Estafilococos y betalactmicos,aminoglicsidos, macrlidos y

glicopptidos

E. Cercenado y M.I. Morosini

Estafilococosb-lactmicos: mecanismo de accin

Unin e inactivacin de las PBPs

Actividad bactericida

Mecanismos de resistencia abeta-lactmicos en estafilococos

Resistencia a penicilinas: produccin de beta-lactamasa (penicilinasa)

Resistencia a penicilinas estables a penicilinasa(resistencia a meticilina):

- Bajo nivel: Hiperproduccin de beta-lactamasa Aumento de niveles de PBPs intrnsecas Reduccin de afinidad de unin a PBPs- Alto nivel: Expresin de nueva PBP: PBP2a (gen mecA)

Resistencia a meticilina (oxacilina)

Gen mecA:- Cromosmico- Expresin constitutiva o inducible- Expresin homognea- Expresin heterognea

OXA

Leyendas

PEN: PenicilinaAMP: AmpicilinaPIP: PiperacilinaOXA: OxacilinaCEF: CefalotinaCXM: CefuroximaCTX: CefotaximaFOX: CefoxitinaCTZ: CeftazidimaAMC: Amoxicilina - c. clavulnicoFEP: CefepimaATM: AztreonamIMP: ImipenemAmox/Clav: Amoxicilina - c. clavulnicoPiper/Tazo: Piperacilina - Tazobactam

Fenotipo: Raro: 50%

CIM: Concentracin Inhibitoria Mnima.Real: Interpretacin directa del dimetro deinhibicin o de la CIM obtenidas.Interpr: Resultado de la lectura interpretadadel antibiograma.

S: Sensible.r: Sensibilidad disminuida respecto alfenotipo salvaje.R: Resistente.

Estafilococos: resistencia natural- Sensible a todos los beta-lactmicos y carbapenemas- Resistente a aztreonam

PenicilinaOxacilina (S. aureus)Oxacilina(S. coagulasa negativa)

0,032

0,25

CIMSS

S

InterprSS

S

Real

Fenotipo poco frecuente

Staphylococcus spp.

FOXIMP

CTX PEN

AMP

A/C OXA CEF

Comentarios Se debe utilizar penicilina para determinar la

sensibilidad de estafilococos a penicilinas lbilesa penicilinasa: ampicilina, amoxicilina,azlocilina, carbenicilina, mezlocilina,piperacilina y ticarcilina.

Los estafilococos sensibles a penicilina sontambin sensibles a otras penicilinas,combinaciones de beta-lactmico/inhibidor debeta-lactamasa, cefalosporinas y carbapenemas.

La sensibilidad a penicilina implica sensibilidada todos los beta-lactmicos.

Estafilococos: produccin de penicilinasa- Resistente a todas las penicilinas lbiles a la penicilinasa- Sensible a penicilinas estables a la penicilinasa

PenicilinaOxacilina (S. aureus)Oxacilina(S. coagulasa negativa)

>0,25

2

0,25

CIMRS

S

InterprRS

S

Real

Fenotipo muy frecuente

Staphylococcus spp.

beta-lactamasa - +

PEN AMP

CTX OXA

CEF

A/C FOX IMP

Comentarios Una CIM de penicilina de 0,03 mg/L

generalmente implica ausencia de produccinde beta-lactamasa.

Si la CIM est entre 0,06 y 0,12 mg/L puedeproducir o no producir beta-lactamasa, y se deberealizar una prueba de deteccin de beta-lactamasa previa induccin con penicilina.

Una prueba de beta-lactamasa positiva prediceresistencia a todas las penicilinas lbiles apenicilinasa.

Produccin de mecA (PBP2a)- Resistente a meticilina- Resistente a todos los beta-lactmicos

PenicilinaOxacilina (S. aureus)Oxacilina(S. coagulasa negativa)

>0,25

>2

>0,25

CIMRR

R

InterprRR

R

Real

Fenotipo frecuente

Staphylococcus spp.Medio oxacilina-sal-agar (slo para S. aureus)

PEN AMP

OXA CEF

CTX

FOX A/C IMP

Comentarios La resistencia a oxacilina mediada por el gen mecA

implica resistencia a todos los beta-lactmicos, a todaslas combinaciones de beta-lactmico/inhibidor debeta-lactamasa y a carbapenemas.

La CIM de oxacilina puede oscilar entre 4 y >256 mg/L(S. aureus) y entre 0,5 y >256 mg/L (S. coagulasanegativa).

La sensibilidad o resistencia de estafilococos a los beta-lactmicos se puede deducir de los resultados de laspruebas de sensibilidad a penicilina y a oxacilina, porlo que no es necesario realizar pruebas frente a otrosbeta-lactmicos.

Hiperproduccin de penicilinasa, alteraciones enPBPs, resistencia heterognea a meticilina- Principalmente en S. aureus- Aislados borderline

Staphylococcus spp.:resistencia heterognea a oxacilina

Fenotipo raro

PenicilinaOxacilina (S. aureus)

CIM RealRR

InterprRr/R

>0,25

2-8

FOX

OXA

Comentarios Los aislados hiperproductores de beta-lactamasa o con

alteraciones en las PBPs presentan resistencia homogneaborderline a meticilina.

Se comportan como resistentes a meticilina, pero no poseen elgen mecA.

Presentan un moderado nivel de resistencia a cefalosporinas ypor ello no se recomienda su utilizacin.

Para diferenciarlos de los productores de mecA de expresinheterognea se requieren pruebas adicionales: deteccin del genmecA, de la PBP2a o prueba de screening en el mediooxacilina-sal-agar.

Todos los estafilococos frente a los cuales la CMI de oxacilina es 4 mg/L se deben informar como resistentes a oxacilina.

Otros mtodos de deteccin de resistencia ameticilina mediada por mecA

- Mtodo de difusin con discos- Discos de cefoxitina de 30 mg

Staphylococcus spp.

Cefoxitina(S. aureus y S. lugdunensis)

Cefoxitina(S. coagulasa negativa)

mm halo Real Interpr

R R

R R

19

24

FOX

Sensible a meticilina

Resistente a meticilina

FOX

FOX

Interpretacin de la resistencia a meticilinaen Staphylococcus saprophyticus:

comentarios- Los criterios del NCCLS paraesta especie pueden implicarfalsa resistencia a meticilina.- Es necesario detectar el gen mecA o la PBP2a.- Si son mecA o PBP2a negativo pero la CIM es 4 mg/L se

deben interpretar como resistentes a meticilina.

CIM NCCLS RealOxacilina 0,5-2 R S/ROxacilina 4 R R

Staphylococcus saprophyticus

Interpretacin de la resistencia a meticilinaen Staphylococcus lugdunensis: comentarios

- En S. lugdunensis no se aplican losmismos criterios que para otrosestafilococos coagulasa negativa.

- En S. lugdunensis, la resistencia a cefoxitina (disco de 30 mg, 19 mm de

halo) predice la resistencia a oxacilinamediada por mecA.

- Si son mecA o PBP2a negativo pero la CIM es 4 mg/L se deben interpretarcomo resistentes a meticilina.

CIM NCCLS RealOxacilina 0,5-2 S SOxacilina 4 R R

Staphylococcus lugdunensis

Glicopptidos: mecanismo de accin

Unin a las cadenas D-alanil-D-alanina

del pptidoglicano o de sus precursores

Previenen el entrecruzamiento de la

cadena del pptidoglicano

Mecanismos de resistencia a glicopptidos Resistencia de alto nivel: S. aureus Produccin del gen vanA (ligasa VanA, D-alanil-

D-lactato, baja afinidad por glicopptidos) Fenotipo VanA VRSA Resistencia de bajo nivel: (S. aureus, S. coagulasa

negativa) Sensibilidad disminuida a glicopptidos Resistencia heterognea Engrosamiento de la pared (*) Subpoblaciones de lento crecimiento VISA, GISA, VI-SCN, GI-SCN

*

Estafilococos: resistencia mediada por vanA

Gen vanA en Tn1546 Plasmdico Resistencia de alto nivelJulio 2002 Michigan: 1 SARM-VRSA CMI vancomicina >128 mg/ml y teicoplanina 32 mg/ml: gen vanA

Septiembre 2002 Pensilvania: 2 SARM-VRSA CMI vancomicina 64 mg/ml y teicoplanina 8 mg/ml : gen vanA

Octubre 2004 Nueva York: 3 SARM-VRSA CMI vancomicina 64 mg/ml: gen vanA

Estafilococos: resistencia mediada por vanA- Resistente a vancomicina y teicoplanina- Sensibles a linezolid, minociclina, cotrimoxazol, rifampicina

VancomicinaTeicoplanina (S. aureus)

64->128

4-32

CIMRR

InterprRr/R

Real

VRSAFenotipo muy raro

Staphylococcus aureus. Tenover et al. AAC 2004; 48: 275-280

Comentarios La resistencia a vancomicina mediada por el

gen vanA implica resistencia a vancomicina y ateicoplanina.

Solamente se ha descrito en aislados de SARM. Los sistemas automatizados no detectan este

tipo de resistencia. Para su deteccin se recomienda utilizar una

placa de agar BHI con 6 mg/L de vancomicina.

Resistencia heterognea a glicopptidos- S. aureus y Staphylococcus coagulasa negativa- Difusin con disco: muy baja sensibilidad de deteccin- Generalmente CIM de teicoplanina superior a la de vancomicina

Staphylococcus spp.

VancomicinaTeicoplanina

CIM RealRR

Interpr 8-16

16

r r

GISA, GI-SCN Fenotipo raro

Estafilococos: resistencia heterognea a glicopptidos

- Estudiar aislados con CMI 4 mg/ml- Aumento del inculo (2 McFarland) para detectarla- Anlisis poblacional

Staphylococcus spp.

2 McFarland

0,5 McFarland

Vancomicina 1 mg/L 2 mg/L

3 mg/L 4 mg/L Cortesa Dra. J. Liares

- Dilucin de cultivos

(107, 106, 105, 104, 103, 102 ufc)

- Siembra en agar BHI +vancomicina a diferentes concentr.

(0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 8 mg/L)

- Recuento de colonias a las 48 h.

0.5 1

2

3

4 5 6 8 12

0.5 1

2

3

4

5 6 8 12

0.5 1

2

3 4 5 6 8 12

0.5 1

2

3

4 5

6 8 12

0.5

1

2

3

4

5

6 8 12

0.5 1 2

3

4

5

6 8

120

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0.5 1 2 3 4 5 6 8 12Vancomicina (mg/L)

log

CFU

/ml

MRSA 9MRSA 4MRSA 5MRSA 8MRSA 1MRSA 2

Estafilococos: resistencia heterognea a glicopptidos

Anlisis poblacional de GISA (PAP: population analysis profile)

Comentarios La resistencia heterognea a glicopptidos en

estafilococos es poco frecuente y difcil dedetectar con los mtodos de rutina.

Su deteccin debe realizarse con alto inculo (2de McFarland) y E-test o mediante anlisispoblacional en aislados con CIM devancomicina de 4 mg/L.

El mtodo de difusin con discos nunca debeutilizarse para detectarlos.

Macrlidos - Cetlidos

Lincosamidas - Estreptograminas

OOR

O

O

O

O

O

O

N

O

O

O

O

OO

O

O

O

O

O

O

O

N

N

O

O

O

O

Eritromicina (R=H)Claritromicina (R=CH3) Azitromicina (15C)

Tilosina (16C)ONO

OO

O

OO

O

OO

O

OO

O

OO

O

(14C)

Macrlidos

NO

O

O

O

O

N

O

O

O

N

O

O

N

N

Telitromicina

Cetlidos

O

4

N

3O

R

2

S

O

O

O

N

N

O

O

O

N

O

O

N

O

O

N

O

N O

N

O

O

O

O

NO

N

NO

ON

O

R1

R2

R1

R2

BEstreptograminas

Lincosamidas

A

Mecanismo(s) de Accin - Unin a subunidad 50S ribosomal: 23S ARNr: centro peptidiltransferasa - Unin Reversible - Inhibicin sntesis proteica (transpeptidacin, translocacin) - En el caso de los macrlidos: inhibicin de la sntesis proteica + inhibicin de la formacin de la subunidad 50S - Bacteriostticos / Bactericidas: microorganismo fase del crecimiento

condiciones de crecimiento (pH) tiempo de exposicin

concentracin Macrlidos-Lincosamidas: tiempo / CMI - PFD Azitromicina-Telitromicina-Quin-Dalf(QD): AUC24 / CMI

Mecanismos de resistencia en EstafilococosAlteracin de la diana (ribosoma)

- Enzimtica: metilacin 23S ARNr (erm): iM(C)LSB, cMCLSB - Mutacional: genes rrl (5-6 copias) y/o gen rplV (L22)/rplD (L4)

Bombas de Eflujo

- msr: M14-15- SB - mef, erp : M14-15 - vga: SA

Modificacin Enzimtica

- nucleotidiltransferasa (L), liasa (SB), acetiltransferasa (SA),

fosfotransferasa (M14-15(16)), esterasa (M14)

Codificacin Gentica: Plsmidos-Transposones Diseminacin

* Coexistencia de diferentes mecanismos de resistencia

Patrones de Resistencia en Estafilococos

MECANISMO

ERI AZI SPI TEL CLI SB SA SAB RESISTENCIA FENOTIPO

S S S S S S S S - SENSIBLE

R R S/R S/R S/R S/R S S erm(A, C, B, Y) iM(C)LSB

R R R R R R S S * erm(A, C, B, Y) cMCLSB

I/R I/R S S S S/R S S msr(A, B) MSB

R R S S S S S S mef(A), erp(A)** M

S S S S S S R s/R vga(A,Av,B), vat (A, B, C) SA/SAB

* Bacteriosttico ** slo en SCN

Patrones de Resistencia en Estafilococos (cont.)

MECANISMO

ERI AZI SPI TEL CLI SB SA SAB RESISTENCIA FENOTIPO

S S S S S R S S vgb(A, B) SB

S S S S s/I/R S S S lnu(A, A) L

R S S S S S S S ere(B) M14

I/R I/R I/r S S S S S mph(C) M14 -15 (16)

R R I/R ND I/R I/R S/I S/r rrl, rplV, rplD MLSB(SAB)

R R R R S R R R rplV MCSAB

ND: no determinado

iM(C)LSB

SB

iM(C)LSB

SB

cMCLSB

SB

msr(A)Bomba de eflujo

SB

Bomba de eflujo vga(A, B) Inactivacin vat(A, B, C)

SB

Inactivacin vgb(A, B)

SB

Inactivacin lnu(A, A)

SB

ComentariosGnero Staphylococcus

Los SCN son ms resistentes a MCLSB que S. aureus

(el fundamento de la resistencia es el mismo: difieren los genes y su incidencia)

S. aureus: SARM: predominio de erm(A) de expresin constitutiva

SASM: predominio de erm(C) de expresin inducible

La resistencia iM(C)LSB slo se detecta por el mtodo de difusin con discos

(15-20 mm): ERIR- CLIS: inducible: fallo clnico con CLI ERIR- CLIS: no inducible (bomba): utilidad clnica de CLI

(Este fenotipo se puede detectar por microdilucin si se dispone de un M16)

Slo inducen M14 y M15. Si se dispone, probar M16, SA y SB: deteccin de otros

mecanismos (ej. LSA)

Variacionesgeogrficas

Comentarios (cont.)

Es frecuente la seleccin de cM(C)LSB a partir de iM(C)LSB (induc. M14- M15)

La expresin constitutiva de erm suprime completamente la actividad de loscetlidos y limita la actividad de las estreptograminas (QD: bacteriosttico)

No asumir sensibilidad 100% a QD: existen diversos fenotipos minoritariosque deben confirmarse

Considerar la posibilidad de mecanismos asociados (Lina et al. AAC 1999, 43:1062-66)

Relevancia clnica-incidencia global

70-90% metilasas (> 80% constitutiva en METIR)

30-10% bombas-enzimas inactivantes

< 1% mutaciones ribosomales

Aminoglicsidos

Aminoglicsidos- Clasificacin

ENLACES GLUCOSDICOS

AMINOAZCARES AMINOCICLITOL

ESTREPTIDINA DESOXIESTREPTAMINA

ESTREPTOMICINA 4,6 4,5

KANAMICINA GENTAMICINA NEOMICINA

AMICACINA NETILMICINA PAROMOMICINA TOBRAMICINA SISOMICINA DIBEKACINA ISEPAMICINA

ARBEKACINA

Mecanismo de Accin - Unin a subunidad 30S ribosomal: 16S ARNr

(Estreptomicina: 16S ARNr + protena S12)

- Unin Irreversible

- Alteracin de la traduccin y lectura errnea de codones

Terminacin prematura. Protena naciente aberrante

- Bactericidas

- PFD: Cmax / CMI

Mecanismo de Resistencia en Estafilococos

Modificacin Enzimtica- N-Acetiltransferasas (AAC): NH2 Donante: Acetil-CoA

- O-Nucleotidiltransferasas (ANT): OH Donante: ATP

- O-Fosfotransferasas (APH): OH Donante: ATP

* Coexistencia de diferentes enzimas Codificacin gentica: Plsmidos (conjugativos, movilizables) Transposones conjugativos (cromosomas/plsmidos)

Diseminacin

KANAMICINA B

Patrones de Resistencia en Estafilococos

STR GEN TOB AMK KAN NET ENZIMA

S S S S S S -

S R R R R R AAC(6)-APH(2)*

S S R r/R R S ANT(4)-(4)

S S S S/R R S APH(3)-III

R S S S S S ANT(6)

R S S S/R R S ANT(6) + APH(3)-III

* Bifuncional

AAC(6)-APH(2)

ANT(4)(4)

APH(3)-III

ComentariosLa presencia de la enzima bifuncional puede enmascarar la presencia de

otras enzimas inactivantes

Ensayar otros aminoglicsidos /PCR/hibridacin

Perfil poblacional de resistencia a aminoglicsidos: valor epidemiolgico

EARSS 2000/02 disminucin de gentamicinaR en S. aureus invasivos:

16.6% 9.7% (Campos et al. JAC 2004, 53:1033-38)

Cambio en la prevalencia de enzima inactivante en SARM (prdida Tn 4001)

De: AAC(6)-APH(2): GRKRARTR a: [ANT (4)(4)]: GSKRARTR

Nuevos aminoglicsidos de mayor actividad: Arbekacina