Splicing nos SpliceossomasOnde ocorre? O Splicing do mRNA ocorre no Spliceossoma (fig.2) que é composto por proteínas e RNAs. Os componentes de RNA são 5 tipos de small nuclear RNAs (snRNAs) ricos em Uracilo chamados U1,U2,U4,U5 e U6. Estes snRNAs têm entre 107 e 210 nucleotídeos e estão associados a proteínas para formar small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) que têm papel central no processo de Splicing, ou seja, os snRNPs são snRNAs ligados a cerca de 6 e 10 proteínas (algumas comuns a todos, outras específicas de cada um). Os snRNPs U1,U2 e U5 contêm uma única molécula de snRNA, enquanto que o U3 é nucleolar e o U4 e o U6 formam um único complexo de snRNP (podem aparecer por isso com a seguinte notação U4/U6)

Como ocorre? O primeiro passo é a ligação do snRNP U1 à extremidade 5’ do splice site do pré-mRNA. A seguir, o snRNP U2 liga-se ao branch point (ponto de reconhecimento). Ambas as ligações se dão por complementaridade de bases, dado que a sequência de nucleotídeos à volta destas regiões é muito conservada (fig.3). Em seguida, um complexo pré-formado de snRNP U4/U6 + snRNP U5 é incorporado no Spliceossoma. O U5 liga-se ao exão na extremidade 5’ e o U4 dissocia-se do U6. O U4 sai juntamente com o U1 e o U6 liga-se ao U2 para a primeira reacção de transesterificação que converte o intrão numa estrutura em forma de laço (lariat). Entretanto há a clivagem do exão na extremidade 5’ e o U5 passa para a extremidade 3’. Por fim, ocorre a clivagem do exão na extremidade 3’ e a segunda reacção de transesterificação unindo os dois intrões. Os snRNPs dissociam-se do intrão que vai ser degradado e ficam disponíveis para novo processo.

IntroduçãoObjectivo dos Mecanismos de Splicing?

O nosso DNA é constituído por 25 000 genes distribuídos pelos 23 pares de cromossomas.

O DNA é transcrito no núcleo dando origem a um pré-mRNA que posteriormente será processado por vários mecanismos, um dos quais é o Splicing, antes de se tornar num RNA “maduro” ou funcional.

Mas nem todo o DNA codifica proteínas, apenas 5% do DNA total é codificante, os exões. O restante 95% corresponde a DNA que não é codificado que tanto se pode encontrar fora dos genes (sequências não codificantes), como dentro dos genes (intrões). Logo, os mecanismos de Splicing são de extrema importância porque seleccionam as partes codificantes do gene de forma a facilitar a tradução dos péptidos e proteínas nos ribossomas (processo de tradução), pois existem em média, nos humanos, 10 vezes mais intrões que exões.

Qual o papel dos Intrões? Os intrões são variáveis tanto em tamanho como em número e são as partes não codificantes que, após serem retiradas do pré-RNA, são destruídas dentro do núcleo gerando nucleotídeos livres que são reciclados. Pensa-se que a grande quantidade de intrões deve-se à acumulação de genes (outrora importantes) ao longo da evolução, o que não implica forçosamente que os seres mais evoluídos tenham mais intrões que os seres menos complexos. Podem também ter função reguladora ou simplesmente não apresentar qualquer função. Mas desengane-se quem pensa que não têm utilidade, pois é a sua grande diversidade que permite a caracterização individual ou de determinados grupos. Esta diferença na sequência intrónica reflecte a diversidade genética humana, permitindo-nos realizar coisas tão extraordinárias como os testes de paternidade ou a identificação de indivíduos envolvidos em acidentes e crimes.

Qual o papel dos Exões? Os exões constituem o RNA funcional e são sequências semelhantes entre indivíduos, pois codificam as proteínas básicas à sobrevivência humana. Assim, não podem apresentar grande variabilidade, contrariamente aos intrões, porque manifestam-se fenotipicamente, o que significa que qualquer alteração pode tornar-se incompatível com a vida.

Auto-SplicingApesar da na maioria dos eucariontes o Splicing ocorrer nos Spliceossomas, encontra-se também um mecanismo de Auto-Splicing que pode ocorrer no núcleo, nas mitocôndrias, nos cloroplastos e nas bactérias.

Este mecanismo é catalisado pelos seus intrões que agem como uma ribozima (RNA com função catalítica) levando à sua auto-excisão.

Existem dois grupos de Auto-Splicing (fig.4):

Grupo I de Auto-Splicing de IntrõesOnde ocorre? Nos genes nucleares de rRNA de protozoários (exemplo: pré-RNAr de Tetrahymena thermophila).

Como ocorre? Por duas transesterificações, sendo a primeira entre o grupo 3’-hidróxilo do cofactor Guanosina livre (que não é interior à cadeia de RNA) e o Fósforo da extremidade do intrão; e a segunda entre a extremidade 3’ do exão livre e a extremidade 3’onde ocorre Splicing para retirar o intrão sob forma de molécula de RNA aberta.

Grupo II de Auto-Splicing de IntrõesOnde ocorre? Em genes que codificam proteínas e alguns genes tRNA da mitocôndria e cloroplastos de plantas e fungos.

Como ocorre? Também por duas transesterificações, mas que apresentam algumas diferenças. A primeira ocorre entre o grupo 2’-hidroxilo de um nucleótido de Adenina reactivo (interior à cadeia de RNA) e o Fósforo da extremidade do intrão; e a segunda é análoga à do grupo I sendo, no entanto de salientar que neste caso, o intrão é removido em forma de laço (lariat).

Splicing Alternativo

Onde ocorre? Este processo é frequente em eucariontes complexos, permitindo ampliar a diversidade de proteínas. Como ocorre de forma diferente em cada tecido é importante na diferenciação tecidular (exemplo: cínase da tirosina).

Como Ocorre? A existência de múltiplos intrões e exões num gene abre a possibilidade de combinar os vários exões em mais do que um mRNA. Isto significa que um pré-mRNA pode originar múltiplos mRNA e consequentemente várias proteínas (fig.5).

Para que serve? Múltiplos mecanismos estão envolvidos na regulação do Splicing Alternativo que, por permitir grande variabilidade, contribui para a multiplicidade de proteínas expressas durante o desenvolvimento e diferenciação (exemplo: o mesmo mecanismo, no mesmo pré-RNA, pode dar origem tanto a um inibidor como a uma activador do mesmo processo).

Splicing dos tRNA

Onde ocorre? Ocorre no núcleo, em alguns tRNA mas está presente em todos os eucariontes. Pensa-se estar relacionado com mecanismos de regulação, embora esta matéria não esteja bem esclarecida.

Como ocorre? O mecanismo de Splicing dos pré-tRNA difere em certos aspectos dos outros mecanismos. Durante o processo de Splicing o intrão é "retirado" da sequência havendo uma clivagem em ambos os lados do mesmo. Forma-se então um 2',3'-fosfomonoester cíclico na extremidade 3' do exão 5'. Este processo é efectuado por enzimas em vez de RNA.

Posteriormente, para a reacção de "ligação" dos dois exões, são necessários dois nucleosídeos trifosfatos: um GTP que contribui com um grupo fosfato para a ligação 3‘ - 5' no final da molécula de tRNA e um ATP que forma um intermediário da AMP-ligase activa.

No passo final, o 2'-fosfato da extremidade 5‘ do exão é removido.

CURIOSIDADES- Um exemplo específico de Splicing Alternativo é o caso da determinação do sexo na espécie Drosophila, onde o Splicing do mesmo pré-mRNA determina se a “mosca” é macho ou fêmea.

- Num caso extremo, um gene de Drosophila pode produzir 38 000 proteínas diferentes a partir de um único gene através de Splicing alternativo, apesar de apenas alguma combinações terem sido observadas experimentalmente.

- Nos vertebrados e nos insectos o mRNA forma-se a partir de um único pré-mRNA, enquanto que em dois tipos de protozoários (tripanossomas e euglenóides) a molécula de mRNA é construída por Splicing de moléculas de RNA separadas: Trans-Splicing.

- Splicing “normal” de DNA ocorre nos linfócitos B e T, apesar de ser muito mais raro.

Mecanismos de SplicingClaudia Junqueira, Nuno Couto, Pedro Reis , Pedro Sousa

Orientadora: Professora Delminda Neves

Disciplina de Biologia Celular e Molecular, 2004/2005

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Referências:

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LODISH Harvey, BERK Arnold, ZIPURSKY S. Lawrence, MATSUDAIRA Paul, BALTIMORE David, DARNELL James E., Molecular Cell Biology, 4th ed, W. H. Freeman & Co., New York, 2000, pp 527-528.

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DA SILVA AD., GRAMAXO F., SANTOS, M.E., MESQUITA A.F., BALDAIA L., Terra, Universo de Vida, 1º parte – Biologia, 11º ano, Porto Editora, Porto, 2001, pp 101-114.

BROWN T. A., Genomes, 2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd, Oxford, UK, 2002.

Fig.3 - Sequências determinadas à volta das extremidades 5’ e 3’ nos pre-mRNA dos vertebrados onde ocorre o Splicing.

Fig.1 - Processo geral do Splicing nos Spliceossomas

Fig.2 - Um Spliceossoma visto ao ME

Fig.4 - Os dois diferentes tipos de Auto-Splicing

Fig.6 - Processo geral do Splicing dos pre-RNAt

Fig.5 - Diferentes proteínas resultantes do mesmo gene por Splicing alternativo

Splicing nos Spliceossomas

Auto-Splicing

Grupo I Grupo II

Sequências de intrões libertadas sob forma

linear X

Sequências de intrões libertadas em “lariat” X X

Cofactor nucleótido G livre X

“Cofactor” nucleótido Adenina reactivo X

Duas transesterificações sem consumo de energia X X X

Precisam de intrões para manutenção da sua forma

tridimensional que lhe atribui actividade

catalítica para a reacção

X X

Onde ocorre No núcleo, Spliceossoma

Núcleo, mitocôndrias, cloroplastos e bactérias