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FRANCELINE REYNAUD
MECANISMO DE INTERAÇÃO CROMATOGRÁFICA
DA QUITINA COMPLEXADA COM ÍONS Fe, NA
SEPARAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS
ITAJAÍ - 2005
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE EDUCAÇÃO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
MECANISMO DE INTERAÇÃO CROMATOGRÁFICA
DA QUITINA COMPLEXADA COM ÍONS Fe, NA
SEPARAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêutica.
FRANCELINE REYNAUD
Itajaí, Dezembro de 2005.
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ESTUDO DO MECANISMO DE INTERAÇÃO
CROMATOGRAFICA DA QUITINA COMPLEXADA COM
ÍONS Fe, NA SEPARAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS
Franceline Reynaud
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
_____________________________________
Clóvis Antonio Rodrigues, Dr.
Orientador
_____________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra.
Coordenadora do programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Banca examinadora:
_____________________________________
Clóvis Antonio Rodrigues, Dr.
Presidente
_____________________________________
Valdir Cechinel Filho, Dr.
Banca
_____________________________________
Tomoe Nakashima, Dra.
Banca
ii
4iii
Resumo da Dissertação apresentada à UNIVALI como parte dos requisitos necessários para
obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ESTUDO DO MECANISMO DE INTERAÇÃO
CROMATOGRAFICA DA QUITINA COMPLEXADA COM
ÍONS Fe, NA SEPARAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS
Franceline Reynaud Dezembro/2005
Orientador: Clovis Antonio Rodrigues, Dr.
Área de Concentração: Biopolímeros
Palavras-chaves: quitina, CAMI, compostos fenólicos
Número de páginas: 68
A eficiência cromatográfica do polímero quitina 100% acetilada (QTN-100), e
QTN complexado com íons Fe, contendo 5mg/g de íons Fe (QTN-Fe(1)) e 100mg/g de íons Fe
(QTN-Fe(2)), na separação de compostos fenólicos foram comparados com a sílica. O
procedimento cromatográfico foi realizado em coluna aberta, tendo como sistema de solvente
CHCl3:MeOH com polaridade crescente. Foram utilizadas as relações composto:adsorvente
1:25 e 1:50 e variação no leito cromatográfico. Foram utilizadas diferentes séries de
compostos fenólicos, os quais foram agrupados de acordo com suas características estruturais.
Em todas as séries de compostos, quando se utilizou a sílica, o aumento do leito
cromatográfico ocasionou uma diminuição na eficiência de separação. Para compostos
fenólicos não substituídos, o aumento do leito cromatográfico, independente do adsorvente,
melhorou a eficiência de separação. A presença dos íons Fe na superfície polimérica,
apresentou uma significativa melhora no rendimento da separação, entretanto o aumento da
quantidade de 5mg/g para 100mg/g de Fe ocasionou a retenção de grande parte da quantidade
inicial dos compostos na superfície do polímero.
iii
5
Abstract of Dissertation presented to UNIVALI as a partial fulfillment of the
requirements for degree of Master in Pharmaceutical Sciences
CHROMATOGRAPHIC INTERACTION MECHANISM OF
CHITIN COMPLEX WITH IRON IONS, FOR SEPARATION
OF PHENOLIC COMPOUNDS
Franceline Reynaud Dezember/2005
Advisor: Clovis Antonio Rodrigues, Dr.
Área os Concentration: Biopolymers
Keywords: chitin, affinity metal immobilized chromatography, phenolic compounds
Number of Pages: 68
The efficiency of the adsorbent chitin, fully acetylated (CH-100), chitin containing
5mg/g of iron (CH-Fe(1)) and chitin containing 100mg/g of iron (QTN-Fe(2)) to separation of
phenolic compounds was compared with the silica gel. The separation was carried out at glass
column, using CHCl3:MeOH gradient as solvent system, and the following variations: ration
compound:sorbent 1:25, 1:50 and increase of the chromatographic bed. Compounds were
reuned in different series, which were determined according to their structures. For all the
compound series, when was utilized silica gel , the increase of the chromatographic bed,
resulted in a small separation of the compounds. In relation to the phenolic compounds
without substituent, it was observed an increase of the chromatographic bed, independent of
the adsorbent, with improvement of the chromatographic separation. The iron on the surface
polymer, resulted in an improved of the ration of the separation, therefore when the iron
quantity was higher, 5 mg/g for 100 mg/g, a part of the initial compounds was adosorbed on
the polymer surface.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 10 2 OBJETIVOS 12 2.1 Objetivo geral 12 2.2 Objetivos específicos 12 3 EMBASAMENTO TEÓRICO 13 3.1 Compostos fenólicos: importância e perspectivas 13 3.1.1 Interesse medicinal 13 3.1.2 Impacto ambiental 17 3.2 Separação e determinação quantitativa de compostos fenólicos 18 3.3 Adsorventes 21 3.3.1 Sílica 21 3.3.2 Material polimérico 22 3.3.3 Carbono 24 3.4 CAMI-Fe(III) – Princípios gerais 24 3.5 QTN como suporte para a CAMI 28 4 MATERIAIS E MÉTODOS 31 4.1 Reagentes e compostos 31 4.2 Equipamentos 31 4.3 Preparação dos polímeros 31 4.4 Caracterização dos polímeros 32 4.5 Adsorção dos compostos ao polímero QTN-Fe 32 4.6 Deslocamento dos íons cloreto 33 4.7 Análise cromatográfica 33 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 36 5.1 Caracterização dos plímeros 36 5.1.1 QTN-Fe(1) 36 5.1.2 QTN com um diferente grau de acetilação 37 5.1.3 QTN-100 39 5.2 Comportamento cromatográfico 40 5.2.1 Primeira série de compostos: Fenol, Catecol e Pirogalol 41 5.2.2 Segunda série de compostos: Hidroquinona, Catecol e Resorcinol 46 5.2.3 Terceira série de compostos: 4-Bromofenol, 4-Clorofenol e 3,4-Diclorofenol 49 5.2.4 Quarta série de compostos: 4-Nitrofenol e 4-Aminofenol 50 5.2.5 Quinta série de compostos: 4-metilfenol, 5-metilresorcinol e 4-metoxifenol 53 5.3 Adsorção dos compostos ao polímero QTN-Fe 56 5.3.1 Deslocamento de íons cloreto 56 5.3.2 Espectro de Infravermelho 57 6 CONCLUSÕES 62 7 REFERÊNCIAS 64
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Estrutura da Quitina 28Figura 2: Espectro de IV dos suportes QTN-Fe(1), pastilha de KBr. 36Figura 3: Provável estrutura da QTN-Fe(1) 37Figura 4: Curva de titulação potenciométrica . Método da primeira derivada.
38
Figura 5: Espectro de IV do suporte QTN-Fe(2) 39Figura 6: Curva de titulação potenciométrica do polímero QTN. Método da primeira derivada
39
Figura 7: Espectro de IV do suporte QTN-100 40Figura 8: Espectro de IV do polímero QTN-Fe(2), QTN-Fe(2) –cat, QTN-Fe(2) –pir e QTN-Fe(2) –fen, respectivamente.
58
Figura 9: Espectro de IV do polímero QTN-Fe(2), QTN-Fe(2) –cat, QTN-Fe(2) –hid e QTN-Fe(2) –res, respectivamente.
59
Figura 10: Espectro de IV do polímero QTN-Fe(2), QTN-Fe(2) –nitro e QTN-Fe(2) –amino, respectivamente.
60
Figura 11: Espectro de IV do polímero QTN-Fe(2), QTN-Fe(2) –metoxi e QTN-Fe(2) –metil, respectivamente.
61
vi
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da primeira série, frente aos diferentes polímeros. Relação composto:polímero 1:25.
41
Tabela 2: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da primeira série, frente aos diferentes polímeros. Relação composto:polímero 1:50.
43
Tabela 3: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da primeira série, frente aos diferentes polímeros. Leito cromatográfico de 25 cm
45
Tabela 4: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da segunda série, frente aos diferentes polímeros. Relação composto:polímero 1:25
47
Tabela 5: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da segunda série, frente aos diferentes polímeros. Relação composto:polímero 1:50
47
Tabela 6: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da segunda série, frente aos diferentes polímeros. Leito cromatográfico de 25 cm
48
Tabela 7: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quarta série, frente aos diferentes polímeros. Relação composto:polímero 1:25
51
Tabela 8: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quarta série, frente aos diferentes polímeros. Relação composto:polímero 1:50
51
Tabela 9: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quarta série, frente aos diferentes polímeros. Leito cromatográfico de 25 cm
52
Tabela 10: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quinta série, frente aos diferentes polímeros. Relação composto:polímero 1:25
54
Tabela 11: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quinta série, frente aos diferentes polímeros. Relação composto:polímero 1:50
54
Tabela 12: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quinta série, frente aos diferentes polímeros. Leito cromatográfico de 25 cm
55
Tabela 13: Porcentagem de íons cloreto deslocados pelos compostos em estudo
55
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9
LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência CAMI Cromatografia de afinidade por metal imobilizado CAMI-Fe(III) Cromatografia de afinidade por ferro (III) imobilizado CCD Cromatografia de camada delgada CHCl3:MeOH Clorofórmio:metanol FeCl3:EtOH 1% Solução etanólica a 1% de cloreto férrico GA Grau de acetilação IDA Ácido iminodiacético LogKow Logaritimo da constante de partição óleo:água NIQFAR Núcleo de Investigações Químico-farmacêuticas pKa Constante de acidez PS-DVB Poliestireno-divinilbenzeno QTN Quitina QTN-100 Quitina com grau de acetilação igual a 100% QTN-33 Quitina com grau de acetilação igual a 33% QTN-Fe Quitina imobilizada com íons ferro QTN-Fe(1) Quitina imobilizada 5mg/g de íons ferro QTN-Fe(1) Quitina imobilizada 100mg/g de íons ferro QTN-Fe(1)-amino Quitina imobilizada 100mg/g de íons ferro tendo 4-aminofenol
adsorvido QTN-Fe(1)-cat Quitina imobilizada 100mg/g de íons ferro tendo catecol l adsorvido QTN-Fe(1)-fen Quitina imobilizada 100mg/g de íons ferro tendo fenol adsorvido QTN-Fe(1)-hid Quitina imobilizada 100mg/g de íons ferro tendo hidroquinona
adsorvido QTN-Fe(1)-metil Quitina imobilizada 100mg/g de íons ferro tendo 4-metilfenol
adsorvido QTN-Fe(1)-metoxi Quitina imobilizada 100mg/g de íons ferro tendo 4-metoxifenol
adsorvido QTN-Fe(1)-nitro Quitina imobilizada 100mg/g de íons ferro tendo 4-nitrofenol
adsorvido QTN-Fe(1)-pir Quitina imobilizada 100mg/g de íons ferro tendo pirogalol adsorvido QTN-Fe(1)-res Quitina imobilizada 100mg/g de íons ferro tendo resorcinol adsorvido Rf Parâmetro de retenção Si-OH Grupo silanol Si-O-Si Gruo siloxano SPE Extração por fase sólida
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1 INTRODUÇÃO
Compostos fenólicos são normalmente referendados como um grupo diverso de
compostos de ocorrência natural. Estão presentes em plantas e apresentam relevância na área
medicinal demonstrando várias atividades biológica (HANDIQUE e BARUAH, 2002) São
candidatos potenciais para combater doenças como AIDS, problemas cardíacos, úlceras,
infecções bacterianas e desordens mutagênicas e neurais (GARCIA et al., 2002).
Já na área industrial, os compostos fenólicos estão presentes no meio aquático como
resultado de sua ampla aplicação. São gerados a partir da produção de plásticos, corantes,
fármacos, antioxidantes e papéis, assim como na indústria petroquímica. O pentaclorofenol é
utilizado como conservante para madeiras, o fenol é gerado a partir da degradação de lignina
na produção de papel, os clorofenóis originados de fenóis em água clorada e produtos de
degradação de herbicidas, os nitrofenóis são formados fotoquimicamente na atmosfera pela
queima de combustíveis e como produtos de degradação de pesticidas organosfosforados, os
aminofenóis são intermediários específicos na produção de corante (PULGARIN e KIWI
1995; POCURULL et al., 1995a; GALCERAN e JÁUREGUI, 1995; RODRÍGUEZ et al.,
2000).
O isolamento e a identificação destes compostos é difícil devido à sua complexidade
química. Diferentes técnicas analíticas estão sendo revisadas para a análise de tais compostos,
como a cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) e eletroforese capilar associada com
detecção por ultra-violeta (UV), fluorescência, eletroquímica ou espectroscopia de massa.
Em muitos casos, dados isolados na retenção e separação de compostos fenólicos são
relevantes para avaliar o comportamento do suporte cromatográfico (RODRÍGUEZ et al.,
2000).
A cromatografia de afinidade por metal imobilizado (CAMI) é um método de
separação baseado na interação entre um íon metálico imobilizado em um suporte
cromatográfico e as moléculas a serem purificadas. É um método eficaz na separação de
vários materiais biológicos como enzimas receptores de membrana, células intactas,
anticorpos e vírus (HEFTAMANN, 1992, parte A). A escolha do suporte cromatográfico,
método de ativação do suporte, o ligante e o metal imobilizado dependem das propriedades
das moléculas a serem separadas (HOLMES e SCHILLER, 1997).
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Os suportes utilizados para a imobilização da cátions metálicos são resinas
trocadoras fortemente catiônicas, tais como: sílica, celulose modificada, polímeros sintéticos e
macromoléculas (SHI et al., 1996). Os ligantes utilizados para adsorver os cátions metálicos,
geralmente apresentam em sua estrutura grupos amino, piridínico, fenólicos e hidróxidos.
A utilização da CAMI como técnica alternativa de separação, em trabalhos rotineiros
de fracionamento de compostos orgânicos, é limitada pelo elevado custo de tais adsorventes
sendo sua aplicação restritas à trabalhos específicos. Uma alternativa para a aplicação desta
técnica é a preparação de adsorventes com custos reduzidos utilizando suportes alternativos,
reagentes comuns e rotas sintéticas simples.
A quitina (QTN) é um biopolímero natural, e em estudos anteriores foi demonstrado
que, quando o Fe(III) é imobilizado em sua superfície, torna-se uma boa alternativa como
suporte cromatográfico na CAMI, para a separação de compostos fenólicos (RODRIGUES et
al., 1999) e na separação de biflavonóides (RODRIGUES et al., 2000a).
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Analisar o mecanismo de separação cromatográfica de compostos fenólicos,
utilizando QTN e QTN complexada com íons ferro (QTN-Fe), em sistema não aquoso.
2.2 Objetivos específicos
• Preparar e caracterizar o suporte QTN com diferentes graus de acetilação;
• Analisar o perfil cromatográfico do suporte QTN-100 (100% acetilada), na
separação de compostos fenólicos como: halofenóis, polihidroxifenólicos e compostos
fenólicos com substituintes no anel aromático;
• Estudar o perfil cromatográfico do suporte QTN-Fe, com diferentes
concentrações de íons ferro adsorvidos na superfície do polímero, na separação de compostos
fenólicos como: halofenóis, polihidroxifenólicos e compostos fenólicos com substituintes no
anel aromático;
• Comparar o perfil cromatográfico dos suportes QTN e QTN-Fe com o
suporte cromatográfico sílica-gel, na separação de compostos fenólicos.
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3 EMBASAMENTO TEÓRICO
3.1 Compostos fenólicos: importância e perspectivas
3.1.1 Interesse medicinal
As plantas medicinais são utilizadas como fonte de medicamentos para o tratamento
de enfermidades que acometem a espécie humana desde a idade antiga (WILHELM-FILHO
et al. 2001; GARCÍA et al., 2002) Nestes últimos anos o uso destas plantas vem crescendo
notadamente, devido ao extraordinário potencial em servirem como fontes de princípios
ativos. Os flavonóides se encontram dentro destes princípios ativos de origem natural cujas
propriedades despertam o interesse de muitos pesquisadores e estão em constante estudo
(GARCÍA et al., 2002).
Os flavonóides são um grupo de metabólitos secundários das plantas, amplamente
distribuídas no reino vegetal. Apresentam uma relevante importância na dieta humana pois
são encontrados em muitas frutas, sementes, vegetais e ervas. (BORRELLI e IZZO, 2000;
WANG, 2000; FRIEDMAN e JÜRGENS, 2000; GARCÍA et al., 2002)
Todos os flavonóides são compostos polifenólicos com uma origem biossintética
comum e derivada da mesma estrutura química, o esqueleto benzopirânico (GARCÍA et al.,
2002). O grupo químico dos flavonóides é composto por mais de 4000 diferentes compostos
fenólicos, sendo que, as diferenças individuais dentro de cada grupo resultam de uma variação
no número e posição dos grupamentos hidroxila, por modificações nos núcleos e pelo grau de
metilação e glicosilação, as quais afetam várias propriedades dos flavonóides, particularmente
a hidrofobicidade das moléculas (WILHELM-FILHO et al., 2001).
Devido à complexidade das misturas naturais de compostos fenólicos presentes nos
diversos tipos de extratos de plantas é complicado caracterizá-los quimicamente
(GEROTHANASSIS et al., 1998) Suas propriedades químicas e físicas são muito variáveis,
no entanto, podem ser relacionadas algumas propriedades farmacológicas do grupo, as quais,
na terapêutica, tem demonstrado muitos efeitos benéficos à saúde das pessoas.
(BENAVENTE-GARCÍA e GOMEZ, 1997; WANG, 2000). A seguir, serão abordadas
algumas propriedades farmacológicas relevantes dos flavonóides:
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A maioria dos flavonóides afeta as reações imunológicas não específicas, reações
inflamatórias agudas, mediante a supressão da fagocitose dos macrófagos, da liberação de
substâncias oxidantes dos neutrófilos e da ativação dos mastócitos. A interação destes
compostos com o metabolismo do ácido aracdônico e a inibição de mediadores pro-
inflamatórios como as prostaglandinas e os leucotrienos podem também ser responsáveis pela
atividade antiinflamatória dos flavonóides (GARCÍA et al., 2002).
A propriedade antioxidante tem atraído a atenção para a nutrição preventiva, pois
protegem os constituintes alimentares contra danos oxidativos e ainda, podem contribuir para a
prevenção de importantes patologias como doenças cardiovasculares (FRIEDMAN, 1997;
OWEN et al., 2000a; WILHELM-FILHO et al., 2001). A quercetina, um flavonóide presente
em altas concentrações no vinho tinto, tem a capacidade de ligar-se a partículas de LDL e as
células da parede das artérias e assim protegê-las contra a peroxidação lipídica (AVIRAM e
FUHRMAN, 2002). A peroxidação de biomembranas contribui para o inicio e progressão de
diversas doenças degenerativas. ZHU et al. (2002) demonstraram que os flavonóides presentes
em extratos de cocoa a epicatequina, catequina e procianidina promovem um pronunciado
efeito protetor sobre as membranas.
As catequinas estão presentes em altas concentrações no chá verde. Estudos
epidemiológicos indicam que o consumo deste chá pode ser efetivo para a prevenção de
determinados tumores. Existe uma relação entre o alto consumo do chá verde e uma baixa
incidência do câncer de próstata e de mama em alguns países asiáticos (WANG, 2000). Além
desta propriedade anti-tumoral, as catequinas apresentam efeito antihipertensivo, antioxidante,
antiarteriosclerose, hipocolesterolemico e ainda estão relacionadas com a prevenção de
formação de cárie dentária (FERNÁNDEZ et al., 2000).
O possível mecanismo de ação antitumural dos flavonóides, tem sido objeto de
vários estudos. Entre as diversas possibilidades de mecanismo de ação, destacam-se: a
atividade estrogênica, suas propriedades antiproliferativas, a indução da apoptose, suas
propriedades antioxidantes e a possível indução de enzimas destoxificadoras (MERKEN e
BEECHER, 2000a; GARCÍA et al., 2002), bem como a inibição de enzimas que ativam
precarcinogens em carcinogens (FRIEDMAN, 1997). Em recentes estudos, OWEN et al.
(2000b) demonstraram que óleo de oliva contendo, em abundância, compostos fenólicos com
atividade antioxidante como o hidroxitirosol, tirosol, flavonóides e ligninas, apresentam uma
potente inibição de espécies reativas de oxigênio. Estas espécies reativas de oxigênio como
OH- e O2- estão diretamente relacionadas a etiologia de neoplasmas como o câncer de mama e
do reto.
15
Diversos flavonóides intervêm sobre o processo de agregação plaquetária alterando o
metabolismo do ácido araquidônico, entretanto, cada composto apresenta seu próprio espectro
de ação nas diferentes vias do sistema (GARCÍA et al., 2002).
Na atualidade, a busca de novos fármacos que possam ser empregados no tratamento
de infecções bacterianas tem gerado estudos que buscam demonstrar a capacidade dos
flavonóides em apresentarem atividade sobre bactérias Gram positivas e Gram negativas. De
acordo com FRIEDMAN (2000), os compostos fenólicos estão envolvidos na defesa da planta
contra a invasão de patógenos, incluindo bactérias, fungos e vírus, logo, levanta-se uma
hipótese destes compostos naturais apresentarem uma efetividade antimicrobiana. Com base
nestas afirmações alguns grupos de pesquisa buscam desenvolver estudos com a finalidade de
comprovar a atividade antibacteriana dos flavonóides, dentre estes grupos pode-se citar SAVI
et al. (1997), onde os autores demonstraram que vários extratos foliares de Bauhinia
splendens, uma planta rica em flavonóides, apresentam efetividade contra Salmonella
typhimurium e Staphylococcus aureus, sustentando assim o uso popular desta planta na
medicina folclórica. GARCIA et al. (2002) relatam a atividade antibacteriana dos flavonóides
em relação a inibição do crescimento de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a
meticilina.
Os flavonóides presentes no Ginkgo biloba são os responsáveis pelas ações
vasoreguladora e inibidora da agregação plaquetária, sendo essas atividades responsáveis pelo
emprego desta planta desde a antiguidade pela medicina chinesa. Vários estudos clínicos estão
sendo desenvolvidos, para evidenciar os benefícios do emprego dos flavonóides presentes
nesta planta, para o tratamento dos sintomas ligados a insuficiência cerebral, dificuldade de
concentração, alteração de memória, confusão e transtornos de humor, bem como, os efeitos
benéficos para o tratamento de problemas de circulação periférica (WATSON e OLIVEIRA,
1999; NDJOKO et al., 2000; GARCIA et al., 2002)
As isoflavonas adquiriram nos dias de hoje, um grande destaque, devido a seu efeito
estrogênico no tratamento de sintomas do climatério. Numerosos estudos epidemiológicos
relacionam a baixa incidência da sintomatologia climatérica em países que consomem
alimentos que contém fitoestrógenos. Estes fitoestrógenos são um grupo de compostos de
natureza não esteroídica, procedentes de diferentes espécies vegetais, sendo que todos
apresentam uma estrutura difenólica similar a estrutura estrogênica, a qual tem a capacidade
de interagir com os receptores para o 17β-estradiol (MERKEN e BEECHER, 2000a;
GARCIA et al., 2002)
16
3.1.1.1- Estudos realizados na UNIVALI
A atividade analgésica e antinociceptiva dos compostos fenólicos tais como
flavonóides e biflavonóides tem sido objeto, de estudo de diversos grupos de pesquisadores.
Dentre eles, destaca-se o grupo de pesquisa do Núcleo de Investigações Químico-
farmacêuticas (NIQFAR), que em 10 anos de existência, busca de forma incessante,
substâncias derivadas de plantas para o desenvolvimento de novos fármacos, particularmente
para o desenvolvimento de novos analgésicos. Dentre os trabalhos desenvolvidos, destacam-
se:
• A avaliação química e farmacológica de Phyllanthus caroliniensis, com o qual
foi demonstrado que a quercetina, o ácido gálico e alguns compostos fenólicos não
identificados apresentam uma significativa atividade antinociceptiva contra a dor induzida
pelo ácido acético em camundongos (CECHINEL-FILHO et al., 1996).
• O estudo do efeito analgésico de alguns fitoconstituintes presentes em folhas
da Rheedia gardneriana, tais como volkensiflavona, GB-2a, fukugetina e fukugeside,
revelando que estes biflavonóides apresentam uma significante atividade analgésica em
relação a dor inflamatória, no teste da formalina. Os resultados sugerem que estes quatro
compostos são os responsáveis pela aplicação farmacológica da referida planta (LUZZI et al.,
1997).
• A avaliação da atividade analgésica dos constituintes presentes nos extratos das
folhas, caules, cascas e raízes da Bauhinia splendens, ricos em compostos fenólicos, tais como
galato de etila, rutina e quercetina. Este estudo permitiu evidenciar que todos os diferentes
extratos apresentaram significante atividade analgésica em diferentes modelos de dor, sendo
que o mecanismo desta inibição da dor, pode estar relacionado ao sistema opióide
(CECHINEL-FILHO et al., 1995; WILLAIN-FILHO et al., 1997; DA SILVA e CECHINEL-
FILHO, 2002).
• A análise do efeito analgésico do extrato hidroalcoólico da Sebastiania
schottiana, a qual apresenta uma concentração relativamente alta de compostos fenólicos,
demonstrando uma maior potência contra a dor induzida por formalina e capsaicina, do que a
aspirina (LUZZI et al., 2000).
• O estudo da ação da morusina, o principal prenilflavonóide presente na Morus
nigra, revelou que este composto exibe um promissor efeito antinociceptivo ou analgésico,
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testado em modelos clássicos de dor. O mecanismo pelo qual a morusina exerce seu efeito
pode estar relacionado ao sistema opióide (DE SOUZA et al., 2000a).
• A avaliação do extrato metanólico e das frações de acetato de etila e aquosas
da Ipomea pes-caprae, a qual exibiu uma atividade antinociceptiva em modelos clássicos de
dor, desta forma, comprovando o uso popular da planta para processos inflamatórios e
álgicos. A análise fitoquímica dos extratos testados, indicou a presença de esteróides,
terpenos, alcalóides e flavonóides (DE SOUZA et al., 2000b).
• A comprovação do efeito analgésico do biflavonóide I3-narigenin-II8-Ome-
eriodictiol, presente nas folhas da Rheedia gardneriana, através do teste da formalina. Este
composto apresenta uma potente ação analgésica dose-dependente, sendo mais potente que as
drogas de referência normalmente utilizadas (CECHINEL-FILHO et al., 2000; BITTAR et
al., 2000).
• A avaliação farmacológica dos flavonóides: hiperoside, amentoflavona,
quercetina e ácido gálico, demonstrou que estes compostos apresentam uma significante
atividade analgésica principalmente em relação a dor inflamatória no teste da formalina,
sugerindo que estes flavonóides são efetivos no tratamento de processos dolorosos (DA
SILVA et al., 2001; MEYRE-SILVA et al., 2001).
Somadas a toda essas propriedades farmacológicas aqui relatadas, os flavonóides
apresentam ainda uma atividade antiviral, principalmente na inibição do crescimento do vírus
da Herpes simples; ação antiespasmódica; diurética; antiasmática; antialérgica; capacidade em
estimular o sistema imunológico e também, são encontrados em diversas linhas de cosméticos
na dermofarmácia, como por exemplo, em dentifrícios, colutórios, adstringentes entre outros
(MERKEN e BEECHER, 2000b; GARCIA et al., 2002)
3.1.2 – Impacto ambiental
O interesse no impacto ambiental provocado pelos compostos fenólicos tem sido
evidenciado devido à sua ampla aplicação. Dependendo dos substituintes presentes no anel
fenólico, muitos destes compostos tornam-se altamente tóxicos e possivelmente mutagênicos
(PUIG e BARCELÓ, 1996; EDER et al., 1998).
Diferentes dos flavonóides, que provém de fontes naturais, estes compostos são
gerados a partir da produção de plásticos, corantes, fármacos, antioxidantes, papeis, produtos
de reação de processos de cloração, assim como, na industria petroquímica (POCURULL et
18
al., 1995b; GALCERAN e JÁUREGUI, 1995; RODRÍGUEZ et al., 2000). Ocorrem também,
como produtos de biodegradação de substâncias húmicas, taninos e ligninas, sendo que a
presença destes em alimentos limita sua digestibilidade (SHARMA et al., 1998). Podem
ainda, ocorrer como produtos de biodegradação de herbicidas e pesticidas organofosforados,
sendo que, os principais produtos de degradação são o clorofenol e o nitrofenol,
respectivamente (PUIG e BARCELÓ, 1996).
Devido a alta solubilidade em meio aquoso, estes compostos podem influenciar no
ecossistema pois depositam-se no fundo de rios e lagos e, mesmo causar a poluição de águas
superficiais. A estes poluentes pode ser atribuído a responsabilidade pelo desenvolvimento de
carcinomas nos tecidos dos homens e ainda causar uma embriotoxicidade nos animais
(CSERHÁTI e FORGÁCS, 1998).
Mesmo em baixas concentrações, estes compostos fenólicos, interferem nas
propriedades organolépticas de frutas, vegetais, peixes e até mesmo na água utilizada para
consumo humano (GOTO et a.l., 1996; FULCRAND et a.l., 1999). Essa interferência
organoléptica e a alta toxicidade, são as principais razões pelas quais os compostos fenólicos
estão sendo monitorados, rotineiramente, tanto nos efluentes como na água para consumo
humano (GALCERAN e JÁUREGUI, 1995; ELVIRA-COZAR et al., 1995).
A Agencia de Proteção Ambiental dos Estados Unidos da América (EPA), criou uma
lista contendo onze compostos fenólicos considerados poluentes de alta prioridade no meio
aquático, dos quais os clorofenóis são os mais tóxicos e carcinogênicos. A legislação da
União Européia, também estabeleceu a concentração máxima admitida de compostos
fenólicos presentes na água para consumo humano, de 0,5 ng/ml (RUANA e URBE, 1993;
PUIG e BARCELÓ, 1996; RODRIGUEZ et al., 2000).
3.2 – Separação e determinação quantitativa de compostos fenólicos
Devido a considerável importância dos compostos fenólicos, várias linhas de
pesquisa dedicam uma especial atenção ao desenvolvimento de métodos confiáveis e
sensíveis para sua análise, determinação quantitativa, extração e mesmo a purificação. A
cromatografia é o principal e mais utilizado método de separação, pois possibilita a separação
de compostos com estrutura molecular muito similar (BRUZZONITI et al., 2000).
A identificação e a quantificação dos compostos fenólicos, principalmente aqueles
extraídos de extratos vegetais está baseada na separação e isolamento de seus componentes
19
individuais através de processos cromatográficos (EXARCHOU et al., 2001). Os compostos
fenólicos podem ser separados com eficiência através de cromatografia de papel e
cromatografia de camada delgada. Este último, é um método de escolha por representar um
custo relativamente baixo, fácil e rápido, e ainda, por permitir a escolha de fases estacionárias
distintas, resultando na detecção e visualização do composto analisado (CISOWSKI et al.,
1998). Entretanto, a baixa reprodutibilidade desta técnica limita a sua utilização. Outros
métodos muito utilizados para a análise dos compostos fenólicos incluem a cromatografia
gasosa e a CLAE. Mais recentemente, a eletroforese capilar aparece como um método
alternativo (FIEHN e JEKEL, 1997; MACIEJEWICZ e SOCZEWINSKI, 2000). A diferença
na seletividade dos distintos sistemas cromatográficos, como fase reversa ou fase normal,
representam a razão e a determinação de qual método utilizar na separação de uma mistura de
compostos, como por exemplo os flavonóides em extratos de plantas (HAMRYL e
SOCZEWINSKI, 2000).
A cromatografia gasosa fornece a possibilidade de uma identificação segura.
Entretanto, a maioria dos compostos fenólicos apresenta uma baixa volatilidade sendo, assim,
necessário um passo de derivatização do composto, com a finalidade de aumentar sua
volatilidade (CSERHÁTI e FORGÁCS, 1998).
A CLAE oferece melhores condições para a separação e purificação dos compostos
fenólicos. Devido a alta flexibilidade e sua baixa toxicidade da fase móvel a CLAE tornou-se
o método de escolha para a separação desta classe de analitos. Normalmente, essas técnicas
cromatográficas são associadas a diferentes tipos de detectores, como a detecção por UV,
fluorescência, eletroquímica ou espectroscopia de massa (CSERHÁTI e FORGÁCS, 1998).
Um método inovador para a identificação e quantificação de compostos fenólicos, é
através de metodologias avançadas de ressonância nuclear magnética. A combinação da
variação de temperatura com a espectroscopia bi-dimensional próton-próton e próton-carbono
permitem a identificação e a quantificação de compostos fenólicos, tais como, o ácido caféico
e ácido rosmarinico (EXARCHOU et al., 2001). Entretanto, este é um método que representa
custos relativamente elevados e ainda é pouco utilizado.
A presença nas amostras, de uma quantidade considerável de compostos mono, oligo
e poliméricos reduz a eficiência da separação de qualquer método cromatográfico, por
alteração da capacidade de retenção e devido a baixa concentração dos compostos fenólicos
em amostras, nenhuma destas combinações de técnicas analíticas pode quantificar os limites
requeridos para uma determinação direta, tornando-se necessário realizar uma pré-
20
concentração da amostra (RUANA e URBE, 1993; POCURULL et al., 1995a; RODRIGUEZ
et al., 2000).
Basicamente, existem dois processos de pré-concentração dos solutos de interesse: a
extração de fase líquida e a extração por fase sólida (SPE) (BRUZZONITI et al., 2000).
Ambos, os métodos apresentam tanto vantagens como desvantagens.
A extração por fase líquida tem um protocolo de fácil aplicação, não necessitando de
equipamentos sofisticados, entretanto, a eficiência deste método é relativamente menor
quando comparado à SPE, outra desvantagem é o emprego de solventes tóxicos. Já a SPE é
mais rápida mais eficiente e utiliza uma quantidade menor de solventes, entretanto necessita
de matrizes especiais as quais aumentam os custos da análise (CSERHÁTI e FORGÁCS,
1998; RODRIGUEZ et al., 2000; BRUZZONITI, et al. 2000).
A SPE é utilizada para a pré-concentração de compostos fenólicos, e devido a esse
fator, têm-se alternativas para facilitar e otimizar este processo. Os principais objetivos se
enquadram num dos pontos abordados a seguir:
A) Desenvolvimento de novas fases estacionárias, com exceção dos materiais à
base de carbono e sílica, há um rápido progresso na produção de polímeros e
adsorventes poliméricos modificados.
B) Desenvolvimento de técnicas e protocolos de análises automatizados. Com este
objetivo pode-se ressaltar o trabalho de POCURULL et al. (1996) onde os
autores utilizaram a cromatografia líquida de fase reversa e foto diode array
como detector, para determinar traços de compostos fenólicos na água. Foram
analisados os materiais: octadecilsilano (C18) e um copolímero de
estirenodivinilbenzeno carregado com sulfato de sódio. Com a finalidade de
aumentar a eficiência de retenção, levando em consideração a alta de
polaridade destes compostos, foi acrescentado um reagente de par-iônico ao
sistema de retenção. Os experimentos foram realizados em diferentes colunas
apresentando variações no diâmetro interno. Sob as condições testadas os
autores concluíram que uma melhor performance do método cromatográfico
foi obtida com o polímero estirenodivinilbenzeno carregado com sulfato de
sódio.
C) Derivatização dos compostos fenólicos antes da concentração. Devido a alta
polaridade dos compostos fenólicos, é comum, na cromatografia gasosa, estes
composto apresentarem picos largos e altos e esse efeito aumenta com o tempo
de uso da coluna cromatográfica. Para evitar este inconveniente, propõem-se
21
várias reações de derivatização com a finalidade de diminuir a polaridade dos
compostos fenólicos. As principais técnicas de derivatização são acetilação e
formação de par-iônico. Estas reações podem melhorar a eficiência dos
procedimentos de extração por fase sólida por acentuar a interação por fase
reversa (CSERHÁTI e FORGÁCS, 1998; RODRIGUEZ et al., 2000).
3.3- Adsorventes
Alguns compostos fenólicos são sistematicamente incluídos em testes para a
avaliação e determinação do mecanismo de separação de adsorventes para colunas
cromatográficas e matrizes para a extração por fase sólida. Em muitos casos, dados isolados
referentes à retenção e separação destes compostos são úteis para a avaliação da performance
do material cromatográfico (RODRIGUEZ et al., 2000).
Dentre os adsorventes freqüentemente utilizados tanto como suporte cromatográfico
ou como matrizes para a extração por fase sólida, destacam-se:
3.3.1 – Sílica
A sílica é amplamente empregada em cromatografia liquida de fase reversa,
sendo que, as principais características que permitem esse emprego são: variedade de
tamanho, porosidade, força mecânica que permite o uso mesmo em altas pressões, permitindo
uma rápida transferência de massa (STELLA, et al., 2001).
A superfície da sílica é caracterizada por grupos silanóis (Si-OH) e siloxano (Si-O-Si).
Os grupos Si-OH constituem o principal sítio de adsorção e, também apresenta alta
reatividade. Eles podem estar na forma livre, ligado a mais e um grupo hidroxila ou ainda
formando pontes de hidrogênio entre dois grupos Si-OH distintos. A presença destes grupos
livres, na superfície da sílica possibilitam a modificação estrutural do material,
proporcionando desta forma a sínteses de adsorventes para separações cromatográficas
específicas (STELLA, et al., 2001).
Adsorventes a base de sílica foram os primeiros materiais testados na separação de
compostos fenólicos, em sistema aquoso. Para esta separação o material mais utilizado é o
C18. O mecanismo pelo qual os compostos fenólicos são adsorvidos pelo C18 é através de
mecanismo de fase reversa, onde ocorre uma interação apolar tipo Van Der Waals entre o
22
analito e o adsorvente. Devido ao processo de partição, que envolve a diferença de
solubilidade do analito entre a fase aquosa e a fase estacionária apolar, a polaridade do analito
representa uma significante relevância na determinação da efetividade da fase estacionária.
Além da polaridade, outro fator que pode influenciar na efetividade da separação é o aumento
da carga do C18, pois aumentando a carga aumenta a capacidade de adsorção. Deve-se
considerar, ainda, o tamanho da partícula da sílica, o material mais comum apresenta 6nm de
diâmetro. O tamanho da partícula apresenta grande importância pois quanto menor, maior a
superfície de contato (RODRIGUÉZ et al., 2000).
É possível concentrar grandes volumes de amostra de fenóis, através do uso de
adsorventes com o grupo Si-OH livre. Este fato, leva a formação de ligações de hidrogênio
entre o adsorvente e o compostos fenólico, entretanto, esta adsorção pode ser irreversível e
apresentar uma dificuldade extra na eluição. Esta eluição seria possível realizar-se, após a
remoção dos resíduos aquosos, com solventes como o acetato de etila, metanol, acetonitrila ou
acetona. O volume de eluição depende da natureza do solvente, quantidade de adsorvente e
polaridade do composto (RODRIGUÉZ et al., 2000). A sílica com sistema de solventes não
aquoso, como fase móvel é raramente utilizada, entretanto, novas pesquisas têm demonstrado
resultados promissores na separação de compostos hidrofílicos (MACIEJEWICZ e
SOCZEWINSKI, 2000).
Entre as desvantagens desde material, pode-se citar sua limitada estabilidade em
diferentes pH, principalmente em pH alcalino e a presença de grupos Si-OH não reativos e
impurezas metálicas. Estes fatores limitam a aplicação deste material como fase estacionária
para a separação de determinados compostos, fazendo necessário o desenvolvimento de
adsorventes mais aprimorados (STELLA et al., 2001).
3.3.2 - Material polimérico
Fases estacionárias quimicamente modificadas são adaptadas para diferentes processos
analíticos, principalmente para CLAE e para a SPE. Os polímeros quimicamente modificados
retêm com eficiência uma variedade de analitos orgânicos, apresentando uma alta capacidade
de adsorção (BUSZEWSKI et al., 1999). Muitos são os materiais poliméricos utilizados pra a
separação ou extração de compostos polares, dentre os mais utilizados e estudados pode-se
citar: o poliestireno-divinilbenzeno (PS-DVB) e suas modificações e, o divinilbenzeno-n-
vinilpirrolidona.
23
O PS-DVB foi desenvolvido por modificações da resina XAD e constitui um polímero
com estrutura hidrofóbica e dependendo do fornecedor, apresenta diferentes tamanhos de
partículas, área de superfície e graus de reticulação (RODRÍGUEZ et al., 2000).
A retenção de compostos polares, tais como os compostos fenólicos no PS-DVB
envolvem a ativação do polímero por solvente, concentração da amostra em sistema aquoso,
secagem e eluição utilizando solventes como metanol-acetonitrila, acetato de etila ou terc-
butil-metil-ester. A retenção dos compostos fenólicos neste polimero, é resultado do
mecanismo de fase reversa e interações π-π entre os elétrons do anel aromático presente no
suporte e a molécula fenólica. Comparando este suporte com a sílica, nota-se que o PS-DVB
apresenta as seguintes vantagens (LEÓN-GONZÁLEZ e PÉREZ-ARRIBAS, 2000;
RODRÍGUEZ et al., 2000):
• Maior estabilidade em pH ácido, o qual normalmente é usado na
concentração de fenóis;
• Maior capacidade de adsorção de analitos polares, isto é atribuído a
quantidade de carbono, que é em torno de 90%, comparados a no máximo
18% no C18;
• Maior área superficial, alguns suportes comerciais apresentam uma área
maior que 1000 m2/g, enquanto o C18 apresenta entre 200 a 600 m2/g.
A retenção de compostos fenólicos no PS-DVB pode ser melhorada através da
introdução de grupos polares na matriz polimérica. Apesar do PS-DVB apresentar uma boa
capacidade de adsorção de compostos fenólicos, esta pode ser melhorada, pois a adição de
grupos funcionais com características hidrofílicas, melhora a característica de molhabilidade e
conseqüentemente, auxilia a transferência de massa de fenóis polares da fase aquosa para o
adsorvente (HUCK e BONN, 2000; RODRÍGUEZ et al., 2000).
Em resinas modificadas, a adsorção de compostos fenólicos, é devida ao esqueleto
polimérico (mecanismo de fase reversa e interações π-π) e é facilitada pela introdução de
grupos funcionais, tais como são: acetil, hidroximetil, benzoil, o-carboxibenzoil ácido
carboxílico e sulfônico (HUCK e BONN, 2000; RODRÍGUEZ et al., 2000). Destas
modificações a mais comumente utilizada é sulfatação do PS-DVB o que demonstra uma
excelente hidrofilicidade e melhora a eficiência de extração de compostos orgânicos polares.
24
O grau de sulfonação representa um maior efeito na retenção destes compostos (HUCK e
BONN, 2000).
O divinilbenzeno-n-vinilpirrolidona é um copolímero macroporoso consistindo em
monômeros, o lipofílico divinilbenzeno e o hidrofílico n-vinilpirrolidona. Estes dois
monômeros proporcionam um balanço hidro-lipofílico. Este material pode ser utilizado para a
determinação de compostos orgânicos polares e apolares. Devido a sua alta estabilidade em
diferentes pH e a compatibilidade com diferentes sistemas de solventes os analitos são retidos
na sua forma lipofilica não-iônica (HUCK e BONN, 2000).
3.2.3 – Carbono
Carbono grafite é o terceiro material mais utilizado na separação de compostos
fenólicos. A retenção destes compostos neste tipo de material resulta na combinação de
diferentes processos, tais como (RODRÍGUEZ, et al., 2000):
• Absorção de compostos não-polares por fase reversa (a alta capacidade de
absorção é resultado do aumento da superfície de contato do carbono grafite, a
qual aumenta a possibilidade de retenção por fase reversa)
• Interações π-π entre o solvente e os analitos aromáticos
• Troca iônica, sendo este mecanismo conseqüência do sal benzopirilium com
carga positiva, presente, como impureza, na superfície do carbono grafite.
3.4 - CAMI-Fe(III) – Princípios gerais
A cromatografia de afinidade é um método inovador e potente de purificação o qual
permite, além de diminuir o número de passos para a separação dos compostos, a obtenção do
composto de interesse com alto grau de pureza. Muitas pesquisas com diferentes métodos de
cromatografia de afinidade estão em desenvolvimento, cada qual baseada na seletividade e
interação reversível entre um ligante imobilizado e seu analito complementar, tais como
interação antígeno-anticorpo, enzima-inibidor, glicoproteína-lecitina, anticorpo-proteína G e
interação entre analito-íon metálico imobilizado. Este último, explora a afinidade dos íons
metálicos, especialmente os metais de transição como o Cu(II), Ni(II), Zn(II) e Fe(III), em
relação a grupos funcionais contendo oxigênio, nitrogênio e enxofre (LI e DASS, 1999a).
25
Na forma original, esta técnica foi introduzida por Helffeirch em 1961, neste caso foi
utilizado uma coluna trocadora, fortemente catiônica pela qual foi eluído Cu(II) e Ni(II). Uma
mistura de aminas foi percolada através da coluna usando uma solução aquosa de amônia
como eluente. Como a amina coordena mais fracamente com o Cu(II) foi deslocada primeiro,
acompanhada pelo excesso de amônia. A maior parte dos íons metálicos permaneceram
retidos na coluna, entretanto verificou-se que, uma pequena quantidade destes foram
deslocada, supondo-se que ocorreu uma troca com os íons amônio da solução aquosa de
amônia. Esta perda de íon poderia ser minimizada escolhendo-se um trocador mais forte ou
adicionando íons metálicos com baixa concentração no eluente (HEFTMANN 1992, parte A).
A CAMI-Fe(III) apresenta uma aplicação na purificação e caracterização de
macromoléculas fosforiladas. Este método de separação pode ser aplicado, com sucesso, na
purificação de fosfopeptídeos obtidos por síntese em fase-sólida para os quais, numa
separação através de CLAE, normalmente são necessários vários passos para obtenção da
fosfoproteína desejada, com alto grau de pureza. Através da CAMI-Fe(III) pode-se eliminar
vários passos desta separação, com redução do tempo consumido, e ainda assim obter-se o
produto com o mesmo teor de pureza (LI e DASS, 1999a). Além, da purificação de
fosfopeptídios sintéticos, esta técnica é ideal para o isolamento e identificação de
fosfopeptídios de amostras biológicas. Este isolamento e purificação seletiva de produtos
fosforilados, tanto sintéticos quanto de origem biológica, pode ser atribuída à forte interação
do íon Fe(III) com grupos fosfato (LI e DASS, 1999b). A adsorção do grupo fosfato ao Fe(III)
imobilizado não é apenas resultado de uma simples interação eletrostática. A alta afinidade
com o qual o fósforo interage com o Fe(III) é particularmente explicada pelo fato de que,
provavelmente, ocorra a formação de dois pontos de coordenação com o metal, enquanto
outros grupos como carboxila, formam apenas um ponto (HOLMES e SCHILLER, 1997).
Compostos não fosforilados, como o aminoácido cisteína, também podem ser
purificados através da CAMI-Fe(III). Neste caso, a purificação da cisteína pode ser atribuída a
presença do grupo sulfidril, o qual é quimicamente similar ao hidroxil. Devido a essa
semelhança química, o sulfidril apresenta uma relativa afinidade pelo Fe(III) (HOLMES e
SCHILLER, 1997).
Em todos os casos, na CAMI, a adsorção de uma amostra em um suporte
cromatográfico, requer a interação desta amostra com um metal, enquanto um ou mais
ligantes fracos são deslocados. Quando o íon metálico ligado é um átomo doador múltiplo de
elétrons, há uma favorável contribuição entrópica para a energia de ligação, resultante do
26
deslocamento de múltiplos ligantes fracos, este fato pode ser chamado de efeito quelato
(HOLMES e SCHILLER, 1997).
Para a compreensão do mecanismo de separação do Fe(III) imobilizado à um suporte
cromatográfico, ou seja, da CAMI-Fe(III), deve-se primeiramente, considerar o conceito de
“dureza e moleza”. A química de coordenação classifica os ligantes e os íons metálicos em
ácidos e bases “duros” e “moles”. Segundo o princípio de Pearson, tem-se que, num pH em
torno de 7, ácidos “duros” interagem com bases “duras” e ácidos “moles” com bases
“moles”. Um ácido de Lewis “mole” contém os íons dos metais de transição de maior peso
molecular e que se encontram em baixos estados de oxidação, como o Cu(I), Ag(I), Hg(I),
Hg(II), Pd(II) e Pt(II). Nos os ácidos de Lewis “duros”, incluem os metais alcalinos, alcalinos
terrosos e os metais de transição com um estado de oxidação alto, tais como Ti(IV), Fe(III),
Cr(III), Co(III) e o íon hidrogênio (HUHEEY, 1981).
O Fe(III) é considerado um ácido de Lewis “duro” logo, apresentará uma interação
mais forte com bases “duras” como o oxigênio fenólico, fosfatos, sulfatos e carboxilatos. As
moléculas que contém estas bases de Lewis “duras” possuem uma constante de estabilização
alta, já, as moléculas que possuem bases de Lewis “moles”, tais como grupamentos amino e
sulfidril, apresentam uma constante de estabilização baixa. Embora o enxofre e o nitrogênio
possam doar elétrons ao Fe(III), normalmente, resulta na formação de complexos fracos.
(HOLMES e SCHILLER , 1997).
A força de coordenação entre o íon Fe(III) e um ligante é controlada principalmente
por três fatores:
a) Interação eletrostática controlada pela carga e pelo raio molecular, pois a
energia eletrostática de um par iônico é inversamente proporcional à distância interatômica,
quanto menor for o íon, maior será a atração (HOLMES e SCHILLER, 1997; HUHEEY,
1981).
b) Afinidade do centro iônico em receber elétron do ligante. Em geral, toda
espécie “dura” possui uma eletronegatividade elevada. A relação entre “dureza” e
eletronegatividade indica que se obtém complexos mais estáveis, quando a ligação é formada
entre elementos que apresentam eletronegatividades muito diferentes (HOLMES e
SCHILLER , 1997; HUHEEY, 1981).
c) Configuração eletrônica do metal que é susceptível de estabilização
devido a distorção da simetria octaédrica. Essa distorção octaédrica é conhecida como “Efeito
Jahn-Teller”, o qual estabelece que, para uma molécula não linear, que apresenta um estado
eletronicamente degenerado, ocorre uma distorção na simetria para eliminar a degeneração e
27
alterar a energia, de forma que a energia de repulsão seja a mínima e a de ligação seja a
máxima (HOLMES e SCHILLER , 1997; HUHEEY, 1981).
O mecanismo de separação da CAMI-Fe(III) pode ocorrer através dos métodos:
coordenação metálica ou troca-iônica. A flexibilidade desta técnica origina-se no fato que
ambos, troca iônica ou as propriedades de coordenação do ligante, podem resultar em uma
afinidade específica. Os fatores a serem considerados, quando se desenvolve uma separação
utilizando CAMI-Fe(III), são: a carga do complexo metal-ligante, a força iônica do tampão e
a presença de uma superficie acessível às moléculas a serem purificadas (HOLMES e
SCHILLER , 1997).
Para uma melhor compreensão das propriedades de separação através de
coordenação com o ligante ou troca iônica, estes autores supra citados, consideram o uso do
ácido iminodiacético (IDA) como um ligante quelante. Sem um íon metálico coordenado, a
fase estacionária que contém o IDA negativamente carregado, apresenta uma troca,
relativamente forte de cátions. Quando o IDA quela o íon Fe(III), o complexo metal ligante
apresenta uma rede de cargas positivas, o que não ocorre quando o complexo IDA-íon é
formado por metais divalentes, tais como, o IDA-Cu(II), o qual não possui uma carga formal.
Para complexo do IDA com o Fe(III), a interação eletrostática é relativamente significante
(id., ibidem).
Exemplificando o mecanismo de separação da CAMI-Fe(III), através da troca iônica,
pode-se citar a purificação da enzima lactato-desidrogenase. Sem o aumento da força iônica, a
proteína citada não é deslocada através da coluna que contem o íon Fe(III).
Entretanto, complexos de ligantes com o Fe(III), que não possuam uma rede de
cargas formais, ligam-se a proteínas séricas, com uma eficiência relativamente maior do que
complexos de ligantes com o IDA-Fe(III), em pH baixo, isto sugere que interações não-
iônicas podem, também, ter um papel importante na formação do complexo metal proteína. O
mecanismo de adsorção é controlado por fatores séricos, ou ainda, por cargas que ocorrem
localmente, reduzindo desta forma, a importância da rede de cargas da proteína (id., ibidem).
28
3.5 - QTN como suporte para a CAMI
A QTN é um polímero natural, presente nas cascas de crustáceos e na parede celular
de fungos, ela consiste em cadeias de β(1→4)N-acetilglucosamina. É insolúvel em solventes
comuns, tais como soluções ácidas ou solventes. É parcialmente desacetilada, normalmente
sob condições heterogêneas em processos industriais, produzindo assim, uma variedade de
polímeros. Apresenta ampla aplicação tanto no campo biomédico, como farmacêutico e
cosmético e, devido a essas aplicações, torna-se importante sua caracterização para controlar a
produção e suas propriedades finais (BRUGNEROTTO et al., 2001).
Uma análise estrutural da QTN, de várias origens, indica que há um átomo de
nitrogênio em cada anel do polímero. Este átomo de nitrogênio está na forma de grupos NH2
livres, (cerca de 15%) e grupos acetamida (MUZZARELLI e TUBERTINNI, 1969;
MALINOWSKA e RÓZYLO, 1997). A presença dos grupos NH2 livres, na cadeia
polimérica, confere à QTN uma característica de nucleofilicidade, num pH básico (>7), estes
grupos são desprotonados e o par de elétrons não compartilhados pode ocasionar uma
variedade de modificações químicas (KUMAR et al., 2000). Essas modificações, na
superfície do polímero, representam uma grande importância para aplicações analíticas,
especialmente para diferentes métodos cromatográficos, assim como em sistemas biológicos
quando, complexos imobilizados à sua superfície mimetizam a atividade biológica de
metaloenzimas (RODRIGUES et al., 1998a). Na figura 1, está representado a estrutura da
QTN.
O
OHOOH
NH2
O
CH2OH
CH2OHNHCOCH3
n
Figura 1: Estrutura da QTN
Os amino açúcares e seus derivados poliméricos, como é o caso da QTN, são ligantes
eficientes, formando complexos estáveis com íons metálicos, tais como Cr(III), Co(II), Ni(II),
Cu(II), Fe(III) dentre outros. Esses cátions são coordenados ao par de elétrons livres dos
grupos NH2 livres (TONG et al., 1991; BURKE et al., 2002).
29
Alguns destes metais são fortemente retidos, não sendo assim, eluídos e, desta forma,
podem ser utilizados para modificar a estrutura polimérica. Esta alteração na superfície da
QTN propicia a utilização desta como fase estacionária para a separação de grupos de
compostos que não são eficientemente separados quando se utiliza o polímero sem a adsorção
dos metais (MALINOWSKA e RÓZYLO, 1997).
A QTN com o íon Cu(II) imobilizado em sua superfície apresenta uma eficiência
relativamente maior na separação de uma mistura de isômeros ópticos de aminoácidos,
quando comparada com o polímero sem íon imobilizado (MALINOWSKA e RÓZYLO,
1997).
Em trabalhos anteriores foi realizado um estudo comparativo usando QTN e QTN-
100 para separar os flavonóides swertisina e 2''-O-rhamnosilswertesina de extratos de
Aleurites molucana. Os resultados revelaram que a presença do grupo amino na superfície da
QTN favorece a formação de fortes pontes de hidrogênio entre a hidroxila do composto
fenólico e os grupos NH2. Por outro lado, a acetilação do polímero elimina a presença de
grupos NH2 livres, consistindo no polímero denominado QTN-100, o qual apresenta
características de poliamida. A interação da hidroxila dos compostos fenólicos com o
grupamento acetamida da QTN-100 apresentou numa intensidade relativamente menor
quando comparada à interação com os grupos NH2 da QTN, desta forma favorecendo a
separação dos compostos (MORSCH et al., 2002). Ao utilizar extratos de Rhedia
gardneriana, rica em flavonóides, tais como volkensiflavona, GB-2a, fukugetina e
fukugesida, foi observada a mesma forte interação do polímero QTN com a hidroxila fenólica
dos compostos, confirmando a hipótese dos estudos acima descritos (RODRIGUES et al.,
2000b)
A presença de interações π-π entre o analito e o adsorvente pode apresentar
vantagens para a separação de compostos com parâmetro de retenção similar aos adorventes
tradicionais. Esta interação pode ser definida como uma interação entre elétrons π da fase
estacionária e compostos fenólicos, tais como flavonóides. Estudos realizados com a
modificação da superfície da quitosana com benzaldeído revelaram que a adição do grupo
benzênico na superfície polimérica aumenta o caráter hidrofóbico. Este grupo aromático
propicia a interação do tipo π-π com os flavonóides, resultando numa interação mais fraca do
que a formação de pontes de hidrogênio. Ao utilizar o polímero modificado com o grupo
benzênico para a separação de flavonóides observa-se uma capacidade particular deste
adsorvente na separação, melhorando de forma significativa a quantidade de composto obtido
30
na forma pura, quando comparado com a separação dos mesmos compostos utilizando o
adsorvente sem o grupo benzênico (GIRARDI et al., 2003).
Em trabalhos anteriores foram demonstrados que a QTN-Fe pode ser um suporte
alternativo para a CAMI uma vez que apresentou eficiência na separação de compostos
fenólico (RODRIGUES et al., 1999) e compostos de origem natural como é o caso de
flavonóides, biflavonóides, terpenos, diterpenos e derivados do ácido gálico (RODRIGUES et
al., 1998b; RODRIGUES et al., 2000a). Entretanto, alguns pontos necessitam ser elucidados
como, por exemplo, a extensão em que cada mecanismo de separação cromatográfica (troca
iônica, polaridade, formação de complexo), é responsável pela retenção dos compostos
fenólicos no adsorvente.
31
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Reagente e compostos
• Acetona, anidrido acético, cloreto férrico, clorofórmio, etanol, formamida,
metanol, sulfato de cálcio; todos de grau analítico.
• Catecol, fenol, hidroquinona, pirogalol, resorcinol, 4-bromofenol, 4-
clorofenol, 3,4-diclorofenol, 4-nitrofenol, 4-aminofenol, 4-metilfenol, 4-
metoxifenol e 5-metilresorcinol.
4.2 Equipamentos
• Espectofotômetro de Infravermelho (Bomem-Hartmann S. Braun-M-
Séries).
• Espectofotômetro de UV-visível (1601, Shimadzu).
4.3 Preparação dos polímeros
4.3.1 QTN com diferentes graus de acetilação
Foram obtidos diferentes polímeros (QTN) com variações no grau de acetilação,
através da modificação da quitosana, através da reação com anidrido acético com diferentes
proporções (1:0,25 e 1:1) em relação ao monômero de quitosana em meio contendo
metanol:formamida, sob agitação por 48 h. Após este período, o sólido foi filtrado, lavado
com etanol e acetona para a remoção de excesso de anidrido e seco sob ação do calor.
4.3.2 Preparação dos polímeros complexados com o íon Fe
O polímero QTN, com diferentes graus de acetilação, foi complexado com íons Fe.
Em uma solução de cloreto férrico (FeCl3) 1M foi adicionado o respectivo polímero e o
32
sistema foi mantido em agitação por um período de 12 h, em temperatura ambiente. Após este
período, o sólido foi separado por filtração, lavado com etanol e acetona, para a remoção do
excesso de FeCl3 e em seguida foi seco sob ação do calor.
4.4 Caracterização dos polímeros
Os polímeros foram caracterizados através de espectroscopia IV, usando pastilhas de
KBr.
A determinação do grau de acetilação (GA) dos polímeros foi realizada segundo o
método descrito por BROUSSIGNAC (1968) para a determinação do grau de desacetilação da
quitosana, tal método está baseado na equação 01. O método envolve a titulação de amostra
da QTN em presença de um excesso de ácido forte (HCl) com hidróxido de sódio.
%NH2 = 16,1 x (V2 –V1) x Mb Equação 01 m
onde: V2 é o volume (mL) correspondente ao segundo ponto de equivalência, V1 é o volume
(mL) correspondente ao primeiro ponto de equivalência, Mb é a molaridade da base, m é a
massa (g) da amostra e 16,1 é o valor relacionado com o peso molecular do monômero da
QTS.
O primeiro ponto de equivalência (V1) está relacionado com a neutralização do ácido
fraco NH3+. O segundo ponto de equivalência (V2), está relacionado com a neutralização do
ácido clorídrico pelo hidróxido de sódio.
As quantidades de Fe adsorvidas em cada polímero, foram determinadas por
colorimetria usando 1,10-fenantrolina, descrito por JEFFERY et al. (1992).
4.5 Adsorção dos compostos ao polímero QTN-Fe
Para a caracterização da absorção dos compostos ao polímero QTN-Fe foi preparado
um complexo composto:polímero na proporção 1:50, levado a um sistema de agitação
constante, por um período de 24 h, com os compostos em estudo: Fenol, Catecol, Resorcinol,
33
Hidroquinona e Pirogalol, separadamente. Após o período de agitação os sólidos foram
filtrados, lavados com acetona e secos em temperatura ambiente.
4.6 Deslocamento dos íons cloreto
A concentração de íons cloreto deslocados de seu ponto de coordenação com o Fe foi
determinado de acordo com o método de Volhard, descrito por JEFFERY et al. (1992). Para
realização deste método foi utilizado o complexo QTN-Fe(2) tendo adsorvidos em sua
superfície os compostos: Fenol, Catecol, Resorcinol, Hidroquinona e pirogalol.
O método de Volhard envolve a titulação com tiocianato de potássio 0,1M, da
amostra, QTN-Fe-composto, em excesso de nitrato de prata. A quantidade de íons cloreto de
uma solução padrão, QTN-Fe(2), subtraído da quantidade determinada de íons cloreto na
amostra representa a quantidade de íons cloreto deslocadas pelos compostos.
4.7 Análise cromatográfica
Para a análise cromatográfica foram utilizados 5 séries distintas de compostos
fenólicos. Tais séries foram determinadas de acordo com características estruturais dos
compostos.
4.7.1 Primeira série
Para esta série foram selecionados compostos fenólicos que apresentam número
crescente de hidroxilas, sendo:
OH OH
OH
OH
OH
OHFENOL
Ácido FênicoCATECOL
1,2-dihidroxibenzeno
PIROGALOL
1,2,3-trihidroxibenzeno
34
4.7.2 Segunda série
Fazem parte desta série os compostos fenólicos com o mesmo número de hidroxilas,
diferenciando apenas em sua posição, sendo:
CA
TECOL
1,2-dihidroxibenzeno
RESORCINOL
1,3-dihidroxibenzeno
HIDROQUINONA
1,4-dihidroxibenzeno
OH
OH
OH
OH
OH
OH
4.7.3 Terceira série
Fazem parte desta série alguns halofenois.
4-BROMOFENOL 4-CLOROFENOL 3,4-DICLOROFENOL
OH
Cl
OH
Br
OH
Cl
Cl
4.7.4 Quarta série
Esta série é composta por compostos fenólicos que apresentam substituintes
nitrogenados no anel fenólico.
OH
NH2
OH
NO2
4-AMINOFENOL 4-NITROFENOL
35
4.7.5 Quinta série
Fazem parte desta série, compostos fenólicos que apresentam grupos metilas ou
metoxilas. OH
CH3
OH
OCH3
OH
OHCH3
4-METILFENOL 4-METOXIFENOL 5-METILRESORCINOL
O comportamento cromatográfico foi avaliado através de cromatográfia líquida de
coluna, sendo que as colunas cromatográficas foram preparadas pela mistura do respectivo
polímero com o solvente clorofórmio.
A quantidade de polímero e o tamanho da coluna foram determinados de acordo com
a quantidade de amostra a ser separada. A proporção composto: polímero teve uma variação
na sua relação de 1:25 e 1:50, sendo que para estas duas variação a altura do leito
cromatográfico foi em torno de 10 cm.
Com o intuito de verificar a influência do leito cromatográfico, foi mantida a relação
composto:polímero 1:50 e utilizado uma coluna cromatográfica com um diâmetro interno
menor. Neste caso, a altura do leito cromatográfico foi em torno de 20 a 25 cm.
Para a eluição dos compostos foi utilizado o sistema de solvente CHCl3:MeOH com
polaridade crescente. As amostras foram colocadas na forma de pastilhas e eluídas a seguir
com o solvente apropriado. Este foi coletado em frações de 5 ml, que, posteriormente, foram
agrupadas de acordo com o componente presente, o qual foi identificado com o auxílio da
CCD convencional, utilizando como sistema de solvente CHCl3:MeOH na proporção 80:20 e
UV, dicromato de potássio ou FeCl3:EtOH 1% como agente revelador. A escolha do revelador
foi determinada de acordo com o composto a ser identificado.
36
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Caracterização dos polímeros
5.1.1 QTN-Fe(1)
A QTN-Fe(1) foi preparada com a QTN extraída da casca de camarão, e nestas
condições o polímero apresenta um grau de desacetilação de aproximadamente 15%.
A quantidade de ferro presente neste polímero foi determinada por método
colorimétrico usando 1,10-fenantrolina como descrito por JEFFERY et al., (1992), e ficou
em torno de 0.5 %. O espectro de Infravermelho do polímero QTN-Fe(1), mostrado na figura
2, apresenta pouca diferença em relação ao o espectro da QTN, uma vez que predomina a
absorbância deste polímero. No espectro pode-se observar as bandas de absorção em 1660,
1558 e 1315 cm-1 correspondendo às bandas de amida I, II e III respectivamente.
Figura 2: Espectro de IV dos suportes QTN-Fe(1), pastilha de KBr.
De acordo com RODRIGUES et al. (1999), o espectro de Mössbauer para o suporte
QTN-Fe(1) demonstrou a presença de complexos de Fe(II) baixo spin com ligantes σ-doador.
37
Na figura 3, está representada a provável estrutura da QTN-Fe(1), na qual pode ser
observada a interação do ferro com o grupamento NH2 do polímero.
Figura 3: Provável estrutura da QTN-Fe(1) (RODRIGUES et al., 1999)
5.1.2 QTN com um diferente graus de acetilação
Inicialmente foi realizado a preparação do polímero QTN-33 em meio heterogêneo
na presença de anidrido acético, o qual apresentou uma proporção de 1:0.25 com o monômero
de quitosana.
O grau de acetilação dos grupos NH2 livres foi de 53%, o qual foi calculado com o
auxílio da equação de BROUSSIGNAC, sendo os respectivos volumes dos pontos de
equivalência obtidos a partir da curva de titulação potenciométrica mostrada na Figura 4.
Com este grau de acetilação, obteve-se um polímero que apresentou 33% de grupos NH2
livres em sua superfície.
Fe
Cl
NH2
H2OH2O NH2
H2N
HO
Fe
Cl
NH2
H2OH2O
NH2
Cl
HO
NH2
NH2
OH
OHNH
CCH3O
OH
NHCCH3
O
NHC
CH3 O
NHC
CH3 O
Cl
38
0 10 20 30 40 50
0
2
4
Volume (mL)
pHPr
imei
ra d
eriv
ada
Figura 4: Curva de titulação potenciométrica. Método da primeira derivada.
Com o intuito de obter um polímero que apresentasse uma maior quantidade de íons
Fe adsorvidos em sua superfície, o polímero QTN-33 foi utilizado para a preparação de um
novo suporte cromatográfico para a CAMI.
Neste caso a quantidade de Fe presente no polímero ficou em torno de 10%, esta
concentração foi determinada por método colorimétrico utilizando 1.10-fenantrolina como
descrito por JEFFERY et al. (1992). Esse aumento na quantidade de íons Fe imobilizados à
superfície do polímero pode ocorrer em algumas condições, tais como aumento do grau de
desacetilação, aumento da concentração de íons Fe na solução e alteração do pH do meio
(BURKE et al., 2002). No caso deste estudo, o aumento da quantidade de íons adsorvidos foi
devido ao aumento do grau de desacetilação, desta forma o polímero apresentou um maior
número de grupos NH2 livres para interagir com o íon Fe. Este polímero foi denominado
como QTN-Fe(2), e seu perfil cromatográfico foi comparado aos demais polímeros em estudo.
A figura 5 apresenta o espectro de Infravermelho do polímero QTN-Fe(2), onde pode-
se observar as bandas de absorção em 1655, 1542 e 1310 cm-1 correspondendo às bandas de
amida I, II e III respectivamente, mostrando novamente que predomina a absorbância da
QTN.
39
Figura 5: Espectro de IV do suporte QTN-Fe(2)
5.1.3 QTN-100
Com o objetivo de eliminar interações não específicas, foi preparado o suporte
cromatográfico QTN-100, em meio heterogêneo na presença de anidrido acético, na
proporção de 1:1 com o monômero de quitosana.
O grau de acetilação dos grupos NH2 livres da QTS, após a preparação dos
polímeros, foi calculado com o auxílio da equação de BROUSSIGNAC (1968), sendo o
volume do ponto de equivalência obtido a partir da curva de titulação potenciométrica
mostrada na Figura 6.
0 10 20 30 40 50
0
2
4
6
8
10
12
Volume (ml)
Prim
eira
der
ivad
a
Figura 6: Curva de titulação potenciométrica do polímero QTN-100. Método da primeira derivada
40
Ao analisar o gráfico pode-se observar apenas um ponto de equivalência, o qual está
relacionado com a neutralização do ácido clorídrico. Isto indica que não há o ácido fraco
NH3+ para a neutralização, o que sugere uma substituição de 100% dos grupos NH2 da
quitosana, resultando no polímero QTN-100.
A figura 7 apresenta o espectro de Infravermelho do polímero QTN-100, onde pode-
se observar as bandas de absorção em 1660, 1552 e 1304 cm-1 correspondendo às bandas de
amida I, II e III respectivamente, mostrando novamente que predomina a absorbância da
QTN.
Figura 7: Espectro de IV do suporte QTN-100
5.2 Comportamento cromatográfico
Obtidas as misturas dos componentes de cada série de compostos foram realizados os
procedimentos cromatográficos utilizando os diferentes suportes. Foram mantidas as mesmas
condições de eluição, tendo como variação:
• Relação composto:adsorvente de 1:25
• Relação composto:adsorvente de 1:50
• Aumento do leito cromatográfico
41
5.2.1 Primeira série de compostos: Fenol, Catecol e Pirogalol
Os compostos desta série diferem entre si no número de hidroxilas fenólicas, sendo
uma hidroxila no fenol, duas no catecol e três no pirogalol.
Os resultados demonstrados nas tabela 1 apresentam o comportamento
cromatográfico, as porcentagens de recuperação e de composto retido nos diferentes
polímeros, tendo como variação a relação composto:polímero 1:25. A quantidade inicial de
cada composto foi de 50 mg.
Tabela 1: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da primeira série, frente aos
diferentes polímeros. Relação composto:adsorvente 1:25.
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de comp. recuperado*
% de comp. retido no
polímero** Fenol -
Fenol + Catecol 2%
Catecol 58% Sílica
Pirogalol 78%
30%***
Fenol -
Catecol 45% QTN-100
Pirogalol 75%
40%***
Fenol 12%
Catecol 96% QTN-Fe(1)
Pirogalol 92%
6%***
Fenol -
Catecol 20% QTN-Fe(2)
Pirogalol 32%
74%***
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
*** A porcentagem de composto retido desconsidera a quantidade inicial de Fenol
Os dados da tabela 1 revelam que a porcentagem de compostos fenólicos
recuperados na forma pura bem como porcentagem de composto retido varia
42
consideravelmente com o suporte cromatográfico empregado. Os adsorventes QTN-100 e
sílica apresentaram comportamento semelhante. A seletividade da sílica na separação de
compostos pode ocorrer devido à polaridade, embora isto ocasione um aumento na retenção
de compostos polares e a especificidade de separação é diminuída.
A QTN-100 apresenta em sua estrutura grupos acetamida, o qual pode estar
interagindo através de pontes de hidrogênio, com a hidroxila fenólica dos compostos,
resultando desta forma, na retenção de uma boa parte da amostra. Estes resultados obtidos
com o polímero QTN-100 estão em desacordo com aqueles relatados por MORSCH et al.
(2002) na separação de flavonóides, uma vez que foram observados melhores rendimentos na
obtenção de tais compostos quando comparados com a sílica. Este fato pode ser atribuído a
diferença estrutural dos compostos, os flavonóides são compostos mais complexos,
apresentando uma menor polaridade por sua carga estar distribuída por toda a estrutura, já os
compostos fenólicos empregados neste estudo, apresenta estrutura molecular simplificada,
apresentando uma maior polaridade, pois sua carga está concentrada.
Quando são comparados os valores do rendimento dos compostos recuperados
empregando os suportes contendo íons Fe adsorvidos, pode ser observada uma melhora na
eficiência destes suportes, quando comparado com a sílica e a QTN-100. Estes resultados
estão em acordo com aqueles relatados por RODRIGUES et al. (1999). A melhora de
eficiência cromatográfica pode ser atribuída a presença dos centros metálicos livres para
interagir. A adsorção do Catecol e do Pirogalol na QTN-Fe envolve interação do composto
com o Fe, enquanto um ou mais ligantes fracos são deslocados. A diferença na retenção entre
eles pode ser atribuída a interação de uma molécula de Catecol para um centro metálico,
enquanto que para o Pirogalol a interação é de uma molécula para dois centros metálicos,
tendo em vista que a diferença destes compostos consiste no número de hidroxilas fenólicas.
O aumento da capacidade de retenção do polímero QTN-Fe(2) em relação a QTN-
Fe(1) está associado ao aumento da quantidade de íons Fe adsorvidos. O QTN-Fe(1) apresenta
0.5% de íons Fe imobilizados e apresentou uma boa porcentagem de recuperação dos
compostos, já o QTN-Fe(2) que apresenta 10% de íons Fe imobilizado, reteve a maior
porcentagem dos compostos em sua superfície.
A forte interação dos compostos com os centros metálicos é evidenciada pela
utilização do polímero QTN-Fe(2). O complexo formado entre os compostos e o íon Fe é muito
estável, o que resultou na retenção total dos compostos, quando o polímero apresentou uma
grande quantidade de tal íon adsorvido em sua superfície. O logaritmo da constante de
estabilidade do complexo Catecol:Fe, em meio aquoso é de aproximadamente 20.0
43
(HOLMES e SCHILLER, 1997), impedindo a remoção do composto de um suporte com
grande porcentagem de Fe presente.
O efeito do aumento na relação composto: adsorvente sobre o comportamento
cromatográfico dos compostos pode ser observado na tabela 2. Os resultados demonstrados
nesta tabela, apresentam as porcentagens de recuperação e de composto retido nos diferentes
polímeros, tendo como variação a relação composto:polímero 1:50. A quantidade inicial de
cada composto foi de 25 mg.
Tabela 2: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da primeira série,
frente aos diferentes polímeros. Relação composto:adsorvente 1:50
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de recuperação*
% de comp. retido no
polímero** Fenol -
Catecol 24%
Pirogalol + catecol 14% Sílica
Pirogalol 32%
58%***
Fenol 4%
Catecol 68% QTN-100
Pirogalol 96%
16%***
Fenol -
Catecol 84% QTN-Fe(1)
Pirogalol 96%
10%***
QTN-Fe(2)Fenol + Catecol +
Pirogalol 28% 72%
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
*** A porcentagem de composto retido desconsidera a quantidade inicial de Fenol
Ao analisar os dados da tabela 2, verifica-se que ocorreu a diminuição na recuperação
dos compostos quando foi utilizada a sílica. Nestas condições de eluição, na qual foram
mantidos constantes os volumes do eluente, parte dos produtos ficaram adsorvidos, estes fatos
pode ser atribuído a forte interação entre os sítios ativos da sílica e os compostos.
44
Por outro lado, quando a QTN-100 foi empregada ocorreu um aumento na eficiência
de separação, tanto na quantidade dos compostos puros, como na quantidade final de
composto retido. Estes resultados podem ser explicados pela diferença na natureza física do
adsorvente. Diferente da sílica, que apresenta uma estrutura esférica rígida, a QTN-100 não
apresenta forma regular e não é tão rígida, podendo sofrer compactação durante o processo
cromatográfico. Com esta compactação ocorre uma diminuição da velocidade de eluição,
favorecendo consideravelmente a cinética de adsorção e melhorando a eficiência da
separação.
No caso dos adsorventes contendo íons Fe, o aumento da relação adsorvente:composto
teve pouco efeito. Observa-se a mesma tendência dos resultados obtidos com a variação
composto:adsorvente de 1:20, especialmente no caso do polímero QTN-Fe(1). N o polímero
QTN-Fe(2), o aumento da relação provoca uma diminuição na eficiência do adsorvente.
O efeito do aumento do leito cromatográfico, mantendo a relação composto:adsorvente
1:50, sobre o comportamento cromatográfico, está demonstrado na tabela 3. Os resultados
apresentados nesta tabela indicam e as porcentagens de recuperação e de composto retido nos
diferentes polímeros. A quantidade inicial de cada composto foi de 25 mg.
45
Tabela 3: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da primeira série, frente aos
diferentes polímeros. Leito cromatográfico de 25 cm.
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de recuperação*
% de comp. retido no
polímero** Fenol puro -
Catecol puro 96% Sílica
Pirogalol puro 100%
2%***
Fenol puro - QTN-100
Catecol + Pirogalol 100% -***
Fenol puro -
Catecol puro 80% QTN-Fe(1)
Pirogalol puro 80%
20%***
Fenol puro -
Catecol puro - QTN-Fe(2)
Pirogalol puro 20%
90%***
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
*** A porcentagem de composto retido desconsidera a quantidade inicial de Fenol
Com estes resultados pode-se observar um aumento na recuperação dos compostos
quando a sílica foi utilizada. Este aumento na eficiência de separação pode ser atribuído ao
maior tempo de contato do composto com o adsorvente. No polímero QTN-100, o maior
tempo de contato foi prejudicial para a separação, possibilitando a obtenção dos compostos
apenas na forma de mistura.
Para os polímeros contendo o íon Fe, o aumento do tempo de contato do composto
apresentou a mesma tendência observada anteriormente, sendo mantidas praticamente as
mesmas porcentagens de separação para o QTN-Fe(1) e a mesma tendência de retenção de
grande parte da amostra pelo QTN-Fe(2).
Comparando os resultados obtidos com o polímero QTN-Fe(1) que apresenta 5mg/g
de íons Fe com os resultados obtidos em estudos anteriores com o polímero QTN-Fe,
contendo 9 mg/g de íons Fe (RODRIGUES et al., 1999) e os resultados apresentados pelo
polímero QTN-Fe(2), o qual apresenta 100mg/g de íons Fe adsorvidos, observa-se um efeito
crescente na quantidade de composto retido na superfície polimérica. Este crescimento pode
ser diretamente relacionado a quantidade de íons Fe adsorvidos. Quanto maior a quantidade
46
de centros metálicos presentes, maior é a quantidade de composto retido, comprovando assim
que a separação dos compostos fenólicos está diretamente relacionada a presença do íon Fe
presente no polímero. Por outro lado, a eficiência na separação dos compostos puro é reduzida
com o aumento da quantidade de íons Fe no polímero.
Conforme observado nas tabelas 1, 2 e 3 a quantidade de fenol praticamente não foi
considerada. Isto ocorreu porque o composto apresentar uma alta volatilidade, resultado na
perda do composto antes de adicionar a pastilha na coluna cromatográfica.
5.2.2 Segunda série de compostos: Hidroquinona, Catecol e Resorcinol
Os componentes desta série de compostos apresentam o mesmo peso molecular, a
mesma polaridade e fórmula molecular, diferenciando apenas em sua fórmula estrutural na
posição das hidroxilas fenólicas, sendo 1,2-, 1-3-, e 1-4-dihidroxibenzeno.
Os resultados demonstrados nas tabela 4, 5 e 6 apresentam o comportamento
cromatográfico e as porcentagens de recuperação e de composto retido nos diferentes
polímeros, tendo como variação a relação composto:polímero 1:25, 1:50 e aumento do leito
cromatográfico, respectivamente.
A quantidade inicial dos compostos para os procedimentos cromatográficos tendo
como relação composto:adsorvente 1:25 foi de 50 mg de cada composto, para a relação 1:50 e
maior leito essa quantidade inicial foi de 25 mg de cada composto.
47
Tabela 4: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da segunda série, frente aos
diferentes polímeros. Relação composto:adsorvente 1:25.
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de comp. recuperado*
% de comp. retido no
polímero**
Sílica Catecol + Resorcinol +
Hidroquinona 100% -
Catecol 35% QTN-100
Resorcinol + Hidroquinona 90% 28%
Catecol 60%
Resorcinol +Hidroquinona 82% QTN-Fe(1)
Resorcinol 10%
22%
Catecol 60%
Catecol + Resorcinol +
Hidroquinona 38% QTN-Fe(2)
Resorcinol + Hidroquinona 26%
24,6%
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
Tabela 5: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da segunda série, frente aos
diferentes polímeros. Relação composto:adsorvente 1:50.
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de recuperação*
% de comp. retido no
polímero** Catecol 40%
Sílica Resorcinol + hidroquinona 76%
36%
Catecol 40% QTN-100
Resorcinol + Hidroquinona 52% 52%
Catecol 48%
Resorcinol + Hidroquinona 84% QTN-Fe(1)
Resorcinol 20%
21%
Catecol 12%
Resorcinol + Hidroquinona 18% QTN-Fe(2)
Catecol + Resorcinol +
Hidroquinona 33,8%
50,6%
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
48
Tabela 6: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da segunda série, frente aos
diferentes polímeros. Leito cromatográfico de 25 cm.
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de recuperação*
% de comp. retido no
polímero** Catecol 76%
Catecol + Resorcinol +
Hidroquinona 58.6% Sílica
Hidroquinona 28%
6.6%
Catecol 76% QTN-100
Resorcinol + Hidroquinona 100% 8%
Catecol 100%
Resorcinol + Hidroquinona 58% QTN-Fe(1)
Hidroquinona 28%
18.6%
Catecol 40%
Catecol + Resorcinol +
Hidroquinona 60% QTN-Fe(2)
Resorcinol + Hidroquinona 10%
20%
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
Os resultados da separação dos compostos desta série, quando a sílica gel foi
empregada como fase estacionária, refletiu os resultados com os experimentos de
cromatografia de camada delgada, isto é, os três compostos apresentam praticamente o
mesmo Rf, portanto nos experimentos de cromatografia de coluna aberta, fase normal, estres
são eluidos simultaneamente. Este mesmo comportamento, também foi relatado por
SHARMA et al. (1998). O aumento da proporção composto:adsorvente não resultou numa
melhora da eficiência da separação, tabela 5, sendo que essa eficiência só foi atingida quando
foi aumentado o leito cromatográfico, (tabela 6). Em ambos os casos, o rendimento dos
compostos na forma pura foi muito baixo. Este mesmo comportamento foi observado para a
QTN-100, conforme mostrados nas tabelas.
Quando são comparadas as porcentagens, tanto de recuperação quanto de compostos
retidos nos suportes cromatográficos QTN-100 e QTN-Fe(1) observa-se uma melhor eficiência
para este último. Sabendo-se que o Fe apresenta uma alta afinidade por oxigênio
49
FERNADEZ-SALINERO et al. (1999), sugeriram que a melhor eficiência do suporte que
apresentasse tal íon imobilizado em sua superfície seria devido a sua interação com as
hidroxilas fenólicas. Trabalhos anteriores demonstraram que a interação do Catecol com o
suporte envolve a interação de uma molécula do composto com um centro metálico,
ocorrendo tal fato devido à proximidade das hidroxilas (posição 1,2-). Os compostos
Resorcinol e Hidroquinona apresentam um espaçamento maior entre suas hidroxilas (posição
1,3- e 1,4-, respectivamente) sugerindo desta forma que a interação ocorra entre uma
molécula e dois centros metálicos; este fato pode ser atribuído à maior retenção destes
compostos, principalmente quando o polímero apresenta uma maior quantidade de íons
adsorvidos como é o caso do polímero QTN-Fe(2).
5.2.3 Terceira série de compostos: 4-Bromofenol, 4-Clorofenol e 3,4-
Diclorofenol
Ressalta-se, que para a terceira série contendo compostos halofenólicos, não foi
possível a separação, pois a mistura dos compostos foi coletada nas primeiras frações de
eluente. Este fato ocorreu mesmo alterando a natureza e a polaridade do sistema de solvente.
De acordo com RHEE et al. (1998), a principal interação, entre a QTN e a quitosana
em sistema aquoso, ocorre devido a formação de ligações de hidrogênio entre estes fenóis e
átomos eletronegativos do adsorvente incluindo grupos hidroxilas e amino. Os resultados
mostraram uma relação direta entre a acidez do composto e a quantidade de substância
adsorvida, por exemplo, quanto menor o pKa maior a capacidade de adsorção, mais
pronunciada na quitosana, uma vez que o composto é mais hidrofilico, devido a presença de
grande quantidade de NH2 livre, portanto as pontes de hidrogênio são mais intensas.
Os resultados obtidos para o sistema não aquoso, revelaram que a acidez dos
compostos não teve influência na separação nos adsorventes empregados. A recuperação total
dos compostos e a eluição nas primeiras frações, ou seja, com polaridade de solvente baixa,
mostrou que não ocorreu interação entre o adsorvente e o composto. Conforme relatado por
RODRIGUEZ et al., (2000), a interação entre um determinado composto e o adsorvente
também está relacionado com a polaridade do composto. Desta forma, se o composto tem
baixa polaridade ele não interage fortemente com adsorventes polares. Nesta série os
compostos 4-bromofenol, 4-clorofenol e o 3,4-diclorofenol apresentam Log Ko/w igual a
2,59, 2,39 e 3,33 respectivamente.
50
Outra indicação relacionada com a pouca interação entre os compostos desta série e
os polímeros QTN-Fe(1) e QTN-Fe(2), pode ser observada no processo de revelação nas placas
de CCD. A forte coloração preta, característica das reações entre o revelador FeCl3 e os
compostos fenólicos, não foi observada.
5.2.4 Quarta série de compostos: 4-Nitrofenol e 4-Aminofenol
Os resultados demonstrados nas tabela 7, 8 e 9 apresentam o comportamento
cromatográfico e as porcentagens de recuperação e de composto retido nos diferentes
polímeros, tendo como variação a relação composto:polímero 1:25, 1:50 e aumento do leito
cromatográfico, respectivamente.
A quantidade inicial dos compostos para os procedimentos cromatográficos tendo
como relação composto:adsorvente 1:25 foi de 50 mg de cada composto, já para a relação
1:50 e maior leito essa quantidade inicial foi de 25 mg de cada composto.
51
Tabela 7: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quarta série, frente aos
diferentes polímeros. Relação composto:adsorvente 1:25
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de comp. recuperado*
% de comp. retido no
polímero** 4-nitrofenol 88%
Sílica 4-aminofenol 74%
19%
4-nitrofenol 60%
4-nitrofenol + 4-aminofenol 42% QTN-100
4-aminofenol 40%
8%
4-nitrofenol 82%
4-nitrofenol + 4-aminofenol 19% QTN-Fe(1)
4-aminofenol 68%
6%
4-nitrofenol 62%
4-nitrofenol + 4-aminofenol 1% QTN-Fe(2)
4-aminofenol 82%
27%
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
Tabela 8: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quarta série, Frente aos
diferentes polímeros. Relação composto:adsorvente 1:50
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de comp. recuperado*
% de comp. retido no
polímero** 4-nitrofenol puro 48%
4-nitrofenol + 4-aminofenol 14% Sílica
4-aminofenol 16%
54%
4-nitrofenol puro 36%
4-nitrofenol + 4-aminofenol 32% QTN-100
4-aminofenol 44%
28%
4-nitrofenol puro 96% QTN-Fe(1)
4-aminofenol 88% 8%
4-nitrofenol puro 92% QTN-Fe(2)
4-nitrofenol + 4-aminofenol 88% 6%
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
52
Tabela 9: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quarta série, frente aos
diferentes polímeros. Leito cromatográfico de 25 cm.
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de comp. recuperado*
% de comp. retido no
polímero** 4-nitrofenol 100%
Sílica 4-aminofenol 52%
24%
4-nitrofenol 24%
4-nitrofenol + 4-aminofenol 46% QTN-100
4-aminofenol 56%
14%
4-nitrofenol 32%
4-nitrofenol + 4-aminofenol 2% QTN-Fe(1)
4-aminofenol 52%
56%
4-nitrofenol 80% QTN-Fe(2)
4-nitrofenol + 4-aminofenol 34% 26%
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto * Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
Os resultados obtidos com esta série de compostos, apresentados nas tabelas 7, 8 e 9,
revelaram que a sílica foi o adsorvente que apresentou uma maior porcentagem de
recuperação dos compostos na forma pura, para este adsorvente não foi observado a mistura
dos compostos.
Diferindo do observado para as séries 1 e 2, o aumento da proporção
composto:polímero, resultou na diminuição da eficiência da QTN-100, tabelas 8 e 9.
Provavelmente estes resultados estão relacionados com as condições de eluição. A diminuição
da velocidade de eluição permite que ocorra uma interação muito forte entre o adsorvente e os
compostos, resultando na sua retenção. O aumento do leito cromatográfico não altera o
desempenho do adsorvente.
Com esta série de compostos a presença do íon Fe no polímero QTN provoca uma
melhora no desempenho da separação. Para o composto 4-Nitrofenol, de maneira geral, pode-
se observar que sua porcentagem de recuperação na forma pura foi maior, indicando assim,
uma menor interação com o polímero. De acordo com EDER et al. (1998) a pequena
interação com o polímero, pode estar relacionado ao fato do composto apresentar a
capacidade de formar pontes de hidrogênio intramolecular.
53
O aumento na proporção composto:adsorvente para o QTN-Fe(1) e QTN-Fe(2), resultou
numa melhora considerável no rendimento dos compostos na sua forma pura. Por outro lado,
o aumento do leito cromatográfico resultou na diminuição da eficiência, tanto na qualidade
dos compostos quanto na quantidade retida na superfície polimérica. Estes resultados podem
ser atribuídos a cinética de adsorção, isto é, quanto maior o tempo de contato, mais forte é a
interação entre o adsorvente e o composto.
Este comportamento também foi observado por FERNADÉZ-SALINERO et al.
(1999), na separação de compostos nitrofenólicos utilizando adsorventes contendo Fe(III).
Segundo os autores quando os compostos não estão ionizados, várias interações podem estar
envolvida no processo de separação entre as quais: pontes de hidrogênio, formação de
complexo, dipolo:dipolo e dispersão. Segundo estes mesmos autores a presença de Fe foi
fundamental no processo de separação de tais compostos.
5.2.5 Quinta série de compostos: 4-metilfenol, 5-metilresorcinol e 4-
metoxifenol
Os resultados demonstrados nas tabelas 10, 11 e 12 apresentam o comportamento
cromatográfico e as porcentagens de recuperação e de composto retido nos diferentes
polímeros, tendo como variação a relação composto:polímero 1:25, 1:50 e aumento do leito
cromatográfico, respectivamente.
A quantidade inicial dos compostos para os procedimentos cromatográficos tendo
como relação composto:polímero 1:25 foi de 50 mg de cada composto, para a relação 1:50 e
maior leito essa quantidade inicial foi de 25 mg de cada composto.
54
Tabela 10: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quinta série, frente aos
diferentes polímeros. Relação composto:adsorvente 1:25
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de comp. recuperado*
% de comp. retido no
polímero** 4-metilfenol + 4-metoxifenol 29%
Sílica 5-metilresorcinol 72%
43,3%
4-metilfenol + 4-metoxifenol 58% QTN-100
5-metilresorcinol 76% 36%
4-metilfenol + 4-metoxifenol 81% QTN-Fe(1)
5-metilresorcinol 76% 20,6%
4-metilfenol + 4-metoxifenol 70% QTN-Fe(2)
5-metilresorcinol 56% 34.6%
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
Tabela 11: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quinta série, frente aos
diferentes polímeros. Relação composto:adsorvente 1:50
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em mistura)
% de comp. recuperado*
% de comp. retido no
polímero** 4-metilfenol + 4-metoxifenol 28%
Sílica 4-metilfenol + 5-metilresorcinol
46% 50,6%
4-metilfenol + 4-metoxifenol 44% QTN-100
5-metilresorcinol 100% 37,3%
4-metilfenol + 4-metoxifenol 70% QTN-Fe(1)
5-metilresorcinol 100% 20%
4-metilfenol + 4-metoxifenol 62% QTN-Fe(2)
5-metilresorcinol 68% 36%
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
55
Tabela 12: Separação cromatográfica dos compostos fenólicos da quinta série, frente aos
diferentes polímeros. Leito cromatográfico de 25 cm.
Polímero em estudo Compostos coletados (na forma pura ou em
mistura)
% de comp. recuperado*
% de comp. retido no
polímero** 4-metilfenol + 4-metoxifenol 28%
Sílica 5-metilresorcinol 76%
56%
4-metilfenol + 4-metoxifenol 20% QTN-100
5-metilresorcinol 100% 60%
4-metilfenol + 4-metoxifenol 30% QTN-Fe(1)
5-metilresorcinol 80% 53.3%
4-metilfenol + 4-metoxifenol 20% QTN-Fe(2)
5-metilresorcinol 48% 70.6%
OBS. * Em relação a quantidade inicial de cada composto ** Em relação a quantidade inicial da mistura dos compostos
Os resultados da separação dos compostos desta série revelaram, que grande
quantidade dos compostos 4-metilfenol e 4-metoxifenol ficaram retidos em todos os
adsorventes. Outra observação importante foi que estes compostos não foram separados em
nenhum dos adsorventes empregados. Experimentos de CCD mostraram, usando placas de
sílica, mostraram que estes compostos apresentam o mesmo RF, portanto tem polaridade
muito próxima frente à este adsorvente.
Também nesta série os adsorventes poliméricos apresentaram melhor eficiência na
separação quando comparado com a sílica, tabela 11.
A QTN-100 foi o polímero mais eficiente na separação do 5-metilresorcinol. A
presença de íon Fe no polímero QTN, também melhorou o rendimento principalmente no
polímero QTN-Fe(1), por outro lado, o aumento da quantidade de tal íon, como no caso do
polímero QTN-Fe(2), ocorreu uma diminuição da eficiência de separação. Estes resultados
reforçam a influência do íon metálico no processo de adsorção, pois o 5-metilresorcinol
apresenta duas hidroxilas no anel aromático, as quais interagem com o Fe, tendo como
resultado a sua separação.
Observa-se ainda uma grande quantidade de 4-metilfenol e 4-metoxifenol retida na
coluna cromatográfica, quando foi empregado o polímero QTN-100 como adsorvente,
principalmente com o aumentado a razão adsorvente:compostos 1:50 e aumento do leito
56
cromatográfico. Estes resultados revelam forte interação entre estes compostos e os grupos
acetamida da QTN-100, mostrando que a polaridade do composto por si só não é a principal
responsável pela retenção, uma vez que tanto o 4-metilfenol e o 4-metoxifenol são menos
polares que o 5-metilresorcinol, conforme mostraram os experimentos de CCD.
5.3 Adsorção dos compostos ao polímero QTN-Fe
5.3.1 Deslocamento de íons cloreto
Para verificar um possível deslocamento dos íons cloreto, coordenados ao Fe
adsorvido ao polímero QTN, quando em contato com uma solução contendo os compostos
fenólicos, foram realizados experimentos de adsorção. A quantidade de cloreto deslocada pelo
composto foi calculada pela diferença entre a quantidade inicialmente presente no polímero e
a quantidade que ficou no polímero após o processo de adsorção. Neste experimento foi
escolhido o QTN-Fe(2) por apresentar a melhor capacidade de retenção dos composto
fenólicos, conforme resultados mostrados anteriormente. A quantidade de cloreto inicialmente
presente no polímero foi de 73,9 mg/g.
A porcentagem de íons cloreto deslocado pelos compostos em estudo está
demonstrado na tabela 13.
Tabela 13: Porcentagem de íons cloreto deslocados pelos compostos em estudo
QTN-Fe-composto Quantidade de Cl- deslocados
(mg/g)
% de Cl- deslocado
QTN-Fe-fenol 57,40 77,6 QTN-Fe-catecol 41,62 56,3 QTN-Fe-resorcinol 46,50 62,9 QTN-Fe-hidroquinona 21,98 29,7 QTN-Fe-pirogalol 43,20 58,4
Como pode ser observado ocorreu o deslocamento do cloreto após o contato com o
composto, estes resultados sugerem que a adsorção dos compostos à superfície do polímero
cromatográfico QTN-Fe pode estar ocorrendo através da interação do composto ao íon Fe
57
imobilizado ao polímero, enquanto os ligantes mais fracos, tais como os íons cloreto são
deslocados. O composto que deslocou a maior porcentagem de íons cloreto foi o fenol,
sugerindo uma forte interação deste à superfície do polímero.
Cabe salientar que não existe uma relação direta entre os resultados dos
experimentos de adsorção em banho e adsorção na coluna, uma vez que diferentes fatores
governam cada processo de adsorção entre os quais: cinética de adsorção, velocidade de
eluição e de agitação, tempo de contato do composto com o adsorvente, quantidade de
adsorvente, entre outros.
5.3.2 Espectro de Infravermelho
A figura 8 apresenta os espectros de IV do polímero QTN-Fe(2) e QTN-Fe(2) após o
processo de adsorção com os compostos catecol, pirogalol e fenol.
58
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 8: Espectro de IV do polímero QTN-Fe(2)(a), QTN-Fe(2) –cat(b),
QTN-Fe(2) –pir(c) e QTN-Fe(2) –fen(d), respectivamente.
Ao comparar os espectros de IV do polímero que apresenta os compostos desta série
(b, c, e d) com o espectro de IV do polímero QTN-Fe(2)(a), pode-se observar a intensificação
da banda na região de 1650 cm-1, esta intensificação pode ser atribuída a presença do grupo
C=C, presente nos compostos aromáticos. Ressalta-se ainda o alargamento da banda na região
de 3500 cm-1, este alargamento ocorre devido a presença da hidroxila fenólica.
59
A figura 9 apresenta os espectros de IV do polímero QTN-Fe(2) e QTN-Fe(2) após o
processo de adsorção com os compostos catecol, pirogalol e fenol.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 9: Espectro de IV do polímero QTN-Fe(2)(a), QTN-Fe(2) –cat(b),
QTN-Fe(2) –hid(c) e QTN-Fe(2) –res(d), respectivamente.
Ao comparar os espectros de IV dos compostos desta série, com o espectro de IV do
polímero QTN-Fe(2), pode-se observar a intensificação da banda na região de 1650 cm-1, esta
intensificação pode ser atribuída a presença do grupo C=C, presente nos compostos
aromáticos. Ressalta-se ainda, o alargamento da banda na região de 3500 cm-1, o qual ocorre
devido a presença da hidroxila fenólica.
60
A figura 10 apresenta os espectros de IV do polímero QTN-Fe(2) e QTN-Fe(2) após o
processo de adsorção com os compostos 4-nitrofenol e 4-aminofenol.
(a)
(b)
(c)
Figura 10: Espectro de IV do polímero QTN-Fe(2)(a) QTN-Fe(2) –nitro(b)
e QTN-Fe(2) –amino(c), respectivamente.
Ao comparar os espectros de IV do polímero que apresenta o composto 4-
Aminofenol (c) com o espectro de IV do polímero QTN-Fe(2)(a), pode-se observar a
intensificação da banda na região de 3600 cm-1, esta intensificação pode ser atribuída ao
grupo N-H, presente neste composto.
61
A figura 11 apresenta os espectros de IV do polímero QTN-Fe(2) e QTN-Fe(2) após o
processo de adsorção com os compostos 4-metoxifenol e 4-metilfenol.
(c)
(b)
(a)
Figura 11: Espectro de IV do polímero QTN-Fe(2) (a), QTN-Fe(2) –metoxi(b)
e QTN-Fe(2) –metil(c), respectivamente.
Ao comparar os espectros de IV do polímero QTN-Fe(2) tendo os compostos 4-
metilfenol e 4-metoxifenol adsorvidos, com o espectro de IV do polímero QTN-Fe(2), pode-se
observar uma pequena alteração região de 1650 cm-1, esta alteração pode estar ocorrendo pela
presença do grupo alquenila C=C, presente nos compostos aromáticos. Outra alteração ocorre
com o alargamento da banda na região de 3500 cm-1, principalmente para o composto 4-
metilfenol, ocorrendo devido a presença da hidroxila fenólica.
62
6 CONCLUSÕES
Na análise do sistema cromatográfico utilizando o polímero QTN-Fe contata-se que
o mecanismo de interação, para a separação de compostos fenólicos é através de interações da
OH fenólica com o centro metálico Fe, enquanto ligantes fracos como íons cloreto, são
deslocados. A capacidade de retenção dos compostos a serem separados está diretamente
relacionada com a quantidade de íons Fe adsorvidos, sendo que quanto maior o número de
centros metálicos para interagirem, maior será a quantidade de compostos retidos. Portanto,
polímeros que apresentam uma quantidade elevada de centros metálicos imobilizados à sua
superfície, como o QTN-Fe(2), não são suportes cromatográficos eficientes, pois dificultam a
separação retendo os compostos em sua superfície. Com isto, estes polímeros apresentam uma
especial aplicação para a pré-concentração de ânios e compostos fenólicos através de SPE.
Na análise do sistema cromatográfico utilizando o polímero QTN-100 verifica-se que
este polímero apresenta comportamento semelhante ao da sílica gel, difirindo Apenas no
mecanismo de retenção, enquanto na sílica a retenção é devido a polaridade, na QTN-100 a
retenção pode ser atribuída à presença dos grupos acetamida, pois tais grupos podem estar
formando pontes de hidrogênio com a hidroxila fenólica dos compostos fenólicos. A
velocidade de eluição influencia diretamente a eficiencia da separação. Ainda, constatou-se
uma dificuldade de separação cromatográfica de compostos fenólicos que apresentam Rf
próximos.
Para compostos fenólicos não substituídos, como o catecol, hidroquinona, resorcinol e
pirogalol, o aumento do leito cromatográfico de 10cm para 25cm, melhora significativamente
a eficiência de separação. Este fato ocorreu independentemente do adsorvente utilizado
Ressalta-se ainda que a diferença observada na porcentagem de recuperação do mesmo
composto entre diferentes séries pode estar indicando que ocorre uma interação entre
compostos.
63
7 – REFERÊNCIAS
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