmanj{ajo njegovo biolo{ko upo-rabnost (1, 2).

Dostavni sistemi skozi usta

Jemanje zdravila skozi usta je najbolj zaèle-na pot vnosa u~inkovine v telo, vendar je za

Slika 4. Sistem Glucowatch® (Cygnus Inc., ZDA).

g = glukoza= negativni ion= pozitivni ion

MED RAZGL 2005; 44

455

proteine skoraj nemogo~e zaradi majhne bio-lo{ke uporabnosti. Vendar so raziskovalci napodro~ju dostavnih sistemov za proteinskeu~inkovine odkrili mo`nosti, s katerimi bi lah-ko vna{ali proteine v telo tudi peroralno. Medomenjenimi pristopi so dostavni sistemi, kiza{~itijo proteinsko u~inkovino pred agresiv-nim biolo{kim okoljem (pH, encimi ipd.),podalj{ajo ~as zadrèvanja na sluznici preba-vil in s tem pove~ajo mo`nost absorpcije. Edenzanimivej{ih pristopov so biorazgradljivinanodelci, ki zaradi majhnih velikosti preha-jajo v Peyerjevo pot, limfni sistem, kjer seabsorbirajo skozi t. i. celice M. Zaradi tar~ne-ga mesta se zdi tovrstna dostava z nanodelciprimerna tudi za vnos cepiv (1, 5). Peroral-ni vnos nanodelcev obeta veliko pri lokalnemzdravljenju v prebavilih, npr. pri Cronovibolezni, saj lahko delci zaradi nanometrskihvelikosti prodirajo globoko v obolelo tkivo inse tam zadrìjo dalj ~asa.

NANOSISTEMI ZA VNOSTERAPEVTSKIH GENOV

Gensko zdravljenje je nova metoda, s katerobi lahko popravljali napake v genskem zapisucelic ali pove~ali izraànje genov, ki kodira-jo dolo~ene terapevtske proteine. V genskozdravljenje {tejemo vsak poseg v genski zapiscelice ob uporabi polinukleotidov oz. razli~nihfragmentov nukleinskih kislin. V to skupi-no uvr{~ajo protismiselne oligonukleotide, kiz vezavo onemogo~ijo izraànje dolo~enegagena, in ribocime, molekule RNK z encimskoaktivnostjo (3, 22).

Vektorji so sistemi za vnos terapevtskihgenov v telo. Zanje velja, da morajo biti varni,netoksi~ni, neimunogeni, omogo~iti morajoza{~ito genskega materiala, prenos do tar~nihcelic, ciljanje, ter vstop v celice in sprostitevgenskega materiala. Drugi vidiki, ki zade-vajo vklju~evanje gena, transgeno izraànjein terapevtski odziv, so odvisni predvsem odu~inkovitosti genskega fragmenta in njegovevloge v patogenezi dolo~ene bolezni.

Za uspe{no gensko zdravljenje se morav celici odviti vrsta zapletenih biolo{kih pro-cesov: vnos vektorja z genskim materialomv telo bodisi lokalno v tkivo ali sistemskov krvni obtok, prenos vektorja do tar~nega tki-va oz. celice in prepoznavnost receptorja,vstop vektorja v celico, njegov transport doceli~nega jedra in spro{~anje genskega mate-riala iz vektorja v jedro celice, prepisovanjegenske informacije v jedru, prevajanje infor-macij iz nastale mRNK v ustrezen proteinv citoplazmi, vezava in delovanje proteina nareceptor, ki je lahko znotraj celice (intrakri-ni mehanizem) ali na njeni povr{ini (avtokrinimehanizem) ali na sosednji tar~ni celici (pa-rakrini mehanizem). V nekaterih primerihprotein vstopi v sistemski krvni obtok indeluje na oddaljene celice in tkiva (endokrinimehanizem) (npr. rastni faktor, eritropoetin,koagulacijski faktorji itd.), kjer prek receptor-jev povzro~a biolo{ki u~inek (3, 22).

Vektorji za vnos terapevtskihgenov

K sistemom za vnos genov pri{tevamo viru-sne, nevirusne in hibridne vektorje ter ex vivo

Vektor [tevilo klini~nih testiranj Bolezen

Virusni vektorjiretrovirus 161 rak, aids, hemofilija idr.adenovirus 135 rak, cisti~na fibroza, krvoìlne bolezni idr.poksvirus 37 rakadenoasociacijski virus 9 cisti~na fibroza, hemofilija, rak na prostatidrugi virusi 6 rak

Nevirusni vektorjikompleks liposom-DNA 57 rak, cisti~na fibroza, bolezni koronark idr.prosta DNA 59 rak, bolezni arterij idr.vnos RNA 6 rakpi{tola za vnos genov 5 ko`ni rak

Tabela 5. Gensko zdravljenje na stopnji klini~nih testiranj v svetovnem merilu (26).


456

spremenjene presajene celice (3, 8, 23–25).Najpogosteje uporabljani vektorji, ki so nastopnji klini~nih testiranj, so prikazani v tabe-li 5 (26).

Virusni vektorji

Na podro~ju sistemov za vnos terapevtskihgenov so kot prve razvili virusne vektorje.Virusi ̀ e v osnovi vklju~ujejo princip preno-sa genskega materiala. Vektorje izdelajo tako,da v virusu dolo~ene gene, ki kodirajo za viru-sne proteine, zamenjajo s terapevtskimi geni.V ta namen najpogosteje uporabljajo retroviru-se in adenoviruse, sledijo jim herpes simpleksvirus, adenoasociacijski virusi ter poksvirusi.Virusi se razlikujejo po velikosti, obliki verigeDNK/RNK (enovija~na ali dvovija~na), kapaci-teti dednega materiala ter u~inkovitosti oku-ènja celic, ki so bodisi v stanju mirovanja aliceli~ne delitve. Vsak virusni vektor ima svojeprednosti in slabosti. Npr. retrovirusi so neu-~inkoviti pri nedele~ih se celicah, kar bi celopomenilo ciljanje na hitrodele~e se rakavecelice, vendar so tudi slednje lahko v stanjumirovanja. Obratno so adenovirusi u~inko-viti pri dele~ih in nedele~ih se celicah. Ker sole-ti tudi ~love{ki naravni patogeni, fiziolo{koprisotna protitelesa v organizmu zmanj{ajonjihovo u~inkovitost. Poksviruse uporabljajoza cepljenje, ker so manj toksi~ni in imajo veliko

zmo`nost za vnos tujega genskega materia-la (3, 23, 24).

Raziskave s tovrstnimi sistemi vse boljupadajo zaradi slabih izidov nekaterih klini~-nih testiranj. Sistemi so namre~ problemati~nizaradi svoje varnosti, neèlene virulence, muta-geneze in kancerogeneze, lahko izzovejoimunske reakcije, zahteven je izbor ustrezneceli~ne linije za razmnoèvanje virusa in s tempovezano teàvno ~i{~enje. Zato iz omenjenihrazlogov vse bolj razvijajo nevirusne vektor-je (3, 25).

Nevirusni vektorji

Prednosti, ki jih imajo nevirusni vektorji predvirusnimi, so enostavnej{a izdelava in prenosproizvodnje v ve~je merilo, ve~ja prilagodljivostpri izdelavi in obse`nost dednega materiala,so varnej{i in manj imunogeni v in vivo pogo-jih. Njihova slaba stran je manj{a u~inkovitostpri okuènju celic z dednim materialom (25).

Pri oblikovanju tovrstnih nevirusnih vektor-jev je mogo~e najti skupna izhodi{~a s sistemiza vnos proteinskih u~inkovin v telo. Tako pro-teini kot geni so hidrofilni, pomembno raz-liko pa predstavlja struktura omenjenih spojin.Ker proteini zahtevajo za svoje delovanje nativ-no tridimenzionalno konformacijo, morajo ves~as izdelave ohraniti strukturo nespremenje-no. Obratno pa geni za svoje delovanje potre-

polikationz ligandom

tvorba kompleksaz DNK

DNK

vezava kompleksnana receptor

– –

––

––

–––

–

–

+

+

+

+

++

+

endocitoza

endosomnabrekanje

endo/lizosoma

vstop DNAv jedro

jedro

razpad endo/lizosoma

disociacijakompleksa

izstop kompleksa izendo/lizosoma

Slika 5: Vnos dednega materiala z nevirusnimi vektorji v celico: zdruèvanje kationskega nosilca in liganda z molekulo DNA, vezavakompleksa na receptor celice, vstop kompleksa v celico – endocitoza, razpad endo/lizosoma z nabrekljivimi-endosomoliti~nimi polimeri,izstop kompleksa iz vezikla in vstop molekule DNK v celi~no jedro.

MED RAZGL 2005; 44

457

bujejo le kemijsko celovitost fragmentov (8).Zato je mo`no tehnologijo izdelave sistemovza vnos proteinskih u~inkovin z vidika stabil-nosti prenesti tudi na tiste za vnos genov. Izbi-ra najustreznej{ih pogojev izdelave je namre~`e prilagojena za nestabilne u~inkovine, bodi-si proteine ali gene. Ve~ji problem za vnosgenov v celico je izbor pomo`nih spojin. V tanamen so razvili ustrezne nosilce, ki omogo~a-jo vgradnjo in za{~ito DNK, jo ciljano dosta-vijo do celice in v celico ter jo na tar~nemmestu tudi sprostijo (slika 5). Nosilci, ki jihuporabljajo za vnos DNK v telo, imajo kation-ski zna~aj in so bodisi polimeri, lipidi alipeptidi (3, 24, 30–33).

Polimerni nanodelci z DNK – polipleksi

Od naravnih kationskih polimerov sta najpo-gostej{a kolagen in hitosan, med sinteznimipa so najve~krat polilizin, polietilenimin, polia-midoamin in polimetakrilati, ki z DNK tvorijokomplekse, imenovane polipleksi. Polimeri solahko linearni ali razvejani, dendrimeri, (sli-ka 6), ki tvorijo razli~ne komplekse z DNK.

Ugodna lastnost kationskih polimerov jevelika pufrska kapaciteta, saj po vstopu v celicopride polimerni vektor v endosom ali lizo-som. Zaradi nizkega pH ve`e polimer velikoprotonov, pri ~emer nabreka in destabiliziramembrano lizosoma, ki posledi~no razpade.

Slednje omogo~i spro{~anje genskega mate-riala iz endosoma ali lizosoma, kar je klju~noza ohranjanje njegove stabilnosti v neugod-nem okolju in prenos v citoplazmo ter nada-lje v celi~no jedro. Drugi na~in, ki vektorjuomogo~a destabilizacijo lizosomskih in endo-somskih membran, je vklju~evanje fuzoge-nih peptidov v polimer. S pripetjem tar~nihligandov na polimerno ogrodje lahko vektorusmerijo do ciljnih celic, obloga iz polietilen-glikolov (PEG) pa lahko dodatno stabilizirasistem v obtoku in zmanj{a mo`nost, da bi

Slika 6. Struktura kationskega dendrimera poliamidoamina.

--

--

-

--

---

ligand-PEI+ + + + ++ + + + +

PEG

PEG

enostopenjski postopek

ligand3. stopnja

ligand-PEG-PEI

DNA

--

--

-

--

---

--

--

-

--

---

--

--

-

--

---

PEI

PEIPEI-PEG

+ + + + ++ + + + +

+ + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ + +

1. stopnja

1. stopnja

2. stopnja

2. stopnja

Slika 7. Razli~ne strategije tvorbe pegiliranih (PEG) kompleksov molekule DNA s kationskim polimerom polietileniminom (PEI) ter dodanimligandom.


458

celice imunskega odziva prepoznale vektor(slika 7) (24, 27, 31).

Liposomi in lipidni kompleksiz DNK – lipopleksi

Najbolj znani lipidni nosilni sistemi so liposomi,ki so se tudi prvi pojavili v genskem zdravlje-nju (28, 34, 35). Razvili so nove lipidne nosilce,in sicer so anionske in nevtralne lipide, kijih pogosto uporabljajo za izdelavo liposoma,zamenjali s kationskimi. Z vklju~evanjemkationskih skupin v lipide liposomov so dose-gli ustrezno zdruèvanje z molekulami DNK.Kationski lipidi so amfifilne molekule z dve-ma lipofilnima repoma in kationsko glavo.Pogosti kationski lipidi so DOTAP (1,2-diole-oil-3-trimetilamonijev propan), DOTMA(N-[1-(2,3-dioleil) propil]-N,N,N-trimetila-monijev klorid), ter drugi, ki lahko imajov hidrofobnem delu holesterolski ostanek(24, 26, 32, 35). Njihova struktura je pomemb-na zato, ker tvorijo ustrezne lamelarne veziklezna~ilne za liposome (slika 8, 9).

Lipopleksi so kompleksi iz liposomov inDNK, kjer je molekula DNK ujeta med ve~liposomi (slika 10, A). Tvorijo jih s postopkomhidratacije suhega lipidnega filma. Zaradi sla-be stabilnosti in agregacije je treba tovrstnesisteme uporabiti takoj po njihovem nastan-ku. Za izbolj{anje vnosa genov so liposomomdodali {e nevtralne kolipide (holesterol,DOPE – dioleilfosfatidiletanolamin idr.), kivplivajo na konformacijske spremembe oz.

fluidnost membranskih sistemov in olaj{ajovnos liposomov v celico oz. izstop DNK izmembrane lizosoma. Razvili so {e novej{esisteme, kjer je DNK vklju~ena v notranjostliposoma (slika 10, B). Sistem izdelajo tako,da molekulo DNK najprej veèjo na pozitiv-no nabiti protamin in {ele nato zdruìjov kompleks z liposomi. Zaradi preureditveliposomskih lipidov nastane kompaktensistem spontano (kompleks LPD). Tovrstnisistemi imajo ve~ji u~inek najverjetneje zaradimanj{e velikosti kot navadni lipopleksi (22, 24,32, 35, 36).

Nadalje so ugotovili, da lipidne komplek-se z DNK lahko tvorijo tudi v odsotnostimembranskih lamelarnih struktur, zna~il-nih za liposome. Tako so razvili lipidnenanodelce z DNK. Najprej naredijo me{a-ne micele kationskih lipidov in povr{inskoaktivnih spojin. Ko dodajo molekule DNK,spontano nastajajo kompleksi med lipidi inDNK, po ~i{~enju pa se lipidi in povr{inskoaktivne molekule prerazporedijo in tvorijostrukture v obliki polà, kamor se ujamemolekula DNK. Dokazali so, da je vna{anjetuje DNK v celico s tovrstnimi sistemi bolj-{e, kljub temu pa zelo pogojeno z velikostjonastalih delcev, razmerjem nabojev medkationski lipidi in molekulami DNK, koncen-tracijo povr{insko aktivne snovi, prisotnostjokolipidov ter sestavo pufra, kjer nastajajoomenjeni delci (22).

Slika 8. Molekula fosfolipida in strukture, ki lahko nastanejo po spontanem organiziranju tovrstnih molekul.

Fosfolipid

variabilnaskupina

polarnaglava

nepolarnirep

fosfatglicerol

Spontano asociiranje molekul

micel

liposom

lipidni dvosloj

notranjavodnasredica

nasi~enama{~obna kislina

in nenasi~ena

MED RAZGL 2005; 44

459

Peptidni nanodelci

S posnemanjem naravnih mehanizmov, ki jihizkori{~ajo celice same, uporabljajo kot nosil-ce za DNK tudi kationske peptide, polilizin,protamin, histon in druge (24). Z vezavo raz-li~nih peptidov oz. ligandov na vektor sodokazali u~inkovito ciljanje v razli~ne celiceali tkiva, ki bolj ali manj specifi~no izraàjodolo~ene receptorje. Med na{tetimi so recep-torji za integrin, transferin, nevrotenzin,inzulin, manozo, laktozo, rastni faktor terdruge hormone. Tudi z monoklonskimi pro-titelesi ali dolo~enimi fragmenti protiteleslahko u~inkovito usmerijo vektor do tar~e (37).

Nadalje uporabljajo domene dolo~enih para-zitnih peptidov, ki imajo fuzogene lastnostiin izbolj{ajo vklju~itev vektorja v celi~no mem-brano (ali zlitje vektorja s celi~no membrano).Ugotovili so tudi, da pri vnosu dednega materia-la v jedro sodelujejo kratke peptidne molekule(t. i. NLSs-nuclear localisation signals), ki jihprepozna regulacijski sistem za prenos gen-skega materiala v jedro. Proteinsko inènirstvoje odprlo novo pot ideji o sintezi takega protei-na, ki bi zdruèval razli~ne vektorjeve lastnosti,potrebne za vsako fazo vnosa DNK v celi~nojedro. Razvili so t.i. multifunkcionalne proteine;dva sta prikazana na sliki 11. Proteini so kom-binirani tako, da imajo domeno s kationskim

O

O

O

O

O

O

O O

OP

O–

3NH+

DOTAP

DOPE

O

O

Cl–

N+

Slika 9. Kemijski strukturi kationskega in nevtralnega lipida in okraj{ani imeni (26).

--

--

--

--

+

+ +

+

+

+

+

--

-

--

+

-

--

+

+

+ +

+

++

+

+

+ ++

+

--

--

--

--

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+

++

+

++

++

++ +

+

++

- - --- -

+

DNA

--

--

--

--

+

+ +

+

+

+

+

--

-

--

+

-

--

+

+

+ +

+

++

+

+

+ ++

+

--

--

--

--

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+

++

+

++

++

++ +

+

++

- - --- -

+

--

--

--

--

--

--

--

--

+

+ +

+

+

+

+

+

+ +

+ +

+

+

+

--

-

--

+

-

--

+

+

+ +

+

++

+

+

+ ++

--

-

--

--

-

--

+

-

--

+

+

+ +

+

++

+

+

+ ++ -

--

--

--

+

+

+ +

+

++

+

+

+ ++

+

liposom-DNA kompleks

liposomi

--

--

--

--

--

--

--

--

DNA

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+

++

+

++

++

++ +

+

+

++

+

++

++

++ +

+

++

- - --- -

- - --- - --- -

+

liposom-protamin-DNA kompleks (LPD)

protamin

liposomi

A B

Slika 10. Primerjava razli~nih kompleksov molekule DNK s kationskimi liposomi. A: tvorba lipopleksa, kjer je DNK ujeta med kationskimiliposomi. B: predhodno zdruèvanje molekule DNK s kationskim protaminom in naknadno vgrajevanje v liposome (kompleks LPD).


460

zna~ajem za u~inkovito vezanje DNK (pri GD5:Gal4 in Lys; pri NLSCt: Lys), domeno za ciljanjedo tar~nih celic (pri GD5: fragment protitele-sa scFV; pri NLSCt: ligand za receptor-integrin:FMDV RGD fragment) ter dolo~eno domenoza vstop v celico oz. izstop iz lizosoma (pri GD5:fuzogeni peptid toksina difterije); ali prenosv jedro (pri NLSCt: SV40NLSs) (37).

Hibridni vektorji

Hibridni vektorji so kombinacija nevirusnih vek-torjev in dolo~enih virusnih komponent. Sled-

nje so dodane zato, da bolje posnemajo lastno-sti virusov, ki omogo~ajo u~inkovitej{o trans-fekcijo kot nevirusni vektorji (slika 12) (25).

Vnos terapevtskih genov z ex vivo spremenjenimi celicami

Presajanje tkiv je `e dolgo znana strategijanadome{~anja ali popravljanja biolo{kihnepravilnosti v organizmu (transfuzija krvi,presaditev kostnega mozga idr.). Gensko in`e-nirstvo in celi~na biologija sta odprli mo`nostvnosa terapevtskega gena v odvzete celice in

FLAG His Gal4 toksin difterije scFVN-

N- -C

-C

Lys

GD5

NLSCt

Lys FMDV RGD SV40 NLS

Slika 11. Multifukcionalna proteina GD5 in NLSCt kot vektorja za vnos genskega materiala v celico.

--

-

--

--

--

--

--

--

-

--

--

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

kompleks polimer-DNKpolipleks

--

-

--

--

--

--

--

--

-

--

--

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

--

-

--

--

-

---

--

--

--

--

--

--

--

--

--

-

--

--

--

-

--

--

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

DNKtransferin-PLL

inaktivirani virusni delci

vezava liganda (transferina) na receptor in pove~anvnos v celico ob prisotnosti virusnih delcev

jedro

tar~na celica

Slika 12. Tvorba kompleksa med molekulo DNK in transferin-polilizinom (PLL). Transferin omogo~a vezavo na receptor tar~ne celice,dodani inaktivirani virusni delci pa olaj{ajo vstop v celico.

MED RAZGL 2005; 44

461

njihovo gojenje ex vivo, ki jih nato ponovnovnesejo v organizem. Najustreznej{e so hemato-poeti~ne in endotelijske celice, celice kostnegamozga in ìv~evja. Nekatere è testirajo zazdravljenje angiogeneze, Parkinsonove bolez-ni in aidsa (3, 8).

SKLEP

V prispevku smo predstavili najnovej{e smer-nice na podro~ju novih dostavnih sistemov,ki {e zdale~ niso dosegli vrha svojih zmo`-

nosti (38). Rezultati na{ih {tudij in drugihavtorjev kaèjo, da novodobne u~inkovinezahtevajo specifi~no izpopolnjene farmacevt-ske oblike in ovojnino za ciljani vnos v teloin prirejeno spro{~anje. Vzporedno z razvo-jem biotehnologije, genskega inèniringa innanotehnologije je treba razvijati in dograje-vati tudi znanje iz farmacevtske tehnologije,edinega orodja, ki dejansko oblikuje velikomolekulo u~inkovine v u~inkovito in varnozdravilo. Za~ete raziskave kaèjo, da je pomemb-no zlivanje izku{enj iz razli~nih podro~ij.

LITERATURA

1. Cleland JL, Daugherty A, Mrsny R. Emerging protein delivery methods. Curr Opin Biotech 2001; 12: 212–9.2. Walsh G. Pharmaceutical biotechnology products approved within European Union. Eur J Pharm Biopharm

2003; 55: 3–10.3. Rubanyi GM. The future of human gene therapy. Mol Asp Med 2001; 22: 113–42.4. Gantar M, [trukelj B. Mehanizmi delovanja in oblikovanje biotehnolo{kih produktov. Farm Vest 2000; 51: 491–8.5. Planin{ek O, Sr~i~ S. Kriti~ne fizikalno-kemijske lastnosti peptidov in proteinov za na~rtovanje farmacevtskih

oblik. Farmacevtska tehnologija na prelomu tiso~letja. Ljubljana: Slovensko farmacevtsko dru{tvo 1998: 33–44.6. Sinha VR, Trehan A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J Control Rel 2003; 90: 216–80.7. Banga AK. Delivery of protein thrapeutics. World Markets Series Business Briefing, Pharma Tech 2003, p. 198–202.8. Whittlesey KJ, Shea LD. Delivery systems for small molecule drugs, proteins, and DNA: the neuroscience/bio-

material interface. Exp Neurol 2004; 190: 1–16.9. Cegnar M, Kos J, Kristl J. Cystatin incorporated in poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles: development and

fundamental studies on preservation of its activity. Eur J Pharm Sci 2004; 22 (5): 357–64.10. Cegnar M, Premzl A, Zava{nik - Bergant V, et al. Poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles as a carrier system for

delivering cysteine protease inhibitor cystatin into tumor cells. Exp Cell Res 2004; 301 (2): 223–31.11. Dai C, Wang B, Zhao H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloid Surface: Bioin-

terface 2005; 41: 117–20.12. Chaubal MV. Role of excipients in parenteral sustained-release formulations. Drug Del Tech 2003; 7.13. Packhaeuser CB, Schnieders J, Oster CG, et al. In situ forming parenteral drug delivery systems: an overview.

Eur J Pharm Biopharm 2004; 58: 445–55.14. Sershen S, West J. Implantable, polymeric systems for modulated drug delivery, Adv Drug Del Rev 2002;

54 (9): 1225–35.15. Kristl J, Zajc N, Ga{perlin M. Inhalacijski aerosoli za lokalno in sistemsko dostavo u~inkovin. Med Razgl 2001;

40 (4): 401–14.16. Kalia YN, Naik A, Garrison J, et al. Iontophoretic drug delivery. Adv Drug Del Rev 2004; 56: 619–58.17. European Pharmacopoeia 5th edition. Council of Europe, Strasbourg. Ligugé: Aubin; 2004.18. Panchagnula R, Pillai O, Nair VB, et al. Transdermal iontophoresis revisited. Current Opin Chem Biol 2000;

4: 468–73.19. Tierney MJ, Tamada JA, Potts RO, et al. Clinical evaluation of the GlucoWatch biographer: a continual, non-in-

vasive glucose monitor for patients with diabetes. Biosenzor & Bioelectronics 2001; 16: 621–9.20. Ma~ek Lebar A, Ser{a G, êmàr M, et al. Elektroporacija. Med Razgl 1998; 37: 339–54.21. Wang Y, Thakur R, Fan Q, et al. Transdermal iontophoresis: combination strategies to improve transdermal ion-

tophoretic drug delivery. Eur J Pharm Biopharm 2005 (v tisku).22. Bally MB, Harvie P, Wong FMP, et al. Biological barriers to cellular delivery of lipid-based DNA carriers. Adv

Drug Del Rew 1999; 38: 291–315.23. Pannier AK, Shea LD. Controlled release systems for DNA delivery. Mol Ther 2004; 10: 19–26.24. El-Aneed A. An overview of current delivery systems in cancer gene therapy. J Control Rel 2004; 94: 1–14.25. Schmidt-Wolf GD, Schmidt-Wolf GH. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update. Trend

Mol Med 2003; 9: 67–72.26. Ewert K, Slack NL, Ahmad A, et al. Cationic lipid-DNA complexes for gene therapy: understanding the rela-

tionship between complex structure and gene delivery pathways at the molecular level. Curr Med Chem 2004;11: 133–49.


462

27. Brannon-Peppas L, Blanchette JO. Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy. Adv Drug Del Rev 2004;56 (11): 1649–59.

28. Torchilin VP. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Rev Drug Discov 2005; 4: 145–65.29. Spack EG, Sorgi FL. Developing non-viral DNA delivery systems for cancer and infectious disease. Drug Discov

Today 2001; 6: 186–97.30. Montier T, Delepine P, Pichon C, et al. Non-viral vectors in cystic fibrosis gene therapy: progress and challenges.

Trend Biotech 2004; 22: 586–92.31. Ogris M, Walker G, Blessing T, et al. Tumor-targeted gene therapy: strategies for the preparation of ligand-pol-

yethylene glycol-polyethylenimine/DNA complexes. J Control Rel 2003; 91: 173–81.32. Liu F, Huang L. Development of non-viral vectors for systemic gene delivery. J Control Rel 2002; 78: 259–66.33. Podlogar F, Kristl J. Dendrimeri in njihova farmacevtska uporabnost v prihodnosti. Farm Vestn 2004; 55(2): 197–205.34. Ko~evar N, Kristl J. Ciljana dostava u~inkovin v tumorske celice z liposomi. Farm Vestn 2005 ; 56 (3): 202–6.35. Abramovi~ Z, Kristl J. Inteligentni hidrogeli za dostavo zdravilnih u~inkovin. Farm Vestn 2004; 55 (4): 555–63.36. Lasic DD. Liposomes in gene therapy. In Petraria P, Unger CL, editors. Liposomes in gene therapy. Boca Raton – Flo-

rida: CRC Press; 1996.37. Aris A, Villaverde. Modular protein engineering for non-viral gene therapy. Trend Biotech 2004; 22: 371–7.38. Cegnar M, Kristl J, Kos J. Nanoscale polymer carriers to deliver chemotherapeutics to tumours. Exp Opin Biol

Ther 2005; 5 (12): 1557–69.

Prispelo 24. 5. 2005

mateja cegnar ,julijana kristl dostavni sistemi ...medrazgl.si/arhiv/mr05_4_06.pdf · dnk, ter...

Documents