maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · sunum planı • teorik bilgi (20 dk)...
TRANSCRIPT
![Page 1: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/1.jpg)
Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile
identifikasyonu
Dr. Ayşe KALKANCIGazi Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara
24-25 Şubat 2011, İzmir
![Page 2: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/2.jpg)
Sunum Planı
• Teorik bilgi (20 dk)
• Örnekler (15 dk)
• Tartışma (10 dk)
![Page 3: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/3.jpg)
Sekans analizi nedir ?DNA baz dizilimlerinin belirlenmesi
![Page 4: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/4.jpg)
DNA RNA
Şeker D-deoksiriboz D-riboz
Asit Fosforik asit Fosforik asit
Baz A, T, G, C A, U, G, C
![Page 5: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/5.jpg)
![Page 6: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/6.jpg)
BazlarPürin
• Adenin
• Guanin
Pirimidin
• Sitozin
• Timin
![Page 7: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/7.jpg)
• Nükleozid = Baz + Şeker
Glikozid bağı ile birleşir, aradan su çıkar
• Nükleotid = Fosfat + Şeker + Baz
![Page 8: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/8.jpg)
Nükleotidler• DNA ve RNA yapı taşıdır
![Page 9: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/9.jpg)
Sekans (DNA dizi) analizi yöntemleri
1. Kimyasal (Maxam-Gilbert)
2. Enzimatik (Sanger)
3. Pirosekanslama
![Page 10: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/10.jpg)
Kimyasal yöntem
• DNA molekülü kinaz enzimi ile 5’ fosfat ucundan 32P ile işaretlenir.
• Seçici olarak 4 bazı parçalayan kimyasal maddeler kullanılarak farklı uzunluklarda DNA parçaları elde edilir.
• Elektroforezle ayrılan bantlar otoradyografi ile incelenir.
Maxam A & Gilbert W. 1977
![Page 11: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/11.jpg)
![Page 12: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/12.jpg)
Enzimatik yöntem• DNA parçası asimetrik PCR ile tek zincir halinde
çoğaltılır ve kalıp olarak kullanılır. • DNA polimerazlar deoksiribozun 3’ pozisyonunda OH
grubu taşımayan dideoksiribonükleotidleri dizilere ekler.
• Sentezleri ddNTP kullanılarak durdurulmuş farklı uzunlukta yeni zincirler
• Her modifiye baz için ayrı tüplerde sentez yapılır ve ürünler denatüre akrilamid jel elektroforezinde 4 sıra halinde yürütülür.
Sanger ve ark., 1980
![Page 13: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/14.jpg)
• Kalıp DNA’lar• Primer• dNTP karışımı• Enzim• Dört reaksiyon tüpünün her birine bir ddNTP
eklenmesinden sonra bağlanma ve uzama işlemleri uygulanmaktadır.
• Farklı uzunlukta DNA parçaları• Jel elektroforezi
![Page 15: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/15.jpg)
DNA dizi analizi
5’
5’ Primer
3’ KalıpG C A T G C
dATPdCTPdGTPdTTPddATP
dATPdCTPdGTPdTTPddCTP
dATPdCTPdGTPdTTPddTTP
dATPdCTPdGTPdTTPddCTP
GddC
GCATGddC
GCddA GCAddT ddG
GCATddG
![Page 16: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/16.jpg)
G
C
T
A
+
_
+
_
GCATGC
kısa
uzun
![Page 17: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/17.jpg)
![Page 18: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/18.jpg)
Maxam & Gilbert
Yöntemi
Sanger Yöntemi
![Page 19: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/19.jpg)
Sanger:
Maxam-Gilbert:
DNA parçaları nasıl elde edilir ?
32P32P ATCGATCG32P ATCG
AT
ATCGAT
ATCGTAGCTAGCTA
TAGCTAGCTA
TAGCTAGCTA
ATCGA32P
G için özgül reaksiyon
ATCGSTOPASonlandırma
DevamEnzimatik yöntem
Kimyasal yöntem
Hedef
veya
Radyoaktif olmayan(görünmeyen)
32P A,T,C,G AAnalog
Parçala → Temizle
Parçala → Temizle
ATCGATCGAT
Yeni parçalar üretme
![Page 20: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/20.jpg)
Fosfodiester bağı
PRPRPRPRPRPR
OH
5’
3’1
3’
5’
A
1
2
3
4
5
6
APO42-
H3’
5’
2
Hdideoxynuceotide
SonlanmaSonlanmaddNTPSangerYöntem
i
Norm
al bağlanma
Reaksiyona girmez
![Page 21: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/21.jpg)
DNA dizisi nasıl sonlandırılır ?
PAGE
ATC32PAT32PA32P
T A G C
TA
CG
ATCG32PATCGA32PATCGAT32PATCGATC32PATCGATCG32PATCGATCGA32PATCGATCGAT32P
Bir nükleotid farkı olan DNA parçaları jelde ayrılır
Fakat bu bantlar bize son nükleotid bilgisini vermez
Aynı nükleotid ile biten dizileri gruplar isek,tüm genomu tanımlayabiliriz.
![Page 22: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/22.jpg)
OTOMATİZE DNA DİZİ ANALİZİ
Floresans boyaLeroy Hood ve ark. 1986
![Page 23: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/23.jpg)
![Page 24: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/24.jpg)
![Page 25: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/25.jpg)
Kapiller Elektroforez
![Page 26: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/26.jpg)
![Page 27: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/27.jpg)
Kromatogram analizi
![Page 28: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/28.jpg)
DNA sekans cihazları
Kapiller sayıları
Cihaz
![Page 29: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/29.jpg)
PCR
Saflaştırma
“Cycle Sequencing” (ddNTP)
Presipitasyon
Kapiller jel elektroforezi ve okuma
![Page 30: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/30.jpg)
HEDEF
ssDNA vektörleri– M13– pUCPCR
dsDNA (+/- PCR)
![Page 31: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/31.jpg)
Primerler
Genel primerler– ucuz, hızlı, kolay
Özel primerler– pahalı, yavaş, özgül
![Page 32: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/32.jpg)
UZAMA
Polimeraz– Sekans
– (Cycle Sequencing)
Sonlandırma– Boyama=İşaretleme (“Big Dye”)
– ddA,C,G,T
![Page 33: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/33.jpg)
AYIRMA
Jel Elektroforezi
Kapiller Elektroforez– Otomatize edilebilir
• Hızlı (2 saat)• Basit ısı kontrolü• 96 kuyucuk
![Page 34: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/34.jpg)
PİROSEKANSLAMASekans primeri tek zincirli DNA kalıbına hibridize olur.
4 deoksinükleotid trifosfattan (dNTP) ilki reaksiyona eklenir.
Her nükleotid yerleşimine, yerleşen nükleotid miktarı kadar pirofosfat (PPi) salınımı eşlik eder.
![Page 35: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/35.jpg)
![Page 36: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/36.jpg)
PİROSEKANSLAMA• Elektroforez
gerektirmez• Hızlıdır• Her dNTP sıra ile
eklenir• Komplimenter değilse
hızla ortadan kaldırılır
![Page 37: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/37.jpg)
454 Teknolojisi• Başlangıçta DNA 300-800 bp parçalara ayrılır
• Her sona bir adaptör bağlanır
• Bir adaptör biotin içerir ve streptavidin-kaplı boncuklara bağlanır. Boncuk / DNA oranı kontrol edilir. Her boncuğa bir DNA bağlanması sağlanır.
• Boncuklara yağ eklenir ve bir sütsü sıvı yaratılır. PCR yapılır. DNA kopyalanır.
![Page 38: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/38.jpg)
454 Teknolojisi• Yağ uzaklaştırılır. Boncuklar
“picotiter” plaklarına eklenir. Her bir kuyucuğa bir boncuk yerleşir.
• Her kuyucuğa pirosekans enzimi eklenir.
• Her plak tekrar tekrar dNTP ile yıkanır. Gerekli kimyasallar eklenir.
• Plak “fiber optik” çip ile kaplanır. Her kuyucuktan ayrılan ışıma CCD kamera ile okunur.
![Page 39: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/39.jpg)
DNA dizi analizi ile mantarların tanımlanması
Örnekler
![Page 40: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/40.jpg)
18S5.8S
26S5S
18SITS1 ITS2
IGS1 IGS2
rDNA bölgesi
8,188 bpITS : Internal Transcribed SpacerIGS : Intergenic Spacer
![Page 41: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/41.jpg)
Sınıf Aile Cins Tür Köken
18S26SITSIGS
Hangi bölgeyi dizileyelim ?
![Page 42: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/42.jpg)
DNA benzerliği
Aynı tür
Farklılık
Farklı tür
> 70%
30-70%
< 30%
![Page 43: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/43.jpg)
Subunit orspacer region Name of primer Sequence
ITS region ITS1 (forward) TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4 (reverse) TCCTCCGCTTATTGATATG
D1/D2 LSU NL1 (forward) GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG
NL4 reverse) GGTCCGTGTTTCAAGACGG
rRNA gen bölgesi için kullanılacak primer dizileri
![Page 44: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/44.jpg)
18S
5.8S
26S5S
18SITS1 ITS2
IGS1 IGS2
1787 3390441
1181737
8,188 bpITS : Internal Transcribed SpacerIGS : Intergenic Spacer
266158
291
DNA dizi analizi ile mantarların tanımlanması
Malassezia rRNA geni
![Page 45: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/45.jpg)
IGS bölgesi
C. albicans
Cr. neoformans
T. asahii
M. globosa
65912304
2095
2181
0 1 2 3 4 5 6 7 (kbp)
IGS1 IGS2
![Page 46: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/46.jpg)
95
96
97
98
99
100
30 40 50 60 70 80 90 100
IGS benzerliği (%)
ITS
benz
erliğ
i(%
)
IGS & ITS
![Page 47: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/47.jpg)
IGS analizi ile epidemiyolojik karşılaştırma yapılabilir.
![Page 48: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/48.jpg)
![Page 49: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/49.jpg)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2 3 4 5 6 7 8 9
%
Trichosporon asahii kökenlerinin
IGS analizi ile genotiplendirilmesi
Türkiye
Japonya
ABD
Genotip
![Page 50: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/50.jpg)
Uygulama örneği
Fenotipik yöntemler ile tür tanımı yapılamayan bir mantar…
18S
5.8S
26S
5S
18S
ITS 1
ITS 4
IGS 1IGS 2
DNA DİZİ ANALİZİ
![Page 51: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/51.jpg)
PCR
Saflaştırma
“Cycle Sequencing” (ddNTP)
Presipitasyon
Kapiller jel elektroforezi ve okuma
![Page 52: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/52.jpg)
• Dizilenecek üründen DNA elde edilir. Bu ürün genellikle mantar kolonisidir. Nadiren hasta örneklerinde bulunan fungal DNA da dizilenebilir.
• Elde edilen DNA miktarı ve kalitesi MUTLAKA ölçülür. Çok düşük (10-50ng/mikrolitre) DNA olan örneklerde dizi analizi sonucu başarılı olmayabilir. DNA miktarı yüksek ve saf olan örneklerde tür tanımı daha doğru yapılır.
• Nanodrop (USA)
• Bir hedef seçilerek çoğaltma yapılır.
![Page 53: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/53.jpg)
Amplifikasyon karışımı
• 10x buffer 3.5 l• dNTP 2.8 l (36.6nmol)• Forward primer 0.14 l (100pmol)• Reverse primer 0.14 l (100 pmol)• Taq polimeraz 0.175 l (250 U)• SU 27.245 l
• HER TÜPE 34 l dağıt• 1 l DNA ekle. “Termal cycler” cihazına
yükle.
![Page 54: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/54.jpg)
PROGRAM (IGS 1-IGS 2 primerleri için)
• 94 0C 1 dk
• 94 0C 30 sn• 57 0C 30 sn x 33 Siklüs• 72 0C 30 sn
• 72 0C 10 dk
ADI DİZİSİ
IGS 1 5’-ATC CTT TGC AGA CGA CTTIGS 2 AGC TTG ACT TCG CAG ATC
![Page 55: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/55.jpg)
• Amplifikasyon sonrasında PCR ürünü MUTLAK elektroforez yürütülür. Kontrol edilir. Sekans öncesi mutlak gereklidir.
• Yürütme sırasında 1 birim yükleme tamponu, 3 birim örnek yüklenir.
• PCR sonrasında mutlak pürifikasyon yapılır. Pürifikasyon için spin kolon protokolü kullanılır.
• Pürifiye edilen ürünlerde ürün tekrar ölçülür veya tekrar elektroforez yapılır. Kontrol için.
![Page 56: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/56.jpg)
“Cycle Sequencing” (ddNTP)
• BigDye daha önceden 6 l halinde 0.2 lik ependorflara hazırlanarak -20 de bekletilebilir.
• 20 l karışım için her tüpe tek tek şunlar eklenir;
• BigDye 6 l (HAZIR)• Hedef PCR ürünü (pürifikasyon sonrası ürün) 1 l• Primer (reverse primer) 0.65l• SU 12.35l
• Program: • 96 0C 10 sn• 50 0C 5 sn X 25 siklüs• 60 0C 4 dk
![Page 57: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/57.jpg)
BigDye Cycle sequencing sonrası pürifikasyon
• Pürifikasyon için, etil alkol kullanılır.
– 20 l BigDye ürünü içeren ependorf termal cycler dan çıkarılıp üzerine 3.3 l NaOAc (sodyum asetat) eklenir. Pipetaj yapılır.
– Karışımın üzerine 2.5 kat (20+3.3=23.3 X 2.5 = 58.25 l) Etil alkol (%100) eklenir.
– 14 000 rpm 15 dk santrifüj yapılır.– Süpernatan atılır. Çökelek üzerine 100 l %70’lik Etil alkol
konur.– 14 000 rpm 5 dk santrifüj yapılır.– Süpernatan atılır. – 14 000 rpm 3 dk santrifüj– 10l lik pipet ile kalan etil alkol çekilir. – Ependorflar vakumlu santrifüj ile kurutulur. – -20 0C de saklanır.
![Page 58: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/58.jpg)
• Etanol pürifikasyonu sonrası YİNE DNA ölçülür. Kalite kontrolü için.
• Otomatik sekans cihazına yüklenir. Burada yapılan kapiler jel eketroforezidir. Tek yönde uzatılmış (BigDye) DNA burada tek tek okunur.
• Elde edilen nükleotid dizisi veri kütüphaneleri ile karşılaştırılarak tür tanımlaması yapılır.
![Page 59: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/59.jpg)
• Hizalama• Göz ile kontrol !!!!!
![Page 60: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/60.jpg)
İşlem basamakları• DNA eldesi• DNA ölçümü• PCR• Elektroforez• Pürifikasyon• DNA ölçümü
• Elektroforez• “Cycle sequencing”• Pürifikasyon• DNA ölçümü• Kapiller elektroforez• Veri analizi
![Page 61: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/61.jpg)
Fungal DNA dizi analizi bize neler sağlar ??
• Kesin tür tanımı• Alt tür• Filogenetik analiz
• Mutasyon analizi– Direnç bölgelerinde mutasyon– Virülans genlerinde mutasyon
![Page 62: Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile ... · Sunum Planı • Teorik bilgi (20 dk) ... 5S 18S ITS 1 ITS 4 IGS 1 IGS 2 DNA DİZİ ANALİZİ . PCR Saflaştırma “Cycle](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022040312/5e013d98f4f84572ba12344e/html5/thumbnails/62.jpg)