B. Bellier

Mécanismes effecteurs de défense contre les agents infectieux :

Immunité à médiation humorale

Dr. B. Bellier Labo. Immunologie-Immunopathologie-Immunothérapie

UPMC CNRS UMR7211, INSERM U959 Pitié-Salpêtrière; Paris 13

bertrand.bellier@upmc.fr

Master BMC MV403 : Interface Microbio – Immuno - Env

B. Bellier Plan

•  I. Intro: rappel sur Anticorps et Lymphocytes B –  Structure des Ig –  Diversité isotypique et idiotypique –  Origine de la diversité

•  II. Stimulation antigénique des LyB et mise en place de la réponse humorale

–  Nature des antigènes (thymo-dépendent/ indépendant) –  Coopération cellulaire –  La réponse germinative:

•  maturation d’affinité •  commutation de classe •  Cellules mémoire

•  III. Utilisation des anticorps en clinique: Sérothérapie / Vaccination /Immunothérapie

B. Bellier

I.  Rappels:

Anticorps : Structure, Diversité, Origine

B. Bellier Anticorps et Réponse humorale

•  Anticorps : protéines sériques, du groupe des gammaglobulines, aussi appelées immunoglobulines ou Ig soluble

•  Sécrétés après recrutement, activation et différenciation en plasmocytes des lymphocytes B suite au contact Antigène - Récepteur membranaire (BCR ou Ig membranaire)

- BCR est responsable de la reconnaissance de l’antigène - Les chaînes intracellulaires Iga-Igb assurent la transmission du signal

Lymphocyte B Molécule hétérodimérique 4 chaînes polypeptidiques :

•  2x (H : 50 Kda) •  2x (L : 22 Kda)

Liaison disulfure intrachaîne Formation de domaines de type « Ig »

• 110 AA • Repliement en feuillets plissés Beta

Régions hypervariables (CDR)

B. Bellier Classes d’Immunoglobulines

IgM IgD

IgE

IgG

IgG1, IgG2, IgG3, IgG4

IgA

IgA1, IgA2

Partie constante: •  Variabilité de la partie constante (variabilité allotypique) •  5 Classes d’Ig: M (µ), D (δ), G (γ), A (α), E (ε) •  Sous-classes pour IgG et IgA (variabilité isotypique) •  L’isotype est défini d’après la chaîne lourde •  Propriétés fonctionnelles spécifiques

B. Bellier Reconnaissance antigénique

Variabilité idiotypique

Partie variable:

•  Reconnaissance et fixation directe de l’Ag par le BCR au niveau de la région variable

•  Chaque lymphocyte B exprime un récepteur de spécificité unique = 1 CLONE

•  Grande diversité de spécificité (1013 régions variables différentes en théorie)

•  L’ensemble des cellules B produits défini le RÉPERTOIRE PRIMAIRE (Diversité répertoire = diversité de la spécificité antigénique; 107 à 109 BCR)

•  Seules les cellules exprimant le récepteur approprié pourront lier avec une grande affinité un antigène particulier (recrutement) et ainsi s’activer =SELECTION CLONALE

Reconnaissance antigénique

B. Bellier Diversité de la spécificité antigénique:

origine génétique

• La région V est formée par l’association de segments géniques. • Les régions V sont composés de segments: V, D, J ou V, J

• H, L: loci géniques différents (H, K, L : chromosome 14, 2, 22)

Origine de la diversité: • Diversité combinatoire • Diversité jonctionnelle • Hypermutation

B. Bellier Domaines de liaison à l’Ag

•  Site de fixation défini par des séquences hypervariables au sein de la région variable

•  3 Zones hypervariables: CDR1, 2, 3 dans chaque région V

•  CDR= Complementary Determining Regions

•  Entre les CDR se trouvent les régions charpentes (Framework Regions): FR1 -4 qui présentent peu de variabilité

La séquence des régions V est plus variable au niveau des CDR

CDR3

FR3

CDR2

FR2

CDR1

FR1

CDR3

FR3

CDR2

FR2

CDR1

FR1

Antigène

Épitope

Paratope

B. Bellier Liaison antigénique

•  Interactions entre les acides aminés (AA) des CDR (paratope) et l’antigène (épitope)

•  Complémentarité de conformation entre épitope et paratope

•  Epitopes linéaires ou continus: AA juxtaposés dans la struture primaire

•  Epitopes conformationnels ou discontinus : composés d’AA éloignés dans la structure primaire mais regroupés dans la protéine)

B. Bellier

II. Stimulation antigénique et mise en place de la réponse humorale

B. Bellier Sélection et activation des lymphocytes B

•  Reconnaissance directe de l’épitope par le BCR

•  Pontage des BCR

•  Transduction signal

•  Antigène = 1er signal

•  Généralement insuffisant pour activer le LyB

•  Nécessité d’un « help » à l’exception de certains Ag (Ag Thymo-indépendants)

B. Bellier Cas des antigènes thymo-indépendants

•  Ag Thymo-indépendants –  sont classiquement des substances polymériques. –  2 types:

•  Type 1: Sucres =mitogènes: Activateurs polyclonaux (indépendant de la spécificité

antigénique). Ex: Lipopolysaccharide (LPS) de paroi des bactérie Gram-

•  Type 2: Protéines multivalentes =molécules présentant des motifs répétitifs. Ex: flagelline bactérienne

•  Ag Thymo-dépendants

–  Antigènes protéiques solubles (peu de répétition des déterminants antigéniques)

–  Activation nécessite l’aide des LyT : •  Interactions moléculaires

–  Surface des LyT CD4 activés = signal 2

•  Cytokines –  Sécrétées par LyT CD4 activés = signal 3

cytokines

Th

B21

3

B. Bellier Signaux requis pour l’activation des

LyB thymo-dépendants

•  3 signaux: –  Signal 1: Ag

= signaux de compétence

–  Signal 2 : Mol de costimulation entre LyB-LyT •  Présentation des Ag par LyB pré-activé •  Interaction moléculaire avec molécule de co-stimulation

des LyT helper

–  Signal 3: Cytokines •  Stimule la prolifération

= signaux de progression •  Détermine la différentiation des Ly B naifs en LyB

effecteurs

•  Résultats: –  Prolifération extra-folliculaire et différenciation en

plasmocytes à courte durée-vie sécrétant des anticorps de faible affinité d’isotype IgM

B. Bellier – Interaction CD40-CD40L déclenche la formation d’un centre germinatif lieu de:

- maturation d’affinité - commutation de classe - formation de plasmocytes et des cellules mémoire

Centres germinatifs

LB

CD40

activé

B. Bellier Différenciation des cellules B

Maturation d’affinité

•  Affinité des AC augmente de 100 à 1000 fois au cours de la réponse primaire

•  Hypermutation somatique: –  Exclusivement au niveau des centres germinatifs –  Mutation intense des régions variables des

chaînes lourdes et légères –  AID: Activation induced Cytidine Deaminase –  Incoporation d’Uracile Mécanisme réparation –  10-3/paire de base/ division (>>10-9) –  Mutations ponctuelles dans région proche des

segments V(D)J = CDR1, CDR2 –  V(D)J =700pb: après 2 divisions presque tous

les centroblastes sont mutés –  Modification éventuelle de:

•  L’Affinité •  La Spécificité

–  Pas d’altération de la région C (Fonction)

•  Requiert la sélection des nouveaux clones en présence des FDC (cellules folliculaire dendritiques) présentant à leur surface des complexes Ag-AC

B. Bellier Différenciation des cellules B

Commutation de classe

•  Mécanisme: Association du domaine VH réarrangé(VDJ) avec une nouvelle région constante

•  Conséquences: –  Ne change pas la spécificité antigénique –  Changement de l’isotype de la partie Fc

= nouvelles fonctions biologiques

•  Initiée suite à l’interaction CD40/CD40L –  Cf syndrome hyper IgM

Syndrome Hyper-IgM

AID Activation-Induced cytidine Deaminase

B. Bellier Commutation de classe: influence des cytokines

B. Bellier Adapatation de la réponse humorale:

Influence du micro-organisme TLR / profil cytokinique

APC

LyB

Commutation de Classe

MICRO-ORGANISME

Génération d’IgE lors des infections parasitaires et des allergies

B. Bellier Evolution de la réponse primaire

Plasmocytes à durée de vie courte

Plasmocytes à durée de vie longue

•  Maturation d’affinité •  Commutation de classe •  Génération de LyB mémoire ou

plasmocytes à durée de vie longue

EFFICACITE

B. Bellier Génération des LyB mémoire

•  LyB mémoire: –  Générées à partir des centrocytes de haute

affinité sélectionnées dans la zone claire des CG

–  Capacité à répondre plus vite et plus vigoureusement lors d’un second contact avec le même Ag

–  Efficacité de la réponse Mémoire: •  Fréquence > •  Seuil d’activation <

•  Maintien Mémoire et Protection: –  Maintien de la population mémoire (via division)

•  Ré-activation rapide à l’Ag

–  AC plasmatiques recirculants •  Activation régulière des B mem ou persistance de

plasmocytes sécrétant des AC •  Rôle persistance Ag sur FDC

B. Bellier

Ag Thymo-dépendants

Ag Thymo-indépendants : ( ou Activation des LyB en l’absence de CD40L)

Défaut de génération de cellules mémoire

B. Bellier

III. Mécanismes effecteurs des anticorps

B. Bellier Anticorps et Mécanismes effecteurs

•  Mécanisme effecteur direct : –  Fixation et Neutralisation de l’antigène

(pathogène) par l’anticorps –  Empêche fixation de l’Ag sur récepteur

Bloque l’infection ou la toxicité Fixation Précipitation

Agglutination Neutralisation

•  Mécanisme effecteur indirect : -  Suite à la reconnaissance de l’Ag par la

partie Variable des Ig, interaction de la partie Constante CH: avec protéines, cellules ou tissus qui assurent la fonction effectrice de la RIH

B. Bellier Anticorps et Neutralisation de l’agent infectieux

•  Neutralisation : interdit la fixation du pathogène sur son récepteur membranaire: - Bloque l’infection virale:

- Bloque l’action des toxines

B. Bellier Opsonisation: aide à la phagocytose

concerne les IgM et IgG

B. Bellier Activation du complément

par la voie classique

Protéines sériques: C1, C2, C3, C4, …C9 Fixation aux complexes immum IgM et IgG Cascade d’activation

B. Bellier ADCC

Cytotox à médiation cellulaire dépendante des anticorps

B. Bellier Conséquences de la formation du complexe Ag-Ig

B. Bellier Spécificité des fonctions effectrices

en fonction de la classe des Ig

IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA1 IgA2 IgM IgE IgD

PM (kDa) 150 150 150 150 150-600

150-600

9000 190 150

H g1 g2 g3 g4 a1 a2 m e d

TS(mg/ml) 9 3 1 0.5 3 0.5 1.5 0.003 0.03

T1/2 (jours) 23 23 8 23 6 6 5 2.5 3

T placenta + +/- + + - - - - -

T muqueuse - - - - ++ ++ + - -

+ Cplt + +/- + + - - +++ - -

Se lie RFc ++ +/- ++ + - - +/- - -

Dégranul Mastocystes

- - - - - - - + -

B. Bellier Fonctions des IgM

• Propriétés – Premier isotype produit par le foetus et lymphocytes B – 5-10% seulement des Ig – Pentamérique – Forte avidité – Agglutination +++ – Fixe le complément – Poids moléculaire restreint les IgM au secteur vasculaire – Piéce J : autorise la traversée des épithélium par cellules sécrétrices, dans sécrétions externes au niveau des muqueuses

B. Bellier

La large diffusion des IgG associée à leur forte affinité pour les Ag fait de cette classe d ’Ig, la principale ligne de défense contre les toxines dans le compartiment extracellulaire

Et action anti-virale (neutralisation, opsonisation)

et anti-tumorale

(ADCC)

Fonctions des IgG

• IgG: intra-extravasculaires, transfert placentaire

• Propriétés – Isotype le + abondant dans le sérum (80% des Ig) – Le + abondant dans les espaces extra-vasculaires – Passage transplacentaire – Fixe le complément (C1q, C3b et C4b sauf IgG4) – Interagit avec les Fc recepteurs (sauf IgG2)

• Phagocytes - opsonisation • NK cells - ADCC

-Neutralisation

B. Bellier

Les IgA neutralisent efficacement les toxines présentes au niveau des muqueuses de l ’organisme

• Propriétés – Isotype le + abondant après IgG (10-15%) – Principale Ig sécrétoire

– Interaction de J avec le récepteur poly-Ig – Traverse l’épithélium – Libération après clivage du récepteur (Piéce sécrétoire)

- Lait, Larmes, salive, sécrétions gastriques et pulmonaires – N’active pas le complément par la voie classique

Lumière digestive

Plasmocyte

Sous-Muqueux

Fonctions des IgA

B. Bellier IgE:

Allergie et défense anti-parasitaire

•  Propriétés –  Ig sérique la plus rare (5 10-5 mg/ml) –  Action après fixation sur Rfc des

Mastocytes et Basophiles –  Responsables des réponses

d’hypersensibilité immédiate •  Médiateurs de l’allergie

–  Rôle dans les défense anti-parasitaire (Helminthes)

•  Recepteur pour le Fc des éosinophiles (RFcεI = haute affinité)

–  Ne fixe pas le complement

B. Bellier Classe

(Isotype) Structure Caractéristiques principales Mode d’action

- Base de la réponse primaire

- Faible affinité, forte avidité

- Neutralise

- Agglutine

- Active le C

Récepteur des lymphocytes B

Activation cellulaire

- Le plus abondant

- Base des réponses secondaires

- Traverse le placenta

- Neutralise, agglutine

- Active le C

- Opsonise

- ADCC

- Médiateur de l’allergie

- Défense anti-helminthes

- Neutralise les parasites

- Interagit avec RFcε1 sur mastocytes et basophiles qui relarguent l’histamine.

- Le plus abondant dans les sécrétions

- Traverse les cellules épithéliales (Pièce « S »)

- Neutralisation

- Agglutine

- Active le complément

B. Bellier Mécanismes de défense

B. Bellier

IV. Utilisation des anticorps en clinique: Sérothérapie / Vaccination /Immunothérapie

B. Bellier Utilisation des anticorps en clinique:

Sérothérapie / Vaccination /Immunothérapie

•  Diagnostic –  Séroconvertion (HIV, HBV, ..) –  Syndromes et Maladies Auto-Immunes: AutoAC,AC nucléaire, AC antiphospholipides (Hugues) –  Déficit génétiques: Hyper-IgM, .. –  Tests utilisant AC: ELISA, Cytométrie de Flux, ELISPOT, Immunohisto/fluo, Imagerie

•  Sérothérapie: Immunisation passive –  Cas d’uregence (action immédiate)

•  Vaccination : Immunisation active –  Génération es LyB mémoire et maintien d’un taux d’AC sériques protecteurs –  Vaccins conjugués: une illustration de la coopération cellulaire

•  Immunothérapie –  Génération d’anticorps monoclonaux (1975) –  Utilisation en clinique: 1982, Orthoclone OKT3 (anti-CD3; contrôle rejet de greffe) –  Immunisation: AC humains dirigés contre AC murins (AHAM) –  Anticorps chimériques (ReoPro, 1994; Anti-Rr Plaquete, anti-coagulant) –  Anticorps humanisés –  Nombreuses applications :

•  Essais cliniques •  Rejet de greffe •  Maladie auto-immune •  Infection virales chroniques •  Cancer, …

B. Bellier Sérothérapie

•  Administration d'un sérum immunisant d'origine animale ou humaine ou d’anticorps (monoclonaux) purifiés."

•  Cas d’urgence (action immédiate)

•  Avantage: •  Protection immédiate

•  Désavantages •  Protection de courtes durée •  Coût élevé •  Sécurité contestée

Immunoglobulines administrées à

un sujet non-immun

Donneur (sujet immun)

Immunoglobulines provenant d’un

sujet immun

Sujet immunisé passivement

Con

cent

ratio

n en

ant

icor

ps

semaines 4 8 12 16 20 Injection de Ig

B. Bellier Vaccination

Receveur (sujet non-immun)

Antigène (vaccin) administré à un

sujet non-immun

Sujet immunisé activement

Con

cent

ratio

n en

ant

icor

ps

semaines 4 8 12 16 20

Injection du vaccin

•  Les avantages: • Protection à long terme, suite à la génération des cellules mémoire • Coût-efficacité • Sécurité

•  Les limites: • Cas des personnes ID, femmes enceintes • Non-répondeurs • Virus émergents

B. Bellier Immunothérapies

•  Définition: •  Sens strict: Développement d’outils « biologiques » dirigés contre une cible

spécifique de la réaction immunitaire •  Plus largement, appliqué au développement d’outils immunologiques

-  Actions des Immunothérapies: -  Immunostiumlation: activation du système immunitaire -  Immunosuppression: suppression du système immunitaire et de l’inflammation

•  Types d’Immunothérapies: -  Immunothérapie adoptive: injection d’effecteurs (cellules, molécules); substitution du

système immunitaire -  Immunothérapie active: consiste à intervenir sur le système immunitaire du sujet;

par injections de molécules, cellule régulatrices

•  Les outils –  Cellules du système immunitaire –  Cellules souche, précurseurs des CSI –  Antigènes –  Cytokines –  Anticorps

B. Bellier Anticorps en Immunothérapie:

AC dans les immunothérapies antitumorales

B. Bellier Anticorps monoclonaux

•  Historique –  Durant les années 1970, il était connu qu'un cancer

(myélome) des cellules B produisait de grandes quantités d'anticorps identiques.

–  1975: mise au point de la technique d’obtention des anticorps monoclonaux (Kohler et Milstein, Nature)

–  1984: Ac monoclonaux chimériques souris/homme

–  1986: premier Ac monoclonal mis sur le marché: Muromomab (anti-CD3)

–  1989: Ac monoclonaux humanisés

–  1994: production d’Ac monoclonaux humains par des souris transgéniques ou trans-chromosomiques

B. Bellier Anticorps monoclonaux chimériques & humanisés

B. Bellier ACm

• Murins -momab OKT3

• Chimériques -ximab CD20

• Humanisés -zumab CD52

• Humains -mumab TNFα

B. Bellier Conclusions

•  Développement RIH: –  RIH contre Ag protéique (thymo-dépendant) requiert T helper: Coopération cellulaire –  Nécessite co-stimulation via CD40L

•  Action des AC: –  Agglutination (IgM) –  Neutralisation Ag (IgG, vaccin, IgA) –  Augmente phagocytose (IgG+M; opsonisation) –  Activation du complément (IgG+M) –  Renforce RIC : ADCC

•  RI antivirale, antibactérienne et anti-parasitaire

•  Place importante dans les immunothérapies –  Anticorps monoclonaux (Rituximab,…) –  Sérothérapie –  Vaccination